Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Högeffektiv generering av antigen-specifika primära mus cytotoxiska T-celler för funktionell testning i en autoimmun diabetes modell

doi: 10.3791/59985 Published: August 16, 2019

Summary

Denna artikel beskriver ett protokoll för generering av antigen-specifika CD8 T-celler, och deras expansion in vitro, i syfte att ge ett stort antal funktionella T-celler för användning in vitro-och in vivo.

Abstract

Typ 1-diabetes (T1D) kännetecknas av Holmen-specifik autoimmunitet leder till beta cell förstörelse och absolut förlust av insulinproduktion. I den spontana icke-feta diabetes (NOD) musmodell, insulin är det primära målet, och genetisk manipulation av dessa djur för att ta bort en enda nyckel insulin epitop förhindrar sjukdom. Sålunda, selektiv eliminering av professionella antigen presenterande celler (APCs) med denna patogena epitop är ett sätt att hämma oönskade insulinspecifika autoimmuna reaktioner, och sannolikt har större translationell potential.

Chimeric antigen receptorer (bilar) kan omdirigera T-celler för att selektivt rikta sjukdomsframkallande antigener. Denna teknik är grundläggande för de senaste försöken att använda cellulära teknik för adoptiv cellterapi för att behandla flera cancerformer. I detta protokoll, beskriver vi en optimerad T-cell retrovirus (RV) signaltransduktion och in vitro expansions protokoll som genererar ett stort antal funktionella antigen-specifika CD8 bil-T-celler från ett lågt antal naiva celler. Tidigare har flera bil-T cell protokoll beskrivits, men typiskt med relativt låg transduktionseffektivitet och cellernas lönsamhet efter transduktion. I kontrast, vårt protokoll ger upp till 90% signaltransduktion effektivitet, och de celler som genereras kan överleva mer än två veckor in vivo och signifikant fördröja sjukdomsdebut efter en enda infusion. Vi ger en detaljerad beskrivning av cell underhåll och transduktionsprotokoll, så att de kritiska stegen lätt kan följas. Hela proceduren från primär cell isolering till bil uttryck kan utföras inom 14 dagar. Den generella metoden kan tillämpas på alla mus sjukdomsmodeller där målet är känt. På samma sätt är den specifika tillämpningen (som riktar sig till en patogena peptid/MHC klass II-komplex) tillämplig på alla andra autoimmuna sjukdomsmodeller för vilka ett nyckel komplex har identifierats.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med tanke på den sannolika minskade risken för oönskade off-Target effekter, antigen-specifika immunterapier (ASI) är lovande behandlingar för autoimmuna sjukdomar som T1D. Ackumulerande bevis antyder att immunsvar till (prepro) insulin kan vara särskilt viktigt i T1D1. Under det senaste decenniet, studier från flera grupper, inklusive vår egen, starkt tyder på att presentationen av en epitop innehållande insulin B-kedjan aminosyror 9 till 23 av specifika MHC klass II molekyler (B: 9-23/MHCII), spelar en viktig roll i utvecklingen av T1D i möss och människor2,3,4,5. För att selektivt inrikta sig på B: 9-23/MHCII-komplexet genererade vi en monoklonal antikropp, kallad mAb287, som inte har någon kors reaktivitet till hormonet insulin eller komplex som innehåller andra peptider6. MAb287 blockerar antigen presentation in vitro, och veckovis administrering av mAb287 till pre-diabetiker NOD möss fördröjde utvecklingen av T1D i 35% av de behandlade möss6. För att blockera antigen presentation in vivo krävs ofta injektioner för att bibehålla en hög cirkulerande koncentration. Vi hypotes om att vi kunde övervinna denna svårighet genom att dra nytta av den höga specificitet Ab287 att programmera T-celler, vilket ger en förbättrad antigen-specifik T-cellterapi för T1D7.

Cytotoxiska T-celler rapporteras kunna döda sina mål om ens en enda kopia av deras besläktat ligand uttrycks8,9,10. Sålunda, B: 9-23/MHCII specifika CD8 T celler förväntas ha högre effektivitet i att eliminera oönskade antigen presentationen än den överordnade antikroppen, som sannolikt kommer att behöva binda till flera komplex på samma APC att utöva sin effekt. Bil T-celler har använts för behandling av flera mänskliga cancerformer11,12,13, och kan också vara effektiv i autoimmunitet14. Emellertid, CAR-T-celler med specificitet för patogena peptid-MHC-komplex har hittills inte använts för att ändra utvecklingen av T1D. Genom att använda den optimerade CD8 T cell signaltransduktion teknik som beskrivs nedan, vi nyligen visat bevis för principen att detta verkligen utgör en livskraftig metod7.

I detta protokoll skisserar vi en effektiv och strömlinjeformad transduktion och expansions metod. Vårt protokoll är tillämplig på andra studier som kräver generering av mus CD8 bil T-celler med hög verkningsgrad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Möss upprätthölls under särskilda patogenfria förhållanden vid en transgen mus anläggning, och alla djurförsök utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Baylor College of Medicine djuromsorg och användnings kommitté.

Anmärkning: experimentet kräver att förbereda viruset och T-celler parallellt. I tabell 1 sammanfattas protokollet. Nyckelreagenser och buffertar listas i material tabellen. Vi fokuserar på generering och utbyggnad av bil-T-celler riktade mot specifika populationer av APCs i detta protokoll.

1. generering och validering av enkedjiga fab-antikroppar (scFab)-bilar.

Obs: bilar innehåller vanligtvis 3 kritiska domäner-en antigen målgrupp, en spacer/transmembrandomän, och en cytoplasmisk signalering domän. Den exakta utformningen av varje bil beror på det avsedda målet, och så, bortsett från de viktigaste inslagen i konstruktionen som är relevant för generering av retrovirus, kommer inte att beskrivas i detalj i detta protokoll. Den övergripande utformningen av bilarna som används för de studier som beskrivs nedan visas i figur 1. I korthet omfattar måldomänen hela ljus kedjan och den variabla och CH1-domänen i den tunga kedjan från den överordnade monoklonala antikroppen som är knuten till en halv styv länkare. Distansen/transmembrandomänen är från Mouse CD28 och signal domänen är en fusion som innehåller element från mus CD28, CD137 (4-1BB) och CD247 (CD3ζ). Dessa element är sammansatta av standard molekylära biologi förfaranden såsom skarvar överlappning polymeras kedjereaktion (PCR), eller syntesen av ett lämpligt "gen block". Detaljer om generationen av mAB287-bilen finns i Zhang et al.7. CDNA-sekvenserna kan erhållas från författarna på begäran.

  1. Montering av bil konstruktionen
    1. Syntetisera inriktningen enda kedja fab antikropp (scFab) och kombinerade spacer/signalering domäner separat, och använda en "3 punkt" ligering teknik15 för att montera den slutliga konstruktionen (figur 1).
      Obs: det viktigaste kravet för bil insatsen är att det bör innehålla kompletterande begränsning Endonuklease platser som tillåter ligering i retrovirala uttrycket Vector pMSCV-IRES-GFP II (pmig II), eller ett relaterat derivat15 är också Lämpliga.
  2. Validering av BILENS ytuttryck
    1. Transduce de Hybridomteknik cellerna med hjälp av pmig II härledda retrovirala partiklar som genereras av ett standardprotokoll (t. ex. Holst et al.16).
    2. Kör flödescytometri analys för att upptäcka uttrycket av GFP från bil Vector17.
    3. Fläcken ytbehandlar uttryck av bilen av den sensorik hybridomceller med märkta antikroppar mot musen κ kedjan (t. ex., klon RMK-45)17.
      Anmärkning: 18.
  3. Validering av BILSPECIFICITET
    1. Stimulera de omvandade hybridomerna med lämpliga plattbundna eller cellulära antigener. Efter övernattning Co-kultur samla samman supernatanterna och utsöndras cytokiner, och analyseras med enzymkopplad immunosorbent assay (Elisa)7.
      Märk: helst bör varje bil vara oberoende validerad innan den används för transduktion. I det här steget kan experimentet pausas och startas om senare.

2. transfektion av virala producent celler (dag-4 till dag 3)

Obs: retrovirus produceras med hjälp av Phoenix-Eco celler (se tabellen av material)19,20. Använd lämpliga försiktighetsåtgärder för generering av potentiellt infektiösa agens (företrädesvis inklusive en utsedd BSL-2 skåp och separat inkubator för odling transfected/transduced celler).

