מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.
סוכרת סוג 1 (T1D) מאופיין על ידי החסינות העצמית הספציפית איון המוביל הרס תא ביתא ואובדן מוחלט של ייצור האינסולין. במודל העכבר הספונטני ללא שמנים (נוד), האינסולין הוא היעד העיקרי, ומניפולציה גנטית של בעלי חיים אלה כדי להסיר אפירופה של אינסולין מפתח אחד מונע מחלות. כך, חיסול סלקטיבית של אנטיגן מקצועי הצגת התאים (APCs) הנושאת את האפירופה הפתוגניים הזאת היא גישה לעכב את התגובות בלתי רצויות החיסון האוטואימוניות הספציפי, וסביר להניח שיש פוטנציאל טרנסלטילי גדול יותר.
כימאריק קולטני אנטיגן (מכוניות) יכול לנתב מחדש את תאי T ליעד סלקטיבי מחלות הגורמות אנטיגנים. טכניקה זו היא בסיסית לניסיונות האחרונים להשתמש הנדסה סלולרית לטיפול בתאי המאמצת לטיפול בסוגי סרטן מרובים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים ממוטב וירוס T-cell (RV) התמרה ו בפרוטוקול הרחבה מחוץ לגופית המפיקה מספר גבוה של תאים אנטיגן ספציפי CD8-T הספציפיים המתחילים ממספר נמוך של תאים תמימים. בעבר הפרוטוקולים מרובים תא T שתוארו, אבל בדרך כלל עם יעילות התמרה נמוכה יחסית ואת הכדאיות התאים הבאים התמרה. לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מספק עד 90% יעילות התמרה, ואת התאים שנוצר יכול לשרוד יותר משבועיים בvivo ולעכב באופן משמעותי את התפרצות המחלה בעקבות אינפוזיה אחת. אנו מספקים תיאור מפורט של תחזוקת התא ופרוטוקול התמרה, כך שהשלבים הקריטיים ניתן לעקוב בקלות. ההליך כולו מבידוד התא הראשי לביטוי רכב ניתן לבצע בתוך 14 ימים. ניתן להחיל את השיטה הכללית על כל מודל מחלת העכבר שבו היעד ידוע. באופן דומה, היישום הספציפי (המיקוד של מורכבות מסוג פפטיד/MHC class II) חל על כל מודל אחר של מחלות אוטואימוניות שעבורן זוהתה מתחם מפתח.
בהינתן סיכון מופחת סביר של תופעות לא רצויות מחוץ ליעד, אנטיגן ספציפי טיפולים חיסוניים (ASI) מבטיחים טיפולים למחלות אוטואימוניות כגון T1D. צבירת ראיות עולה כי תגובות החיסון (prepro) אינסולין עשוי להיות חשוב במיוחד ב T1D1. בעשור האחרון, מחקרים מקבוצות מרובות, כולל שלנו, מציעים בחריפות כי הצגת אפירופה המכיל את חומצות אמינו שרשרת אינסולין B 9 עד 23 על ידי מולקולות ספציפיות mhc class II (ב: 9-23/mhcii), ממלא תפקיד חשוב בפיתוח T1D ב . עכברים ואנשים2,3,4,5 כדי באופן סלקטיבי למקד את B: 9-23/MHCII קומפלקס, יצרנו נוגדן חד שבטיים, בשם mAb287, כי אין לו לחצות את ההורמון אינסולין או מכלולי מתחמים המכילים פפטידים אחרים6. MAb287 חוסם אנטיגן מצגת בתחום החוץ, והמינהל השבועי של mAb287 כדי לקדם סוכרת עכברים הנהון הפיתוח של T1D ב 35% העכברים שטופלו6. כדי לחסום את המצגת אנטיגן ב vivo, זריקות תכופות נדרשים בדרך כלל כדי לשמור על ריכוז במחזור גבוה. אנו שיערו כי אנחנו יכולים להתגבר על הקושי הזה על ידי ניצול של הספציפיות של Ab287 כדי לתכנת מראש את התאים T, ובכך לספק טיפול משופר אנטיגן תא T עבור T1D7.
תאים T ציטוטוקסיים דיווחו להיות מסוגלים להרוג את היעד שלהם אם אפילו עותק אחד של קנצוני שלהם ליגנד מבוטא8,9,10. לפיכך, B: 9-23/MHCII CD8 T ספציפי תאים צפויים להיות יעילות גבוהה יותר ביטול מצגת אנטיגן לא רצויות מאשר הנוגדן ההורה, אשר ככל הנראה צריך לאגד מתחמים מרובים על הנגמ אותו כדי להפעיל את השפעתו. תאי T מכונית שימשו לטיפול בסרטן אנושי מרובים11,12,13, וייתכן גם יעיל בחסינות עצמית14. עם זאת, מכונית-T תאים עם ספציפיות עבור מכלולי פפטיד-MHC הפתוגניים לא עד כה שימשו כדי לשנות את ההתקדמות של T1D. באמצעות טכניקת התמרה ממוטבת של CD8 T המתוארים להלן, הדגמנו לאחרונה הוכחת העיקרון שזה אכן מייצג גישה בת7.
בפרוטוקול זה אנו מתווה התמרה ושיטת התרחבות יעילה ומפושטת. הפרוטוקול שלנו חל על מחקרים אחרים הדורשים את הדור של העכבר CD8 T תאים עם יעילות גבוהה.
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להפקת תאים CD8-T ספציפיים אנטיגן על-ידי התמרה ויראלית. יעילות התמרה של הפרוטוקול שלנו היא בדרך כלל גבוהה, וביטוי חזק של המכונית הוא נצפתה בדרך כלל. תאי T רכב מורחב לשמור את התכונות החיוניות של התאים המופעל על-ידי ההורה, וספציפיות נוגדנים, ומתאימים הן בתוך מבחנה והן ?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה היה נתמך על ידי JDRF מענקים 1-INO-2015-74-S-B, 2-סרה-2016-238-S-B, והסרה-2-S-2018-648-S-B, החינוך סוכרת הפרס פעולה, ואת החוק קרוליין Wiess למחקר ברפואה מולקולרית ביילור המכללה לרפואה. מיון התא היה נתמך על ידי Cy, ליבת מיון התא ביילור המכללה לרפואה עם מימון NIH (S10RR024574 ו P30CA125123). כל ה-פפטיד-MHC טמרס הושגו ממתקן הליבה של NIH טטרמר.
2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
BSA | Sigma | A7030 | |
Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
pMIG II | Addgene | 52107 | |
pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Tryple | Gibco | 12605-028 |