Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

कल्पना सतह टी-सेल रिसेप्टर गतिशीलता चार आयामी जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/59914
Automatic Translation
1, 1,2
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह दिखाना है कि लाइव कोशिकाओं में सतह रिसेप्टर गतिशीलता को चार आयामी रूप से कल्पना करने के लिए जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करें। यहां सीडी 4+ प्राथमिक टी कोशिकाओं पर टी सेल रिसेप्टर्स दिखाए जाते हैं।

Abstract

एक कोशिका के सिग्नलिंग और कार्य गतिशील संरचनाओं और इसकी सतह रिसेप्टर्स की बातचीत से तय होते हैं। सीटू में इन रिसेप्टर्स के संरचना-कार्य संबंध को वास्तव में समझने के लिए, हमें पर्याप्त स्थानिक संकल्प के साथ लाइव सेल सतह पर उन्हें कल्पना और ट्रैक करने की आवश्यकता है। यहां हम दिखाते हैं कि लाइव सेल झिल्ली पर टी-सेल रिसेप्टर्स (टीसीआरएस) चार-आयामी (4डी, अंतरिक्ष और समय) के लिए हाल ही में विकसित जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएलएम) का उपयोग कैसे करें। टी कोशिकाएं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की मुख्य प्रभावक कोशिकाओं में से एक हैं, और यहां हमने टी कोशिकाओं का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया ताकि यह दिखाया जा सके कि इन कोशिकाओं के सिग्नलिंग और कार्य टीसीआरएस की गतिशीलता और बातचीत से प्रेरितहैं। एलएलएम अभूतपूर्व स्थानिक संकल्प के साथ 4डी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इसलिए इस माइक्रोस्कोपी तकनीक को आम तौर पर जीव विज्ञान में विभिन्न कोशिकाओं के सतह या इंट्रासेलुलर अणुओं की एक विस्तृत सरणी पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

वास्तविक समय में त्रि-आयामी कोशिका सतह पर अणुओं की तस्करी और विसारित की सटीक गतिशीलता को हल करने के लिए एक पहेली रही है । माइक्रोस्कोपी हमेशा गति, संवेदनशीलता और संकल्प का संतुलन रहा है; यदि किसी भी एक या दो को अधिकतम किया जाता है, तो तीसरे को कम किया जाता है। इसलिए, छोटे आकार और अपार गति के कारण, जिसके साथ सतह रिसेप्टर्स चलते हैं, उनकी गतिशीलता पर नज़र रखना सेल जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक प्रमुख तकनीकी चुनौती बनी हुई है। उदाहरण के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी1,2,3का उपयोग करके कई अध्ययन किए गए हैं, जिसमें उच्च अस्थायी संकल्प है, लेकिन केवल टी-सेल झिल्ली (~ 100 एनएम) का एक बहुत पतला टुकड़ा छवि कर सकता है, और इसलिए कोशिका में दूर हो रही घटनाओं को याद करता है। इन TIRF छवियों को भी केवल सेल के एक द्वि आयामी अनुभाग दिखा । इसके विपरीत, स्टॉचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म)4,फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम)5,और उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (एसटीईडी)6जैसी सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक, प्रकाश की एबी विच्छेदन सीमा को दूर कर सकती है। इन तकनीकों में उच्च स्थानिक संकल्प (~ 20 एनएम संकल्प)4,5,6,7है, लेकिन वे अक्सर पूर्ण द्वि-आयामी (2डी) या त्रि-आयामी (3 डी) छवि प्राप्त करने में कई मिनट लगते हैं, और इसलिए लौकिक संकल्प खो जाता है। इसके अलावा, तूफान और हथेली जैसी तकनीकें जो निमिष संकेतों पर भरोसा करती हैं,8,9कीगिनती में अशुद्धियां हो सकती हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अब तक का उच्चतम संकल्प (50 बजे तक संकल्प)10है; यह भी केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FIB-SEM) के साथ तीन आयामी आयोजित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप 3 एनएम XY और 500 एनएम जेड संकल्प11तक है । हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के किसी भी रूप कठोर नमूना तैयारकरने की आवश्यकता है और केवल निश्चित कोशिकाओं या ऊतकों के साथ आयोजित किया जा सकता है, समय के साथ लाइव नमूनों इमेजिंग की संभावना को नष्ट करने ।

अपने सच्चे शारीरिक 3 डी प्रकृति में जीवित कोशिकाओं में सतह और इंट्रासेलुलर अणुओं की गतिशीलता की पहचान करने के लिए आवश्यक उच्च स्थानिक संकल्प प्राप्त करने के लिए तकनीक केवल हाल ही में विकसित की जा रही है। इन तकनीकों में से एक जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएलएम)12है, जो फोटोब्लीचिंग को काफी कम करने के लिए एक संरचित प्रकाश शीट का उपयोग करता है। नोबेल पुरस्कार विजेता एरिक बेतजिग द्वारा 2014 में विकसित, उच्च अक्षीय संकल्प, कम फोटोब्लीचिंग और पृष्ठभूमि शोर, और एक साथ देखने के क्षेत्र में सैकड़ों विमानों की छवि बनाने की क्षमता एलएलएस माइक्रोस्कोप को वाइडफील्ड, टीआईआरटी एफ और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप12,13,14,15,16, 17,18,19से बेहतर बनाती है। यह चार आयामी (एक्स, वाई, जेड और समय) इमेजिंग तकनीक, जबकि अभी भी विवर्तन सीमित (~ 200 एनएम XYZ रिज़ॉल्यूशन) में अविश्वसनीय अस्थायी संकल्प है (हमने लगभग 100 एफपीएस की फ्रेम दर हासिल की है, जिसके परिणामस्वरूप 3 डी स्थानिक अधिग्रहण के लिए प्रति फ्रेम 0.85 सेकंड के साथ 3 डी पुनर्निर्मित सेल छवि है)।

LLSM आम तौर पर एकल अणु और एकल कोशिका स्तर पर किसी भी कोशिका के भीतर किसी भी अणुओं के वास्तविक समय गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में अत्यधिक गतिशील कोशिकाओं में उन । उदाहरण के लिए, हम यहां दिखाते हैं कि टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एलएलएम का उपयोग कैसे करें। टी कोशिकाएं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रभावक कोशिकाएं हैं। टीसीआरएस एंटीजन-पेश कोशिकाओं (एपीसी) की सतह पर प्रदर्शित पेप्टाइड-एमएचसी (पीएमएचसी) लिगांड को पहचानने के लिए जिम्मेदार हैं, जो टी सेल के चयन, विकास, भेदभाव, भाग्य और कार्य को निर्धारित करता है। यह मान्यता टी कोशिकाओं और एपीसी के बीच इंटरफ़ेस पर होती है, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीयकृत रिसेप्टर क्लस्टरिंग जिसे इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स कहा जाता है। हालांकि यह ज्ञात है कि इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स में टीसीआरएस टी-सेल प्रभावक कार्य के लिए अनिवार्य हैं, फिर भी अज्ञात सिनेप्स के लिए वास्तविक समय टीसीआर तस्करी के अंतर्निहित तंत्र हैं। एलएलएम ने हमें वास्तविक समय में टीसीआरएस की गतिशीलता को परिणामी पीएमएचसी-टीसीआर इंटरैक्शन(चित्रा 1)के साथ सिनैप्स के लिए तस्करी करने से पहले और बाद में कल्पना करने की अनुमति दी है। इसलिए एलएलएम का उपयोग टीसीआरएस की प्रारंभिक गतिशीलता के वर्तमान प्रश्नों को हल करने और यह समझने के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए किया जा सकता है कि एक कोशिका स्वयं और विदेशी एंटीजन के बीच कैसे अलग होती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

5C. B10 में C7 TCR-ट्रांसजेनिक RAG2 नॉकआउट चूहों । शिकागो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार इस अध्ययन में एक पृष्ठभूमि का उपयोग किया गया था।

1. हार्वेस्ट और सक्रिय टी कोशिकाओं

नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा पिछले प्रोटोकॉल पर आधारित है। 20,21के लिए प्रशस्ति पत्र देखें .

  1. एक 10-12 सप्ताह पुराने 5C इच्छामृत्यु । अनुमोदित आईएसीयूसी प्रोटोकॉल (यानी, सीओ2 चैंबर के अनुसार या तो सेक्स (~ 20-25 ग्राम) का C7 ट्रांसजेनिक माउस गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद।)
  2. फर को सोखने और बीएसएल-2 सुरक्षा कैबिनेट में लाने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस शव को अच्छी तरह से स्प्रे करें।
  3. माउस को अपनी दाईं ओर मोड़ें और सर्जिकल कैंची के साथ शरीर गुहा में एक छोटा सा चीरा बनाएं। सर्जिकल संदंश का उपयोग करत तिल्ली निकालें। सर्जिकल कैंची के साथ आवश्यक संयोजी ऊतक को काट दें।
  4. तिल्ली को 70 माइक्रोन-पोर मेश सेल छलनी में रखें और 1 मिलीस सिरिंज प्लंजर के पीछे मैश करें। पूरी आरपीएमआई (आरपीएमआई के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 माइक्रोन 2-मर्काप्टोथेनॉल) के साथ अच्छी तरह से धोलें।
  5. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर स्प्लिनोसाइट्स के एकल सेल निलंबन को केंद्रित करें।
    नोट: इस बिंदु पर गोली लाल हो जाएगा।
  6. 5 एमएमएल आरबीसी लिसिस बफर में प्लंप्लेट्स को फिर से सस्पेंड करें। 5 मिन के लिए इनक्यूबेट, फिर पूर्ण आरपीएमआई के 5 mL के साथ बुझाें।
  7. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर स्प्लिनोसाइट्स के एकल सेल निलंबन को केंद्रित करें।
    नोट: इस बिंदु पर गोली सफेद होना चाहिए, लाल नहीं।
  8. पूरी आरपीएमआई के 5 एमआईएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. टी-25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 10 माइक्रोन मॉथ साइटोक्रोम-सी (एमसीसी, अनुक्रम ANERADLIAYLKQATK) जोड़ें। कोशिकाओं को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 रातोंरात रखें।
  10. अगले दिन, १०० U/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए recombinant माउस आईएल-2 जोड़ें ।
  11. अगले दिनों के लिए निरीक्षण करें, वर्तमान मीडिया के रूप में ताजा मीडिया जोड़ने पीला हो जाता है । टी कोशिकाओं मर जाएगा अगर पीले मीडिया में छोड़ दिया ४८ घंटे से अधिक के लिए उपेक्षित कोशिकाओं को फसल के बाद 6-10 दिनों का उपयोग करने के लिए तैयार हैं ।

2. कोशिकाओं को तैयार करें

  1. इनक्यूबेट 5 मिमी गोल कवरस्लिप 0.1% पॉली-एल-लिसिन के साथ 10 मिमी के लिए।
  2. मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए और 1 x 106 टी कोशिकाओं और 1 x 106 एपीसीएस (CH27 कोशिकाओं21,22 साइटोसोलिक mCherry के साथ transduced) अलग से प्राप्त करने के लिए एक घनत्व ढाल अभिकर्मक (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
    नोट: कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिना जाता है।
    1. एक 15 मिलील शंकुई ट्यूब के लिए घनत्व ढाल अभिकर्मक के 3 mL जोड़ें और ट्यूब के किनारे करने के लिए कोशिकाओं ड्रॉपवाइज ध्यान से जोड़ें । मिश्रण न करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 930 x ग्राम पर सेंट्रलाइज; त्वरण/मंदी का उपयोग करें: धीमी गति से/ पूर्ण मीडिया और घनत्व ढाल अभिकर्ता के बीच कोशिकाओं की पतली मध्य परत को ध्यान से हटा दें, प्रत्येक सेल प्रकार को अलग-अलग शंकुई ट्यूबों में डालें।
      नोट: इमेजिंग के लिए आवश्यकता से अधिक कोशिकाओं को तैयार करना आवश्यक है, जैसा कि हम पाते हैं कि प्रक्रिया के दौरान औसतन 50% खो जाता है। इस प्रक्रिया के लिए जितनी अधिक कोशिकाएं उपयोग की जाती हैं, उन्हें घनत्व ढाल से फसल करना उतना ही आसान होता है। हम अतिरिक्त कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए दोनों सेल प्रकारों के 4-8 mL का उपयोग करते हैं। यदि वांछित है, तो कोशिकाओं को आवश्यक मात्रा सुनिश्चित करने के लिए इस चरण से पहले गिना जा सकता है। किसी भी अतिरिक्त कोशिकाओं को उनके संबंधित फ्लास्क में वापस डाल दिया जाता है।
    2. टी कोशिकाओं और CH27 कोशिकाओं की दोनों ट्यूबों को तीन बार धोकर 5 mL पूरा आरपीएमआई (5 मिन के लिए 300 x ग्राम)। धोने के दौरान हर बार अधिनेता को त्यागें। प्रत्येक ट्यूब को 1 एमएल पूर्ण आरपीएमआई में फिर से निलंबित करें और कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर द्वारा गिनें।
  3. 500 माइक्रोन पूर्ण आरपीएमआई में 1 x 106 एपीसी को फिर से निलंबित करें और 10 माइक्रोन एमसीसी जोड़ें। 3 7 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट। 500 माइक्रोन पूर्ण आरपीएमआई (5 मिन के लिए 300 x ग्राम) के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोएं। अधिनेतों को त्यागें।
  4. 500 माइक्रोन पूर्ण आरपीएमआई में 1 x 106 टी कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं के 500 माइक्रोन में एंटी-टीसीआरएलेक्सा 488-लेबल फैब (क्लोन एच57) के 2 μg जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट। पूर्ण आरपीएमआई (5 मिन के लिए 300 x ग्राम) के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के बाद अधिनेता को त्यागें।
    नोट: डिवेलंट एंटी-टीसीआर एंटीबॉडी को फैब तैयारी किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके मोनोवेलेंट फैब में काटा गया था ताकि डिवेलेंट एंटीबॉडी द्वारा टी सेल रिसेप्टर्स को क्रॉसलिंक करने से बचा जा सके (यह कदम वैकल्पिक है)।
  5. इमेजिंग मीडिया के 500 माइक्रोन में दोनों सेल प्रकारों को फिर से निलंबित करें (फिनॉल रेड-फ्री लीबोविट्ज के एल-15 मीडियम के साथ 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन)।

3. एलएलएम दैनिक संरेखण का आयोजन

नोट: (महत्वपूर्ण) यह संरेखण प्रोटोकॉल एलएलएम उपकरण पर आधारित है जिसका उपयोग किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें)। प्रत्येक LLSM अलग हो सकता है और विभिन्न संरेखण रणनीतियों की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से उन है कि घर का निर्माण कर रहे हैं । उचित नियमित संरेखण करें और धारा 4 तक जारी रखें।

  1. एलएलएम बाथ (~ 10 मिलीग्राम वॉल्यूम), प्रेस इमेज (होम) में 10 मिलीग्राम पानी के साथ-साथ 30 माइक्रोन फ्लोरेसिन (1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक), प्रेस इमेज (होम) को इमेज पोजिशन पर ले जाने के लिए 10 मिलील पानी और एक ही बेसेल लेजर बीम पैटर्न को देखें । बीम को सभी दिशाओं में संतुलित पैटर्न बनाने के लिए गाइड और पूर्व-निर्धारित ब्याज क्षेत्र (आरओआई) का उपयोग करके लेजर बीम को संरेखित करें।
    1. बीम भी खोजक कैमरे में ध्यान केंद्रित दिखाई देना चाहिए। समायोजित करने के लिए दो दर्पण झुकाव समायोजक, शीर्ष माइक्रोमीटर, फोकस और उत्सर्जन उद्देश्य कॉलर का उपयोग करें। सही ढंग से गठबंधन बीम के लिए चित्रा 2ए, बी देखें।
  2. फ्लोरेसिन को पूरी तरह से हटाने के लिए कम से कम 200 मीटर पानी से स्नान और उद्देश्यों को धोएं।
  3. इमेजिंग मीडिया में इमेजस्टैंडर्ड फ्लोरोसेंट मोतियों (पॉली-एल-लाइसेन के साथ 5 एमएम कवरस्लिप के मोतियों का पालन करके तैयार, सामग्री की तालिकादेखें; इमेजिंग मीडिया में भौतिक बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) के लिए इसे पहले से तैयार और फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: बाद में प्रसंस्करण के लिए देखने में केवल एक ही बीड हो सकता है, इसलिए एक माक जिसे दर्शक में अपने आप में खोजने की कोशिश करें या एक ही माक प्राप्त करने के लिए आसानी से फसली की जा सकती है।
    1. 'एक्स गैल्वो रेंज' बॉक्स में 3 से सेटिंग करके डिथर चालू करें। वर्तमान क्षेत्र को देखने के लिए लाइव प्रेस करें। कवर स्लिप और मोतियों को खोजने के लिए जेड दिशा के साथ ले जाएं। जेड के साथ आगे बढ़कर एक बीड के केंद्र का पता लगाएं, लेजर को थामने के लिए स्टॉप प्रेस करें। 3डी,प्रेस सेंटर की जांच करें और फिर निष्पादितप्रेस करें । इससे डाटा एकत्र होगा।
    2. झुकाव दर्पण, उद्देश्य कॉलर को मैन्युअल रूप से समायोजित करें, और उच्चतम ग्रे मूल्यों के लिए माइक्रोमीटर पर ध्यान केंद्रित करें, फिर उद्देश्य स्कैन, जेड गैल्वो, जेड + उद्देश्य (totPSF) और नमूना स्कैन (नमूनापीएसएफ) कैप्चर मोड के लिए उचित पैटर्न प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित करें। ठीक से समायोजित अधिकतम तीव्रता अनुमानों (एमआईपी) के लिए चित्रा 2सी-एफ देखें।
      नोट: विभिन्न कैप्चर मोड (ऑब्जेक्टिव स्कैन, जेड गैल्वो, जेड + ऑब्जेक्टिव और सैंपल स्कैन) बदलते हैं कि प्रकाश-शीट नमूने के माध्यम से कैसे चलती है। सभी स्कैन मोड संरेखण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    3. सैंपल स्कैन से पता चलता है कि प्रयोग के दौरान डाटा कैसे एकत्र किया जाएगा। डेस्कईविंग और डेकोवोलुशन (सेक्शन 5 देखें) के लिए सैंपल स्कैन मोड में निष्पादित दबाकर नमूना पीएसएफ को एकत्र करें। तीन रंग मोड (488, 560, 647) के लिए लेजर बदलें और फिर से निष्पादित प्रेस।
      नोट: चूंकि एलएलएम छवियां एक कोण (57.2 डिग्री) पर होती हैं, "नमूना स्कैन" मोड में कैप्चर की गई छवियां इस कोण पर एकत्र की जाती हैं, और इसलिए "विषम" हैं। डी-तिरछा इस कोण के लिए सही करने और छवि को एक सच्चे जेड-स्टैक में "फिर से संरेखित" करने की प्रक्रिया है। इन डेटा को इमेजिंग मीडिया और सभी चैनलों में एकत्र किया जाना चाहिए जो प्रयोग के दौरान चित्रित किए जाएंगे। यदि इसे ठीक से एकत्र नहीं किया जाता है, तो डेटा ठीक से डी-विषम नहीं होगा। इसी तरह, सुनिश्चित करें कि मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस (या वांछित प्रायोगिक तापमान) पर गर्म किया गया है।

4. एलएलएम के साथ सेल की स्थापना

  1. चरण 2.1 से 5 मिमी व्यास परिपत्र कवरस्लिप में चरण 2.5 से 100,000 एपीसी (50 माइक्रोन) जोड़ें और उन्हें 10 मिमी के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  2. इसके बाद सैंपल होल्डर को इसमें कवरस्लिप सेल-साइड-अप जोड़ें । स्नान में रखने से पहले बुलबुले से बचने के लिए कवरस्लिप के पीछे इमेजिंग मीडिया की एक बूंद जोड़ें। पीजो पर नमूना धारक पेंच, और प्रेस छवि (घर)।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए छवि के लिए एक एपीसी ढूंढें कि एलएलएम और इमेजिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) ठीक से काम कर रहे हैं।
    नोट: हम 60 z-चरणों के साथ 0.4 माइक्रोन चरण आकार और 3 के लिए निर्धारित करने के लिए दो रंगों के लिए 10 एमएस एक्सपोजर पर छवि है, जो ~ 200 एनएम XY और 400 एनएम जेड संकल्प के साथ 3 डी छवि के प्रति फ्रेम 1.54 एस में परिणाम है। इन सेटिंग्स को सेल आकार, वांछित जेड-रिज़ॉल्यूशन और उपयोग की जाने वाली फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक से सिग्नल की ताकत के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। लेजर पावर का उपयोग भी फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक के आधार पर अलग-अलग होगा।
    1. वर्तमान छवि को देखने के लिए लाइव प्रेस करें। कवर स्लिप और कोशिकाओं को खोजने के लिए जेड के साथ ले जाएं।
    2. जेड दिशा में आगे बढ़कर एपीसी के केंद्र का पता लगाएं, फिर लेजर को थामने के लिए स्टॉप दबाएं। वांछित सेटिंग्स 3 डी की जांच करें और इनपुट करें (चरण 4.3.1 देखें), प्रेस सेंटर और फिर निष्पादितप्रेस करें। इससे डाटा एकत्र होगा।
  4. स्थिति लोड करने के लिए चरण को कम करें और इमेजिंग मीडिया (100,000 कोशिकाओं, चरण 2.5 से) में टी कोशिकाओं के 50 माइक्रोन जोड़ें, सीधे कवरस्लिप पर ड्रॉपवाइज करें। पिपेट टिप के अंत में एक बूंद फॉर्म देना सबसे अच्छा है और फिर स्नान तरल को टिप को छूना। "छवि(वापसी)पर क्लिक करके मंच वापस उठाएं।
  5. इमेजिंग शुरू करते हैं। वांछित स्टैक आकार और समय चूक लंबाई निर्धारित करना सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, 0.4 माइक्रोन चरण आकार और इनपुट 500 समय फ्रेम पर छवि 60 z-ढेर। (आमतौर पर) फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए 500 फ्रेम तक पहुंचने से पहले रिकॉर्डिंग बंद करें। सेल जोड़े की खोज करने के लिए लाइव मोड का उपयोग करें, और जब तैयार और वांछित सेटिंग्स दर्ज की गई हैं, तो डेटा एकत्र करने के लिए निष्पादित करें। एक उदाहरण के लिए मूवी 1 और चित्रा 1 देखें।

5. ट्रैक सतह गतिशीलता

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर से डेटा निर्यात करें (सामग्री की तालिकादेखें)। इससे हर रंग में हर बार प्वाइंट के लिए जेड-स्टैक टीआईएफ फाइलें बनेंगी।
  2. पहले डेटा को डिसेव और डिकोनोवोलेव करें।
    नोट: हम एचएचएमआई के जेनेलिया रिसर्च कैंपस18द्वारा लाइसेंस के तहत एलएलस्पी पाइपलाइन का उपयोग करते हैं, लेकिन डेस्कविंग और डेकोनोलुयूशन कई इमेजिंग सॉफ्टवेयर्स (सामग्री की तालिकादेखें) के भीतर भी उपलब्ध हैं।
  3. डेटा को डिब्लीच करें।
    नोट: हम हिस्टोग्राम मिलान (फिजी पाथवे: छवि) के साथ फिजी के डिब्लीच फीचर का उपयोग करते हैं। समायोजित करते हैं । ब्लीच करेक्शन । हिस्टोग्राम मिलान । ठीक है)।
  4. ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में आयात करें (सामग्री की तालिकादेखें)। सॉफ्टवेयर स्पेसिफिकेशंस के हिसाब से क्लस्टर ट्रैक करें। एक उदाहरण के लिए मूवी 2 देखें ।
    नोट: ट्रैकिंग परिणाम उपयोग किए गए ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर, एल्गोरिदम चुने गए, चयनित वांछित आउटपुट पैरामीटर आदि पर निर्भर करेगा। उदाहरण के लिए, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में हमने उपयोग किया (सामग्री की तालिकादेखें), हमने सॉफ्टवेयर को प्रत्येक सुविधा को एक ही स्थान निर्दिष्ट करने के बजाय अनियमित आकार ों को ट्रैक करने की अनुमति देने का फैसला किया, क्योंकि टीसीआर समूह सही क्षेत्रों में व्यवस्थित नहीं हैं। इसके अलावा, हमने गति, दिशा, मात्रा, तीव्रता, क्षेत्र, स्थान और ट्रैक अवधि की जानकारी सहित 35 मापदंडों को एकत्र करने का फैसला किया। हालांकि अलग-अलग सवालों के जवाब देने के लिए अलग-अलग तरीके या पैरामीटर फायदेमंद होंगे।
    1. यदि ट्रैकिंग वांछित नहीं है, तो हाइपरस्टैक डेटा से फिल्मों की कल्पना और निर्माण के लिए फिजी के लिए क्लीयरवॉल्यूम प्लगइन का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां, हम प्राथमिक माउस 5C के अलगाव, तैयारी और इमेजिंग का वर्णन करते हैं। एक जाली प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर C7 टी कोशिकाओं । धारा 3 के दौरान, माइक्रोस्कोप को सही ढंग से संरेखित करना और पीएसएफ को दैनिक एकत्र करना अनिवार्य है जिसके साथ संग्रह के बाद डेटा को कम करना है। चित्रा 2में, हम सही संरेखण छवियों को दिखाते हैं जो माइक्रोस्कोप को संरेखित करते समय देखी जाएंगी। चित्रा 2ए और फिगर 2बी फ्लोरोसिन में इमेज्ड होने पर क्रमशः सही बीम पाथ और बीम अलाइनमेंट दिखाते हैं । उद्देश्य स्कैन XZ और YZ अनुमानों में एक बड़ा एक्स आकार दिखाना चाहिए जो संभव के रूप में सममित है; इसे एक्स जितना संभव हो उतना छोटा होने के लिए भी समायोजित किया जाना चाहिए(चित्रा 2सी)। यह मुख्य रूप से उत्सर्जन उद्देश्य कॉलर को समायोजित करके हासिल किया जाता है। जेड गैलवो स्कैन को एक्सजेड और XY में एक अंडाकार दिखाना चाहिए जिसमें दोनों तरफ एक डॉट (XZ के लिए ऊपर और नीचे और वाईजेड के लिए बाएं और दाएं)(चित्रा 2डी)के साथ एक अंडाकार दिखाना चाहिए। यह मुख्य रूप से गैल्वो मिरर झुकाव को समायोजित करके, या तो मैन्युअल रूप से या सॉफ्टवेयर में मोटरचालित समायोजन के साथ हासिल किया जाता है। अंत में, जेड + ऑब्जेक्टिव स्कैन और नमूना स्कैन दोनों को उन बिंदुओं को दिखाना चाहिए जो यथासंभव दौर दिखते हैं(क्रमशः चित्रा 2ई और चित्रा 2एफ)। ये एक छोटे से एक्स हो सकता है, लेकिन यह संभव के रूप में के रूप में dimished होना चाहिए । यदि उद्देश्य स्कैन और जेड गैल्वो को अच्छी तरह से स्थापित किया गया था, तो इन्हें अच्छी तरह से गठबंधन किया जाना चाहिए, लेकिन यदि समायोजन आवश्यक हैं, तो वे ज्यादातर गैल्वो मिरर के साथ आयोजित किए जाएंगे। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस संरेखण के दौरान, कॉलर और गैल्वो को समायोजित किया जाता है, ध्यान (उत्सर्जन उद्देश्य से ऊपर माइक्रोमीटर) को भी समायोजित करने की आवश्यकता होगी।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम टी-सेल सतह पर टीसीआरएस की चार-आयामी गतिशीलता देख सकते हैं(चित्रा 1, मूवी 1)। इस माइक्रोस्कोप का मुख्य लाभ टीसीआरएस की कल्पना सतह इकाइयों को ट्रैक करने और उनके आकार, गति, संकेत तीव्रता आदि (सामग्री की तालिकादेखें) से मात्राबद्ध डेटा प्राप्त करने की क्षमता में निहित है। मूवी 2 प्राप्त पटरियों का एक उदाहरण दिखाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: टी सेल-एपीसी सिनेप्स की 4-आयामी इमेजिंग। (क)एक प्रतिनिधि उदाहरण 3डी समय-चूक एलएलएम छवियां जिसमें टी सेल को एपीसी के साथ बातचीत करते हुए दिखाया गया है। दिखाया गया है टीसीआर (ग्रीन, एंटी टीसीआर-AF488 द्वारा लेबल) एक एपीसी (लाल, साइटोसोलिक mCherry) की सतह पर प्रस्तुत एंटीजन को पहचानने में गतिशीलता । स्केल बार = 5 माइक्रोन। इसकेअलावा मूवी 1 देखें । (ख)ऑर्थोगोनल XY स्लाइस ऑफ (ए)। इनसेट एक पूरे सेल का एक संदर्भ फ्रेम है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (C)ऑर्थोगोनल वाईजेड स्लाइस ऑफ (ए)। इनसेट एक पूरे सेल का एक संदर्भ फ्रेम है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (घ)(ए) का दोहरा ऑर्थोगोनल स्लाइस । इनसेट पूरे सेल का संदर्भ फ्रेम है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। इसके अलावा मूवी 3देखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एलएलएम संरेखण। (ए)एलएलएम इमेजिंग प्रयोग के लिए वांछित बीम पैटर्न। (ख)बीम संरेखण प्रक्रिया का स्क्रीनशॉट; बाईं ओर केंद्रित खिड़की संकुचित, केंद्रित बीम दिखा रही है; शीर्ष दाईं ओर एक ग्राफ दिखा रहा है कि बीम खिड़की के भीतर केंद्रित है; नीचे दाईं ओर खोजक कैमरा है, जो एक पतली, केंद्रित बीम भी होना चाहिए। (ग)वस्तुनिष्ठ स्कैन द्वारा एक बीड की अधिकतम तीव्रता अनुमान (एमआईपी) । (D)जेड-गैल्वो स्कैन द्वारा एक बीड की अधिकतम तीव्रता अनुमान (एमआईपी) । (ई)जेड + उद्देश्य स्कैन द्वारा एक बीड की अधिकतम तीव्रता अनुमान (एमआईपी)। (एफ)नमूना स्कैन द्वारा एक बीड की अधिकतम तीव्रता अनुमान (एमआईपी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1: टी सेल synapse गठन । 1.54 एस अंतराल पर 70 समय बिंदुओं पर साइटोसोलिक एमचेरी (लाल) को व्यक्त करने वाले लक्ष्य एपीसी के साथ αTCR-AF488 (हरे रंग) के साथ लेबल किए गए टी सेल की बातचीत का दो-रंग वॉल्यूम प्रतिपादन। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Movie 2
फिल्म 2: ट्रैकिंग टीसीआर गतिशील गति । मूवी 1के साथ तुलना करें । दृश्यमान टीसीआर संरचनाओं के अनुरूप समूहों को इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ समय के साथ 3डी में ट्रैक किया गया था। ड्रैगन पूंछ पिछले चार फ्रेम पर क्लस्टर पदों दिखा रहे है रंग विस्थापन लंबाई से कोडित कर रहे हैं । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Movie 3
मूवी 3: टी सेल सिनेप्स के ऑर्थोगोनल स्लाइस। मूवी 1 और फिगर 1बी-डीके साथ तुलना करें । मूवी 1का डुअल ऑर्थोगोनल स्लाइस, दिखारहा है कि αTCRο-AF488 फैब वास्तव में सेल सतह TCRs लेबलिंग है । इनसेट पूरे सेल का एक संदर्भ फ्रेम है । स्केल बार = 5 माइक्रोन। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल को 5C से अलग सीडी 4+ टी कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। एलएलएम उपकरण पर C7 ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग किया जाता है, और इसलिए अन्य सेल सिस्टम और एलएलएम को अलग-अलग अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल 4D इमेजिंग की शक्ति को दिखाता है, क्योंकि इसका उपयोग शारीरिक स्थितियों में कम से कम विरूपण के साथ एक पूरे कोशिका पर सतह रिसेप्टर की गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, इस तकनीक के कई संभावित भविष्य के अनुप्रयोग हैं।

एक महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं को उचित एकाग्रता पर बसने की अनुमति दे रहा है। यदि बहुत सारे एपीसी कवरस्लिप पर व्यवस्थित होते हैं और बहुत घने हो जाते हैं, तो एक टी सेल ढूंढना मुश्किल है जो केवल एक एपीसी के साथ बातचीत कर रहा है। जब किसी टी सेल में कई सिनेप्स होते हैं, तो डेटा की ट्रैकिंग और व्याख्या बहुत जटिल हो सकती है। इसी तरह, यदि बहुत कम एपीसीएस मौजूद हैं, तो एक टी सेल ढूंढना भी मुश्किल है। हमारे हाथों में, 50,000 कोशिकाओं को 10 00 00 के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति देना एक इष्टतम घनत्व प्राप्त करता है। हालांकि, अगर अनुयायी कोशिकाओं के साथ एक प्रणाली का उपयोग कर इस समस्या से बचा जा सकता है। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में एक वांछित संप्रवाह के लिए कवरस्लिप के साथ उगाया जा सकता है।

इसी तरह, प्रणाली में गिराए गए टी कोशिकाओं की संख्या स्नान के आकार और वे जिस दूरी को फैला सकते हैं, उस पर निर्भर है। यहां इस्तेमाल किए जाने वाले एलएलएम सिस्टम में 12 मिलीआर बाथ और 2.5 मिलील बाथ है, जैसा कि सिस्टम के पिछले संस्करण के विपरीत था जिसमें केवल 10 मिलीआर स्नान उपलब्ध था। हम मूल फ्लोरेसिन इमेजिंग के लिए 12 mL स्नान का उपयोग करें तो कोशिकाओं इमेजिंग के लिए २.५ mL स्नान करने के लिए स्विच । यह बीम विज़ुअलाइज़ेशन चरण के बाद स्नान की कम पूरी तरह से धोने की अनुमति देता है, और प्रत्येक इमेजिंग सत्र के लिए आवश्यक टी कोशिकाओं की संख्या को भी कम करता है। बदले में, यह उपयोगकर्ताओं को कम कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देगा।

बातचीत के सही बिंदु पर कोशिकाओं को ढूंढना भी एक चुनौती है। हमारे हाथों में, टी कोशिकाओं के बारे में 2 मिन लेने के लिए कवरस्लिप पर APCs के लिए नीचे बसने, तो यह गतिशील टी APCs के करीब कोशिकाओं के लिए कवरस्लिप खोज शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसमें एक बड़ा सुधार हाल ही में फाइंडर कैमरे में एलईडी लाइट को जोडऩे से हुआ है। यदि घर में निर्मित प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं, तो हम डिजाइन में इस सुविधा को शामिल करने की अत्यधिक सलाह देते हैं।

अंत में, फ्लोरोसेंट लेबलिंग रणनीतियां एक और महत्वपूर्ण विचार हैं। प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंग में एक अलग क्वांटम यील्ड और फोटोब्लीचिंग की दर होती है। फ्लोरोसेंट रंग आम तौर पर उज्जवल होते हैं, लेकिन यदि कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल अणु के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया गया है, तो लेबल को भरदिया जाता है क्योंकि कोशिका अणु का उत्पादन जारी रखे हुए है। इसलिए, प्रयोगों को डिजाइन करते समय विचार करने के लिए लेबलिंग रणनीति एक महत्वपूर्ण कारक है।

हम प्रौद्योगिकी के लिए भविष्य के निर्देशों पर चर्चा के साथ अपनी बात समाप्त करना चाहेंगे । एलएलएम संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) में भी सक्षम है, जिसके परिणामस्वरूप 150 एनएम XY रिज़ॉल्यूशन और 280 एनएम जेड रेजोल्यूशन होता है, और वाइडफील्ड सिम12की तुलना में कम से कम 10 गुना तेज होता है। इसलिए, जबकि एलएलएम 4डी इमेजिंग की अभूतपूर्व गति प्रदान करता है, यह वर्तमान सुपर-रिज़ॉल्यूशनतकनीकों 4,5,6के स्थानिक संकल्प को प्राप्त नहीं कर सकता। हालांकि, अगर एक एसटीएड एलएलएम बनाया जा सकता है तो इस संकल्प में सुधार किया जा सकता है । चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसटीईडी-एसपीआईएम) के साथ प्रकाश पत्रएसटीईडी और उत्तेजित उत्सर्जन की कमी का उपयोग किया गया है, लेकिन एलएलएम21,22,23,24के लौकिक संकल्प की कमी है। यदि एसटीईडी-एसपीआईएम को जाली को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया था, तो हम संभावित रूप से 50 एनएम अक्षीय संकल्प प्राप्त कर सकते हैं, जो वर्तमान में उपलब्ध तकनीकों की तुलना में तेजी से 50 एनएम अक्षीय संकल्प प्राप्त कर सकते हैं। फिर भी, वर्तमान उपलब्ध प्रौद्योगिकियों के साथ, LLSM हमें उच्च अक्षीय संकल्प के साथ सबसे तेजी से लौकिक संकल्प देता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम शिकागो विश्वविद्यालय में डॉ व्यातास बिंदोकास से सलाह और मार्गदर्शन स्वीकार करना चाहते हैं । हम जाली प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप का समर्थन और रखरखाव के लिए शिकागो विश्वविद्यालय में एकीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एनआईएच न्यू इनोवेटर अवार्ड 1DP2AI144245 और एनएसएफ करियर अवार्ड 1653782 (जेएच) ने सपोर्ट किया। जेआर को एनएसएफ ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309659 For T cell harvest
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-25ML For T cell culture
5 mm round coverslips World Precision Instruments 502040 For Imaging
70um Sterile Cell Strainer Corning 7201431 For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody BioLegend 109215 For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) X&Y Cell Culture FBS-500 For T cell culture
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377 For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres Thermo Fisher Scientific F8810 For microscope alignment
Imaris Bitplane N/A Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope 3i N/A Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 21083027 For Imaging
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-081 For T cell culture
LLSpy Janelia Research Campus N/A LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK Elimbio Custom Synthesis For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin Life Technologies 15140122_3683884612 For T cell culture
Poly-L-Lysine Phenix Research Products P8920-100ML For Imaging
RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54 For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2 Sigma-Aldrich I0523 For T cell culture
RPMI 1640 Medium Corning MT10040CV For T cell culture
Slidebook 3i N/A LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools Nova-Tech International DSET10 For T cell harvest
T-25 Flasks Eppendorf 2231710126 For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits Thermo Fisher Scientific 44685 For preparing Fab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
  3. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  5. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
  7. Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
  8. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  9. Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
  10. Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
  11. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  12. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
  13. Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
  14. Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
  15. Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
  16. Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
  17. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
  18. Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
  19. Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
  20. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
  21. Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
  22. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
  23. Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
  24. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).

Tags

बायोकेमिस्ट्री इश्यू 155 जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी इम्यूनोलॉजी टी-सेल रिसेप्टर इमेजिंग ट्रैकिंग डायनेमिक्स
कल्पना सतह टी-सेल रिसेप्टर गतिशीलता चार आयामी जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing … More

Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e59914, doi:10.3791/59914 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter