Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fokuseret Ionstrålithografi til etch Nano-arkitekturer i Mikroelektroderne

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60004
Automatic Translation
1, 2,4, 5, 6, 2,3,4
1Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, 2Veteran Affairs Ann Arbor Healthcare System, 3Department of Neurology, School of Medicine, University of Michigan, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 5Michigan Center for Materials Characterization, University of Michigan, 6Carl Zeiss SMT, Inc.

Summary

Vi har vist, at ætsning af Nano-arkitektur i intracortical mikroelektrode enheder kan reducere den inflammatoriske respons og har potentiale til at forbedre elektrofysiologiske optagelser. Metoderne beskrevet heri skitserer en tilgang til etch Nano-arkitekturer i overfladen af ikke-funktionelle og funktionelle enkelt skaft silicium intracortical mikroelektroder.

Abstract

Med fremskridt inden for elektronik og fabrikation teknologi, har intracortical mikroelektroderne gennemgået betydelige forbedringer gør det muligt at fremstilling af sofistikerede mikroelektroderne med større opløsning og udvidede kapaciteter. Fremskridtene inden for fabrikation teknologi har støttet udviklingen af biomimetiske elektroder, som har til formål at gnidningsløst integreres i hjernen parenchyma, reducere den neuroinflammatoriske respons observeret efter elektrode indsættelse og forbedre kvaliteten og levetiden for elektrofysiologiske optagelser. Her beskriver vi en protokol til at ansætte en biomimetisk tilgang for nylig klassificeret som nano-arkitektur. Brugen af fokuseret ion Beam litografi (FIB) blev udnyttet i denne protokol til etch specifikke Nano-arkitektur funktioner i overfladen af ikke-funktionelle og funktionelle enkelt skaft intracortical mikroelektroder. Ætsning af nanoarkitekturer i elektrodeoverfladen indikerede mulige forbedringer af biokompatibiliteten og funktionaliteten af den implanterede anordning. En af fordelene ved at bruge FIB er evnen til at etch på fremstillede enheder, i modsætning til under fabrikation af enheden, lette grænseløs muligheder for at ændre talrige medicinske enheder efter fremstilling. Den protokol, der præsenteres heri, kan optimeres til forskellige materialetyper, nanoarkitektur funktioner og typer af enheder. Augmenting overfladen af implanterede medicinsk udstyr kan forbedre enhedens ydeevne og integration i vævet.

Introduction

Intracortical mikroelektroder (IME) er invasive elektroderne, som giver et middel til direkte grænseflade mellem eksterne enheder og neuronal populationer inde i hjernebarken1,2. Denne teknologi er et uvurderligt værktøj til optagelse af neurale aktionspotentialer for at forbedre forskernes evne til at udforske neuronal funktion, fremme forståelsen af neurologiske sygdomme og udvikle potentielle terapier. Intracortical mikroelektrode, der anvendes som en del af hjernen Machine Interface (BMI) systemer, muliggør registrering af handlings potentialer fra en enkelt eller små grupper af neuroner til at detektere motoriske hensigter, der kan bruges til at producere funktionelle udgange3. Faktisk har BMI-systemer med succes været anvendt til proteser og terapeutiske formål, såsom erhvervet sensorisk rytmekontrol til at betjene en computer markør hos patienter med Amyotrofisk lateral sklerose (ALS)4 og rygmarvsskader5 og genoprette bevægelsen i mennesker, der lider af kronisk tetraplegi6.

Desværre, IES ofte undlader at registrere konsekvent over tid på grund af flere svigt tilstande, der omfatter mekaniske, biologiske og materielle faktorer7,8. Den neuroinflammatoriske respons, der opstår efter elektrodens implantation, menes at være en betydelig udfordring, der bidrager til elektrode svigt9,10,11,12,13,14. Den neuroinflammatoriske respons initieres under den indledende indsættelse af IME, som severs blod-hjerne barrieren, skader den lokale hjerne parenkym og forstyrrer gliaceller og neuronal netværk15,16. Dette akutte respons er karakteriseret ved aktivering af gliacceller (mikroglia/makrofager og astrocytter), som frigiver pro-inflammatoriske og neurotoksiske molekyler omkring implantationsstedet17,18,19,20. Den kroniske aktivering af gliaceller celler resulterer i en fremmedlegeme reaktion karakteriseret ved dannelsen af et gliaceller ar isolerer elektroden fra sundt hjernevæv7,9,12,13,17,21,22. I sidste ende, hindrer elektrodens evne til at registrere neuronal handling potentialer, på grund af den fysiske barriere mellem elektroden og neuroner og degeneration og død af neuroner23,24,25.

Den tidlige fiasko af intracortical mikroelektroder har medført betydelig forskning i udviklingen af næste generation af elektroder, med vægt på biomimetiske strategier26,27,28,29,30. Af særlig interesse for den protokol, der er beskrevet her, er brugen af Nano-arkitektur som en klasse af biomimetiske overflade ændringer for IME'er31. Det er blevet fastslået, at overflader, der efterligner arkitekturen i det naturlige in vivo-miljø, har et forbedret biokompatibelt respons32,33,34,35,36. Således, hypotesen overbevisende denne protokol er, at diskontinuitet mellem den rå arkitektur af hjernevæv og glat arkitektur af de intracortical mikroelektroder kan bidrage til den neuroinflammatoriske og kroniske fremmedlegeme respons på implanterede i'er (for en fuld anmeldelse henvise til Kim et al.31). Vi har tidligere vist, at udnyttelsen af Nano-arkitektur funktioner svarende til hjernens ekstracellulære matrix arkitektur reducerer astrocyt inflammatoriske markører fra celler dyrket på nano-arkitekturerede substrater, sammenlignet med flade kontrol overflader i både in vitro og ex vivo modeller af neuroinflammation37,38. Desuden har vi vist anvendelsen af fokuseret ion Beam (FIB) litografi til etch Nano-arkitekturer direkte på silicium sonder resulterede i signifikant øget neuronal levedygtighed og lavere ekspression af pro-inflammatoriske gener fra dyr implanteret med nano-arkitektur sonder sammenlignet med den glatte kontrolgruppe26. Derfor er formålet med den protokol, der præsenteres her, at beskrive brugen af FIB litografi til etch Nano-arkitekturer på fremstillede intracortical mikroelektrode anordninger. Denne protokol er designet til at etch Nano-arkitektur mellemstore funktioner i silicium overflader af intracortical mikroelektrode skafter udnytte både automatiserede og manuelle processer. Disse metoder er ukomplicerede, reproducerbare, og kan helt sikkert optimeres til forskellige enheds materialer og ønskede funktions størrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: gør følgende trin, mens du bærer det rigtige personlige værnemidler, såsom en laboratorie frakke og handsker.

1. montering af ikke-funktionel silicium sonde til fokuseret ionstråle (FIB) litografi

Bemærk: for den komplette procedure, der beskriver fremstillingen af SOI wafer med 1.000-sonder, henvises der til Ereifej et al.39.

  1. Isoler en strimmel af 2-3 silicium sonder fra silicium på isolator (SOI) wafer indeholdende 1.000 prober. Der må ikke gøres strimler med mere end tre silicium Probe. Dette kan øge chancerne for løs montering og kan forårsage forkert justering resulterer i FIB til etch forkert.
    Bemærk: strimler/sonder ikke sidder fast på aluminiums stub kan forårsage to komplikationer: 1) når scenen bevæger sig til at arbejde på næste afsnit, vil der være vibrationer og fræsning vil ikke være præcis, indtil sonden aflægges og 2) det kan forårsage en høj variation og være ude af fokus flyet.
    1. Mens iført handsker, bruge fine pincet at lægge pres omkring sonder at afbryde en lille sektion med to til tre sonder.
  2. Rengør forsigtigt silikone sonden af alt støv og snavs før FIB ætsning. Forbered en 6 brønd polystyren plade ved pipettering 3 mL/brønd af 95% ethanol i tre brønde.
    1. Pick forsigtigt den afskårne strimmel af silicium sonder ved hjælp af fine tip eller vakuum pincet og placere det i celle sien. Placer kun én strimmel af silicium sonder pr. si for at undgå at bryde prober. Placer sien, der indeholder silicium sonder Strip, i den første brønd, der indeholder 95% ethanol til rengøring. Hold sien i den første brønd i 5 min.
    2. Flyt sien, der indeholder silicium prober fra den første brønd og Placer den i den anden brønd indeholdende 95% ethanol for yderligere 5 min. Gentag en gang mere i den tredje brønd.
    3. Anbring det filter, der indeholder de rengjorte silicium prober, på en polytetrafluorethylenplade til lufttørring. Gør dette trin i en steril hætte for at undgå kontaminering fra støv.
  3. Placer den luft tørrede strimmel af silicium sonder i en forseglet beholder til transport til SEM-FIB. Pak sien, der indeholder de luft tørrede prøver, med en plast-eller aluminiumsfolie wrap til transport og/eller opbevaring for at opretholde rengøringen.
  4. Brug fine tippet eller vakuum pincet til forsigtigt at afhente den rene strimmel af silicium sonder og placere dem på en ren aluminiums stub (bruges til SEM-FIB billeddannelse/ætsning) til at forberede montering.
  5. Brug et tandstikker (eller et andet fintippet instrument som en tynd elektrisk ledning) til at placere en lille dråbe (~ 10 μL) sølv maling på kanten af silicium substratet omkring sonder. Fastgør strimlen nedad ved at sprede sølv malingen rundt om siderne af silicium substratet omkring sonden. Lad sølv malingen tørre helt, før du placerer aluminiums Stubben i SEM-FIB.
    Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at få sølv maling på skaft af elektroden, fordi det er den del, der vil blive ætset. Hvis strimlen af sonder ikke er forsvarligt forankret til aluminiums stubben, kan strimlen bevæge sig under forarbejdningen eller have et andet brændplan, hvilket resulterer i ukorrekt fræsning af FIB. Flere strimler af silicium sonder kan monteres på samme aluminiums stub, og sørg for at der er rigelig plads mellem strimlerne for at tillade fjernelse fra stub efter ætsning. Dette vil give mulighed for mere effektiv ætsning af flere sonder ved hjælp af den automatiserede funktion beskrevet nedenfor.

2. tilpasning af FIB til silicium sonder

  1. Klik på vent -knappen i bjælken kontrol fane for at lufte kammeret. Tryk på Skift + F3 for at udføre start stadiet. Bekræft valget ved at vælge knappen Home Stage i popup-vinduet.
    Bemærk: kørsel af Home Stage operation er et forebyggende skridt for at sikre, at scenen akse læses korrekt af softwaren og mikroskopet er i god stand.
  2. Når Start stadiet er fuldført, skal du flytte scenen til koordinaterne X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. Når kammeret er ventileret, sættes på rene nitrilhandsker og åbne kammer døren.
    Bemærk: afhængigt af den tidligere brugers applikation kan det være nødvendigt at ændre Stage adapteren. Standard-Stage-adapterne (f. eks. FEI-stil) kan fjernes ved at skrue den centrale bolt mod uret og monteres ved at skrue uret ind i rotations pladen på scenen.
  3. Indsæt aluminiums stub, der holder proberne i toppen af Stage adapteren. Fastgør aluminiums Stubben ved at stramme den indstillede skrue på siden af Stage adapteren. Brug 1,5 mm unbrakonøgle til denne opgave.
  4. Juster højden på Stage adapteren ved at dreje adapteren med uret for at sænke den eller mod uret for at hæve den. Fastgør Stage adapteren til rotations pladen ved at dreje låse konus møtrikken med uret, indtil møtrikken er sikret mod scene rotations pladen. Hold Stage adapteren med den anden hånd for at forhindre rotation af adapteren og prøver, mens du strammer låse kegle møtrikken.
    Bemærk: Brug den medfølgende højdemåler til at bestemme den passende højde. Den øverste af aluminiums stub skal være den samme højde som den maksimale linje vist på højdemåleren. Overstramning kegle møtrikken kan forårsage skader på scenen og adapteren. Brug kun tilstrækkelig kraft til at sikre prøverne.
  5. Få et billede af et navigations kamera. Sving forsigtigt navigations kamera armen åben, indtil den stopper. Mikroskop scenen flyttes automatisk til en position under kameraet. Se det Live billede, der vises i kvadrant 3 i mikroskopet (UI).
    1. Når lysstyrkeniveauet automatisk justeres til et passende niveau, skal du anskaffe billedet ved at trykke på knappen ned på kamera beslaget. Sørg for at vente på, at hele billed anskaffelsen afsluttes, hvilket angives med et pause symbol, der vises i kvadrant 3, og belysningen af kameraet slukkes. Dette tager ca. 10 s. Drej kamera armen tilbage til den lukkede position. Scenen vil vende tilbage til den oprindelige position.
  6. Luk forsigtigt mikroskop kammerets dør. Se CCD-kamerabilledet i kvadrant 4, mens du lukker døren. Sørg for, at prøverne og scenen er i sikker afstand fra alle kritiske komponenter i mikroskopet.
  7. Vælg pil ned ved siden af pumpe knappen under fanen stråle kontrol. Vælg pumpe med prøve rensning knappen i UI-softwaren for at starte kammer vakuumpumpen og bygget i plasma renere. Sørg for, at døren er forseglet ved forsigtigt at skubbe på forsiden af døren, mens pumpen kører. Vent ca. 8 minutter for pumpe tiden og plasma rensnings cyklussen, for at mikroskopet skal være færdigt.
    Bemærk: en vakuum forsegling kan bekræftes ved forsigtigt at trække i kammer lågen, som skal forblive lukket, hvis systemet er under vakuum.
  8. Når ikonet i nederste højre hjørne af UI bliver grønt, skal du trykke på Wake-up knappen i bjælken kontrol fane, der tænder elektron og ion bjælker. Vælg kvadrant 1 og Indstil stråle signalet til elektronstråle (hvis det ikke allerede er indstillet), sæt kvadrant 2 til ion Beam (hvis det ikke allerede er indstillet).
    1. Sæt SEM spænding til 5 kV, sæt SEM Beam strøm til 0,20 nA, sæt SEM detektor til ETD, sæt detektor tilstand til sekundær elektron. Sæt FIB spænding til 30 kV, sæt FIB stråle strøm til 24 pA, sæt FIB detektor til ISDETEKTOR, sæt detektor tilstand til sekundær elektron.
  9. Dobbeltklik på silikone sonden i navigations kamerabilledet, kvadrant 3 for at flytte scenen til sondens omtrentlige placering. Klik på kvadrant 1 for at vælge det som den aktive kvadrant og tryk på pause knappen for at starte SEM scanning. Indstil scanningstid til 300 ns, og Deaktiver scannings sammenfletning, linje integrationog ramme gennemsnit. Indstil scannings rotation til 0 under fanen Beam Control, og højreklik på Beam Shift 2D justering, og vælg Zero.
  10. Juster forstørrelsen til minimumværdien ved at dreje forstørrelses knappen mod uret på MUI-panelet. Juster billedets lysstyrke og kontrast ved hjælp af knapperne på MUI-panelet eller værktøjslinjen automatisk kontrast lysstyrke .
  11. Flyt scenen ved enten at dobbelt-venstre-klikke med musen på en funktion for at centrere den, eller ved at trykke ned musehjulet og aktivere joysticket musetilstand. Flyt den ønskede silikone sonde til at være mønstrede ind i midten af SEM-billedet.
  12. Find en kant eller andre funktioner såsom en støv partikel eller ridse. Forøg forstørrelse til 2, 000x ved at dreje forstørrelses knappen med uret. Juster fokus for SEM ved at dreje de grove og fine fokus knopper på MUI, indtil billedet er i fokus. Når billedet er i fokus, skal du vælge knappen Sammenkæd eksempel Z til arbejdsafstand i værktøjslinjen.
  13. Bekræft, at handlingen blev fuldført ved at se på Z-akse koordinaten under fanen navigation. Værdien skal være ca. 11 mm. Indtast 4,0 mm i Z-aksens position og tryk på gå til -knappen med musen eller tryk på Enter-tasten på tastaturet og scenen vil flytte til 4 mm arbejdsafstand.
  14. Flyt scenen i X og Y for at lokalisere silikone sondens skulder. Placer det så tæt på centrum af SEM som muligt. Skift trin hældning til 52 ° ved at skrive i "52" i T-koordinaten og trykke på ENTER. Vær opmærksom på, om sondens skulder ser ud til at bevæge sig op eller ned i billedet. Brug skyderen Stage Z til at bringe sondens skulder tilbage til midten af SEM-billedet. Juster kun Z-positionen, Flyt ikke X-, Y-, T-eller R-aksen.
  15. Kør den indbyggede "XT align-funktion", som er placeret i rullemenuen trin. Brug musen til at klikke på to punkter parallelt med kanten af sonden. Sørg for, at den vandrette alternativknap er valgt i pop op-vinduet, og klik på Udfør. Scenen roterer for at justere sonden med X-aksen i scenen. Juster scenen i X, Y ved hjælp af musen til at sætte den nedre skulder af sonden i midten af SEM billedet igen.
    Bemærk: det første punkt skal være mod sondens greb, og det andet punkt skal være mod sondens punkt.
  16. Vælg FIB i kvadrant 2, og sørg for, at stråle strømmen stadig er 24 pA. Indstil forstørrelsen til 5, 000x og dvæletid til 100 NS. Skriv CTRL-F på tastaturet for at indstille FIB-fokus til 13,0 mm. I bjælken kontrol fanebladet, Højreklik i stigmator 2D justering og vælg Zero og, højreklik også i Beam Shift 2D justering og vælg Zero. Indstil scannings rotationen til 0 °, og tryk på knappen automatisk kontrast lysstyrke på værktøjslinjen.
  17. Kig efter et billede af sonden skulder i kvadrant 2. Brug snapshotværktøjet til at erhverve et billede med FIB. Bekræft sonde skulderen er i midten af FIB billedet, hvis ikke, dobbeltklik på sonden skulder for at flytte den til midten. Flyt scenen til venstre ved at trykke på venstre piletast på tastaturet ca. 10-15 gange. Tag et andet øjebliksbillede og observere, om sonde siden stadig er i midten af FIB.
    Bemærk: Hvis ikke, skal fase rotationen justeres en anelse. Hvis sonden er over billedcenter, skal scenen drejes i negativ retning. Hvis sonden er under midten, skal scenen drejes med uret. Angiv en relativ compucentrisk rotation på 0,01 til 0,2 grader, afhængigt af hvilken vej der er nødvendig for at justere sonden.
  18. Gentag trin 2,16 til 2,17 så mange gange som nødvendigt, indtil kanten af sonden skulder er perfekt justeret med X-aksen af scenen, (kanten forbliver i midten af FIB, mens du flytter til venstre).
  19. Ved hjælp af FIB, flytte scenen tilbage til den nedre skulder af sonden. Gem scene positionen på stillings listen ved at klikke på knappen Tilføj . Skift FIB stråle strømmen til 2,5 nA og sørg forstørrelsen af FIB er stadig 5000x. Kør funktionen til automatisk lysstyrke kontrast, og Indstil FIB-opholdstid til 100 NS.
  20. Tryk på pause knappen for at starte scanningen. Juster FIB-fokus og bygningsfejl så hurtigt og præcist som muligt ved hjælp af de grove og fine fokus knapper og X-og Y-stigmator-knapperne på MUI-panelet. Tryk på pause knappen for at stoppe FIB-scanningen.

3. Skrivning af en automatiseret proces til ætsning

  1. Start softwaren ved at finde den i menuen Start i Windows (dvs. Start\programmer\fei Company\Applications\Nanobuilder). Placer software vinduet på side skærmen, så BRUGERGRÆNSEFLADEN ikke er dækket op. Åbn filen for at mønstre silicium sonder ved at klikke på filer og derefter åbne. Dirigere Windows-browseren til placeringen af software scriptet (supplerende fil 1 -filnavnet er "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime. JBJ").
  2. I softwaren skal du vælge rullemenuen mikroskop og vælge Angiv stadie oprindelse. I softwaren skal du vælge rullemenuen mikroskop og derefter vælge Kalibrer detektorer.
  3. På mikroskop UI, klik i quad 1 en gang med musen for at vælge quad 1. Ignorer de andre instruktioner, der vises i popup-vinduet, de er ikke nødvendige for dette projekt. Klik på OK for at starte kalibreringen. Processen vil tage omkring 5 min. Sørg for, at ETD-og ISDETEKTORER kalibreres. Det er OK, hvis andre detektorer har kalibreringsfejl.
  4. I softwaren skal du vælge rullemenuen mikroskop og vælge Udfør for at starte mønster sekvensen. Når mønsteret er færdigt, lukkes softwaren.
    Bemærk: softwaren vil overtage quad 3 og 4 for mønternes og justerings funktionerne. Scriptet vil tage ca. 12 timer at køre. Mens scriptet kører, skal du ikke ændre nogen parameter på mikroskopet.
  5. Hit "vent" i MIKROSKOPET UI Beam Control tab for at lukke mikroskopet bjælker og starte ventilatoren cyklus. Mens kammeret er udluftning, skal du flytte scenen til koordinater X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. Når kammeret er ventileret, sat på rene nitrilhandsker og træk åbne kammer døren.
  6. Løsn sætskruen på stub adapteren med 1,5 mm hex-skruenøgle. Den aluminiums stub, der indeholder den mønstrede sonde, fjernes fra kammeret. Luk forsigtigt mikroskop kammerets dør. Se CCD-kamerabilledet i kvadrant 4, mens du lukker døren. Sørg for, at Stage adapteren er en sikker afstand fra alle kritiske komponenter i mikroskopet.
  7. Vælg pil ned ud for pumpe knappen under fanen strålestyring. Vælg pumpe knap for at starte kammer vakuumpumpen. Sørg for, at døren er forseglet ved forsigtigt at skubbe på forsiden af døren, mens pumpen kører.
    Bemærk: en vakuum forsegling kan bekræftes ved forsigtigt at trække i kammer lågen, som skal forblive lukket, hvis systemet er under vakuum. Pumpe tiden vil være ca. 5 min. Kun den ene side af sonden kan ætses under en enkelt løbetur.
  8. Hvis den forreste og bageste side af sonden kræver ætsning, skal du forsigtigt fjerne den ætsede strimmel af silicium sonder efter kontrol af den endelige etch og Imaging forsiden (hvis der er behov for billeder). Opløse sølv maling med acetone, ved forsigtigt dabbing/børstning af acetone på sølv maling. Drej forsigtigt strimlen rundt til bagsiden, Re-montere, justere og etch ved at følge trinene beskrevet ovenfor.

4. kontrol af den endelige etch og billeddannelse

  1. Når fræsningen er færdig, skal du kontrollere ensartetheden af de forskellige sektioner ved hjælp af SEM Imaging ved en højere forstørrelse.
    Bemærk: billeddannelse ved den skrå vinkel giver en bedre vurdering af variationen i fræsedybden. Der bør lægges særlig vægt på overgangsregionerne mellem fræse stederne.
  2. Billede prøverne igen efter fræsning med et optisk mikroskop.
    Bemærk: de periodiske fræsede linjer resulterer i en refraktions effekt, der giver anledning til forskellige farver som en funktion af billedbehandlings vinklen. Hvis farven ikke er kontinuerlig sammen med sonden, der er en klar indikation af afbrydelsen i de fræsede linjer.

5. montering af en funktionel silikone sonde til FIB ætsning

  1. Fjern forsigtigt den funktionelle silicium elektrode fra emballagen. Brug pincet til forsigtigt at løfte plastik beskyttelses fanen, der dækker hovedstadiet. Begynd at løfte et hjørne af fanen op fra den klæbrig lim, der holder den på plads, og Fortsæt med at løfte, indtil hele elektroden er fjernet.
  2. Fastgør forsigtigt elektroden med hæmostatika for at forberede montering i den stereo taxiske ramme. Mens du holder den overdækkede fane med pincet, skal du forsigtigt placere buede produkter omkring den grønne aksel over silicium skaft, med den buede del af hemostaterne opad mod fanen. lås produkter på plads for at sikre, at elektroden ikke vil falde ud af hemostats.
  3. Fjern forsigtigt plastik beskyttelses fanen, der dækker hovedscenen. Mens du holder elektroden med hemostats, klistrer elektroden forsigtigt ind i det stereo taxiske stel til rengøring.
  4. Fyld 3 Petri skåle med 95% ethanol (~ 10 mL pr. Petri skål). Placer Petri skålen under den elektrode, der er monteret i det stereo taxiske stel til rengøring. Sænk langsomt elektroden ved at dreje micromanipulatoren nedad (100 μm/s), så skaftet nedsænkes i 95% ethanol.
    Bemærk: pas på ikke at dreje micromanipulatoren for hurtigt eller for dybt, det kan medføre, at elektroden knækker (dvs. at elektroden ikke rører ved Petri skålen).
  5. Lad elektrode skaftet stå i 95% ethanol i 5 min, og løft derefter langsomt elektroden ud af 95% ethanol ved at dreje micromanipulatoren opad (100 μm/s). Gentag dette trin to gange mere, for i alt tre skyller. Lad elektroden lufttørre i fem minutter.
  6. Brug den samme teknik til at montere elektroden i den stereo taxiske ramme, for at fjerne elektroden fra den stereotype ramme. Placer forsigtigt produkter rundt om akslen af elektroden. Når produkter er foldede stramt, frigive elektroden fra stereotaksisk ramme, returnere plastik beskyttende tab, der dækker hovedscenen, og sætte den rensede elektrode tilbage i sin emballage.

6. ætsning af funktionel silicium sonde ved brug af FIB

  1. Monter den rengjorte funktionelle silicium elektrode på en aluminiums stander. Afhent forsigtigt den rengjorte funktionelle silicium elektrode ved hjælp af pincet og fjern beskyttelses fanen fra hovedstadiet. Placer elektrode skaftet på aluminiums stub, så det ikke hænger over nogen kant, og brug derefter et lille stykke cu eller Carbon ledende tape, fastgør hovedscenen sikkert til aluminiums Stubben.
    Bemærk: Alternativt kan en lav-profil Clip holder bruges til at holde elektroden nede. Pas på ikke at røre elektrode skaftet.
  2. Ved at følge de trin, der er beskrevet ovenfor (afsnit 2), skal du placere elektroden i den eucentriske højde og sørge for, at elektroden er på et tilfældigt punkt i SEM-og FIB-strålerne. Justér skaftet med "X" retningen af scenen.
  3. Sæt FIB til den optimale strøm til fræsning af den krævede Nano-arkitektur og sørg for, at fokus og stigmatiseringen er korrekt korrigeret. Forbered en vifte af linjer med ønsket afstand og længde til at dække synsfeltet af skaft (500 μm sektioner). Juster linje længder som ætsning kommer ned skaft til de tyndere sektioner.
    Bemærk: ved ætsning af den funktionelle elektrode er det ikke muligt at tilføje fiducial mærker for at automatisere processen. Derfor foretages der manuel flytning mellem under afsnittene (~ 500 μm).
  4. Efter fræsning af den første sektion er færdig, skal du sørge for at kontrollere fræse kvaliteten, før du går videre til næste afsnit. Gentag trin 6,3 for at etch den næste del af skaftet. Juster de fræsede linjer fra det foregående afsnit til de mønstre, der bruges til næste afsnit, for at forhindre store mellemrum mellem kørsler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FIB ætset Nano-arkitektur på overfladen af enkelt skaft intracortical probes
Ved hjælp af de beskrevne metoder blev intracortical sonder ætset med specifikke nanoarkitekturer efter etablerede protokoller39. Dimensioner og form af Nano-arkitektur design, der er beskrevet i disse metoder blev implementeret fra tidligere in vitro-resultater, der skildrer et fald i gliaceller celle reaktivitet, når kulturperler med nano-arkitektur design beskrevet her37,38. De metoder, der er beskrevet her, udnyttede en fokuseret gallium ion stråle (FIB) til etch nanoskala parallelle riller i overfladen af ikke-funktionelle enkelt skaft silicium mikroelektrode sonder, som tidligere beskrevet39. De parallelle nanoskala-riller blev ætset langs skaftet på bagsiden af sonden ved hjælp af et automatiseret script, der er skrevet i softwaren. De endelige dimensioner af den ætsede Nano-arkitektur var 200 Nm brede parallelle linjer, fordelt 300 Nm fra hinanden, og havde en dybde på 200 Nm (figur 1). Brugen af FIB til etch Nano-arkitekturer i en enhed overflade giver mulighed for ætsning af præcise designs i fremstillede enheder.

Ætset Nano-arkitektur i intracortical probes effekt på Neuroinflammation
I disse tidligere rapporterede data blev de intracortical sonder med ætset Nano-arkitekturer implanteret i hjernebarken i rotter i enten to eller fire uger (n = 4 pr. tidspunkt) og sammenlignet med kontroldyr implanteret med glatte sonder, som ikke indeholdt Nano-arkitektur-raderinger (n = 4 pr. tidspunkt)39. En af mekanismerne i fiasko hæmmer den kliniske anvendelse af intracortical mikroelektroder er den neuroinflammatoriske respons induceret af at forstyrre hjerne parenkym og blod-hjerne barrieren9,10,11,12,15. En komplet beskrivelse af det neuroinflammatoriske respons observeret efter intracortical mikroelektrode implantation kan findes i de følgende anmeldelser13,14,22. Evnen af intracortical mikroelektroder til at registrere action potentialer fra neuroner er afhængig af afstanden af de sunde neuronal organer fra den intracortical mikroelektrode optagelse site40. Derfor vurderede den tidligere rapporterede undersøgelse neuroinflammation omkring det intracortical Probe implantationssted ved at kvantificere histologiske markører for neuronal tæthed, gliaceller celle aktivering og genekspression af proinflammatoriske markører39. Højdepunkter fra denne undersøgelse er præsenteret nedenfor for at repræsentere de virkninger ætsning Nano-arkitekturer i sonde overfladen havde på neuroinflammation.

Effekter af ætset Nano-arkitektur på neuron tæthed
For at bestemme, hvordan ætsning af nanoarkitekturer i sondens overflade påvirker neuronal tætheden umiddelbart omkring implantatet, blev de neuronale kerner plettet og kvantificeret ved at anvende tidligere beskrivelser af Immunhistokemi-metoderne39,41. Der var ingen signifikante forskelle i neuron tætheden omkring Nano-arkitekturen og kontrol sonderne ved 2 uger efter implantation (figur 2A). Der var dog betydeligt flere neuroner omkring Nano-arkitekturen sonder ved 100-150 μm afstand fra implantatstedet sammenlignet med de glatte kontrol implantater (p < 0,05 vs Kontroller) (figur 2B) ved 4 uger efter implantation. Det blev også konstateret, at der var en øget tendens af neuronal tæthed omkring Nano-arkitektur sonder over tid, kontrasterende den faldende tendens af neuronal tæthed omkring kontrol implantater (figur 2). Der er en direkte sammenhæng skildrer en afbødet neuroinflammatoriske respons kombineret med en højere tæthed af levedygtige neuroner omkring mikroelektroden, resulterer i en øget evne til mikroelektroden til at levere kvalitet optagelser15,40,42. Derfor, ved fortolkning af neuronal tæthed data, en højere densitet af neuroner omkring implantatet site kan indikere en mindsket Neuro inflammatorisk respons og potentielt forbedret optagelse kvalitet og stabilitet fra intracortical mikroelektroder.

Effekter af ætset Nano-arkitektur på Neuroinflammatoriske molekylære markører
Histologi er nok til at identificere cellerne omkring et implantat sted; Men, det mangler følsomhed og specificitet for karakterisering af fænotype af de omgivende celler. Derfor blev metoder, der udnytter kvantitativ genekspression analyse anvendt til at kvantificere det relative Gen ekspression af neuroinflammatoriske markører, for at forstå effekten Nano-arkitektur har på fænotype af cellerne39. Flere Neuro inflammatoriske markører blev undersøgt i det tidligere rapporterede studie. Her kun to vil blive fremhævet, der er specifikke for microglia celler, for at diskutere, hvordan deres fænotype kan være blevet ændret. Klyngen af differentiering 14 (CD14) er en mønstergenkendelse receptor på membranen af microglia, der genkender bakterier og signalerer den inflammatoriske vej efter skade/implantation43,44,45. Nitrogenoxid syntase (NOS2), er en oxidativ stress markør udtrykt i microglia/makrofager, der er forbundet med en øget produktion af proinflammatoriske markører46,47.

I de tidligere rapporterede data var der ingen signifikante forskelle i CD14 relative genekspression mellem Nano-arkitektur og kontrol implantater ved enten to-eller fire-ugers post-implantation. Der var især et signifikant fald (p < 0,05) af CD14 relative genekspression fra to til fire uger omkring Nano-arkitektur implantaterne, hvilket indikerer et muligt fald i inflammation (angivet med * i figur 3a). Tilsvarende var der ingen signifikante forskelle i NOS2 relative genekspression mellem Nano-arkitektur og kontrol implantater på to uger. Der var imidlertid betydeligt mindre (p < 0,05) NOS2 relativ genekspression omkring Nano-arkitektur implantatet sammenlignet med kontrol implantatet i fire uger efter implantation (angivet med # i figur 3B). Desuden var der en signifikant stigning fra 2 til 4 ugers NOS2 relative genekspression omkring kontrol implantater (angivet med * i figur 3B), og ingen forskelle observeret omkring Nano-arkitektur implantater over tid, yderligere indikerer en potentiel nedgang i inflammation omkring Nano-arkitektur implantater. Ved fortolkningen af disse data er det vigtigt at forstå funktionen af genet, der kvantificeres. For eksempel indikerer fald af pro-inflammatoriske gener en sandsynlig nedgang i den inflammatoriske respons omkring elektrode stedet, mens en stigning i disse typer af gener tyder på en sandsynlig stigning i inflammation.

FIB ætset Nano-arkitektur på overfladerne af funktionelle enkelt skaft Mikroelektroer
Den tidligere rapporterede undersøgelse havde lovende resultater viser en lille stigning af neuron tæthed og den potentielle fald i microglia inflammatorisk fænotype omkring Nano-arkitektur Probe implantat site. For at undersøge oversættelsen af disse resultater til elektrode funktionalitet, en funktionel enkelt skaft silicium mikroelektrode blev ætset med samme Nano-arkitektur design som den ikke-funktionelle enkelt skaft silikone mikroelektrode sonder, udnytte en lignende FIB ætsning protokol. Den eneste forskel i metoden til ætsning af den specificerede Nano-arkitektur var, at protokollen for de funktionelle elektroder ikke kunne automatiseres, da det ikke var noget ekstra substratmateriale til at skabe fiducial markeringer. Således blev den funktionelle elektrode manuelt ætset ved hjælp af FIB ved at re-justere strålen hver 500 μm, som beskrevet i protokollen ovenfor. De endelige raderinger var 200 Nm brede parallelle linjer, fordelt 300 Nm fra hinanden, og havde en dybde på 200 Nm (figur 4).

Effekter af ætset Nano-arkitektur i intracortical Mikroelektroderne på Elektrofysiologi
Vellykkede intracortical mikroelektrode optagelser er afhængige af nærheden af neuroner omkring implantations stederne, integriteten af anordningen og pålidelig transmission af enkelt enhed aktivitet fra hjernen8,40,48,49. Elektrofysiologiske optagelser blev kvantificeret ved hjælp af indspillede målinger indsamlet to gange om ugen over otte uger. De anvendte Metrics i denne undersøgelse var den procentdel af kanaler, der optager enkelt enheder, maksimale amplituder af optagede enheder og signal-støj-forhold (SNR). De institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg (IACUC) på Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center godkendte alle dyreforsøg. Sprague Dawley rotter (8-10 uger gamle og vejer ~ 225 g) blev implanteret med enkelt skaft silicium mikroelektrode, med ovennævnte Nano-arkitektur (n = 1) eller den glatte kontrol (n = 6). Der blev ikke foretaget nogen statistisk analyse af disse data, da en mikroelektrode med nano-arkitektur blev implanteret til et proof-of-concept-pilotforsøg. Ikke desto mindre, kollektive elektrofysiologiske resultater viser en øget procentdel af kanaler optage enkelt enheder (figur 5A), maksimale amplituder (figur 5B) af indspillede enheder, og SNR (figur 5C) fra Nano-arkitektur mikroelektroderne sammenlignet med den glatte kontrol mikroelektroderne, er lovende. Disse resultater indikerer, at ætsning af Nano-arkitektur i overfladen af mikroelektroder kan potentielt resultere i forbedret kvalitet og øget levetid af elektrofysiologiske optagelser. Yderligere evaluering med øget stikprøvestørrelse er nødvendig for at verificere disse foreløbige resultater.

Figure 1
Figur 1: FIB ætset Nano-arkitektur på overfladen af enkelt skaft intracortical sonder. SEM billeder af de ikke-funktionelle enkelt skaft silicium sonder med FIB ætset Nano-arkitekturer langs bagsiden af skaftet. (A) sammensatte billeder af hele sonde post ætsning vist ved 120x forstørrelse, skala bar = 400 μm. De fiducial mærker, (firkantet boks med et + symbol, der går igennem det), er ætset langs silicium substratet omkring sonden. Forstørrede SEM-billeder af probespidsen vises i (B) ved 1, 056x forstørrelse (Scale bar = 40 μm), (C) ved 3, 500X forstørrelse (skala bar = 10 μm), og (D) ved 10.000 x forstørrelse, Scale bar = 4 μm. Dette tal er blevet ændret fra reference39. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: virkningerne af ætset Nano-arkitektur på neuron tæthed. Neuronal overlevelse præsenteres som en procentdel af baggrunds regionen fra de samme dyr i afstande på 50 μm siloer væk fra implantationsstedet. A) der blev ikke observeret signifikante forskelle i neuronal overlevelse mellem de glatte overflader (kontrol) og nanopatterimplantater ved 2 uger efter implantation. B) der var en signifikant højere neuronal overlevelse omkring de nanopattererede implantater i 100-150 μm-afstand sammenlignet med glatte overflader (p < 0,05) ved 4 uger efter implantation. Repræsentative billeder af neuroner (farvet grøn), med den gule kontur skildrer implantationsstedet, og "P" betegner den ætsede side af mikroelektroden, skala bar = 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra39. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: virkninger af ætset Nano-arkitektur på Neuroinflammatoriske molekylære markører. Væv blev indsamlet omkring 500 μm radius af implantationsstedet for både nanopatterned og kontrol implantater. Relative genekspression af inflammatoriske markører var kvantitativt sammenlignet mellem begge implantat typer (forskellene er angivet med # på grafen; p < 0,05) samt over tid (forskellene er angivet med * på grafen; p < 0,05). A) det relative genekspression af CD14 faldt markant omkring nanopatterimplantater fra to til fire uger (*). B) der var et signifikant mindre relativ genekspression af NOS2 omkring nanopattern implantat sammenlignet med kontrol på fire uger (#), og der var en signifikant stigning på NOS2 fra to til fire uger omkring glatte kontrol implantater (*). Dette tal er blevet ændret fra reference39. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: FIB ætset Nano-arkitektur på overfladerne af funktionelle enkelt skaft Mikroelektroer. Justerings i øverste højre hjørne viser mikroelektroden udnyttet i dette studie ved siden af en skilling til at skildre størrelsen af elektrode skaft (tynd sort linje). SEM billeder af mikroelektroderne skaft med FIB ætsede Nano-arkitekturer langs bagsiden af skaftet. Hele skaftet er vist øverst ved 600x forstørrelse (Scale bar = 50 μm), mens justerings skildrer den nanopatterede overflade ved 25, 000x forstørrelse, skala bar = 1 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: effekter af ætset Nano-arkitektur i intracortical Mikroelektroderne på Elektrofysiologi. Evaluering af elektrofysiologiske målinger opdagede en lovende foreløbig stigning i (a) procentdel af kanaler,deroptager enkelt enheder, (B) maksimale amplituder af indspillede enheder, og (C) signal-støj-forhold fra mikroelektroden ætset med nanoarkitekturer sammenlignet med de glatte kontrol elektroder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Elektrofysiologi optagelse fra implanterede funktionelle enkelt skaft Mikroelektroderne med FIB ætsede Nano-arkitekturer. En af udfordringerne ved at bruge FIB til etch Nano-arkitekturer på fremstillede mikroelektrode enheder er risikoen for kortslutning optagelse kontakter. X-aksen skildrer optagelsestid i sekunder, og y-aksen viser elektrode kanalerne, som registrerer neuronal aktionspotentialer. Hver nummereret linje på y-aksen repræsenterer en anden elektrode kanal, hvor kanalnummer 1 er den skalerligste og 16 er den dybeste. De røde kasser skitserer de kortsluttede kanaler, mens de blå kasser skitserer kanaler med synlig neuronal aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den fabrikations protokol skitseret her udnytter fokuseret ion Beam litografi til effektivt og reproducerbart etch Nano-arkitekturer i overfladen af ikke-funktionelle og funktionelle enkelt skaft silicium mikroelektroer. Fokuseret ionstråle (FIB) litografi giver mulighed for selektiv ablation af substrat overfladen ved hjælp af en fint fokuseret ionstråle50,51. FIB er en Direct-Write teknik, der kan producere forskellige funktioner med nanoskala opløsning og høj billedformat50,52,53. For at skabe de forskellige størrelse funktioner, kan størrelsen af ion stråle strømmen optimeres til at ændre ion Beam spot størrelse inden for en rækkevidde af 3 nm til 2 μm50,51. Nogle generelle fordele ved at bruge FIB til etch funktioner på overflader er: 1) det kan bruges på en bred vifte af materialer, herunder silicium, metaller, og polymerer53,54,55,56, 2) FIB kan udføres på ikke-planar overflader, og 3) FIB kan anvendes til efter behandling på individuelle enheder57.

Her blev FIB brugt i kombination med et SEM mikroskop og software, der bruges til at skrive en specialiseret automatiseret script til ætsning specifikke funktioner i ikke-funktionelle enkelt skaft sonder. Scriptet omfattede parametre, der kræves (2,5 nA ion stråle strøm og 30 kV spænding) at etch den nøjagtige afstand ønskede (200 Nm brede parallelle riller, fordelt 300 Nm fra hinanden og 20 Nm dyb). Elektrodens dimensioner overskred synsfeltet for FIB, så mønstret blev udført i flere scene positioner. For at automatisere processen, blev de fiduelle mærker ætset ind i siden af silicium plade, der holder proberne på plads, for at give softwaren mulighed for præcist at lokalisere de mønstrede linjer på sonde skaftet. De fiducials var nødvendige, fordi scenen bevægelse skabt en stor (~ 5 μm) usikkerhed i placeringen af mønsteret område med hensyn til ion stråle synsfelt. Placeringen af fiducialerne på silicium arket tillod FIB at lokalisere mønster områderne uden direkte at scanne strålen på sonde skaftet, som potentielt kunne forurenes eller beskadige sonde skaftet. Hele den automatiserede ætsning af et skaft tog ca. 12 timer for at fuldføre og krævede ingen operatør intervention, efter at mønstret blev påbegyndt. Kollektivt, fordelene ved at bruge FIB til etch funktioner i silicium sonde skaft var evnen til at gøre nanometer størrelse funktioner, automatisere ætsning proces, og evnen til at etch på en fabrikeret sonde. Selvom FIB har rigelige fordele, er en af ulemperne ved at bruge denne fabrikationsmetode den langsomme Gennemløbshastighed, der i sidste ende begrænser potentialet for masseproduktion af enheder med nanoarkitekturer i deres Surface58. Alternativt, andre fabrikationsmetoder udnyttes til at skabe funktions størrelser og geometrier af interesse, måske med hurtigere satser og ved masse produktioner, omfatter elektronstråle litografi og nanoimprint litografi59,60,61,62,63,64,65. Disse metoder tillader dog ikke ætsning af Nano-arkitektur funktioner i fremstillede enheder. Traditionelt disse metoder udnyttes under fremstillingsprocessen på et ark af silicium eller polymer, som derefter kan anvendes i downstream forarbejdning skridt til at fabrikere den endelige bedrage.

De funktionelle elektroder var ikke i stand til at gennemgå en automatiseret proces, fordi der ikke var noget omgivende materiale omkring elektrode skaftet til at inkludere fiducial mærker i kørslen. Derfor blev de funktionelle elektroder manuelt justeret og ætset ved 500 μm sektioner langs skaftet ved hjælp af den samme ion strøm og spænding som den automatiserede kørsel for at sikre de samme funktions størrelser. Strålen skulle manuelt justeres efter at have afsluttet hvert 500 μm interval og sat op til etch næste afsnit. Processen med manuel omjustering af mønstrene hver 500 μm kan potentielt føre til beskadigede nanostrukturer eller strukturer, der ikke svarer til den tilsigtede geometri. Dette skyldes længere eksponeringstider, at ionstrålen har behov for Manuel justering66. Dette var en af vanskelighederne med den manuelle ætsning. På grund af denne komplikation blev to optagelses kontakter kortsluttet og kunne ikke registrere neuronal virknings potentialer (figur 6). Figur 6 viser et elektrofysiologisk Live optagelses segment fra det dyr, som er implanteret med nano-arkitektur elektroden. De blå bokse skitserer kanalerne optagelse af stærke action potentialer, i forhold til de røde bokse, som angiver de to døde kanaler. Derfor er en af udfordringerne ved at bruge manuel FIB ætsning på post-producerede elektroder er, at der er en chance for, at strålen kan kortslutte kontakter og forhindre dem i at optage. Denne udfordring forstærkes, når man forsøger at etch forsiden af enkelt skaft silicium elektroder, hvor optagelsen kontakter og spor er langs hele skaft af elektroden. Selv om det er muligt at etch silicium omkring optagelsen kontakter og spor, ekstra forsigtighed tilrådes at undgå skader og nedsat ydeevne af optagelsen kapaciteter af elektroden.

Som tidligere nævnt, FIB kan udnyttes på forskellige materialer til etch talrige feature geometrier i overfladen. Det er dog vigtigt at bemærke, at parametrene til etch geometrier, såsom linjer i de forskellige materialer, er komplicerede at forudsige. Især for linjemønstre er linjebredden og dybden stærkt afhængige af mange parametre som accelererende spænding, stråle strøm, opholdstid, pixel afstand, levetid af blænde og materialetype. En anden parameter, der er resultatet af optimeringen, er den samlede tid til at fræser hver linje. Smallere og dybere linjer kan opnås ved hjælp af mindre stråle strømme; men mønster tiden for en hel sonde skaft vil strække sig til flere dage, hvilket ikke er praktisk. Selv om det er muligt at optimere den protokol, der præsenteres her, ville det være overordentlig vanskeligt at beskrive parametrene for ukendte materialer. Ved fejlfinding af parametrene for silicium sonder beskrevet i denne protokol, blev der foretaget talrige test nedskæringer i silicium for at evaluere, hvordan de skiftende forhold påvirkede stregbredden og dybderne. Så snart de evaluerede betingelser var i stand til at etch den specifikke funktion størrelse og geometri af interesse (200 Nm brede linjer, der var 200 Nm dyb), disse parametre blev brugt til at skrive software scriptet. Scriptet blev brugt til at styre afstanden mellem hver linje, fra centrum til centrum, som i denne protokol er 300 Nm. Fremtidige undersøgelser udnytter silicium substrater/enheder, der kræver funktions størrelser i hundredvis af nanometer, kan bruge de parametre, der er beskrevet i denne protokol som et udgangspunkt for fejlfinding de nødvendige betingelser for at skabe de ønskede funktioner størrelser. Yderligere optimering og fejlfinding af ætsning betingelser vil være påkrævet for metal og polymer substrater/enheder. Generelt giver anvendelse af FIB til ætsning af nanoarkitekturer til materialeoverflader mulighed for rigelig kontrol og fleksibilitet i funktions geometrier, brug af mange kompatible materialer og flere overfladetyper, herunder fremstillede enheder. Repræsentative resultater præsenteret heri viste de potentielle fordele observeret i vores undersøgelser af udnytte FIB til etch Nano-arkitekturer i overfladen af intracortical mikroelektroder: 1) øget neuronal tæthed og 2) reduktion af neuroinflammatoriske markører omkring implanterede enheder med nano-arkitekturer, samt 3) foreløbige resultater skildrer forbedret kvalitet af elektrofysiologiske optagelser over tid. Ligeledes, beskæftigelse og optimering af den beskrevne protokol ætsning Nano-arkitektur funktioner i overfladen af et materiale kan udnyttes til at forbedre funktionaliteten af talrige medicinske enheder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af USA (USA) Department of Veterans Affairs rehabilitering forskning og udvikling service Awards: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) og #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). Indholdet repræsenterer ikke de synspunkter, som det amerikanske Department of Veterans Affairs eller den amerikanske regering. Forfatterne vil gerne takke FEI Co. (nu en del af Thermo Fisher Scientific) for personale assistance og brug af instrumentering, som hjalp med at udvikle de scripts, der anvendes i denne forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-Channel ZIF-Clip Headstage Tucker Davis Technologies ZC16 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrapped Thomas Scientific 1213F04 Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder Tucker Davis Technologies Z-ROD32 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml Ted Pella 16023 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter Hemostat Fine Science Tools 13013-14 Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double Coated Ted Pella 16084-7 The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well Sigma Aldrich CLS3736-100EA Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11251-30 Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs Fisher Scientific 22-032-600 Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm Ted Pella 16148 Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll Fisher Scientific 01-213-101 Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes Fisher Scientific 02-617-149 Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrode NeuroNexus A1x16-3mm-100-177 http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holder KOPF Model 1772 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument KOPF Model 900-U Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly KOPF Model 960 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') Ted Pella 807-5 https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V Ted Pella 520-1-220 Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver Paint Ted Pella 16062 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab Thermo Fisher Scientific Helios G2 650 This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salcman, M., Bak, M. J. A new chronic recording intracortical microelectrode. Medical and Biological Engineering. 14 (1), 42-50 (1976).
  2. Im, C., Seo, J. -M. A review of electrodes for the electrical brain signal recording. Biomedical Engineering Letters. 6 (3), 104-112 (2016).
  3. Donoghue, J. Bridging the Brain to the World: A Perspective on Neural Interface Systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
  4. Gilja, V., et al. Clinical translation of a high-performance neural prosthesis. Nature medicine. 21 (10), 1142-1145 (2015).
  5. Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17849-17854 (2004).
  6. Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping in a person with tetraplegia through brain-controlled muscle stimulation: a proof-of-concept demonstration. Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
  7. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  8. Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
  9. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
  10. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
  11. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
  12. Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neurosciences. 6 (1), 48-67 (2015).
  13. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
  14. Michelson, N. J., et al. Multi-scale, multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
  15. Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
  16. Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
  17. Ravikumar, M., et al. The Roles of Blood-derived Macrophages and Resident Microglia in the Neuroinflammatory Response to Implanted Intracortical Microelectrodes. Biomaterials. 0142 (35), 8049-8064 (2014).
  18. Hermann, J., Capadona, J. Understanding the Role of Innate Immunity in the Response to Intracortical Microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
  19. Ereifej, E. S., et al. Implantation of Intracortical Microelectrodes Elicits Oxidative Stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00009 (2018).
  20. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  21. Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
  22. Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862 (2017).
  23. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  24. Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
  25. Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 7 (3), 315-326 (1999).
  26. Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
  27. Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11 (5), 056014 (2014).
  28. Wei, X., et al. Nanofabricated Ultraflexible Electrode Arrays for High-Density Intracortical Recording. Advanced Science. , 1700625 (2018).
  29. Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
  30. Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
  31. Kim, Y., et al. Nano-Architectural Approaches for Improved Intracortical Interface Technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
  32. Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chemical Neurosciences. 1 (1), 36-48 (2010).
  33. Ding, H., Millet, L. J., Gillette, M. U., Popescu, G. Actin-driven cell dynamics probed by Fourier transform light scattering. Biomedical Optical Express. 1 (1), 260-267 (2010).
  34. Kotov, N. A., et al. Nanomaterials for Neural Interfaces. Advanced Materials. 21 (40), 3970-4004 (2009).
  35. Curtis, A. S., et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Trans Nanobioscience. 3 (1), 61-65 (2004).
  36. Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5 (1), 13406 (2011).
  37. Ereifej, E. S., et al. Nanopatterning effects on astrocyte reactivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (6), 1743-1757 (2013).
  38. Ereifej, E. S., Cheng, M. M. -C., Mao, G., VandeVord, P. J. Examining the inflammatory response to nanopatterned polydimethylsiloxane using organotypic brain slice methods. Journal of Neuroscience Methods. 217 (1-2), 17-25 (2013).
  39. Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
  40. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  41. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
  42. Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
  43. Sladek, Z., Rysanek, D. Expression of macrophage CD14 receptor in the course of experimental inflammatory responses induced by lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. Veterinarni Medicina. 53 (7), 347-357 (2008).
  44. Janova, H., et al. CD14 is a key organizer of microglial responses to CNS infection and injury. Glia. , (2015).
  45. Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Ulevitch, R. J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today. 14 (3), 121-125 (1993).
  46. Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell Science. 117 (14), 2865-2867 (2004).
  47. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences. 75 (6), 639-653 (2004).
  48. Kozai, T. D., et al. Comprehensive chronic laminar single-unit, multi-unit, and local field potential recording performance with planar single shank electrode arrays. Journal of Neurosciences Methods. 242, 15-40 (2015).
  49. Kozai, T. D., et al. Mechanical failure modes of chronically implanted planar silicon-based neural probes for laminar recording. Biomaterials. 37, 25-39 (2015).
  50. Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. FIB-nanostructured surfaces and investigation of bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Transactions on Nanobioscience. 7 (1), 1-10 (2008).
  51. Lehrer, C., Frey, L., Petersen, S., Ryssel, H. Limitations of focused ion beam nanomachining. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures Processing, Measurement, and Phenomena. 19 (6), 2533-2538 (2001).
  52. Watkins, R., Rockett, P., Thoms, S., Clampitt, R., Syms, R. Focused ion beam milling. Vacuum. 36 (11-12), 961-967 (1986).
  53. Veerman, J., Otter, A., Kuipers, L., Van Hulst, N. High definition aperture probes for near-field optical microscopy fabricated by focused ion beam milling. Applied Physics Letters. 72 (24), 3115-3117 (1998).
  54. Lanyon, Y. H., Arrigan, D. W. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. Sensors and Actuators B: Chemical. 121 (1), 341-347 (2007).
  55. Menard, L. D., Ramsey, J. M. Fabrication of sub-5 nm nanochannels in insulating substrates using focused ion beam milling. Nano Letters. 11 (2), 512-517 (2010).
  56. Ziberi, B., Cornejo, M., Frost, F., Rauschenbach, B. Highly ordered nanopatterns on Ge and Si surfaces by ion beam sputtering. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (22), 224003 (2009).
  57. Reyntjens, S., Puers, R. A review of focused ion beam applications in microsystem technology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 11 (4), 287 (2001).
  58. Heyderman, L., David, C., Kläui, M., Vaz, C., Bland, J. Nanoscale ferromagnetic rings fabricated by electron-beam lithography. Journal of Applied Physics. 93 (12), 10011-10013 (2003).
  59. Baquedano, E., Martinez, R. V., Llorens, J. M., Postigo, P. A. Fabrication of Silicon Nanobelts and Nanopillars by Soft Lithography for Hydrophobic and Hydrophilic Photonic Surfaces. Nanomaterials. 7 (5), 109 (2017).
  60. Eom, H., et al. Nanotextured polymer substrate for flexible and mechanically robust metal electrodes by nanoimprint lithography. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (45), 25171-25179 (2015).
  61. Li, K., Morton, K., Veres, T., Cui, B. 5.11 Nanoimprint Lithography and Its Application in Tissue Engineering and Biosensing. Comprehensive Biotechnology. , 125-139 (2011).
  62. Dong, B., Zhong, D., Chi, L., Fuchs, H. Patterning of conducting polymers based on a random copolymer strategy: Toward the facile fabrication of nanosensors exclusively based on polymers. Advanced Materials. 17 (22), 2736-2741 (2005).
  63. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Wilkinson, C. D. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (4), 973-979 (2008).
  64. Tseng, A. A., Chen, K., Chen, C. D., Ma, K. J. Electron beam lithography in nanoscale fabrication: recent development. IEEE Transactions on Electronics Packaging Manufacturing. 26 (2), 141-149 (2003).
  65. Yang, Y., Leong, K. W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 478-495 (2010).
  66. Vermeij, T., Plancher, E., Tasan, C. Preventing damage and redeposition during focused ion beam milling: The "umbrella" method. Ultramicroscopy. 186, 35-41 (2018).

Tags

Bioteknik fokuseret ionstråle litografi intracortical mikroelektrode Nano-arkitektur Elektrofysiologi neuroinflammation biokompatibilitet
Fokuseret Ionstrålithografi til etch Nano-arkitekturer i Mikroelektroderne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahajan, S., Sharkins, J. A.,… More

Mahajan, S., Sharkins, J. A., Hunter, A. H., Avishai, A., Ereifej, E. S. Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes. J. Vis. Exp. (155), e60004, doi:10.3791/60004 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter