Summary
Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.
Abstract
Bir hücrenin sinyalizasyonu ve işlevi, yüzey reseptörlerinin dinamik yapıları ve etkileşimleri tarafından belirlenir. Bu reseptörlerin yerinde ki yapı-fonksiyon ilişkisini gerçekten anlamak için, onları canlı hücre yüzeyinde yeterli spatiotemporal çözünürlükle görselleştirmemiz ve izlememiz gerekir. Burada nasıl görüntü T-hücre reseptörleri (TDR) dört boyutlu (4D, uzay ve zaman) canlı hücre zarında son zamanlarda geliştirilen Kafes Işık-Sheet Mikroskobu (LLSM) nasıl kullanılacağını göstermektedir. T hücreleri adaptif bağışıklık sisteminin ana efektör hücrelerinden biridir, ve burada bu hücrelerin sinyalve fonksiyonu Tcr dinamikleri ve etkileşimleri tarafından tahrik olduğunu göstermek için bir örnek olarak T hücrelerikullanılır. LLSM, benzeri görülmemiş spatiotemporal çözünürlükte 4D görüntülemeye olanak tanır. Bu nedenle bu mikroskopi tekniği genellikle biyolojide farklı hücrelerden çok çeşitli yüzey veya hücre içi moleküllere uygulanabilir.
Introduction
Üç boyutlu hücre yüzeyinde gerçek zamanlı olarak yayılan ve yayılan moleküllerin hassas dinamikleri çözülmesi gereken bir muamma olmuştur. Mikroskopi her zaman hız, hassasiyet ve çözünürlük dengesi olmuştur; herhangi bir veya iki maksimize edilirse, üçüncü en aza indirilir. Bu nedenle, yüzey reseptörlerinin hareket ettiği küçük boyut ve muazzam hız nedeniyle, dinamiklerinin izlenmesi hücre biyolojisi alanında önemli bir teknolojik zorluk olmaya devam etmiştir. Örneğin, birçok çalışma toplam iç yansıma floresansı kullanılarak yapılmıştır (TIRF) mikroskopi1,2,3, yüksek zamansal çözünürlüğe sahiptir, ancak sadece T-hücre zarının çok ince bir dilimigörüntü olabilir (~100 nm), ve bu nedenle hücrede daha uzakta oluyor olayları özlüyor. Bu TIRF görüntüleri de sadece hücrenin iki boyutlu bir bölümünü gösteriyor. Buna karşılık, süper çözünürlüklü teknikler, örneğin stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM)4, fotoaktive lokalizasyon mikroskopisi (PALM)5, ve uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopisi (STED)6, Abbe kırınım sınırının üstesinden gelebilir. Bu teknikler yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip (~20 nm çözünürlük)4,5,6,7, ama genellikle tam iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) görüntü elde etmek için birkaç dakika sürer, ve bu nedenle zamansal çözünürlük kaybolur. Buna ek olarak, yanıp sönen sinyallere dayanan STORM ve PALM gibi tekniklerde8,9saymada yanlışlıklar olabilir. Elektron mikroskobu açık ara en yüksek çözünürlüğe sahiptir (en fazla 50 pm çözünürlük)10; hatta 3 nm XY ve 500 nm Z çözünürlüğü11'ekadar sonuçlanan odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile üç boyutlu olarak yapılabilir. Ancak, elektron mikroskobu herhangi bir form sert örnek hazırlanması gerektirir ve sadece sabit hücreleri veya dokuları ile yapılabilir, zaman içinde canlı örnekleri görüntüleme olasılığını ortadan kaldırarak.
Gerçek fizyolojik 3D doğacanlı hücrelerde yüzey ve hücre içi moleküllerin dinamiklerini belirlemek için gerekli yüksek spatiotemporal çözünürlük elde etmek için teknikler sadece son zamanlarda geliştirilmiştir. Bu tekniklerden biri kafes Işık-Levha Mikroskobu (LLSM)12, büyük ölçüde daha düşük photobleaching için yapılandırılmış bir ışık levha kullanır. Nobel Ödüllü Eric Betzig tarafından 2014 yılında geliştirilen, yüksek eksenel çözünürlük, düşük fotobeyazrlama ve arka plan gürültüsü, ve aynı anda görüş alanı başına yüzlerce uçak görüntü lls mikroskoplar geniş alan, TIRF ve konfokal mikroskoplar12,13,14,15,16,17,18,19. Bu dört boyutlu (x, y, z ve zaman) görüntüleme tekniği, hala kırınım sınırlı iken (~ 200 nm XYZ çözünürlük), inanılmaz zamansal çözünürlüğe sahiptir (biz yaklaşık 100 fps bir kare hızı elde ettik, çerçeve başına 0.85 saniye ile 3D yeniden hücre görüntüsü sonuçlanan) 3D mekansal edinim için.
LLSM genellikle tek moleküllü ve tek hücre düzeyinde herhangi bir hücre içinde herhangi bir molekülün gerçek zamanlı dinamikleri izlemek için kullanılabilir, bağışıklık hücreleri gibi son derece hareketli hücrelerde özellikle. Örneğin, Burada T-hücre reseptör (TCR) dinamiklerini görselleştirmek için LLSM nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. T hücreleri adaptif bağışıklık sisteminin efektör hücreleridir. TC'ler, bir T hücresinin seçimini, gelişimini, farklılaşmasını, kaderini ve işlevini belirleyen antijen sunan hücrelerin (APC) yüzeyinde görüntülenen peptid-MHC (pMHC) ligandlarını tanımaktan sorumludur. Bu tanıma T hücreleri ve AAP'ler arasındaki arabirimde meydana gelir, immünolojik sinaps denilen oluşturmak için lokalize reseptör kümeleme ile sonuçlanan. İmmünolojik sinapstaki TCR'lerin T-hücre efektörü fonksiyonu için zorunlu olduğu bilinmekle birlikte, sinapsa gerçek zamanlı TCR ticaretinin altında yatan mekanizmalar hala bilinmemektedir. LLSM, ortaya çıkan pMHC-TCR etkileşimi ile sinapsa ticareti öncesi ve sonrası TCR'lerin dinamiklerini gerçek zamanlı olarak görselleştirmemizi sağlamıştır (Şekil 1). LLSM bu nedenle TT'lerin biçimlendirici dinamiklerinin güncel sorularını çözmek ve bir hücrenin benlik ve yabancı antijenleri nasıl ayırt oluşturduğunu anlamak için içgörüler sağlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
5C'ye kadar. B10'da C7 TCR-transgenik RAG2 nakavt fareler. Chicago Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokole göre bu çalışmada bir arka plan kullanılmıştır.
1. T Hücrelerinin Hasat ve Aktive
NOT: Protokolün bu bölümü önceki protokolleri temel alınr. Daha fazla ayrıntı için alıntılarbakınız 20,21.
- 10-12 haftalık 5C ötenazi. C7 transgenik fare her iki cinsiyet (~ 20-25 g) onaylanmış IACUC protokolüne göre (yani, CO2 odası servikal çıkığı takip).
- Sprey fare karkas iyice% 70 etanol ile kürk aşağı emmek ve bir BSL-2 güvenlik kabine getirmek.
- Fareyi sağ tarafına çevirin ve cerrahi makasla vücut boşluğunda küçük bir kesi yapın. Cerrahi forceps kullanarak dalak çıkarın. Cerrahi makas ile gerektiği gibi bağ dokusunu kesin.
- Dalağı 70 m'lik bir örgü hücresüze yerleştirin ve 1 mL şırınga pistonunun arkasıyla püre haline getirin. Süzgeçi tam RPMI ile iyice yıkayın (RPMI ile 10% fetal sığır serumu [FBS], 2 mM L-glutamin, 1% penisilin / streptomisin, 50 μM 2-mercaptoetanol).
- Splenositlerin tek hücreli süspansiyonuna 5 dk. 300 x g.'da santrifüj.
NOT: Bu noktada pelet kırmızı olacaktır. - 5 mL RBC lysis tamponundaki splenositleri yeniden askıya alın. 5 dakika kuluçka, sonra tam RPMI 5 mL ile söndürmek.
- Splenositlerin tek hücreli süspansiyonuna 5 dk. 300 x g.'da santrifüj.
NOT: Bu noktada pelet kırmızı değil, beyaz olmalıdır. - Tam RPMI 5 mL pelet resuspend.
- Bir T-25 şişesine aktarın ve 10 μM güve sitokrom-C (MM, sıra ANERADLIAYLKQATK) ekleyin. Hücreleri bir hücre kültürü kuluçka makinesine 37 °C, %5 CO2 gecede koyun.
- Ertesi gün, 100 U/mL'lik son konsantrasyona rekombinant fare IL-2 ekleyin.
- Mevcut ortam sarıya dönerken, sonraki günler için gözlemleyin. 48 saat boyunca sarı ortamda gözetimsiz bırakılırsa T hücreleri ölür.
2. Hücreleri Hazırlama
- Kuluçka 5 mm yuvarlak kapaklar ile %0,1 poli-L-lizin 10 dk. Aspire kapatın ve doğal olarak kurumasına izin verin.
- Ölü hücreleri ayırmak ve 1 x 106 T hücreleri ve 1 x 106 AAP'leri (CH27 hücreleri21,22 sitosolik mCherry ile transduced) elde etmek için bir yoğunluk gradyan reaktifi (Malzemeler Tablosunabakın) kullanın.
NOT: Hücreler hemositometre kullanılarak sayılır.- 15 mL konik bir tüpe 3 mL yoğunluk gradyan reaktifi ekleyin ve tüpün kenarına damla yla hücreleri dikkatlice ekleyin. Karıştırmayın. Santrifüj 930 x g 10 dk 4 °C'de; ivme/yavaşlama kullanın: SLOW/SLOW. Tüm ortam ve yoğunluk gradyan reaktifi arasındaki ince orta hücre tabakasını dikkatlice çıkarın ve her hücre türünü ayrı konik tüplere yerleştirin.
NOT: İşlem sırasında ortalama %50'sinin kaybolduğunu gördüğümüziçin görüntüleme için gerekenden daha fazla hücre hazırlamak gerekir. İşlem için ne kadar çok hücre kullanılırsa, yoğunluk degradesinden hasat etmek o kadar kolay olur. Fazla hücreleri sağlamak için her iki hücre tipinden 4-8 mL kullanırız. İstenirse, gerekli hacmi sağlamak için bu adımdan önce hücreler sayılabilir. Herhangi bir ekstra hücre kendi şişelerine geri konur. - Her iki tüp t ve CH27 hücrelerini de 5 mL tam RPMI (5 dk için 300 x g) ile üç kez yıkayın. Yıkama sırasında her seferinde supernatant atın. Her tüpü 1 mL tam RPMI'de yeniden askıya alın ve hücreleri hemositometre ile sayın.
- 15 mL konik bir tüpe 3 mL yoğunluk gradyan reaktifi ekleyin ve tüpün kenarına damla yla hücreleri dikkatlice ekleyin. Karıştırmayın. Santrifüj 930 x g 10 dk 4 °C'de; ivme/yavaşlama kullanın: SLOW/SLOW. Tüm ortam ve yoğunluk gradyan reaktifi arasındaki ince orta hücre tabakasını dikkatlice çıkarın ve her hücre türünü ayrı konik tüplere yerleştirin.
- 500 μL komple RPMI'de 1 x 106 AKIC'yi yeniden askıya alın ve 10 μM MM ekleyin. 37 °C'de 3 saat kuluçka, %5 CO2. Hücreleri 500 μL tam RPMI (5 dk için 300 x g) ile üç kez yıkayın. Supernatants atın.
- 500 μL komple RPMI 1 x 106 T hücreleri resuspend. 500 μL'lik hücrelere 2 μg anti-TCRβ Alexa488 etiketli Fab (Clone H57) ekleyin. 37 °C'de 30 dk, %5 CO2kuluçka . Hücreleri 500 μL tam RPMI (5 dk için 300 x g) ile üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra supernatant atın.
NOT: Divalent anti-TCR antikor, T hücre reseptörlerinin divalent antikor la çapraz bağlanmasını önlemek için Fab hazırlık kiti (Malzeme Tablosunabakın) kullanılarak monovalent Fab'a kesildi (bu adım isteğe bağlıdır). - Görüntüleme media 500 μL her iki hücre tipi resuspend (fenol kırmızı-free Leibovitz's L-15 orta ile 10% FBS, 1% penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin).
3. LLSM Günlük Uyumun Yürütülmesi
NOT: (Önemli) Bu hizalama protokolü kullanılan LLSM aletine dayanır (Bkz. Malzemeler Tablosu). Her LLSM farklı olabilir ve farklı hizalama stratejileri, özellikle de ev yapımı olanlar gerektirir. Uygun rutin hizalamayı gerçekleştirin ve bölüm 4'e devam edin.
- LLSM banyosuna (~10 mL hacim) 10 mL su artı 30 μL floresan (1 mg/mL stok) ekleyin, hedefi görüntü konumuna taşımak için Image (Home) tuşuna basın ve tek bir Bessel lazer ışını desenine bakın. Lazer ışınını kılavuzları ve önceden ayarlanmış ilgi bölgesini (ROI) kullanarak hizalayın ve ışını her yönde ince bir desen dengeli hale getirin.
- Işın da bulucu kamera odaklanmış görünmelidir. Ayarlamak için iki ayna eğim ayarlayıcıları, üst mikrometre, odak ve emisyon nesnel yaka kullanın. Doğru hizalanmış ışın için Şekil 2A,B'ye bakın.
- Tamamen floresan kaldırmak için su en az 200 mL ile banyo ve hedefleri yıkayın.
- Görüntüleme medyasındaki görüntü standardı floresan boncuklar (boncukları poli-L-lizin ile 5 mm'lik bir kapak kaymasına yapıştırarak hazırlanır, Malzeme Tablosu'nabakın ; bu önceden hazırlanabilir ve yeniden kullanılabilir) görüntüleme medyasında fiziksel nokta yayma fonksiyonu (PSF) için.
NOT: Daha sonra işleme için görünümünde sadece bir boncuk olabilir, bu nedenle izleyici tek başına bir boncuk bulmaya çalışın veya kolayca tek bir boncuk elde etmek için kırpılmış olabilir.- 'X Galvo aralığı' kutusunda 3'e ayarlayarak deteyi açın. Geçerli alanı görüntülemek için Canlı'ya basın. Kapak fişi ve boncukları bulmak için Z yönünde ilerleyin. Z boyunca hareket ederek bir boncuk merkezi bulun, lazer duraklatmak için Dur tuşuna basın. 3D'yi kontrol edin, Merkez'e basın ve ardından Yürüt'ebasın. Bu verileri toplayacak.
- Eğim aynasını, nesnel yakayı ve odak mikrometresini en yüksek gri değerler için el ile ayarlayın, ardından nesnel tarama, z galvo, z+objective (totPSF) ve örnek tetkik (samplePSF) yakalama modları için uygun desenleri elde etmek için gerektiği gibi ayarlayın. Düzgün ayarlanmış maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIP) için Şekil 2C-F'ye bakın.
NOT: Çeşitli yakalama modları (nesnel tetkik, z galvo, z+objective ve örnek tarası) ışık tabakasının örnekte nasıl hareket ettirolduğunu değiştirir. Hizalama için tüm tetkik modları kullanılmalıdır. - Örnek tama, deneme sırasında verilerin nasıl toplandığını gösterir. Deskewing ve deconvolution için örnek tetkik modunda Execute tuşuna basarak örnek PSF'yi toplayın (bkz. bölüm 5). Lazerleri üç renk moduna (488, 560, 647) değiştirin ve tekrar Çalıştır'a basın.
NOT: LLSM görüntüleri bir açıda (57.2°) olduğundan, "örnek tetkik" modunda çekilen görüntüler bu açıyla toplanır ve bu nedenle "çarpık"tır. De-skewing bu açı için düzeltme ve gerçek bir z-yığınına görüntü "yeniden hizalama" işlemidir. Bu veriler görüntüleme medyasında ve deneme sırasında görüntülenecek tüm kanallarda toplanmalıdır. Bu düzgün toplanmazsa, veriler düzgün şekilde eğriltilmez. Benzer şekilde, ortamın 37 °C 'ye (veya istenilen deneysel sıcaklığa) ısıtıldığından emin olun.
4. LLSM ile Hücrelerin Ayarlanması
- Adım 2,5'ten 5 mm çapındaki dairesel kapak kaymasına kadar adım 2,1'den 10 000 aparat (50 μL) ekleyin ve 10 dakikaya yerleşmelerini bekleyin.
- Örnek tutucuyu yağlayın ve coverslip hücretarafını yukarı doğru ekleyin. Banyoya koymadan önce kabarcıkları önlemek için kapak kapağının arkasına bir damla görüntüleme ortamı ekleyin. Örnek tutucuyu piezoüzerine vidala ve Image (Home)tuşuna basın.
- LLSM ve görüntüleme yazılımının (bkz. Malzemeler Tablosu)düzgün çalıştığından emin olmak için görüntüye bir APC bulun.
NOT: 0,4 μm adım boyutunda 60 z-adım ve 10 ms pozlama ile iki renk için renk ayarlı 3' e ayarlı görüntü, ~200 nm XY ve 400 nm Z çözünürlüğe sahip 3D görüntünün karesi başına 1,54 s ile sonuçlanır. Bu ayarların kullanılan floresan etiketleme tekniğinden alınan hücre boyutuna, istenen z çözünürlüğüne ve sinyal gücüne göre ayarlanması gerekebilir. Lazer güç kullanımı da kullanılan floresan etiketleme tekniğine göre değişir.- Geçerli görüntüyü görüntülemek için Canlı'ya basın. Kapak fişini ve hücreleri bulmak için Z boyunca hareket edin.
- Z yönünde hareket ederek bir APC'nin merkezini bulun ve ardından lazeri duraklatmak için Dur tuşuna basın. 3D'yi kontrol edin ve istediğiniz ayarları girin (bkz. adım 4.3.1), Orta'ya basın ve ardından Yürüt'ebasın. Bu verileri toplayacak.
- Konumu yüklemek için sahneyi düşürün ve görüntüleme ortamına 50°L T hücresi ekleyin (adım 2.5'ten 100.000 hücre) doğrudan kapak kapağının üzerine damla ile. Bu pipet ucu ucunda bir damla formu izin ve daha sonra banyo sıvı ucu dokunmak en iyisidir. "Resim (Return)" seçeneğini tıklayarak sahneyi geri yükseltin.
- Görüntülemeye başla. İstediğiniz yığın boyutunu ve zaman atlamalı uzunluğunu ayarladığından emin olun. Örneğin, resim 60 z-yığınları 0,4 μm adım boyutunda ve giriş 500 zaman dilimleri. (Genellikle) fotobeyazlama önlemek için 500 kare ulaşılmadan önce kayıt durdurun. Hücre çiftleri aramak için Canlı modunu kullanın ve hazır ve istenen ayarlar girildiğinde veri toplamak için Yürüt'e basın. Örnek olarak Film 1 ve Şekil 1'e bakın.
5. Parça Yüzey Dinamiği
- Görüntüleme yazılımındaki verileri dışa aktarın (Bkz. Malzemeler Tablosu). Bu, her renkteki her zaman noktası için z yığını TIF dosyaları oluşturur.
- İlk deskew ve veri deconvolve.
NOT: Biz HHMI Janelia Araştırma Kampüsü18tarafından lisans altında LLSpy boru hattı kullanmak, ancak deskewing ve deconvolution birden fazla görüntüleme yazılımları içinde de mevcuttur (Malzeme Tablosubakınız). - Verileri bleach denbleach.
NOT: Fiji'nin debleach özelliğini histogram eşleştirmesi ile kullanıyoruz (Fiji Yolu: Resim | Ayarla | Çamaşır Suyu Düzeltme | Histogram Eşleştirme | Tamam). - İzleme yazılımına aktarın (Bkz. Malzemeler Tablosu). Yazılım özelliklerine göre parça kümeleri. Örnek olarak Film 2'ye bakın.
NOT: Takip sonuçları kullanılan izleme yazılımına, seçilen algoritmaya, istenen çıkış parametrelerine vb. bağlıdır. Örneğin, yararlandığımız izleme yazılımında (Bkz. Malzemeler Tablosu),TCR kümeleri mükemmel küreler halinde düzenlenmediğinden, her bir özelliği tek bir nokta atamak yerine yazılımın düzensiz şekilleri izlemesine izin vermeyi seçtik. Buna ek olarak, hız, yön, hacim, yoğunluk, alan, konum ve izleme süresi bilgileri de dahil olmak üzere 35 parametre toplamayı seçtik. Ancak, farklı yöntemler veya parametreler farklı soruları yanıtlamak için yararlı olacaktır.- İzleme istenmiyorsa, hiperyığın verilerinden film oluşturmak ve görselleştirmek için Fiji için ClearVolume eklentisini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, birincil fare 5C'nin izolasyon, hazırlık ve görüntülemesini açıklıyoruz. Kafes ışık sayfası mikroskobu kullanan C7 T hücreleri. Bölüm 3 sırasında, mikroskobu doğru hizalamak ve toplama dan sonra verileri deconvolve hangi ile PSF günlük toplamak için zorunludur. Şekil2'de, mikroskobu hizalarken görülecek doğru hizalama görüntülerini gösteririz. Şekil 2A ve Şekil 2B, floresan olarak görüntülendiğinde sırasıyla doğru ışın yolunu ve ışın hizasını gösterir. Amaç tonu, XZ ve YZ projeksiyonlarında mümkün olduğunca simetrik büyük bir X şekli göstermelidir; bu da mümkün olduğunca bir X küçük olarak ayarlanmalıdır (Şekil 2C). Bu esas olarak emisyon hedefi yaka ayarlayarak elde edilir. Z galvo scan XZ ve XY'de her iki tarafta tek bir nokta ile oval göstermelidir (XZ için yukarıda ve aşağıda, YZ için sol ve sağ)(Şekil 2D). Bu esas olarak galvo ayna eğimi ayarlayarak elde edilir, ya manuel ya da yazılım motorlu ayarı ile. Son olarak, hem z+hedef tarar hem de örnek tarar mümkün olduğunca yuvarlak görünen noktagöstermelidir(Şekil 2E ve Şekil 2F, sırasıyla). Bu küçük bir X olabilir, ama bu mümkün olduğunca dimished olmalıdır. Objektif tarak ve z galvo iyi ayarlanmış sayılsa da, ayarlamalar gerekiyorsa, çoğunlukla galvo aynası ile yapılacaktır. Bu hizalama sırasında, yaka ve galvo ayarlı her zaman, odak (emisyon hedefi üzerinde mikrometre) de ayarlanması gerekecektir dikkat etmek önemlidir.
Bu protokolü kullanarak, TR'lerin dört boyutlu dinamiklerini T-hücre yüzeyinde görebiliriz (Şekil 1, Film 1). Bu mikroskobun en büyük avantajı, TC'lerin görselleştirilmiş yüzey birimlerini izleme ve boyutları, hareketleri, sinyal yoğunluğu vb. sayısal veriler elde edebilme yeteneğidir (bkz. Malzeme Tablosu). Film 2 elde edilen parçaların bir örneğini gösterir.
Şekil 1: T hücre-APC Sinaps4 boyutlu görüntüleme. (A) Temsili bir örnek 3D zaman atlamalı LLSM görüntüleri bir T hücresi bir APC ile etkileşim gösteren. Gösterilen TCR (yeşil, anti-TCR-AF488 tarafından etiketlenmiş) bir APC yüzeyinde sunulan antijenler tanıma dinamikleri (kırmızı, sitosolik mCherry). Ölçek çubuğu = 5 μm. Ayrıca bkz: Film 1. (B) Ortogonal XY dilimi (A). Inset, tüm hücrenin başvuru çerçevesidir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Ortogonal YZ dilimi (A). Inset, tüm hücrenin başvuru çerçevesidir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (D) Çift ortogonal dilim (A). Inset tüm hücrenin referans çerçevesidir. Ölçek çubuğu = 5 μm. Ayrıca film 3bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LLSM hizalama. (A) LLSM görüntüleme deneyi için istenilen ışın deseni. (B) Işın hizalama işleminin ekran görüntüsü; solda daraltılmış, odaklanmış kirişi gösteren odak penceresi; sağ üstte, kirişin pencere içinde ortalanmış olduğunu gösteren bir grafik; sağ alt ta ince, odaklanmış bir ışın olmalıdır bulucu kamera. (C) Bir boncuk maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIPs) objektif talan tarafından. (D) Z-galvo tarak bir boncuk maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIPs). (E) Bir boncuk maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIPs) z + objektif talan tarafından. (F) Numune tadına göre bir boncuk maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIPs). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: T hücre sinaps oluşumu. αTCR-AF488 (yeşil) ile etiketlenmiş bir T hücresinin, 1,54 s aralığında 70 zaman puanı üzerinde sitosolik mCherry (kırmızı) ifade eden bir hedef APC ile etkileşiminin iki renkli hacim li işlemesi. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 2: TCR dinamik hareketini izleme. Film 1ile karşılaştırın. Görünür TCR yapılarına karşılık gelen kümeler görüntüleme yazılımı ile zaman içinde 3Boyutlu olarak izlendi. Önceki dört kare üzerinde küme konumlarını gösteren ejderha kuyrukları, yer değiştirme uzunluğuna göre renk kodlanır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film 3: T hücre sinaps ortogonal dilimleri. Film 1 ve Şekil 1B-Dile karşılaştırın. Film 1çift ortogonal dilim , αTCRβ-AF488 Fab gerçekten hücre yüzeyi TUSAŞ etiketleme olduğunu gösteren. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan protokol 5C'den izole edilen CD4+ T hücrelerinin kullanımı için optimize edilmiştir. Kullanılan LLSM cihazındaki C7 transgenik farelerin ve bu nedenle diğer hücre sistemlerinin ve LLSM'lerin farklı şekilde optimize edilmesi gerekebilir. Ancak, bu protokol 4D görüntülemenin gücünü gösterir, çünkü tüm hücredeki bir yüzey reseptörünün dinamiklerini fizyolojik koşullarda en az bozulmaile ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, bu tekniğin birçok olası gelecekteki uygulamaları vardır.
Kritik bir adım hücrelerin uygun bir konsantrasyonda yerleşmek için izin vermektedir. Çok fazla APC coverslip yerleşmek ve çok yoğun hale, sadece tek bir APC ile etkileşim edebilen bir T hücresi bulmak zordur. Bir T hücresi birden fazla sinaps alabildiği zaman, verilerin izlenmesi ve yorumlanması çok karmaşık hale gelebilir. Benzer şekilde, çok az AAP varsa, bir sinaps oluşturan bir T hücresi bulmak da zordur. Elimizde, 50.000 hücrenin 10 dakikaya razı olması optimum yoğunluk sağlar. Ancak, yapışık hücreleri olan bir sistem kullanıyorsanız bu sorun önlenebilir. Hücreler kuvözde, kapaklarla birlikte istenilen bir kesişme ile yetiştirilebilir.
Benzer şekilde, sisteme düşen T hücrelerinin sayısı banyonun büyüklüğüne ve dağabilecekleri mesafeye bağlıdır. Burada kullanılan LLSM sisteminde, sadece 10 mL banyo bulunan sistemin önceki sürümüne göre 12 mL banyo ve 2,5 mL banyo bulunmaktadır. Orijinal floresan görüntüleme için 12 mL banyoyu kullanıyoruz ve hücrelerin görüntülenmesi için 2.5 mL'lik banyoya geçiyoruz. Bu, ışın görselleştirme adımını takiben banyonun daha az kapsamlı yıkanmasına olanak sağlar ve ayrıca her görüntüleme seansı için gerekli T hücrelerinin sayısını düşürür. Buna karşılık, bu kullanıcıların daha az hücre kullanmak için izin verecek.
Etkileşim doğru noktada hücreleri bulmak da bir meydan okumadır. Elimizde, T hücreleri coverslip üzerinde AAP'ler yerleşmek için yaklaşık 2 dakika sürer, bu yüzden AAP'lere yakın dinamik T hücreleri için coverslip aramaya başlamak önemlidir. Bu önemli bir gelişme bulucu kamera LED ışık son eklenmesi olmuştur. Ev yapımı bir sistem kullanıyorsanız, bu özelliği n için tasarıma dahil etmenizi şiddetle öneririz.
Son olarak, floresan etiketleme stratejileri başka önemli bir husustur. Her floresan protein veya boya farklı bir kuantum verimi ve fotobleaching hızı vardır. Floresan boyalar tipik olarak daha parlaktır, ancak hücreler floresan protein etiketli bir molekülle uygun şekilde transkunyon edilmişse, hücre molekülü üretmeye devam ettikçe etiket yenilenir. Bu nedenle, etiketleme stratejisi denemeler tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir faktördür.
Biz teknoloji için gelecekteki yönleri üzerinde bir tartışma ile sonuçlandırmak istiyorum. LLSM ayrıca 150 nm XY çözünürlük ve 280 nm Z çözünürlük ile sonuçlanan yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) yeteneğine sahiptir ve widefield SIM12'denen az 10 kat daha hızlıdır. Bu nedenle, LLSM 4D görüntüleme benzeri görülmemiş hız sağlarken, mevcut süper çözünürlük teknikleri4,5,6mekansal çözünürlük elde edemez. Ancak, bir STED LLSM oluşturulabilirse, bu çözüm geliştirilebilir. Seçici düzlem aydınlatma mikroskobu (STED-SPIM) ile Hafif levha STED ve uyarılmış emisyon tükenmesi kullanılmıştır, ancak LLSM21,22,23,24zamansal çözünürlüğü eksikliği . STED-SPIM bir kafes iã§in uyarlanmıŠsaÄ lana edebilseydik, mevcut tekniklerden daha az fotobeyazlatma ve görüntü daha hızla 50 nm eksenel çözÃ1/4m elde edebilirdik. Bununla birlikte, mevcut mevcut teknolojileri ile, LLSM bize yüksek eksenel çözünürlük ile en hızlı zamansal çözünürlük verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Chicago Üniversitesi'nden Dr. Vytas Bindokas'ın tavsiye ve rehberliğini kabul etmek istiyoruz. Kafes ışık levhamikroskobunu destekleyip koruduğu için Chicago Üniversitesi'ndeki Entegre Işık Mikroskobu Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH Yeni Yenilikçi Ödülü 1DP2AI144245 ve NSF Kariyer Ödülü 1653782 (To J.H.) tarafından desteklenmiştir. J.R. NSF Lisansüstü Araştırma Bursprogramı tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
