Denna artikel beskriver ett protokoll för generering av antigen-specifika CD8 T-celler, och deras expansion in vitro, i syfte att ge ett stort antal funktionella T-celler för användning in vitro-och in vivo.
Typ 1-diabetes (T1D) kännetecknas av Holmen-specifik autoimmunitet leder till beta cell förstörelse och absolut förlust av insulinproduktion. I den spontana icke-feta diabetes (NOD) musmodell, insulin är det primära målet, och genetisk manipulation av dessa djur för att ta bort en enda nyckel insulin epitop förhindrar sjukdom. Sålunda, selektiv eliminering av professionella antigen presenterande celler (APCs) med denna patogena epitop är ett sätt att hämma oönskade insulinspecifika autoimmuna reaktioner, och sannolikt har större translationell potential.
Chimeric antigen receptorer (bilar) kan omdirigera T-celler för att selektivt rikta sjukdomsframkallande antigener. Denna teknik är grundläggande för de senaste försöken att använda cellulära teknik för adoptiv cellterapi för att behandla flera cancerformer. I detta protokoll, beskriver vi en optimerad T-cell retrovirus (RV) signaltransduktion och in vitro expansions protokoll som genererar ett stort antal funktionella antigen-specifika CD8 bil-T-celler från ett lågt antal naiva celler. Tidigare har flera bil-T cell protokoll beskrivits, men typiskt med relativt låg transduktionseffektivitet och cellernas lönsamhet efter transduktion. I kontrast, vårt protokoll ger upp till 90% signaltransduktion effektivitet, och de celler som genereras kan överleva mer än två veckor in vivo och signifikant fördröja sjukdomsdebut efter en enda infusion. Vi ger en detaljerad beskrivning av cell underhåll och transduktionsprotokoll, så att de kritiska stegen lätt kan följas. Hela proceduren från primär cell isolering till bil uttryck kan utföras inom 14 dagar. Den generella metoden kan tillämpas på alla mus sjukdomsmodeller där målet är känt. På samma sätt är den specifika tillämpningen (som riktar sig till en patogena peptid/MHC klass II-komplex) tillämplig på alla andra autoimmuna sjukdomsmodeller för vilka ett nyckel komplex har identifierats.
Med tanke på den sannolika minskade risken för oönskade off-Target effekter, antigen-specifika immunterapier (ASI) är lovande behandlingar för autoimmuna sjukdomar som T1D. Ackumulerande bevis antyder att immunsvar till (prepro) insulin kan vara särskilt viktigt i T1D1. Under det senaste decenniet, studier från flera grupper, inklusive vår egen, starkt tyder på att presentationen av en epitop innehållande insulin B-kedjan aminosyror 9 till 23 av specifika MHC klass II molekyler (B: 9-23/MHCII), spelar en viktig roll i utvecklingen av T1D i möss och människor2,3,4,5. För att selektivt inrikta sig på B: 9-23/MHCII-komplexet genererade vi en monoklonal antikropp, kallad mAb287, som inte har någon kors reaktivitet till hormonet insulin eller komplex som innehåller andra peptider6. MAb287 blockerar antigen presentation in vitro, och veckovis administrering av mAb287 till pre-diabetiker NOD möss fördröjde utvecklingen av T1D i 35% av de behandlade möss6. För att blockera antigen presentation in vivo krävs ofta injektioner för att bibehålla en hög cirkulerande koncentration. Vi hypotes om att vi kunde övervinna denna svårighet genom att dra nytta av den höga specificitet Ab287 att programmera T-celler, vilket ger en förbättrad antigen-specifik T-cellterapi för T1D7.
Cytotoxiska T-celler rapporteras kunna döda sina mål om ens en enda kopia av deras besläktat ligand uttrycks8,9,10. Sålunda, B: 9-23/MHCII specifika CD8 T celler förväntas ha högre effektivitet i att eliminera oönskade antigen presentationen än den överordnade antikroppen, som sannolikt kommer att behöva binda till flera komplex på samma APC att utöva sin effekt. Bil T-celler har använts för behandling av flera mänskliga cancerformer11,12,13, och kan också vara effektiv i autoimmunitet14. Emellertid, CAR-T-celler med specificitet för patogena peptid-MHC-komplex har hittills inte använts för att ändra utvecklingen av T1D. Genom att använda den optimerade CD8 T cell signaltransduktion teknik som beskrivs nedan, vi nyligen visat bevis för principen att detta verkligen utgör en livskraftig metod7.
I detta protokoll skisserar vi en effektiv och strömlinjeformad transduktion och expansions metod. Vårt protokoll är tillämplig på andra studier som kräver generering av mus CD8 bil T-celler med hög verkningsgrad.
Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att producera antigen-specifika CD8 CAR-T-celler genom antiretrovirala transduktion. Transduktionseffektiviteten i vårt protokoll är typiskt hög, och robust uttryck för bilen är i allmänhet observeras. De utökade bil T-cellerna behåller de viktigaste funktionerna hos de moder-aktiverade T-cellerna och antikroppselektivitet, och lämpar sig för både in vitro-och in vivo-användning. Vi har tillämpat AB-bil CD8 T celler i reprogramming typ 1 diabetes i NOD möss<s…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, och SRA-2-S-2018-648-S-B, en diabetes utbildning och åtgärder Award, och Caroline Wiess Law Fund för forskning inom molekylär medicin vid Baylor College of Medicine. Cell sortering stöddes av Cytometry och cell sortering kärna vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (S10RR024574 och P30CA125123). Alla peptid-MHC tetramer erhölls från NIH tetramer Core facility.
2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
BSA | Sigma | A7030 | |
Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
pMIG II | Addgene | 52107 | |
pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Tryple | Gibco | 12605-028 |