  1. Upptining Phoenix celler (dag-4)
    1. Tina 2 x 106 Phoenix-Eco celler. Skala upp antalet Phoenix-celler om flera transduktioner planeras.
    2. Platta dem i en 10 cm vävnad kultur skålen med 10 mL medium (Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10% fetalt kalv serum (FCS)).
  2. Passage Phoenix celler (dag-3)
    1. Ta bort medium, och tvätta med 5 mL av Dulbecco s fosfat-buffrad saltlösning (DPBS).
    2. Tillsätt 3 mL 0,25% trypsin och inkubera vid 37 ° c under 10% CO2 atmosfär i 3 min.
    3. Skörda cellerna sedan pellets genom centrifugering för 3 min vid 200 x g. Re-Plate celler med 10 mL färskt medium och inkubera vid 37 ° c.
  3. Bestrålning av Phoenix celler (dag-1 eftermiddag)
    1. För att minimera ytterligare celldelning, samla Phoenix celler som beskrivs i steg 2,2, Omsuspendera i 5 ml medium, och gamma bestråla celler på is (1000 rad).
      Anmärkning: försiktighet bör iakttas vid strålningsarbete för att undvika exponering av personalen.
    2. Centrifugera de bestrålade cellerna, Omsuspendera i färskt medium, platta vid 2 x 106 celler (i 10 ml medium)/Plate/bil, och inkubera.
  4. Transfektion (dag 0-förmiddag)
    1. Aspirera supernatanten från Phoenix-cellerna, tvätta med 5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt försiktigt 7 mL reducerat serum medium (t. ex. Opti-MEM) droppvis till plattans sidovägg för att undvika att störa monolayer. Överför celler tillbaka till inkubator.
    2. Ta 2 14 mL runda botten Polypropenrör, och tillsätt 1,5 mL reducerat serum medium till varje. Till ett rör, tillsätt 40 μL transfektionsreagens (se material tabellen).
    3. Till det andra röret, tillsätt 15 μg AB-CAR-plasmid (genereras i steg 1) och 5 μg kuvert och förpackning plasmid (5 μg pCL-Eco). Inkubera rören i rumstemperatur i 5 min.
    4. Lägg till transfektionsreagensblandningen från steg 2.4.2 till det andra röret utan att kontakta rör sidorna och blanda genom att Pipettera lösningen upp och ned försiktigt 3 gånger. Inkubera i rumstemperatur i minst 20 minuter.
    5. Tillsätt 3 mL av blandningen droppvis till Phoenix celler, och placera i en vävnadsodling inkubator.
    6. Efter 4 – 5 h tillsätt 1 mL FCS. Kultur celler över natten vid 37 ° c.
  5. Medium förändring (dag 1)
    1. Avlägsna supernatanten som innehåller plasmid/transfektionreagens-komplexen och kassera dem i enlighet med institutionella förfaranden för hantering av smittat material. Tillsätt 4 mL färskt, förvärmda odlingssubstrat till cellerna.
  6. Skörde virus för transduktion (dag 2)
    1. Samla in viruset som innehåller mediet från Phoenix-celler med en steril spruta, filter (0,45 μm) för att ta bort rester av Cellrester, och samla i ett nytt rör.
    2. Tillsätt rhIL-2 lager till en slutlig koncentration av 200 IU/mL. Använd viruset omedelbart för transduktion (steg 5,3). Tillsätt 4 mL färskt medium till Phoenix cellerna och placera i inkubatorn.
  7. Upprepa virus insamling (dag 3)
    1. Upprepa steg 2,6, men kassera Phoenix-celler som smittsamt avfall istället för att lägga till färskt medium. Denna supernatanten används i steg 5,4.

3. primära CD8 T cell isolering och aktivering (dag-1 till dag 0)

Notera: tidigare, samla in CD8 T-celler från honnicka möss vid 4 – 5 veckor, en tidpunkt innan ö-inflammation börjar21,22. Hantera alla möss efter IACUC godkända protokoll. CD8 T-celler är berikade från splenocyter med en kommersiell negativ Selection kit.

  1. Beläggning plattor med CD3/CD28 antikroppar (dag-1)
    1. Tillsätt 1 mL av en blandning av anti-Mouse CD3 och CD28 antikroppar (båda på 1 μg/mL i PBS) till varje brunn av en 24-brunn tallrik, och inkubera vid 4 ° c över natten.
    2. Nästa dag, tvätta plattorna med 1 mL steril PBS 3 gånger innan du lägger till murina CD8 T-celler (steg 4,1).
      Obs: antalet brunnar som ska beläggas varierar för varje experiment, beroende på det totala antalet aktiverade CD8 T-celler som krävs.
  2. Insamling av splenocyter (dag 0)
    1. Euthanize två nicka honmöss i åldrarna 4 – 5 veckor med CO2 inandning följt av halshuggning. Skörda mjälte och sätta dem på en cell SIL blötläggning i 10 ml PBS i en cellkultur skålen på isen.
    2. I en cellkultur huva, skär varje mjälte i 3-5 bitar, tryck vävnader med en steril kolv på en 3 eller 5 mL spruta för att tvinga mjältfragment isär och tillåta celler att passera genom trådnät.
    3. Ta försiktigt bort röda blodkroppar genom att reomera splenocyter i 1:4 utspädd röd cell lysis buffert (1 mL lysbuffert i 3 mL PBS för en mjälte), och inkuberas i 5 min vid rumstemperatur.
    4. Späd sedan 10 μL av cellsuspensionen med trypan Blue Dye lösning för att räkna celler med en hemocytometer, och pellets resten av cellerna genom centrifugering vid 350 x g för 7 min.
  3. Berikning av CD8 T-celler (dag 0)
    1. Berika CD8 T celler av negativa val med hjälp av en mus CD8 T cell isolering kit, enligt tillverkarens anvisningar.
      Anmärkning: för att säkerställa hög renhet alltid runda upp cellnumren vid beräkning av volymen av biotinylated-antikropp som skall tillsättas (t. ex., Använd volymen av reagens föreslås för 108 celler för en beräknad 9,1 x 107 celler).
    2. Suspendera cell pellets i 400 μL buffert och 100 μL biotin-antikroppscocktail per 1 x 108 celler, blanda väl och inkubera i 5 min i kylskåpet (4 ° c) för att tillåta antikroppsbindning.
    3. Tillsätt 300 μL etiketteringsbuffert och 200 μL antibiotin Micro-beads per 1 x 108 celler, blanda väl och inkubera i 10 min vid 4 ° c.
    4. I väntan på mikro-pärla bindning, ställa in separations kolumnen på separatorn. Tvätta kolonnen genom att skölja med 3 mL etiketteringsbuffert.
    5. Passera 1000 μL av pärla/cell blandning genom en 40 μm cell SIL innan lastning på separations pelaren för att ta bort cell aggregat. Samla kolonnen flöde-igenom i en pre-kyld 15 mL tub.
    6. Tvätta kolonnen enligt tillverkarens anvisningar och samla alla utsläpp i samma rör. Bestäm cell nummer (samma som steg 3.2.4) och samla in genom centrifugering vid 350 x g i 5 min. Tvätta cellerna genom att omlägga i 2 ml komplett T-cellsmedium (rpmi-1640 innehållande FCS, 2-merkaptoetanol, rhil-2 (200 U/ml), mil-7 (0,5 ng/ml), , HEPES och penicillin-streptomycin) och centrifugering vid 350 x g i 5 min.
    7. Omsuspendera cellerna i förvärmda (37 ° c) komplett T cell medium vid en koncentration av 0,25 – 0,5 x 106/ml.

4. T cell aktivering (dag 0 till 2)

  1. Tillsätt 2 mL av cellsuspensionen (0,25 – 0,5 x 106/ml) till varje belagd brunn på den CD3/CD28 antikropp belagda 24-brunn plattan från steg 3.1.2. Använd en virvlande rörelse för att fördela cellerna jämnt.
    Anmärkningar: Lägg till cellerna med en virvlande rörelse för att fördela dem jämnt och minimera kanteffekter. Om cellerna klustret längs kanten av brunnarna, både transduktionshastigheten och cellernas lönsamhet kommer att minskas.
  2. Som en kontroll, plattan samma antal CD8 T-celler till en enda icke-belagd brunn av plattan. Inkubera cellerna vid 37 ° c med en 10% CO2 gasad inkubator för 48 h.
    Anmärkning: efter 48 h, aktivering kan bekräftas med hjälp av ett Mikroskop; de aktiverade cellerna kommer att vara större än de celler som inte stöter på anti-CD3/CD28 antikroppar.

[placera figur 2 här]

5. transduktion av aktiverade CD8 T-celler (dag 1 till 3)

Anmärkning: detta protokoll använder en spin-transduktionmetod. En centrifug med en sväng-ut rotor och vävnad odlingsplattan adaptrar som kan upprätthålla en inre temperatur på 37 ° c krävs. För att säkerställa maximal effektivitet, på dagen för transduktion förvärma centrifugen till 37 ° c innan viruset.

  1. Förberedelse av humana Fibronektin-fragment (dag 1 till dag 2)
    1. På dag 1, tillsätt 0,5 ml Fibronektin (50 μg/ml i PBS) till brunnarna på en 24-brunnsplåt och inkubera över natten vid 4 ° c.
      Anmärkning: normalt krävs två fibronectin-belagda brunnar per platta av transfekterade Phoenix celler.
    2. På dag 2 tar du bort Fibronektin-lösningen och ersätter den med 1 ml 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter för att "blockera" icke-specifika bindningsställen.
    3. Tvätta de behandlade brunnarna med 1 mL steril PBS. Efter avlägsnande av tvättlösningen, plattan är klar för användning; eller, kan förseglas och förvaras vid 4 ° c i upp till en vecka.
  2. Insamling av aktiverade CD8 T-celler (dag 2)
    1. Skörda de aktiverade CD8 T-cellerna, räkna och beräkna cellernas lönsamhet med trypan Blue eller ett lämpligt automatiserat instrument.
    2. Samla celler genom centrifugering och Omsuspendera vid 5 x 106 livskraftiga celler/ml för transduktion. Upprätthålla en liten delmängd av celler i kulturen i det kompletta T-cellmediet i CO2 -inkubatorn för att ge en kontroll för efterföljande fluorescens aktiverad cell sortering av de omvandade cellerna (steg 6).
      Anmärkning: efter aktivering för 48 h, det totala antalet celler bör ha ökat med cirka 1,5 gånger, och har en livskraft större än 95%.
  3. Transduktion (dag 2)
    1. Tillsätt 100 μl aktiverad CD8 cellsuspension per brunn (0,5 x 106 celler) till den Fibronektin belagda plattan. Tillsätt sedan 1,5 – 2 mL virusinnehållande medium (från steg 2,6) till varje brunn. Blanda med en virvlande rörelse för att fördela cellerna jämnt (figur 2).
    2. Placera plattan i en zip-lock plastpåse och tätning (för att ge sekundär inneslutning). Centrifugera vid 2000 x g för 90 min vid 37 ° c.
    3. Ta bort plattan från centrifugen. I den biologiska säkerheten, skåpet försiktigt bort plastpåsen och se till att utsidan av plattan inte är förorenat med något medium.
    4. Överför sedan plattan till den dedikerade 37 ° c CO2 -inkubatorn. Efter 4 h, ta bort 1 mL av mediet från varje brunn och Ersätt med 1 mL förvärmd komplett T cell medium. Byt ut plattan i CO2 -inkubatorn.
      Obs: hantera alla medier från de omvandade cellerna som smittat avfall.
  4. Andra transduktion (dag 3)
    1. I det särskilda biologiska säkerhetsskåpet, luta plattan som innehåller de omvandade cellerna genom att vila på locket och försiktigt ta bort det mesta av mediet (vilket ger 100 – 200 μL) och se till att inte kontakta cellerna längst ner i brunnen.
    2. Lägg till det virusinnehållande mediet som samlats in i steg 2,7 och upprepa steg 5.3.2 – 5.3.4.
      Notera: enligt vår erfarenhet förbättrar en tredje transduktion sällan totalverkningsgrad. Dessutom kommer cellernas lönsamhet sannolikt sjunka betydligt om en tredje transduktion används. Om cellerna är pläterade med en högre koncentration än 0,5 x 106/brunn, T-celler kan nå sammanflödet efter natten inkubering efter den andra transduktion steg. I detta fall, dela celler efter 4 h inkubering på dag 3.
  5. Tvätta celler (dag 4)
    1. Ta bort 1 mL medium från varje brunn, Omsuspendera cellerna i det återstående mediet och överför till en 15 mL tub. Tvätta brunnarna med 1 mL komplett T-cellsmedium och tillsätt i röret som innehåller de poolade cellerna från varje transduktion.
    2. Centrifugera vid 350 x g i 7 min, tvätta sedan två gånger genom att omlägga i 2 mL komplett T-cellsmedium och pelletering. Slutligen Omsuspendera i 2 mL medium och bestämma cellnumret.
      Obs: om 1 x 106 celler var ursprungligen transduced, avkastningen i detta skede bör vara ~ 3 x 106.
  6. Överföra
    1. Överför alikvoter på 0,5 – 1 x 106 celler i 2 ml komplett T-cellmedium till brunnarna på en ny 24-borrplatta och inkubera vid 37 ° c. Cirka 48 – 72 timmar efter transduktion cellerna är redo för bil uttrycks analys och cell sortering.
      Obs: antalet bil-T-celler brukar fördubblas varje 24 h i detta skede. Det är viktigt att aldrig låta dem växa över. Dela upp cellerna omedelbart om densiteten är högre än 2 x 106/ml (eller om mediet någonsin blir ljust gult). I vår erfarenhet av bil-T-celler frodas mer robust i 24-brunn och 12-bra plattor än om överföras till ett större fartyg.

6. rening av omvandade celler med fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) (dag 5 eller dag 6)

