Summary
기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.
Abstract
Durotaxis는 세포가 긴장의 그라데이션을 감지하고 반응하는 과정입니다. 시험관에서 이 과정을 연구하기 위하여는, 세포의 근본적인 기질의 뻣뻣함은 조작되어야 합니다. 등급이 매겨진 강성과 장기 이동 성 법을 가진 하이드로겔은 durotaxis 연구에서 유용하다는 것이 입증되었지만, 기질 긴장의 국소 변화에 대한 즉각적인 급성 반응은 개별 세포 움직임과 세포 전세포 신호 이벤트에 대한 집중적인 연구를 가능하게 합니다. 기질의 강성을 감지하고 반응하는 세포의 능력을 반복적으로 테스트하기 위해 변형 가능한 하이드로겔에 배양된 개별 세포에 증가된 장력의 급성 구배를 적용하기 위한 수정된 방법이 실시간으로 사용됩니다. 문제의 세포에 부여 된 강성 그라데이션의 강도와 방향의 조작. 또한, 마이크로파이펫의 형상 및 치수 또는 적용된 그라데이션의 상대위치, 배치 및 방향과 같은 분석법의 세부 사항 및 파라미터를 미세 조정함으로써, 분석은 기계적으로 임의의 연구에 최적화될 수 있다. 민감한 세포 유형 및 시스템. 이러한 파라미터는 적용된 자극을 안정적으로 변경하고 분석법의 기능 및 다양성을 확장하도록 변경될 수 있다. 이 방법은 장기 durotactic 운동뿐만 아니라 변화하는 강성에 대한 응답으로 세포 신호 및 형태 역학의 더 즉각적인 변화의 검사를 할 수 있습니다.
Introduction
지난 수십 년 동안, 세포 환경의 기계적 특성의 중요성은 세포 생물학에서 점점 더 인정을 얻고있다. 다른 조직과 세포 외 행렬은 다른 상대 강성을 가지고 있으며, 세포가 몸 전체에 마이그레이션할 때,그들은 그들을 안내하기 위해 이러한 기계적 특성을 사용하여 이러한 변화를 탐색 1,2,3 , 4개 , 5개 , 6개 , 7. 세포는 발달, 상처 치유 및 암 전이와 같은 과정에서 운동성 행동을 알리기 위해 주어진 조직의 뻣뻣함을 사용합니다. 그러나, 이러한 기계적 입력의 감각과 반응을 허용하는 분자 메커니즘은 크게 알 수없는 남아1,2,3,4,5, 6개 , 7.
세포가 물리적 환경 단서에 반응하는 메커니즘을 연구하기 위해서는 기질의 강성 또는 강성을 조작해야 합니다. 2000년, 전민로, 유리왕과 동료들은 분석8을 개발하여 변형 가능한 세포외 매트릭스(ECM) 코팅 폴리아크릴아미드를 스트레칭하여 기계큐를 변화시키는 개별 세포의 운동성 반응을 직접 테스트할 수 있었습니다. 세포가 도금된 하이드로겔. 세포는 더 단단한 기판으로 이동하는 것에 대한 상당한 선호를 나타내며, 이는 "듀로탁시스"라고 불리는 현상입니다.
2000년 최초의 보고서 이후, 듀로탁시스 연구에 다른 많은 기술이 사용되었습니다. 가파른 강성 그라데이션은 폴리스티렌 비드9 또는 뻣뻣한 폴리머포스트(10)와 같은 단단한 특징에 겔을 주조하여 제조되었거나 유리 커버슬립(11)의 가장자리 주위에 기판을 중합하여 기계적 을 만들어 ' 스텝 경계'. 양자택일로, 얕지만 고정된 강성 그라데이션을 가진 하이드로겔은 미세 유체 장치12,13 또는 나란히 하이드로겔 용액 방울에 의해 생성된 가교의 그라데이션과 같은 다양한 방법에 의해 제조되었습니다. 다른 강성8,또는 선형 강성 그라데이션14,15를만들기 위해 등급UV 광 노출로 처리 광 반응성 크로스 링커하이드로겔. 이러한 기술은 시간이 지남에 따라 한꺼번에 durotactic 세포 운동을 조사하는 큰 효과에 사용되어왔다. 그러나, 전형적으로 이러한 특징은 세포 도금 의 앞에 제조되고 그 특성은 기계적인 그라데이션의 샘플링을 위한 무작위 세포 운동에 의존하여 실험의 과정을 통해 일관되게 유지됩니다. 이러한 기술 중 어느 것도 급성 기계적 자극에 반응하여 세포 행동의 급격한 변화를 관찰 할 수 없습니다.
기계적인 환경에 있는 급격한 변경에 세포 반응을 관찰하기 위하여는, 단세포 durotaxis 반응은 몇몇 이점을 제안합니다. 이러한 세포에서, 개별 세포는 유리 마이크로파이펫으로 세포로부터 근본적인 기판을 당겨서 급성, 기계적 자극을 부여하여, 세포 매트릭스 장력의 방향구배를 도입한다. 이동 속도 또는 이동 방향과 같은 운동성 거동에 대한 변화는 살아있는 세포 상 대비 현미경 검사법에 의해 관찰됩니다. 이 접근법은 기계적 자극과 세포 이동 사이의 원인과 효과 관계를 직접 관찰할 수 있게 해주며, 이로 인해 장력 구배의 방향과 크기를 신속하고 반복적으로 조작할 수 있습니다. 실시간으로 셀룰러 응답. 또한, 이 방법은 또한 형광 융합 단백질 또는 바이오센서를 발현하는 세포를 기계적으로 자극하여 메카노센싱에 관여하는 것으로 의심되는 단백질의 양, 활성 또는 세포외 국소화의 변화를 시각화하는 데 사용될 수 있으며, 듀로탁시스.
이 기술은 durotaxis8,16을 공부하는 단에 의해 채택되고 SKOV-3 난소 암 세포의 durotactic 행동을 공부하고 분자 기계장치를 공부하기 위하여 하우 실험실에 의해 적응된 것과 같이 여기에서 기술됩니다 언더리 듀로탁시스17. 부가적으로, 변형된 방법은 세포 배양 표면 근처의 단일, 짝수 층의 형광 미소구층을 가진 하이드로겔의 제조를 위해 기술되고; 이것은 마이크로파이펫 생성 된 변형 구이의 시각화 및 최적화를 용이하게하고 견인력 현미경 검사법에 의한 세포 수축도의 평가를 허용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 임베디드 형광 미소구가있는 변형 성 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔 제조
참고: 지침은 직경 22 μm이고 두께가 약 66 μm인 25 kPa 하이드로겔의 중합을 설명합니다. 이러한 매개 변수의 각각 또는 전부를 수정할 수 있으며 그렇게 하는 방향은 표 1 및 노트17에서찾을 수 있습니다.
- 유리 바닥 접시 또는 커버 슬립의 활성화
- 유리 바닥 이미징 접시 또는 라이브 셀 이미징 챔버에 맞는 커버 슬립의 활성화를 위해 바인드 실란 작업 솔루션을 준비합니다. 95% 에탄올 950 μL, 빙하 아세트산 50 μL, 바인드 실란 5 μL(y-메타크릴록실리메틸란)을 섞는다.
참고: 상단 커버 슬립에 비해 더 큰 바닥 커버 슬립을 사용하면 젤을 준비할 때 작업 할 수있는 추가 공간을 제공하고 이후 단계에서 유리 마이크로 파이펫을 쉽게 배치 할 수 있습니다. 또한 유리 바닥 이미징 접시가 아닌 커버슬립을 사용하는 경우 다음 섹션에 설명된 대로 커버슬립을 청소하십시오. - 코로나 지팡이로 20 s용 유리 표면을 활성화하고 바인드 시릴란 작업 용액의 50 μL을 즉시 오버레이하십시오. 용액을 10분 동안 건조시고 다.
- 95% 에탄올로 두 번 헹구고 이소프로판올로 두 번 헹구고 커버립을 약 20분 동안 공기건조시도록 합니다.
참고: 활성 유리는 건조기에서 최대 1 주일 동안 보관 할 수 있습니다.
- 유리 바닥 이미징 접시 또는 라이브 셀 이미징 챔버에 맞는 커버 슬립의 활성화를 위해 바인드 실란 작업 솔루션을 준비합니다. 95% 에탄올 950 μL, 빙하 아세트산 50 μL, 바인드 실란 5 μL(y-메타크릴록실리메틸란)을 섞는다.
- 클리닝 탑 커버슬립
- 22 mm 상부 커버슬립을 70°C에서 70°C에서 2% HCl로 30분 동안 배양한 다음 ddH 2O로 10분 간 2회 세척합니다.
- 커버슬립을 50°C에서 ddH 2O에서 2%큐벳 세정 농축액으로 30분 동안 인큐베이션한 다음 ddH 2O로 10분 간 2회 세척한다.
- 커버슬립을 90°C에서90°C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 70%C에서 70%의 에탄올을 10분 동안 인큐베이션한 다음, 60°C에서 최소 2시간 동안 공기 건조시.
참고: 청소 된 커버립은 깨끗한 건조기에서 무기한 보관 할 수 있습니다.
- 상단 커버슬립에 형광 마이크로스피어/비드 증착
- 초음파 수조에서 1 시간 동안 형광 마이크로 스피어의 재고 용액을 초음파 처리하십시오. 비드 스톡 1:200을 100% 에탄올로 희석하고 1시간 동안 다시 초음파 처리하여 작동하는 비드 솔루션을 만듭니다.
- 비드 용액이 초음파 처리가 완료되기 15 분 전에 세라믹 커버 슬립 홀더에 수직으로 놓고 탁상 플라즈마 클리너에서 3 분 동안 실내 공기 플라즈마로 처리하여 커버 슬립을 철저히 청소하십시오.
- 후속 단계에서 커버슬립의 취급을 용이하게 하고 미끄러지는 것을 방지하려면 파라필름 조각을 60mm 페트리 접시 뚜껑 또는 이와 유사한 용기에 넣습니다. 커버슬립을 안정제에 놓고 가볍게 누릅니다.
- 22mm 커버슬립의 경우, 작동 비드 용액의 150 μL을 커버슬립 상단에 추가합니다. 커버슬립 의 측면에서 에탄올 용액을 즉시 흡인하여 덮개 슬립에 구슬을 남깁니다. 커버슬립을 에어드라이에 넣으세요.
참고: 추가 된 작업 비드 용액의 양은 ~ 4 μL / cm2이어야하며 모든 크기의 커버 슬립을 수용 할 수 있도록 크기를 조정할 수 있습니다.
- 형광 비드가 내장된 하이드로겔 주조
- 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드의 하이드로겔 용액을 준비한다. 표1에 따라 용액을 혼합한 다음 10% APS의 2.5 μL과 TEMED의 0.5 μL을 추가합니다. 잘 섞으세요. 즉시 다음 단계로 이동합니다.
참고: 하이드로겔 용액 혼합물은 표1에 나타낸 바와 같이 아크릴아미드와 비스-아크릴아미드의 비율을 변경하여 하이드로겔의 영의 계수 또는 강성을 변화시키기 위해 변경될 수 있다. 이 값은 원자력 현미경 검사법을 사용하여 하우 실험실에서 사용하기 위해 확인되었지만 하나의 기관 내에서 확인되어야합니다. - 하이드로겔 용액을 만든 직후, 유리 바닥 접시 또는 바닥 커버 슬립의 활성화 된 면에 25 μL 드롭을 추가 한 다음 즉시 비드 코팅 커버 슬립을 용액에 놓고 비드 쪽을 아래로 놓습니다. 커버슬립의 먼 쪽과 드롭을 접촉한 다음 천천히 낮추는 것은 하이드로겔 내의 기포를 트래핑하는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
참고: 하이드로 겔의 높이는 이후 실험에서 사용되는 대물 렌즈의 작동 거리 내에 잘 있어야합니다. 66 μm의 하이드로겔 높이는 대부분의 시스템에서 잘 작동합니다. 하이드로겔의 크기는 커버슬립의 크기에 따라 더 많거나 적은 하이드로겔 용액을 첨가하여 스케일링될 수 있다. 하이드로겔 용액의 적절한 부피를 계산하려면 실린더의 부피에 대한 방정식을 사용하며, V = πr2h여기서 r은 커버슬립 반지름이고 h는 원하는 하이드로겔 높이입니다. 전형적으로, 이 계산은 상부와 하부에 비드 코팅 커버슬립을 가진 겔을 준비하고 공초점 현미경을 사용하여 두 비드 평면 사이의 거리를 측정함으로써 측정된 바와 같이 하이드로겔의 실제 높이를 공정하게 예측한다. 그러나, 하이드로겔의 실제 높이는 ±20 μm(예를들어, 상부 유리 커버슬립의 두께 및 제조방법에 따라)에 의해 이 계산에서 벗어날 수 있다는 것이 관찰되었다. 위에서 설명한 방법을 사용하여 겔 높이를 직접 측정하는 것이 좋습니다. - 젤이 30분 동안 중합되도록 한 다음 집게로 상단 덮개슬립을 부드럽게 제거합니다. 접시에 50 mM HEPES pH 8.5를 추가하면 제거가 용이합니다. 50m HEPES pH 8.5회 3회5분동안 세척합니다.
- 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드의 하이드로겔 용액을 준비한다. 표1에 따라 용액을 혼합한 다음 10% APS의 2.5 μL과 TEMED의 0.5 μL을 추가합니다. 잘 섞으세요. 즉시 다음 단계로 이동합니다.
- 하이드로겔 활성화 및 세포외 매트릭스 코팅
- 0.4 mM Sulfo-SANPAH (설포수치니미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트50 mM HEPES pH 8.5에서 배양하여 하이드로겔 표면을 활성화합니다. 밀폐된 영역에서 UV 아크 램프에 즉시 노출됩니다.
참고: 활성화하기 전에 빛으로부터 설포 -SANPAH를 보호하십시오. 400W 램프의 경우, 젤을 전구에서 10cm 떨어진 곳에 놓고 100s의 조명을 밝힙습니다. Sulfo-SANPAH 용액은 밝은 주황색에서 어두운 갈색으로 바뀝니다. - 50m HEPES pH 8.5회 3회5분동안 세척합니다.
참고: 수화 젤은 최대 1 주일 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다. - 활성화된 하이드로겔을 50 μg/mL fibronectin에서 50 mM HEPES pH 8.5에서 37°C에서 1시간 동안 배양하였다.
- 피브로넥틴 용액을 흡인하고 인산염 완충식염수(PBS)에서 5분 동안 3회 세척하였다. 낮은 부피가 낮은 PBS로 조직 배양 후드에서 UV 광 하에서 하이드로겔과 접시뚜껑을 15분 동안 살균한다. 멸균 된 PBS에서 한 번 씻으소서.
참고: 다른 유형의 ECM 단백질은 콜라겐과 라미닌을 포함한 하이드로겔을 코팅하는 데 사용할 수 있습니다.
- 0.4 mM Sulfo-SANPAH (설포수치니미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트50 mM HEPES pH 8.5에서 배양하여 하이드로겔 표면을 활성화합니다. 밀폐된 영역에서 UV 아크 램프에 즉시 노출됩니다.
2. 도금 세포
- 21,000 개의 세포를 포함하는 3 mL의 매체를 추가하여 ~ 1000 셀 / cm2의 최종 세포 밀도를 위해 60mm 접시를 채웁니다. 필요에 따라 시드 밀도를 조정하여 혼잡을 방지하고 개별 셀의 자유로운 이동을 허용합니다.
- 세포가 적어도 4 시간 동안 37 °C에서 회복되고 이미징 전에 최대 18 시간 동안 회복되도록하십시오. 이미징 미디어를 추가하기 전에 이미징 매체로 두 번 헹대기하여 이미징을 준비합니다. 세포가 이미징 전에 적어도 30 분 동안 평형화되도록 하십시오.
참고: 사용 중인 세포주에서 마이그레이션을 최적화하는 조건을 결정하기 위해 미리 화면 미디어 조건을 결정합니다. SKOV-3 세포의 경우, 페놀 레드가 없는 DMEM은 20 mM HEPES 및 12.5 ng/mL 표피 성장 인자를 함유하여 가장 많은 이동을 자극한다. Ref52 세포에 대한 최적의 조건은 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 25 ng/mL 혈소판 유래 성장 인자를 가진 링거의 버퍼입니다.
3. 유리 마이크로 파이펫의 준비 : 파이펫 당기 및 단조
- 100mm 길이의 보로실리케이트 유리 마이크로파이펫을 2단계 공정으로 1.0mm 의 외부 및 0.58mm 내부 직경으로 잡아당겨 2mm 이상의 테이퍼를 얻어 첫 밀리미터에서 ~50 μm로 줄이고 마지막 밀리미터에서 길고 평행한 10μm 직경 의 튜브로 확장합니다.
- 파이펫을 마이크로포지에 적재합니다. 파이펫을 모양으로 만드는 것은 250 μm 단면의 맨 끝에 동봉된 15 μm 무딘 팁을 나머지 파이펫에서 ~35° 각도로 구부려놓는다. 굽힘의 대략적인 직경은 팁에 강도를 부여하기 위해 약 30 μm이어야 합니다.
참고: 테이퍼 및 팁 치수를 조정하여 원하는 힘을 적절히 적용할 수 있습니다(5단계 참조). 제1 단계동안 65°C에서 마이크로파이펫을 당기고, 제2 단계에 대해 60°C를 당기면 3.1단계에서 기재된 치수가 생성한다. 다른 파이펫 풀러를 사용하는 결과는 다를 수 있습니다. - 사용하기 전에 70% 에탄올로 마이크로파이펫을 살균하십시오.
4. 마이크로 매니퓰레이터 및 마이크로 파이펫 위치 지정
- 접시 뚜껑을 제거하고 접시를 현미경 단계와 중앙에 적재합니다. 10X 또는 이와 유사한 낮은 배율 목표를 사용합니다. 매체의 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일로 매체를 덮습니다.
-
당겨진 파이펫 삽입
- 당겨진 피펫을 마이크로파이펫 칼집에 삽입하여 후크를 접시 쪽으로 향합니다. 후크의 끝은 겔로 낮추면 가장 낮은 지점이 됩니다.
- 시스를 마이크로 매니퓰레이터에 삽입하고 파이펫 끝이 X 및 Y 방향으로 대물 렌즈 위에 중앙에 위치할 때까지 조정합니다.
- 거친 조작기만 액체 표면에 닿을 때까지 파이펫을 낮춥시됩니다.
- 위상 대비 또는 밝은 필드를 사용하여, 젤의 상단에 있는 비드 층에 현미경을 집중하십시오. 이것은 참조 평면이 될 것입니다.
- 목적이 시료 나 단계에 부딪칠 위험이 없는지 확인하려면 X 및 Y 방향에서 거친 조작기의 작은 조정을 사용하여 초점 평면에 그림자를 투사하여 마이크로 파이펫의 끝을 찾기 위해 젤 위에 초점을 맞춥니다. 파이펫의 매우 끝이 시야에 있는지 확신할 때만 마이크로파이펫을 낮춥니다.
- 마이크로파이펫의 무딘 끝이 피펫을 칼집에 회전하거나 미세 조작기에서 칼집을 회전하여 팁이 초점 평면에 수직이 될 때까지 아래로 가리키고 있는지 확인합니다. 필요에 따라 4.4 단계와 4.5 단계를 반복합니다. 파이펫 끝에 초점을 맞춥니다.
- 겔의 상단 비드 층으로 다시 초점을 맞추어 파이펫이 젤 표면에서 얼마나 멀리 떨어져 있는지 측정합니다. 젤과 파이펫 끝 사이의 일부인 평면에 다시 초점을 맞춥니다. 파이펫을 천천히 낮추어 중간 초점 평면에 도달합니다.
- 하이드로겔에 초점을 맞출 때 마이크로파이펫 의 끝에서 매우 희미한 그림자가 인식 될 때까지 4.6 단계를 반복하십시오. 다음으로 높은 배율로 늘립니다.
- 마이크로파이펫의 매우 끝의 그림자 및 굴절이 비드 층 초점 평면 내에서 인식될 수 있을 때까지 마이크로 조작기의 하부.
- 배율을 실험에 사용할 배율을 높입니다. 하이드로겔 표면 바로 위에 떠다야 할 때까지 파이펫을 낮춥춥습니다.
5. 마이크로 매니퓰레이터 및 힘 생성 보정
- 위상 또는 브라이트필드에서 호버링 마이크로파이펫을 하부하여 하이드로겔의 표면에 닿습니다. 파이펫이 하이드로겔과 접촉할 때 어떻게 보이는지 관찰하십시오. X와 Y의 조정이 하이드로겔을 당기고 편향시킬 때까지 Z의 마이크로파이펫을 계속 낮추어 보겠습니다. 마이크로스피어 또는 인근 세포를 수탁자 표시로 사용합니다.
참고: 마이크로 매니더자가 시료 단계 자체가 아닌 위상 응축기 암 이나 벤치에 부착된 경우, 항상 피펫을 파괴하거나 세포를 방해하지 않도록 스테이지를 이동하기 전에 젤을 분리하십시오. 파이펫이 파손되면 3단계와 4단계로돌아갑니다. - 젤을 교전하는 세포가없는 영역을 찾습니다. 모든 방향으로 당기고 미세 조작이 젤의 변형으로 변환하는 방식에 익숙해지십시오.
- 조작없이 비드 필드의 형광 이미지를 가져 가라, 피펫젤을 참여, 그리고 결합 된 파이펫젤을 당겨와. 마이크로 매니더의 눈금 표시, 파이펫 팁이 당기기의 각 단계에서 위상 또는 밝은 필드에서 보이는 방식, 해당 조작을 사용하여 팁이 이동하는 거리 등에 대해 여러 번 반복합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 ImageJ를 사용하여16,17을 사용하여 비드 에 적용된 상대비드 배기량과 힘을 파이펫 결합 없이 비드 필드에 비교하여 비드 필드에 적용된 상대 비드 배기량과 힘을 계산하고, 겔과 비드 필드를 결합하고, 당겨 젤.
- 장력 자극을 미세 조정하려면 다른 마이크로파이펫 팁 치수, 셀로부터의 거리 또는 초기 터치다운 지점에서 마이크로 조작자가 끌어온 거리를 사용하여 힘 응용 프로그램을 비교합니다. 마이크로파이펫 팁 치수가 힘 응용 프로그램에 미치는 영향은 사용자에게 큰 유연성을 제공하지만 치수와 모양이 이전에 보정된 팁과 매우 유사하더라도 새로운 마이크로파이펫에 대한 힘 맵을 생성해야 할 필요성을 보여줍니다.
6. 듀로탁시스 분석 실시
- 실험을 수행하기 전에, 세포 근처에 젤을 참여 연습하고 미세 조작자가 재배치 될 때 세포의 변형을 관찰.
- 명확한 극성을 가지고 있고 지시된 방식으로 움직이는 세포를 확인하기 위하여 30 분 동안 움직이는 것처럼 보이는 세포의 단을 감시하십시오.
- 하나의 명확한 방향으로 움직이는 셀을 선택하고 추가로 30 분 동안 원하는 프레임 속도로 모니터링하십시오.
- 세포에 가해지는 힘 또는 세포에 가해지는 힘의 결정이 필요한 경우, 각 획득시 비드 필드 이미지를 캡처한다. 세포가 모니터링 하는 동안 방향의 과정을 변경 하는 경우, 이 자극의 효과 결정 하기 어려운 것 처럼 모니터링 하는 다른 셀을 선택.
- 하이드로겔을 세포에서 약 50 μm 떨어진 곳에 가담시다. 파이펫을 선두 가장자리의 가까운 쪽 앞에 놓고 미세 조작기를 이동하여 겔이 직교적으로 변형되도록 이동하여 셀의 이동 방향에 따라 이동합니다. 강성의 급성, 국부적 그라데이션에 반응하면서 시간이 지남에 따라 세포를 관찰하십시오.
참고: 여기에 제공 된 타이밍은 SKOV3 또는 Ref52 섬유 아세포를 모니터링 할 때 효과적이지만, 간격 및 전체 시간 과정은 관찰되는 세포 유형 과 생물학적 이벤트에 맞게 조정해야합니다. 형광 현미경 검사법과 페어링하는 경우 6.5단계 직전에 형광 수집을 일시 중지하고 위상 대비 또는 밝은 필드를 사용하여 마이크로파이펫을 배치하고 당기고 형광 수집을 즉시 다시 시작합니다. - 파이펫이 미끄러지거나 그라데이션이 완화되거나 해제된 경우 6.2 및 6.3 단계를 반복하여 새 셀을 찾습니다.
7. durotactic 마이그레이션 응답 결정
- ImageJ19 또는 다른 이미지 분석 프로그램을 사용하여 0분 및 30분 포스트 모니터(셀의 원래 궤적을 반영)에서 셀의 앞가장자리 중간과 중간 사이의 다른 선 사이에 선을 그려 회전 각도를 계산합니다. 자극 및 이 두 라인 사이의 각도를 측정한 직후 와 80분 전의 선행 에지.
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Representative Results
상기와 같이 마이크로파이펫(도 1)을 준비하고 당김의 힘 생성을 정상화(도2 및 도3)함으로써, 여러 세포주에 대해 최적의 듀로택트 조건이 확인되었다. 이 기술을 사용하여, 도4에 설명된 바와 같이, SKOV-3 난소암세포(17) 및 Ref52 쥐 배아 섬유아세포(도5)는유리 미세피펫에 의해 적용된 그라데이션에서 증가된 강성으로 이동한다. durotaxis 이외에, 이 방법은 형광 biosensors 및 마커를 사용하여 동적 신호 이벤트를 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 국면 접착 구조 내의 구조 및 신호는 경질 자극시 관찰될 수 있다. Vinculin 장력 센서 (VinTS)는 초점 접착에 국한된 FRET 기반 의 바이오 센서로 초점 접착 역학의 형광 관찰과 이러한 구조19내의 장력 변화 측정이 가능합니다. 125 kPa 폴리아크릴아미드 겔에 빈TS를 일시적으로 발현하는 Ref52 세포는 40분의 기간에 걸쳐 스트레치 방향으로 국소 유착의 형성을 보여준다(도6A). FRET 분석(20)은 국소 유착에 국한 된 vinculin급성 durotactic 자극으로 제시 될 때 긴장의 즉각적인 변화를 경험하는 것으로 나타났습니다 (그림6B)아세포의 관찰에이 분석의 유틸리티를 확장 경질 자극에 대한 응답으로 이벤트를 신호.
그림 1. 일반적인 당겨진(A) 및 단조(B) 마이크로파이펫의 다이어그램. (A) 마이크로파이펫은 2mm에서 10μm까지 테이퍼를 달성하기 위해 2단계 프로토콜을 사용하여 당겨집니다. (B) 마이크로파이펫은 마이크로포지에 적재되고 그 끝은 구부러지고, 동봉되고, 마지막 250 μm이 되도록 짧아집니다. 마이크로파이펫은 ~35° 각도로 구부러지고 ~ 30 μm에서 ~15 μm를 측정하는 둥근 팁까지 테이퍼가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 폴리-L-리신을 이용한 기존 방법에 비해 에탄올 코팅 후 비드 필드가 개선되었습니다. 대표적인 하이드로겔 비드 필드는 황록색, 적색 및 진적-적색 형광 비드를 이용한 증발 커버슬립 코팅 방법인 폴리-L-리신 및 에탄올(EtOH) 증발 커버슬립 코팅 방법. 스케일 바: 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 예제 durotactic 스트레치에 대 한 힘 지도의 생성. (A) 형광 미소구의 위치 전후 (각각 의사 색 녹색 및 빨간색) 마이크로 파이펫으로 하이드로겔을 변형 (패널의 오른쪽 가장자리 너머에 위치). 스케일 바: 25 μm. 변위 벡터(B) 및 변위 열 맵(C)은 ImageJ의 견인력 현미경 플러그인에 의해 생성된 널과 당겨진 비드 필드 사이의 비드 편향 및 하이드로겔 변형의 구배를 강조한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 듀로탁시스 분석및 편향각의 도식법. (A) 세포는 원래 궤적을 결정하기 위해 적어도 30 분 동안 관찰된다. (B) 마이크로파이펫은 세포 가장자리에서 50 μm 떨어진 세포의 궤적에 직교적으로 위치한다. 하이드로겔은 마이크로파이펫을 이동시켜 하이드로겔의 표면에 힘을 가하도록 마이크로파이펫에 의해 관여된다. (C) 마이크로파이펫은 세포로부터 20 μm 떨어진 곳에 추가로 당겨지고, 직교는 세포의 궤적을 끌어당겨 미세피펫쪽으로 증가하는 급성, 국소 적인 긴장(파란색으로 표시)을 생성한다. (D) 적용된 그라데이션을 탐색할 때 셀이 시간이 지남에 따라 관찰됩니다. (E) ImageJ 또는 이미지 분석 프로그램에서 원래 궤적(파선)은 첫 번째 프레임에서 선행 가장자리의 중심을 통해 셀의 중간에서 그려진 선으로 표시됩니다. 최종 궤적(실선)은 셀이 적용된 장력 그라데이션을 탐색할 수 있게 된 후에 그려진 선으로 표시됩니다. 자극을 향한 이 두 선 사이의 각도는 θ로 표시된 "회전 각도"라고 합니다.
그림 5. 쥐 배아 섬유 아세포는 durotaxis에 있는 증가한 기질 뻣뻣함의 지구를 향해 이동합니다. 시간 코스는 당기기 10분 전 Ref52 셀의 듀로택트 움직임을 나타낸 코스(패널 1), 당기기(패널 2) 1분 전, 당기 시(패널 3), 당기기 후 1시간(패널 4)을 나타낸 것이다. 화살표는 스트레치 방향을 나타냅니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 형광 마커 또는 바이오 센서를 사용하여 듀로택트 자극 동안 단백질 국소화 및 활성. 125 kPa 폴리아크릴아미드 겔에 대한 빈쿨린 장력 센서(VinTS)19를 일시적으로 발현하는 Ref52 세포는 급성 듀로택트 자극을 제시한다. (A) 자극 후, 새로운 초점 유착은 세포가 강성 그라데이션을 따라 방향을 바이면서 스트레칭 방향으로 형성됩니다. 2개의 10분 기간 동안, 기계적 자극 20분 전부터 21분, 세포 형태학(상부) 및 국면 부착 형성(아래)을 모니터링하였다. 빨간색은 기간 내의 첫 번째 타임포인트를 나타내고 녹색은 10분 후에 타임포인트를 나타냅니다. 10분 동안 형성된 새로운 초점 유착은 녹색으로 표시됩니다. 자극 하기 전에 새로운 초점 유착이 이동 방향으로 형성됩니다. 자극 후, 새로운 초점 유착은 스트레치 방향으로 형성됩니다. 화살표는 스트레치 방향을 나타냅니다. 화살촉은 10분 동안 초점 접착력이 형성된 영역을 나타냅니다. 스케일 바: 25 μm. (B) VinTS 형광의 FRET 분석은 투로택 스트레치에 근접 한 초점 접착 내의 장력의 변화를 나타낸다. 스트레칭 전후 세포막의 윤곽은 자극 시 세포의 변형을 강조합니다. 화살촉은 스트레치 시 FRET 비율의 변화가 발생하는 초점 접착력의 예를 나타냅니다. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 원하는 하이드로겔 강성 | 3 kPa | 25 kPa | 125 kPa |
| 7.5% 아크릴아미드 | 100 μL | 100 μL | 160 μL |
| 0.5% 비스 아크릴아미드 | 10 μL | 100 μL | 100 μL |
| ddH2O | 287 μL | 197 μL | 137 μL |
표 1. 아크릴아미드 젤 솔루션.
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Discussion
여기에서 입증된 것은 급성 기계적인 단서에 응하여 그것의 이동 행동을 변경하는 세포의 기능의 평가를 허용하는 반복가능한, 단세포 durotaxis 분석입니다. 이 기술은 또한 형광 현미경 검사법 및 적절한 융합 단백질 또는 바이오 센서와 함께 기계적 자극의 초 이내에 또는 더 긴 기간 동안 세포 간 신호 및 세포 골격 이벤트를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 듀로틱 운동. 세포와 세포의 환경 관계를 이해하는 것은 그 환경의 화학적 및 기계적 측면 모두의 영향에 대한 연구를 포함합니다. 잠재적으로 마스터하기 어렵지만, 이 듀로탁시스 분석법은 기계적 미세 환경의 변화에 대한 세포 반응을 이해하는 데 널리 사용될 수 있다.
기존 방법에 대한 중요성
앞서 언급한 바와 같이, 이러한 미세피펫 기반의 듀로틱 자극 방법은 매우 다공성이며, 기계적 자극에 대한 높은 수준의 시공간적 제어를 허용하며, 미리 형성된 선형 또는 강성의 단계 그라데이션. 부여된 변형 구배의 크기 및 방향은 하이드로겔에 내장된 형광 비드의 변위를 추적하여 세포 배양 표면 근처의 가시화될 수 있다.
이러한 fiducial 마커를 문화서 표면 바로 아래의 단일 레이어로 제한하면 이 추적의 정확도가 높아진다. 편향 평면 아래에 위치한 마이크로스피어(마이크로파이펫에 의해 또는 견인력 현미경 검사법, 셀룰러 수축도)에 의해, 하이드로겔 전체에 걸쳐 미세구를 고르게 혼합할 때 발생하는 것처럼, 평면보다 적게 이동합니다. 적용된 힘의 과소 평가로 이어질 수 있습니다. 또한, 이러한 변형은 비드가 미리 형성된겔(21) 위에 주조된 폴리아크릴아미드의 매우 얇은 층에 중첩되거나 중력 보조 침전(22)에 의해 하이드로겔 표면으로 가져온 방법보다 수행하기 쉽고 더 신뢰할 수 있다. 및 이전에 설명한 방법17,23보다하이드로겔을 가로질러 더 균의 분산을 생성한다.
수정 및 향후 응용 프로그램
이 분석법의 특이체는 관심 있는 세포주에 가장 적합하도록 수정될 수 있다. 예를 들어, 다양한 세포외 매트릭스 분자(예를들어, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌) 또는 다른 접착제 리간드가 하이드로겔을 기능화하는데 사용될 수 있다. 또한, 하이드로겔의 시작 강성은 비스-아크릴아미드에 대한 아크릴아미드의 비율을 튜닝함으로써 용이하게 상승 또는 하강될 수 있다(표 1참조). 마이크로파이펫 팁의 치수와 당김의 크기를 변경함으로써, 이 분석은 문제의 세포 유형에 대해 반복적이고 효과적인 듀로택트 자극을 부여하도록 최적화될 수 있다.
중요한 단계 및 문제 해결
하이드로겔 조작 전에 이동의 꾸준한 선형 궤적을 따르는 세포만 자극하여 궤적의 변화가 기계적 자극에 의한 것이지 무작위 변동이 아님을 확인해야 합니다. 하이드로겔 표면에 미끄러지지 않고 당기면 젤을 찢지 않는 유리 마이크로파이펫을 제작하려면 주의를 기울여야 합니다. 실험 과정에서 하이드로겔에 일정하고 일정한 스트레칭을 적용하여 깨끗한 결과를 얻는 것이 중요합니다. 장력 구배의 변화로 이끌어 내는 마이크로파이펫의 어떤 의도하지 않은 운동은 durotax에 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있었습니다. 마찬가지로, 파이펫 모양의 약간의 변화로 인해 파이펫 /젤 상호 작용이 달라질 수 있으므로 위조 된 각각의 새로운 마이크로 파이펫으로 젤의 조작을 수행해야합니다.
배율을 높이기 전에 미세 한 시야 내에 미세 파이펫을 배치하지 않으면 깨지기 쉬운 유리 팁의 우발적 인 파손이 발생할 수 있습니다. 마이크로오만기와 함께 마이크로파이펫을 내리기 전에 팁의 높이와 X-Y 위치가 알려져 있는지 확인합니다. 항상 마이크로파이펫의 위치를 모니터링하여 파손 위험을 줄이십시오. 마이크로 조작기와 파이펫 칼집의 약간의 움직임으로 인해 새로 로드된 위치의 큰 명백한 변화로 이어질 수 있으므로 미세 조작기에 로드된 각 새로운 마이크로파이펫에 대해 배율을 다시 10배로 낮추는 것이 좋습니다. 마이크로 파이펫.
관찰할 세포를 찾기 전에, 먼저 마이크로파이펫을 시험하여 하이드로겔이 예상대로 결합되고 원하는 스트레치를 적용하는 데 적합한지 확인하는 것이 중요합니다. 실험 및 세포 유형에 맞는 팁 치수를 찾는 것은 durotactic 자극을 적용하는 성공에 매우 중요합니다. 마이크로 파이펫의 끝은 젤을 뚫지 않도록 충분히 반올림되어야하지만, 그렇게 둥근 것은 그것을 잡지 못합니다. 파이펫이 겔을 효과적으로 당기지 않으면 표면을 따라 미끄러질 수 있습니다. 마이크로파이펫 팁의 형상이 너무 둥글게 되어 겔 표면과 제대로 교전할 수 있다. 마이크로파이펫의 맨 끝에 있는 치수는 단단하고 꾸준한 접촉이 일관되게 이루어질 때까지 조정되어야 합니다. 마이크로파이펫이 겔 표면을 가로질러 미끄러지는 경우, 더 많은 견인력을 얻기 위해 하이드로겔내로 마이크로파이펫을 더 낮게 해야 할 수도 있습니다. 마이크로파이펫이 젤을 통해 찢어지면 팁이 너무 미세하거나 너무 날카로울 수 있습니다. 겔 찢어짐은 당기는 동안 너무 많은 힘이 가해지고 있음을 나타낼 수 있습니다. 미세 파이프는 젤 변형을 줄이고 짧은 거리를 당기려면 약간 올려야합니다.
종종, 세포의 세포 또는 가장자리가 마이크로 파이펫에 의해 초점에서 당겨지면, 마이크로 파이펫의 끝이 셀에 너무 가깝게 관여하거나 스트레치가 너무 강해. X-Y 평면에서 셀을 약간 변형시키는 것만으로 마이크로파이펫을 셀에서 더 멀리 이동합니다. 세포를 초점 밖으로 이동하면 셀룰러 이벤트를 모니터링하고 광학 수차를 유발할 수 없을 뿐만 아니라 세포가 의도한 2차원 장력 구배보다 더 많은 자극을 경험하게 됩니다.
가장 중요한 것은 최소한의 인적 오류로 일관된 durotactic 조작이 있는 응답만 기록하고 분석하는 것이 중요합니다. 팁의 하강이 부정확하거나 마이크로파이펫의 위치가 바운다면 실험 결과가 흐려집니다. 이 분석은 복잡하고 많은 단계가 오류가 발생하기 쉽기 때문에 세포의 자극에 의도하지 않은 변화를 피하기 위해 모든 단계에서주의를 기울여야합니다. 어떤 단계에서든 실패하면 일관되지 않은 스트레치 응용 프로그램과 신뢰할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다.
제한
이 기술에는 고려해야 할 제한 사항이 있습니다. 유리 마이크로파이펫의 가장 눈에 띄는 정확한 단조 및 조작은 새로운 사용자를 위한 가파른 학습 곡선을 제시할 수 있습니다. 또한 하이드로겔 풀의 위치와 크기는 서로 다른 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다. 하이드로겔 조작 전후에 형광 비드 변위를 검사하면 이 기술의 측면에 도움이 될 수 있습니다. 또한, 기술은 개별 적인 세포에 있는 durotactic 행동의 높은 spatiotemporal 관측을 허용하는 동안, 이것은 낮은 처리량 분석합니다. 따라서 이 분석은 더 낮은 조작성을 가진 다른 기술에 의해 보완될 수 있다는 것을 지적하는 것이 중요합니다 그러나 더 높은 처리량, 강성의 미리 형성된 그라데이션을 가진 하이드로겔을 사용하여, 더 큰의 durotactic 거동을 분석하기 위하여 한 번에 세포의 인구. 요약하면, 단세포 durotactic 분석법에 의해 제공되는 기계적 단서의 시공간적 제어의 높은 정도는 많은 밑에 많은 다른 세포 모형의 durotactic 행동에 기여하는 분자 기계장치를 구문 분석하기를 위해 아주 유용하게 만듭니다 조건.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
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