Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

Andrew  M. Chiu; Levi Barse; Pavla Hubalkova; Antonio Sanz-Clemente

doi:10.3791/59982

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Article de méthode

Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

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DOI :

10.3791/59982

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2 août 2019

Andrew M. Chiu¹ , Levi Barse¹ , Pavla Hubalkova¹^,² , Antonio Sanz-Clemente¹

¹Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, ²Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

Résumé

Les réponses cellulaires aux stimuli externes dépendent fortement de l'ensemble des récepteurs exprimés à la surface de la cellule à un moment donné. En conséquence, la population de récepteurs exprimés en surface s'adapte constamment et est soumise à des mécanismes stricts de régulation. L'exemple paradigmatique et l'un des événements de trafic les plus étudiés en biologie est le contrôle réglementé de l'expression synaptique des récepteurs du glutamate (GluRs). Les GluRs sont la médiation de la grande majorité de la neurotransmission excitatrice dans le système nerveux central et contrôlent les changements fonctionnels et structurels dépendants de l'activité physiologique aux niveaux synaptique et neuronal (p. ex., plasticité synaptique). Les modifications dans le nombre, l'emplacement, et la composition de sous-unité de la surface exprimée GluRs affectent profondément la fonction neuronale et, en fait, les changements dans ces facteurs sont associés à différentes neuropathies. Présenté ici est une méthode pour étudier le trafic de GluR dans les neurones primaires hippocampiques dissociés. Une approche d'« alimentation par anticorps » est utilisée pour visualiser différemment les populations de GluR exprimées à la surface et aux membranes internes. En étiquetant les récepteurs de surface sur les cellules vivantes et en les fixant à des moments différents pour permettre l'endocytose des récepteurs et/ou le recyclage, ces processus de trafic peuvent être évalués et étudiés de manière sélective. Il s'agit d'un protocole polyvalent qui peut être utilisé en combinaison avec des approches pharmacologiques ou la surexpression des récepteurs modifiés pour obtenir des informations précieuses sur les stimuli et les mécanismes moléculaires affectant le trafic de GluR. De même, il peut être facilement adapté pour étudier d'autres récepteurs ou protéines exprimées en surface.

Introduction

Les cellules utilisent le processus actif de trafic pour mobiliser les protéines à des localisations sous-cellulaires spécifiques et exercer une réglementation spatiotemporal stricte sur leur fonction¹. Ce processus est particulièrement important pour les récepteurs transmembranaires, car les réponses cellulaires à différents stimuli environnementaux reposent sur des cascades intracellulaires déclenchées par l'activation des récepteurs. Les cellules sont capables de modifier ces réponses en modifiant la densité, la localisation et la composition sous-unité des récepteurs exprimés à la surface des cellules par le biais de la régulation du trafic....