  1. Samla in cellerna.
    1. Omsuspendera cellerna genom att Pipettera upp och ner flera gånger (noga med att inte orsaka skumning), överför till 15 mL-rör och centrifugera vid 350 x g i 5 minuter.
    2. Omsuspendera i sorteringsbuffert (2% BSA i steril PBS innehållande gentamicin) vid 1 x 106 celler/ml. Också skörda kontroll (UN-transduced) CD8 T celler från steg 5,2).
      Anmärkning: från 1 x 106 celler på dag 2, en avkastning på ~ 2 x 107 sensorik celler förväntas vid denna tidpunkt.
  2. Tvätta cellerna en gång med sorteringsbuffert genom centrifugering vid 350 x g i 5 min, och Omsuspendera vid 1 x 107 celler/ml i sorteringsbuffert. Ta bort en liten alikvot för Foxp3GFP -kompensationskontroll (som ska användas i steg 6.4.1) och färga resten med märkt anti-Mouse CD8 (klon 53-6.7; 0,2 μg av antikroppar/5 x 106 celler) genom inkuberande i 20 minuter vid 4 ° c.
    1. Likaså fläcken en alikvot av icke-transduced CD8 T-celler för att ge en kompensations kontroll för fluorophore märkning anti-CD8 antikropp.
      Obs: Undvik att tillsätta natriumazid till någon buffert, eftersom detta är giftigt för cellerna.
  3. Tvätta de märkta cellerna två gånger med sorteringsbuffert, Omsuspendera i kall sorteringsbuffert vid 1 x 107 celler/ml.
  4. Sortera cellerna.
    1. Sortera CD8 GFP+ positiva celler i pre-kyld komplett T-cell medium (figur 3b). Ta en liten alikvot för efter sortering analys för att bestämma renhet.
      Notera: för att maximera renheten hos de sorterade cellerna bör trånga grindar användas. Använd ett munstycke på 100 μm för att säkerställa hög cellernas lönsamhet. Minimera den tid som de sorterade cellerna hålls på is. T-celler som har hållits på is i mer än 3 h tar mycket längre tid att återhämta sig än celler kylda i mindre än 2 h. Således, om 3 sensorik cellinjer måste sortera, samla in och märka den andra raden medan den första sorteras och så vidare snarare än att den andra och tredje linjen tillbringar en längre tid vid 0 ° c. Uttrycket av andra T-cellmarkörer som CD28 och CD3 kan också övervakas (figur 3c), men är inte nödvändigt för sorterings ändamål.
    2. (Alternativ sorterings strategi) Innan färgning av bulk population, analysera CD8 uttrycket av en liten population av de sensorik T-celler. Om renheten är > 99% då bulk populationen kan säkert sorteras enbart på grundval av GFP uttryck.

7. utbyggnad av sorterade CAR-T-celler (dag 5 till 10)

  1. BIL-T cell expansion
    1. Tvätta sorterade CAR-T-celler en gång, sedan Omsuspendera i förvärmd komplett T-cell medium på 2.5 – 5 x 105 celler/ml, och tallrik 2 ml alikvoter i 24-brunn plattor.
    2. Räkna och dela cellerna varje 1 – 2 dagar. Vanligtvis cell nummer fördubblas varje dag tills ~ dag 10, med lönsamhet kvar över 95%.
      Obs: utan Re-stimulering, bil-T-celler kommer att sluta prolifererande runt dag 10 och så småningom dö. Således bör T cell funktionella analyser och adoptiv överföringar planeras i enlighet med detta.
  2. Alternativ expansionsstrategi
    1. Efter sortering, kultur de CAR-T celler i komplett T-cell medium som innehåller rhIL-2 på 100 U/mL i stället för 200 U/mL.
      Obs: bil-T-celler förväxer i en något långsammare takt i detta medium. Emellertid, de kommer ofta att fortsätta att förökar sig till dagar 11 till 13 utan Re-stimulering. Även om denna alternativa expansionsstrategi inte genererar ett större antal celler ger det en något längre tidsfönster för nedströms analyser som ska utföras.

8. verifiering av antigenspecificitet och funktion hos BILENS T-celler.

Anmärkning: den bindande specificiteten hos bil T-celler inriktade på peptid/MHC-komplex kan verifieras av tetramer-färgning7,23. Likaså, deras funktionalitet kan bekräftas genom att mäta cytokin sekretion eller cytotoxicitet efter stimulering av deras kognate ligander. NIH Tetramer Core Facility (TCF) vid Emory University är en rekommenderad källa till "tetramers" och relevanta Färgnings protokoll.

  1. Peptid-MHC Tetramer färgning.
    1. Etikett alikvoter av 2 x 105 omvandade Car-T-celler i 100 μl sorteringsbuffert genom att inkuberas med ~ 0,6 μg överföras märkta antigen-specifika och kontroll tetramer vid 37 ° c för 2 h.
    2. Pelleten cellerna genom centrifugering för 5 min vid 350 x g, tvätta sedan två gånger genom att omlägga i 0,5 ml sorterings buffert och re-centrifugering. Slutligen, Omsuspendera cellerna i 300 μL sorteringsbuffert och analysera med flödescytometri (figur 4).
      Anmärkning: för dessa studier använder vi vanligtvis BV421-märkta IAG7-B:9-23 (re) (test) och IAG7-hel (kontroll) tetramers. En kombination av fluorophore/tetramer som är lämplig för bil (er) under utredning kan dock användas istället. I detta fall bör koncentrationen och infärgnings tiden optimeras för varje tetramer som används. Både sorterade och osorterade CAR-T-celler kan användas för färgning av tetramer.
  2. Specificitet mätning genom ligand stimulering.
    1. Inkubera 2 x 105 sorterade Car-T-celler i 200 μl Cytokinfritt T-cellmedium med lämpliga plattbundna eller cellulära ligander.
    2. Efter 6 – 24 h mäta cytokin produktion av ELISA eller intracellulär färgning med tillverkarens protokoll.
      Anmärkning: för våra studier av IAG7-b: 9-23 omdirigeras T-celler, Vi odlar cellerna över natten med M12C3 murina B-cells lymfom celler uttrycker IAG7-b:R3 eller "Tom" IAG724,25, samla sedan in supernatanterna och mät utsöndras musens interferon gamma (IFN-γ) med ELISA26 (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Normalt är transduktionseffektiviteten med detta protokoll ~ 60-90%. I experimentet som visas i figur 3, före sortering cirka, 70% av CD8 T-celler Co-uttryckte GFP. De också Co-uttryckte CD28 och CD3 (figur 3c). Viktigt är att alla "test" GFP+ celler också samfärgas med IAG7-b:R3 tetramers, men inte med kontroll Tetramer (figur 4). På samma sätt, den sorterade test och kontroll CAR-T-celler var utsöndras höga halter av IFN-γ endast efter samodling med målceller som uttrycker deras kognate ligander (figur 5). Detta bekräftar att de sensorik cellerna har en CD8 effektor T cell fenotyp riktad mot målet för de överordnade antikropparna.

Figure 1
Figur 1: schematiskt av bilen antiretrovirala konstruktion. BILEN består av en inriktnings domän som härstammar från fab-fragmentet av en passande mus monoklonal antikropp, och en spacer/membran ankare/signaleringsdomän från mus CD28, CD137 och CD247. Den syntetiska cDNA sätts in i pMIG-II antiretrovirala Expression Vector. Begränsnings Endonuklease platser som används för att generera mAb287-bilen visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: effekt av olika pläteringsmetoder för cell fördelning. Vänster Celler som pipetteras med en virvlande rörelse visar en jämn fördelning. Rätten Celler pipetterades direkt in i mitten av brunnen. Bilder fångades efter spinning på 350 x g för 5 min. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödescytometrisk analys av sensorik T-celler. Celler var Co-färgade med PE-Cy7 konjugerat anti-CD8, AF647 konjugerat anti-CD3, och BV421 konjugerat anti-CD28, som beskrivs i steg 6,4. Profiler som är gated på enstaka livskraftiga celler visas. (A) un-färgade föräldrar CD8 T celler. B) PE-Cy7/GFP-profil för sensorik celler. Den bil som uttrycker celler identifieras av GFP-reportern. (C) färgade sensorik celler var gated på PE-Cy7/GFP dubbel positivitet. AF647/BV421-profilen visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Tetramer färgning av osorterade Car-T-celler. Celler färgas med BV421 konjugerade tetramer som beskrivs i steg 8,1. Profiler som är gated på enstaka livskraftiga celler visas. Atest IAG7-insulin tetramer. (B) kontroll I-ettG7-hel tetramer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: antigenspecifik cytokinsekretion med bil-T-celler. Sorterade CD8 T celler som uttrycker testet mAb287 eller kontroll mAb 24.1 bil var Co-odlade med M12C3 celler som uttrycker IAG7-b: R3, "Tom" IAG7, eller TFR-MBP-dtrl (ligand för MAB 24.1) som beskrivs i steg 8,2. Efter 24 h kvantifierades IFN-γ ELISA med ELISA. Specifik stimulering av båda T-cellinjer observerades. Data motsvarar medelvärdet ± SD av 3 upprepade experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tid Virus förberedelse T-cell beredning
DAG-4 (fre) Tina Phoenix celler (PM)
Dag-3 (lör) Re-Plate Phoenix
Dag-2 (sön) Holiday
Dag-1 (mån) Bestråla Phoenix celler (PM) Täck ej behandlad plåt med CD3/CD28 AB
Dag 0 (TIS) Transfecting Phoenix celler (AM) Förbered splenocyter och isolera CD8 T celler.
T cell aktiveringen.
Dag 1 (ons) Ändra Phoenix celler medium till 4 ml (AM). Coat RetroNectin
Dag 2 (tors) Samla in virus och refill. Transduktion, CD8 T-celler
Dag 3 (fre) Samla in virus. Transduktion, CD8 T-celler
Dag 4 (lör) Tvätta celler och expandera celler.
Dag 5 (sön) Cell expansion om det behövs.
Dag 6 (mån) BIL-T cell sortering.
Dag 7 -10 (tis till fre) Utvidgning av T CAR-Cells. Experiment.

Tabell 1: Sammanfattning av protokollet för bil-T-generering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att producera antigen-specifika CD8 CAR-T-celler genom antiretrovirala transduktion. Transduktionseffektiviteten i vårt protokoll är typiskt hög, och robust uttryck för bilen är i allmänhet observeras. De utökade bil T-cellerna behåller de viktigaste funktionerna hos de moder-aktiverade T-cellerna och antikroppselektivitet, och lämpar sig för både in vitro-och in vivo-användning. Vi har tillämpat AB-bil CD8 T celler i reprogramming typ 1 diabetes i NOD möss7.

Vårt protokoll innehåller flera viktiga modifieringar av tidigare beskrivna metoder. Först använder vi ett optimerat T-cellskulturmedium som möjliggör en förlängd aktiveringstid. Det kompletta mediet som beskrivs innehåller optimala nivåer av flera viktiga kosttillskott, och avsevärt förbättrar både T-cellernas lönsamhet och omfattningen av spridningen efter aktivering. Det bör noteras att mus IL-2 kan ersätta det mänskliga proteinet med likvärdiga resultat, men för närvarande är human IL-2 mer prisvärd. Notera, en betydligt högre transduktionseffektivitet erhålls med hjälp av T-celler aktiveras för 40-48 h än om en 24 h aktiverings steg används.

För det andra använder vi en förbättrad transduktion förfarande som eliminerar polybrene B (som är giftigt för T-celler) och använder Fibronektin istället. Detta förbättrar ytterligare cellernas lönsamhet. Det bör noteras att för att garantera god transduktion effektivitet är det viktigt att bibehålla T-celler i ett optimerat medium vid en lämplig celltäthet och att använda färska hög titer viral samman supernatanterna snarare än tidigare fryst virus. Med hjälp av vår modifierade förfarande, en tredje transduktion steg är onödigt och faktiskt är önskvärt som lönsamhet vanligtvis droppar om en tredje spin infektion steg ingår. Det måste också understrykas att det är viktigt att aldrig låta cellerna växa över under expansionsfasen. När cellerna är igenvuxna, de tenderar att snabbt förlora sin fenotyp och dö.

Utöver de parametrar som beskrivs ovan måste två andra potentiella orsaker till låg transduktionseffektivitet/lönsamhet undvikas. Först, eftersom antibiotika inte bör förekomma under transfektion steg är det viktigt att se till att plasmiderna bereds med hjälp av en endotoxin-fri kit, och löses i sterilt vatten, och att bra steril teknik används hela tiden. För det andra måste närvaron av höga nivåer av döda eller döende T-celler undvikas. Om den aktiverade föräldrarnas CD8 T-cellsuspensionen innehåller höga halter av döda celler eller cellfragment detta bör avlägsnas före transduktion med hjälp av kommersiella kit.

Vi har medvetet inte inkluderat en bil-T cell frysning steg i detta protokoll, som i vår erfarenhet en betydande del av de sensorik cellerna dör under frysförvaring och upptining. På samma sätt, även om den expanderade CAR-T-celler kan återstimuleras in vitro, de har en ökad tendens att förlora uttrycket av transgenen. Med tanke på den höga grad av spridning vi observerar med nysorterade bil-T-celler rekommenderar vi starkt att endast nygenererade CAR-T-celler används för funktionella analyser och adoptiv överföringar.

Sammanfattnings, betydelsen av detta protokoll är att det beskriver ett förfarande som ger hög transduktion effektivitet och genererar ett stort antal hälsosamma antigen specifika mus CD8 T celler för användning in vitro-och in vivo. Vårt protokoll ger således ett användbart verktyg för forskare som utför bil-T cellstudier i musmodeller av sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MAb287 och dess derivat skyddas av ett amerikanskt patent utfärdat i 2014.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, och SRA-2-S-2018-648-S-B, en diabetes utbildning och åtgärder Award, och Caroline Wiess Law Fund för forskning inom molekylär medicin vid Baylor College of Medicine. Cell sortering stöddes av Cytometry och cell sortering kärna vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (S10RR024574 och P30CA125123). Alla peptid-MHC tetramer erhölls från NIH tetramer Core facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40, (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25, (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1, (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73, (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8, (3), e59701 (2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43, (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509, (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167, (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369, (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24, (4), 345-358 (2003).
Högeffektiv generering av antigen-specifika primära mus cytotoxiska T-celler för funktionell testning i en autoimmun diabetes modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).More

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter