توضح هذه المقالة بروتوكولًا لتوليد خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد، وتوسيعها في المختبر، بهدف إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا T الوظيفية لاستخدامها في المختبر وفي الجسم الحي.
يتميز مرض السكري من النوع 1 (T1D) بالحصانة الذاتية الخاصة بالأنواع مما يؤدي إلى تدمير خلايا بيتا والفقدان المطلق لإنتاج الأنسولين. في نموذج الماوس غير السمنة التلقائي ة مرض السكري (NOD)، الأنسولين هو الهدف الرئيسي، والتلاعب الوراثي لهذه الحيوانات لإزالة epitope الأنسولين مفتاح واحد يمنع المرض. وهكذا، فإن القضاء الانتقائي على المستضد المهني للخلايا المقدمة (APCs) التي تحمل هذا الظهارة المسببة للأمراض هو نهج لمنع استجابات المناعة الذاتية غير المرغوب فيها الخاصة بالأنسولين، ومن المرجح أن يكون لديه إمكانات أكبر للترجمة.
يمكن لمستقبلات مستضد الشميري (CARs) إعادة توجيه الخلايا T لاستهداف المستضدات المسببة للأمراض بشكل انتقائي. هذه التقنية أساسية للمحاولات الأخيرة لاستخدام الهندسة الخلوية لعلاج الخلايا بالتبني لعلاج السرطانات المتعددة. في هذا البروتوكول، ونحن نصف الأمثل T-خلية الرجعية (RV) transduction وبروتوكول التوسع في المختبر الذي يولد أعدادا كبيرة من الخلايا وظيفية مستضد محدد CD8 CAR-T بدءا من عدد قليل من الخلايا السذاجة. وقد تم وصف بروتوكولات خلايا CAR-T متعددة في السابق، ولكن عادة مع كفاءة تحويل منخفضة نسبيا وصلاحية الخلية بعد التحويل. وعلى النقيض من ذلك، يوفر بروتوكولنا ما يصل إلى 90٪ من كفاءة التحويل، والخلايا التي تم إنشاؤها يمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من أسبوعين في الجسم الحي وتأخير كبير بداية المرض بعد ضخ واحد. نحن نقدم وصفا مفصلا لصيانة الخلايا وبروتوكول التحويل، بحيث يمكن اتباع الخطوات الحرجة بسهولة. يمكن تنفيذ الإجراء بأكمله من عزل الخلية الأساسية إلى تعبير CAR في غضون 14 يومًا. يمكن تطبيق الطريقة العامة على أي نموذج مرض الماوس الذي يعرف الهدف. وبالمثل، فإن التطبيق المحدد (الذي يستهدف مركباً من الفئة الثانية للبببتيد المسبب للأمراض) ينطبق على أي نموذج آخر من نماذج أمراض المناعة الذاتية التي تم تحديد مركب رئيسي لها.
وبالنظر إلى احتمال انخفاض خطر الآثار غير المرغوب فيها خارج الهدف، فإن العلاجات المناعية الخاصة بالمستضد (ASI) هي علاجات واعدة لأمراض المناعة الذاتية مثل T1D. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الاستجابات المناعية للأنسولين (بريبرو) قد تكون ذات أهمية خاصة في T1D1. في العقد الماضي، والدراسات من مجموعات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، تشير بقوة إلى أن تقديم epitope التي تحتوي على الأنسولين B سلسلة الأحماض الأمينية 9 إلى 23 من قبل جزيئات محددة MHC الفئة الثانية (B:9-23/MHCII)، يلعب دورا هاما في تطوير T1D في الفئران والبشر2،3،4،5. لاستهداف مجمع B:9-23/MHCII بشكل انتقائي، قمنا بإنشاء جسم مضاد أحادي النسيلة، اسمه mAb287، ليس لديه تفاعل متقاطع مع هرمون الأنسولين أو المجمعات التي تحتوي على ببتيدات أخرى6. MAb287 كتل عرض مستضد في المختبر، والإدارة الأسبوعية من mAb287 إلى الفئران NOD ما قبل السكري تأخر تطوير T1D في 35٪ من الفئران المعالجة6. لمنع عرض مستضد في الجسم الحي, وعادة ما تكون هناك حاجة إلى الحقن المتكررة من أجل الحفاظ على تركيز تعميم عالية. افترضنا أننا يمكن التغلب على هذه الصعوبة من خلال الاستفادة من خصوصية عالية من Ab287 لإعادة برمجة الخلايا T، وبالتالي توفير تحسين العلاج بالخلايا T مستضد محددة لT1D7.
ويقال أن الخلايا T السامة للخلايا لتكون قادرة على قتل هدفهم إذا تم التعبير عن حتى نسخة واحدة من ligand كونيت8،9،10. وهكذا، B:9-23/MHCII خلايا CD8 T محددة من المتوقع أن يكون أعلى كفاءة في القضاء على العرض التقديمي مستضد غير المرغوب فيه من الأجسام المضادة الأم، والتي من المرجح أن تحتاج إلى ربط إلى مجمعات متعددة على نفس APC لممارسة تأثيرها. وقد استخدمت خلايا CAR T لعلاج السرطانات البشرية المتعددة11،12،13،ويمكن أيضا أن تكون فعالة في المناعة الذاتية14. ومع ذلك، لم يتم استخدام خلايا CAR-T مع خصوصية لمجمعات الببتيد-MHC المسببة للأمراض حتى الآن لتعديل تطور T1D. باستخدام تقنية نقل الخلايا CD8 T الأمثل الموضحة أدناه، أظهرنا مؤخرًا إثباتًا للمبدأ بأن هذا يمثل في الواقع نهجًا قابلًا للتطبيق7.
وفي هذا البروتوكول، نحدد طريقة فعالة ومبسطة للتنقل والتوسع. بروتوكولنا ينطبق على دراسات أخرى تتطلب توليد الماوس CD8 CAR T الخلايا مع كفاءة عالية.
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لإنتاج خلايا CD8 CAR-T الخاصة بالمستضد عن طريق الانكلب الفيروسي. كفاءة نقل بروتوكولنا عادة عالية، ويلاحظ عموما التعبير القوي عن جمهورية أفريقيا الوسطى. تحتفظ خلايا CAR T الموسعة بالميزات الأساسية للخلايا T التي يتم تنشيطها من قبل الوالدين، وخصوصية الأجسام المضاد…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل JDRF المنح 1-INO-2015-74-S-B، 2-SRA-2016-238-S-B، و SRA-2-S-2018-648-S-B، جائزة التعليم والعمل في مجال مرض السكري، وصندوق كارولين ويس القانوني للبحوث في الطب الجزيئي في كلية بايلور للطب. تم دعم فرز الخلايا من قبل علم الخلايا وخلية فرز الأساسية في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (S10RR024574 و P30CA125123). تم الحصول على جميع رباعيات الببتيد MHC من مرفق نواه رباعي النواة.
2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
BSA | Sigma | A7030 | |
Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
pMIG II | Addgene | 52107 | |
pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Tryple | Gibco | 12605-028 |