Summary
우리는 나노 아키텍처를 피질 내 미세 전극 장치로 에칭하면 염증 반응을 감소시킬 수 있으며 전기 생리학적 기록을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 본 명세서에 기재된 방법은 나노-아키텍처를 비기능적이고 기능적인 단일 생크 실리콘 의 표면에 에칭하는 접근법을 설명한다.
Abstract
전자 및 제조 기술의 발전으로, 피질 내 마이크로 전극은 더 큰 해상도와 확장 된 기능을 가진 정교한 마이크로 전극의 생산을 가능하게 상당한 개선을 겪고있다. 제조 기술의 발전은 뇌 의 자렌치마에 원활하게 통합하고, 전극 삽입 후 관찰 된 신경 염증 반응을 감소시키고 품질을 향상시키는 것을 목표로하는 생체 모방 전극의 개발을 지원하고 있으며, 전기 생리학적 기록의 수명. 여기서 우리는 최근 나노 아키텍처로 분류된 생체 모방 접근법을 채택하는 프로토콜을 설명합니다. 집중 된 이온 빔 리소그래피 (FIB)의 사용은 비 기능및 기능적 단일 생크 내 미세 전극의 표면에 특정 나노 아키텍처 기능을 에칭하기 위해이 프로토콜에서 활용되었다. 전극 표면에 나노 아키텍처를 에칭하는 것은 이식 된 장치의 생체 적합성 및 기능성의 가능한 개선을 나타냈다. FIB 사용의 이점 중 하나는 장치를 제조하는 동안과 는 달리 제조 된 장치에 에칭할 수 있다는 것입니다. 본 명세서에 제시된 프로토콜은 다양한 재료 유형, 나노 아키텍처 특징 및 디바이스의 종류에 최적화될 수 있다. 이식된 의료 기기의 표면을 보강하면 장치 성능과 조직 내 통합을 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
피질 내 미세 전극 (IME)은 대뇌 피질1,2내부의 외부 장치와 신경 인구 사이의 직접적인 상호 작용 수단을 제공하는 침습적 전극이다. 이 기술은 신경 기능을 탐구 하는 과학자의 능력을 개선 하기 위해 신경 행동 잠재력을 기록 하기 위한 귀중 한 도구, 신경 질환의 사전 이해 와 잠재적인 치료를 개발. 뇌 기계 인터페이스 (BMI) 시스템의 일부로 사용되는 피질 내 마이크로 전극은 기능적 출력을 생성하는 데 사용할 수있는 모터 의도를 감지하기 위해 뉴런의 개인 또는 작은 그룹에서 행동 전위를 기록 할 수 있습니다3. 실제로, BMI 시스템은 근위축성 측삭 경화증(ALS)4 및 척수 손상5 및 만성 테트라클레아를 앓고 있는 사람들의 움직임을 회복시키기 위해 획득된 감각운동 리듬 조절과 같은 보철 및 치료 목적으로 성공적으로 사용되어 왔다6.
불행히도, IIM은 종종 기계적, 생물학적 및 물질적 인자7,8을포함하는 여러 고장 모드로 인해 시간이 지남에 따라 일관되게 기록하지 못합니다. 전극 이식 후 발생하는 신경염증성 반응은 전극 부전9,10,11, 12,13,14에기여하는 상당한 도전으로 생각된다. 신경 염증 반응은 혈액 뇌 장벽을 단절하고, 국소 뇌 뼈를 손상시키고 신경교 및 신경 세포 네트워크를 방해하는 IME의 초기 삽입 중에 시작됩니다15,16. 이러한 급성 반응은 임플란트 부위17,18,19,20주위의 염증 및 신경 독성 분자를 방출하는 신경교세포(microglia/대식세포 및 성상세포)의 활성화를 특징으로 한다. 신경교 세포의 만성 활성화는 건강한 뇌 조직7,9,12,13,17,21,22에서전극을 분리하는 신경교 흉터의 형성을 특징으로하는 이물질 반응을 초래한다. 궁극적으로, 전극과 뉴런 사이의 물리적 장벽과 뉴런의 변성 및 사망으로 인한 뉴런 작용 전위를 기록하는 전극의 능력을 저해하는23,24,25.
피질 내 미세 전극의 초기 실패는 생체 모방 전략26,27,28,29,30에중점을 둔 차세대 전극 개발에 상당한 연구를 가져왔습니다. 여기서 설명된 프로토콜에 특히 관심이 있는 것은, IME31에대한 생체 모방 표면 변경의 클래스로서 나노 아키텍처의 사용이다. 생체내 자연환경의 구조를 모방한 표면이 생체적합성반응(32, 33,34,35,36)을개선한 것으로 확립되었다. 따라서, 이 프로토콜을 강요하는 가설은 뇌 조직의 거친 구조와 피질 내 미세 전극의 원활한 구조 사이의 불연속이 이식된 ImEs에 대한 신경 염증 및 만성 이물질 반응에 기여할 수 있다는 것이다(전체 검토를 위해 김 등31참조). 우리는 이전에 뇌의 세포외 매트릭스 아키텍처와 유사한 나노 아키텍처 특징의 활용이 나노 아키텍처 기질상에서 배양된 세포로부터 성상세포 염증 마커를 감소시킨다는 것을 보여주었으며, 신경염증의 생체내 및 생체내 모델 모두에서 평평한 대조군 표면에 비해37,38. 더욱이, 우리는 나노 구조에 직접 나노 아키텍처를 에칭하는 집중 된 이온 빔 (FIB) 리소그래피의 응용을 보여주었으며, 매끄러운대조군(26)에비해 나노 아키텍처 프로브에 이식된 동물로부터의 신경 생존력 및 낮은 발현을 크게 증가시켰다. 따라서, 여기에 제시된 프로토콜의 목적은 제조된 피질 내 미세 전극 장치에 대한 나노 아키텍처에 대한 FIB 리소그래피의 사용을 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 나노 아키텍처 크기의 기능을 자동화 및 수동 프로세스를 모두 활용하여 피질 내 마이크로 전극 생크의 실리콘 표면에 식각하도록 설계되었습니다. 이러한 방법은 복잡하지 않고 재현 가능하며 다양한 장치 재료 및 원하는 피처 크기에 맞게 최적화할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 실험실 외투와 장갑과 같은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 다음 단계를 수행하십시오.
1. 초점 이온 빔 (FIB) 리소그래피용 비기능성 실리콘 프로브 장착
참고 : 1,000 프로브와 SOI 웨이퍼의 제조를 설명하는 전체 절차에 대한, Ereifej 등39를참조하십시오.
- 1,000개의 프로브를 포함하는 절연체(SOI) 웨이퍼의 실리콘에서 2-3개의 실리콘 프로브 스트립을 분리합니다. 3개 이상의 실리콘 프로브가 포함된 스트립을 만들지 마십시오. 이로 인해 장착이 느슨해질 가능성이 높아지며 FIB가 잘못 에칭될 수 있습니다.
참고 : 알루미늄 스텁에 단단히 앉지 않는 스트립 / 프로브는 두 가지 합병증을 일으킬 수 있습니다 : 1) 스테이지가 다음 섹션에서 작동하도록 움직일 때 진동이 있을 것이고 프로브가 정착 할 때까지 밀링이 정확하지 않으며 2) 높은 변형을 일으키고 초점 평면에서 벗어날 수 있습니다.- 장갑을 끼고 있는 동안 미세한 집게를 사용하여 프로브 주위에 압력을 가하여 2~3개의 프로브가 포함된 작은 부분을 끊습니다.
- FIB 에칭 전에 모든 먼지와 이물질의 실리콘 프로브를 조심스럽게 청소하십시오. 3 mL / 3 mL / 3 개의 우물 95 % 에탄올을 3 개의 우물로 피펫팅하여 6 개의 잘 폴리스티렌 플레이트를 준비하십시오.
- 미세 팁 이나 진공 집게를 사용 하 여 실리콘 프로브의 컷 스트립을 신중 하 게 데리 러 셀 스트레이너에 배치 합니다. 스트레이너당 실리콘 프로브 스트립을 하나만 놓아 프로브가 파손되지 않도록 하십시오. 실리콘 프로브 스트립이 들어있는 여과기를 청소를 위해 95 % 에탄올이 들어있는 첫 번째 우물에 놓습니다. 5 분 동안 첫 번째 우물에서 여과기를 유지하십시오.
- 실리콘 프로브를 포함하는 스트레이너를 첫 번째 우물에서 이동하고 다른 5 분 동안 95 % 에탄올을 포함하는 두 번째 우물에 놓습니다.
- 세척된 실리콘 프로브가 들어 있는 여과기를 폴리테트라플루오로에틸렌 플레이트에 놓아 공기 건조시. 먼지로 인한 오염을 방지하기 위해 멸균 후드에서 이 단계를 수행하십시오.
- 공기 건조 된 실리콘 프로브 스트립을 밀봉 된 용기에 놓고 SEM-FIB로 운반하십시오. 공기 건조 시료를 함유한 여과기를 세척을 유지하기 위해 운반 및/또는 보관을 위해 플라스틱 또는 알루미늄 호일 랩으로 감쌉니다.
- 미세 한 팁 또는 진공 집게를 사용하여 실리콘 프로브의 깨끗한 스트립을 조심스럽게 집어 들고 깨끗한 알루미늄 스텁 (SEM-FIB 이미징 / 에칭에 사용)에 놓아 장착준비를하십시오.
- 이쑤시개(또는 얇은 전선과 같은 다른 미세한 기울어진 기기)를 사용하여 프로브를 둘러싼 실리콘 기판 가장자리에 은 페인트의 작은 방울(~10 μL)을 놓습니다. 프로브를 둘러싼 실리콘 기판의 측면 주위에 은 페인트를 확산시켜 스트립을 아래로 고정시다. 알루미늄 스텁을 SEM-FIB에 넣기 전에 은색 페인트가 완전히 건조되도록 하십시오.
참고 : 그것이 에칭 될 부분이기 때문에 전극의 생크에 은색 페인트를 얻지 않도록주의하십시오. 프로브 스트립이 알루미늄 스텁에 단단히 고정되지 않으면 스트립이 처리 중에 이동하거나 다른 초점 평면을 가질 수 있으므로 FIB에 의한 잘못된 밀링이 발생할 수 있습니다. 실리콘 프로브의 여러 스트립은 동일한 알루미늄 스텁에 장착할 수 있으므로 에칭 후 스텁에서 제거할 수 있도록 스트립 사이에 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 아래에 설명된 자동화된 기능을 사용하여 여러 프로브를 보다 효율적으로 에칭할 수 있습니다.
2. FIB를 실리콘 프로브에 맞추기
- 빔 컨트롤 탭의 통풍구 버튼을 클릭하여 챔버를 환기시려면 시프트+F3를 눌러 홈 스테이지를 수행합니다. 팝업 창에서 홈 스테이지 버튼을 선택하여 선택 영역을 확인합니다.
참고 : 홈 스테이지 작업을 실행하는 것은 단계 축이 소프트웨어에 의해 올바르게 판독되고 현미경이 양호한 상태인지 확인하는 예방 단계입니다. - 홈 스테이지가 완료되면 스테이지를 이동하여 X = 70mm, Y = 70mm, Z = 0mm, T = 0°, R = 0°를 좌표합니다. 챔버가 환기되면 깨끗한 니트릴 장갑을 착용하고 챔버 도어를 엽니다.
참고: 이전 사용자의 응용 프로그램에 따라 스테이지 어댑터를 변경해야 할 수 있습니다. 표준 스테이지 어댑터(예: FEI 스타일)는 중앙 볼트를 시계 반대 방향으로 풀고 스테이지의 회전 플레이트에 시계 방향으로 나사를 조여 설치하여 제거할 수 있습니다. - 프로브를 고정하는 알루미늄 스텁을 스테이지 어댑터 상단에 삽입합니다. 무대 어댑터 의 측면에 세트 나사를 조여 알루미늄 스텁을 고정합니다. 이 작업에는 1.5mm 육하는 렌치를 사용하십시오.
- 어댑터를 시계 방향으로 돌려 스테이지 어댑터의 높이를 조정하여 낮추거나 시계 반대 방향으로 올리도록 합니다. 너트가 스테이지 회전 플레이트에 대해 안전할 때까지 잠금 콘 너트를 시계 방향으로 돌려 스테이지 어댑터를 회전 플레이트에 고정합니다. 잠금 콘 너트를 조이면서 어댑터와 샘플의 회전을 방지하기 위해 다른 손으로 스테이지 어댑터를 잡습니다.
참고: 제공된 높이 게이지를 사용하여 적절한 높이를 결정합니다. 알루미늄 스텁의 위쪽높이는 높이 게이지에 표시된 최대 선과 같아야 합니다. 콘 너트를 과도하게 조이면 스테이지와 어댑터가 손상될 수 있습니다. 샘플을 고정하기에 충분한 힘만 사용하십시오. - 내비게이션 카메라 이미지를 획득합니다. 내비게이션 카메라 팔이 멈출 때까지 조심스럽게 스윙합니다. 현미경 스테이지는 자동으로 카메라 아래 의 위치로 이동합니다. 현미경 사용자 인터페이스(UI)의 사분면 3에 표시된 라이브 이미지를 시청합니다.
- 밝기 레벨 자동이 적절한 수준으로 조정되면 카메라 브래킷의 버튼을 아래로 눌러 이미지를 획득합니다. 사분면 3에 나타나는 일시 중지 기호와 카메라의 조명이 꺼져 있는 전체 이미지 수집이 완료될 때까지 기다려야 합니다. 이것은 약 10 초 걸립니다. 카메라 팔을 닫힌 위치로 다시 스윙하십시오. 스테이지가 원래 위치로 돌아갑니다.
- 현미경 챔버 도어를 조심스럽게 닫습니다. 문을 닫는 동안 쿼드런트 4의 CCD 카메라 이미지를 보십시오. 시료와 스테이지가 현미경 챔버의 중요한 구성 요소로부터 안전한 거리인지 확인합니다.
- 빔 제어 탭의 펌프 버튼 옆의 아래쪽 화살표를 선택합니다. UI 소프트웨어에서 샘플 청소 버튼이 있는 펌프를 선택하여 챔버 진공 펌프를 시작하고 플라즈마 클리너에 내장합니다. 펌프가 가동되는 동안 도어의 얼굴을 부드럽게 밀어 도어를 밀봉해야 합니다. 현미경 챔버가 완료될 때까지 펌핑 시간과 플라즈마 세척 주기가 약 8분 동안 기다립니다.
참고: 시스템이 진공 상태일 경우 닫혀 있어야 하는 챔버 도어를 부드럽게 당겨 진공 씰을 확인할 수 있습니다. - UI의 오른쪽 하단에 있는 아이콘이 녹색으로 바뀌면 전자 및 이온 빔을 켜는 빔 컨트롤 탭에서 절전 모드 해제 버튼을 누릅니다. 사분면 1을 선택하고 빔 신호를 전자 빔으로 설정하고(아직 설정하지 않은 경우), 사분면 2를 이온 빔으로 설정합니다(아직 설정되지 않은 경우).
- SEM 전압을 5kV로 설정하고 SEM 빔 전류를 0.20 nA로 설정하고 SEM 검출기를 ETD로 설정하고 검출기 모드를 이차 전자로 설정합니다. FIB 전압을 30kV로 설정하고 FIB 빔 전류를 24pA로 설정하고 FIB 검출기를 ICE 검출기로 설정하고 검출기 모드를 이차 전자로 설정합니다.
- 내비게이션 카메라 이미지에서 실리콘 프로브를 두 번 클릭하고 사분면 3을 클릭하여 프로브의 대략적인 위치로 스테이지를 이동합니다. 사분면 1을 클릭하여 활성 사분면으로 선택하고 일시 중지 버튼을 눌러 SEM 스캔을 시작합니다. 스캔 거점 시간을 300ns로 설정하고 스캔 인터레이스, 라인 통합및 프레임 평균을 끕니다. 빔 제어 탭에서 스캔 회전을 0으로 설정하고 빔 시프트 2d 조정기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 0을선택합니다.
- MUI 패널에서 배율 노브를 시계 반대 방향으로 돌려 배율을 최소값으로 조정합니다. MUI 패널의 노브 또는 자동 대비 밝기 도구 모음 아이콘을 사용하여 이미지 밝기와 대비를 조정합니다.
- 피처에서 마우스를 두 번 왼쪽으로 클릭하여 가운데에 있거나 마우스 휠을 누르고 조이스틱 마우스 모드를 활성화하여 스테이지를 이동합니다. 원하는 실리콘 프로브를 SEM 이미지의 중심으로 패턴화하도록 이동합니다.
- 가장자리 또는 먼지 입자 또는 스크래치와 같은 기타 피쳐를 찾습니다. 배율 노브를 시계 방향으로 돌려 배율을 2,000배로 늘립니다. 이미지가 초점이 맞을 때까지 MUI의 거칠고 미세한 초점 노브를 돌려 SEM의 초점을 조정합니다. 이미지가 초점이 되면 도구 모음에서 작업 거리 단추에 대한 링크 샘플 Z를 선택합니다.
- 탐색 탭에서 Z축 좌표를 확인하여 작업이 완료된지 확인합니다. 값은 약 11mm이어야 합니다. Z 축 위치에서 4.0 mm에 입력하고 마우스로 이동 버튼을 누르거나 키보드의 입력 키를 누르면 스테이지가 4mm 작동 거리로 이동합니다.
- 스테이지를 X 및 Y로 이동하여 실리콘 프로브의 어깨를 찾습니다. SEM의 중심에 가능한 한 가깝게 배치합니다. T 좌표에 "52"를 입력하고 입력하여 스테이지 기울기를 52°로 변경합니다. 프로브의 어깨가 이미지에서 위 또는 아래로 이동하는 지 여부를 관찰합니다. 스테이지 Z 슬라이더를 사용하여 프로브의 숄더를 SEM 이미지의 가운데로 되돌려 보냅니다. Z 위치만 조정하고 X, Y, T 또는 R 축을 이동하지 마십시오.
- 단계 드롭다운 메뉴에 있는"xT 정렬 기능"명령을 내장하여 실행합니다. 마우스를 사용하여 프로브 가장자리에 평행한 두 점을 클릭합니다. 팝업 창에서 가로 라디오 단추가 선택되어 있는지 확인하고 완료를 클릭합니다. 스테이지는 회전하여 프로브를 스테이지의 X축에 정렬합니다. X,Y에서 스테이지를 조정하여 마우스를 사용하여 프로브의 아래쪽 어깨를 SEM 이미지의 중앙에 다시 배치합니다.
참고: 첫 번째 점은 프로브의 그립을 향해야 하며 두 번째 점은 프로브의 지점쪽으로 향해야 합니다. - 사분면 2에서 FIB를 선택하고 빔 전류가 여전히 24 pA인지 확인합니다. 배율을 5,000x로 설정하고 거주 시간을 100ns로 설정합니다. 키보드에 Ctrl-F를 입력하여 FIB 포커스를 13.0mm로 설정합니다. 빔 컨트롤 탭에서 오명 2d 조정기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 0을 선택하고 빔 시프트 2d 조정기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 0을선택합니다. 스캔 회전을 0°로 설정하고 도구 모음에서 자동 대비 밝기 버튼을 누를 수 있습니다.
- 사분면 2에서 프로브 숄더의 이미지를 찾습니다. 스냅샷 도구를 사용하여 FIB로 이미지를 가져옵니다. 프로브 숄더가 FIB 이미지의 중앙에 있는지 확인합니다(그렇지 않은 경우)는 프로브 숄더를 두 번 클릭하여 가운데로 이동합니다. 키보드의 왼쪽 화살표 키를 약 10-15회 밀어 스테이지를 왼쪽으로 이동합니다. 다른 스냅샷을 찍고 프로브 측이 FIB의 중심에 있는지 여부를 관찰합니다.
참고: 그렇지 않은 경우 스테이지 회전을 약간 조정해야 합니다. 프로브가 이미지 중심 위에 있으면 스테이지를 음수 방향으로 회전해야 합니다. 프로브가 중심 아래에 있으면 스테이지를 시계 방향으로 회전해야 합니다. 프로브를 정렬하는 데 필요한 방법에 따라 0.01 ~0.2도의 상대 편평회전을 입력합니다. - 프로브 숄더의 가장자리가 스테이지의 X축과 완벽하게 정렬될 때까지 필요한 만큼 2.16에서 2.17단계를 반복합니다(가장자리는 왼쪽으로 이동하는 동안 FIB의 중심에 유지됩니다).
- FIB를 사용하여 스테이지를 프로브의 아래쪽 어깨로 다시 이동합니다. 추가 단추를 클릭하여 순위 목록에서 스테이지 위치를 저장합니다. FIB 빔 전류를 2.5nA로 변경하고 FIB의 배율이 여전히 5000x인지 확인합니다. 자동 밝기 대비 기능을 실행하고 FIB 거주 시간을 100ns로 설정합니다.
- 일시 중지 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다. MUI 패널의 거친 및 미세 초점 노브와 X 및 Y 낙인 노브를 사용하여 FIB 초점과 난시를 가능한 한 빠르고 정확하게 조정하십시오. 일시 정지 버튼을 눌러 FIB 스캔을 중지합니다.
3. 에칭자동화 프로세스 작성
- Windows 시작 메뉴(즉, 시작\프로그램\FEI 회사\응용 프로그램\나노빌더)에서 소프트웨어를 찾아 서 소프트웨어를 시작합니다. UI가 가려지지 않도록 소프트웨어 창을 측면 모니터에 배치합니다. 실리콘 프로브를 패터닝하기 위한 파일을 열고 파일을 클릭한 다음 엽니다. 소프트웨어 스크립트의 위치로 창 브라우저를 직접(보충 파일 1 - 파일 이름은 "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
- 소프트웨어 내에서 현미경 드롭다운 메뉴를 선택하고 단계 원예 설정을선택합니다. 소프트웨어 내에서 현미경 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 교정 감지기를 선택합니다.
- 현미경 UI에서 마우스로 쿼드 1을 한 번 클릭하여 쿼드 1을 선택합니다. 팝업 창에 표시된 다른 지침을 무시하면 이 프로젝트에 필요하지 않습니다. 확인을 클릭하여 보정을 시작합니다. 이 과정은 약 5분 정도 소요됩니다. 다른 검출기에 교정 실패가 있는 경우 괜찮습니다.
- 소프트웨어 내에서 현미경 드롭다운 메뉴를 선택하고 실행을 선택하여 패터닝 시퀀스를 시작합니다. 패턴이 완료되면 소프트웨어를 닫습니다.
참고 : 소프트웨어는 패터닝 및 정렬 기능에 대한 쿼드 3과 4를 인수합니다. 스크립트를 실행하는 데 약 12시간이 소요됩니다. 스크립트가 실행되는 동안 현미경의 매개 변수를 변경하지 마십시오. - 현미경 UI 빔 제어 탭에서"Vent"를 누르고 현미경 빔을 종료하고 통풍구 주기를 시작합니다. 챔버가 환기되는 동안, X = 70mm, Y = 70mm, Z = 0mm, T = 0 °, R = 0 °를 좌표로 무대를 이동합니다. 챔버가 환기되면 깨끗한 니트릴 장갑을 착용하고 챔버 도어를 엽니 다.
- 1.5mm 육각 렌치를 사용하여 스텁 어댑터의 세트 나사를 느슨하게 합니다. 챔버에서 패턴 프로브를 포함하는 알루미늄 스텁을 제거합니다. 현미경 챔버 도어를 조심스럽게 닫습니다. 문을 닫는 동안 쿼드런트 4의 CCD 카메라 이미지를 보십시오. 스테이지 어댑터가 현미경 챔버의 중요한 구성 요소로부터 안전한 거리인지 확인합니다.
- 빔 제어 탭의 펌프 버튼 옆에 있는 아래쪽 화살표를 선택합니다. 펌프가 가동되는 동안 도어의 얼굴을 부드럽게 밀어 도어를 밀봉해야 합니다.
참고: 시스템이 진공 상태일 경우 닫혀 있어야 하는 챔버 도어를 부드럽게 당겨 진공 씰을 확인할 수 있습니다. 펌핑 시간은 약 5 분입니다. 단 한 번의 실행 중에 프로브의 한쪽면만 에칭할 수 있습니다. - 프로브의 앞면과 뒷면에 에칭이 필요한 경우 최종 식각을 확인하고 전면을 이미징한 후 실리콘 프로브의 에칭 스트립을 조심스럽게 제거합니다(이미지가 필요한 경우). 은색 페인트를 아세톤으로 녹여 서 조심스럽게 아세톤을 두드리고 칫솔질합니다. 조심스럽게 뒤쪽으로 스트립을 돌려, 다시 마운트, 정렬 및 위에서 설명한 단계에 따라 에칭.
4. 최종 식각 및 이미징 확인
- 밀링이 완료되면 더 높은 배율에서 SEM 이미징을 사용하여 상이한 섹션의 균일성을 확인합니다.
참고: 기울어진 각도로 이미징하면 밀링 깊이의 변동을 더 잘 평가할 수 있습니다. 밀링 위치 사이의 전환 영역에 특별한주의를 기울여야합니다. - 광학 현미경으로 밀링 한 후 샘플을 다시 이미지화하십시오.
참고: 주기적인 밀링 된 선은 이미징 각도의 함수로 다른 색상을 초래하는 굴절 효과를 초래합니다. 색상이 프로브와 함께 연속되지 않으면 밀링 된 라인의 중단을 명확하게 나타냅니다.
5. FIB 에칭을위한 기능성 실리콘 프로브 장착
- 포장에서 기능성 실리콘 전극을 부드럽게 제거합니다. 집게를 사용하여 머리 스테이지를 덮는 플라스틱 보호 탭을 조심스럽게 들어 올립니다. 탭의 한 쪽 모서리를 끈적끈적한 접착제에서 위로 들어 올리고 전체 전극이 제거될 때까지 계속 들어 올리십시오.
- 조심스럽게 스테레오 탁시 프레임에 장착 준비를 hemostats와 전극을 고정합니다. 덮개가 있는 탭을 집게로 잡고 실리콘 생크 위의 녹색 샤프트 주위에 곡선 지혈을 부드럽게 놓고, 지주의 곡선 부분이 탭을 향해 위쪽으로 향하도록 합니다. 지혈.
- 헤드 스테이지를 덮는 플라스틱 보호 탭을 부드럽게 제거합니다. 지혈대와 전극을 들고있는 동안 조심스럽게 청소를위한 스테레오 택시 프레임에 전극을 클립.
- 페트리 요리 3개에 95% 에탄올(페트리 접시당 ~10mL)을 채웁니다. 페트리 접시를 스테레오탁스 프레임에 장착된 전극 아래에 놓고 청소합니다. 생크가 95% 에탄올에 잠기게 되도록 마이크로 매니퓰레이터를 아래쪽으로(100 μm/s)로 돌려 전극을 천천히 낮춥니다.
참고 : 마이크로 매니퓰레이터가 너무 빠르거나 너무 깊지 않도록주의하십시오.이 경우 전극이 파손 될 수 있습니다 (즉, 전극이 페트리 접시를 만지지 않아야합니다). - 전극 생크를 95% 에탄올에 5분 동안 방치한 다음 마이크로 매니퓰레이터를 위쪽으로(100 μm/s)로 돌려 95% 에탄올에서 전극을 천천히 올립니다. 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 3번의 세차면 됩니다. 전극이 5분 동안 공기 건조되도록 하십시오.
- 스테레오탁스 프레임에 전극을 장착하고, 스테레오탁스 프레임에서 전극을 제거하는 것과 동일한 기술을 사용한다. 전극의 샤프트 주위에 지혈을 조심스럽게 배치하십시오. 지혈이 단단히 고정되면 스테레오택시 프레임에서 전극을 분리하고 헤드 스테이지를 덮는 플라스틱 보호 탭을 반환하고 청소 된 전극을 포장에 다시 넣습니다.
6. FIB를 이용한 에칭 기능성 실리콘 프로브
- 세척된 기능성 실리콘 전극을 알루미늄 스탠드에 장착합니다. 집게를 사용하여 청소 된 기능성 실리콘 전극을 조심스럽게 선택하고 헤드 스테이지에서 보호 탭을 제거하십시오. 전극 생크를 알루미늄 스텁에 놓고 가장자리에 걸리지 않도록 한 다음 작은 Cu 또는 탄소 전도성 테이프를 사용하여 헤드 스테이지를 알루미늄 스텁에 단단히 고정합니다.
참고: 로우 프로파일 클립 홀더를 사용하여 전극을 누비게 할 수도 있습니다. 전극 생크를 만지지 않도록 주의하십시오. - 위에서 설명한 단계(섹션 2)에 따라 전극을 유중심 높이에 놓고 전극이 SEM 및 FIB 빔의 우연의 일치 지점에 있는지 확인합니다. 생크를 스테이지의 "X" 방향에 맞춥습니다.
- 필요한 나노 아키텍처를 밀링하기 위한 최적의 전류로 FIB를 설정하고 초점과 오명이 제대로 수정되었는지 확인합니다. 생크(500 μm 섹션)의 시야를 커버하기 위해 원하는 간격과 길이가 있는 선 배열을 준비합니다. 에칭이 더 얇은 섹션으로 생크아래로 내려감에 따라 선 길이를 조정합니다.
참고: 기능전극을 에칭할 때 는 공정을 자동화하기 위해 fiducial 마크를 추가할 수 없습니다. 따라서 하위 섹션(~500 μm) 사이를 수동으로 이동합니다. - 첫 번째 섹션의 밀링이 완료된 후 다음 섹션으로 이동하기 전에 밀링 품질을 확인하십시오. 6.3 단계를 반복하여 생크의 다음 섹션을 에칭합니다. 이전 단면의 밀링된 선을 다음 단면에 사용되는 패턴에 맞추어 런 사이에 큰 간격이 발생하지 않도록 합니다.
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Representative Results
단일 생크 내외 프로브 표면에 FIB 에칭 나노 아키텍처
여기서 설명된 방법을 활용하여, 피질 내 프로브는 확립된프로토콜(39)에따른 특정 나노 아키텍처로 에칭되었다. 이러한 방법에 기재된 나노 아키텍처 설계의 치수 및 형상은 여기에 설명된 나노 아키텍처 설계와 배양시 신경교 세포 반응성의 감소를 도시한 시험관내 이전 결과로부터 구현되었다37,38. 여기서 설명된 방법은 앞서 설명한바와같이 나노스케일 병렬 홈을 비기능성 단일 생크 실리콘 마이크로전극 프로브의 표면에 에칭하기 위해 집중된 갈륨 이온 빔(FIB)을 활용하였다. 나노 스케일 병렬 홈은 소프트웨어에 기록 된 자동화 된 스크립트를 사용하여 프로브의 뒷면의 생크를 따라 에칭되었습니다. 에칭된 나노 아키텍처의 최종 치수는 200 nm 폭의 평행선, 300 nm 간격, 200 nm의 깊이를가졌다(도 1). FIB를 사용하여 나노 아키텍처를 장치 표면에 에칭하면 정교한 설계를 제조 된 장치에 에칭 할 수 있습니다.
신경 염증에 대한 내피질 프로브 효과에 에칭 된 나노 아키텍처
이전에 보고된 이 데이터에서, 에칭된 나노 아키텍처를 가진 외피내 프로브는 2~4주 동안 쥐의 피질에 이식되었고(시간당 n=4) 나노 아키텍처 에칭이 없는 매끄러운 프로브로 이식된 대조군 동물과 비교하였다(시간당 n=4)39. 피질 내 미세 전극의 임상 적 배치를 방해하는 실패의 메커니즘 중 하나는 뇌 실조 및 혈액 뇌 장벽을 방해하여 유도되는 신경 염증 반응9,10, 11,12,15. 피질 내 미세 전극 이식 후 관찰된 신경 염증 반응에 대한 전체 설명은 다음 리뷰13,14,22에서확인할 수 있습니다. 뉴런으로부터의 작용 전위를 기록하는 피질 내 미세전극의 능력은 피질 내 미세전극 기록부위(40)로부터건강한 뉴런 체의 거리에 의존한다. 따라서, 이전에 보고된 연구는 신경밀도, 신경교세포 활성화 및 전염증마커의 유전자 발현에 대한 조직학적 마커를 정량화함으로써 피질내 프로브 이식 부위 주변의 신경염증을 평가하였다39. 그 연구 결과에서 하이라이트는 나노 아키텍처를 신경 염증에 있던 프로브 표면에 에칭하는 효력을 나타내기 위하여 아래에 제시됩니다.
뉴런 밀도에 대한 에칭 된 나노 아키텍처의 효과
프로브의 표면으로 나노 아키텍처를 에칭하는 방법을 결정하기 위해 임플란트 주위의 신경 밀도를 즉시, 신경 핵은 이전에 면역 조직 화학 방법을 기술한 활용하여 염색 및 정량화되었다39,41. 이식 후 2주 후 나노 아키텍처 및 대조군 프로브 주위의 뉴런 밀도의 유의한 차이는없었다(도 2A). 그러나, 임플란트 부위로부터 100-150 μm 거리에서 나노 아키텍처 프로브 주위의 뉴런이 현저히 많았으며, 이식 후 4주 동안 의 원활한 대조군 임플란트(p< 0.05 대 대조군)에 비해 훨씬 더 많은 뉴런이 있었다. 또한 시간이 지남에 따라 나노 아키텍처 프로브를 둘러싼 신경 밀도의 증가 추세가 있었다는 것을 발견, 대조 제어 임플란트 주위 의 신경 밀도의 감소 추세(그림 2). 마이크로전극을 둘러싼 생존 가능한 뉴런의 밀도가 높은 신경과 결합된 완화된 신경염증 반응을 묘사하는 직접적인 관계가 있는데, 마이크로전극이 품질 기록을 제공하는능력증가(15,40,42)를초래한다. 따라서, 신경 밀도 데이터를 해석할 때, 임플란트 부위 주변의 뉴런의 밀도가 높을수록 신경염증 반응이 줄어들고 잠재적으로 피질 내 미세전극으로부터의 기록 품질 및 안정성이 향상될 수 있다.
신경 염증 성 분자 마커에 에칭 된 나노 아키텍처의 효과
구내학은 임플란트 부위 주변의 세포를 식별하기에 충분합니다. 그러나, 주변 세포의 표현형을 특성화하기 위한 민감도 및 특이성이 결여되어 있다. 따라서, 정량적 유전자 발현 분석을 활용하는 방법은 나노-아키텍처가 세포의 표현형에 미치는 영향을 이해하기 위해 신경염증성 마커의 상대적인 유전자 발현을 정량화하기 위해39를채택하였다. 몇몇 신경염증성 마커는 이전에 보고된 연구 결과에서 조사되었습니다. 여기에서 단지 2개는 microglia 세포에 특정한 강조될 것입니다, 그들의 표현형이 어떻게 변경될 수 있는지 토론하기 위하여. 분화(CD14)의 클러스터는 세균을 인식하고 부상/이식 후 염증 경로를 신호하는 마이크로글리아의 막상 패턴 인식수용체(43,44,45)이다. 산화질소 신타제(NOS2)는, 전염증성 마커46,47의증가된 생산과 연관되는 미세글리아/대식세포로 발현되는 산화 스트레스 마커이다.
이전에 보고된 데이터에서, 2 주 또는 4 주 이식 후 나노 아키텍처 와 대조군 임플란트 사이의 CD14 상대 유전자 발현의 유의한 차이가 없었다. 특히, 나노 아키텍처 임플란트 부위 주변에서 2~4주 동안 CD14 상대 유전자 발현이 현저히 감소(p< 0.05)하여 염증의 감소 가능성을 나타내고 있었다(도 3A에서*로 표시). 유사하게, 2주에 나노 아키텍처 및 대조군 임플란트 사이의 NOS2 상대유전자 발현의 유의한 차이는 없었다. 그러나, 4주 후 이식 후 대조군 임플란트에 비해 나노 아키텍처 임플란트 주위의 NOS2 상대유전자 발현이 현저히 적어졌다(도 3B에서#로 표시). 더욱이, 대조군 임플란트 주위의 NOS2 상대유전자 발현이 2주에서 4주까지 현저한 증가(도 3B에서*로 표시됨)가 있었고, 시간이 지남에 따라 나노 아키텍처 임플란트 주변에서 관찰된 차이는 없었으며, 또한 나노 아키텍처 임플란트 주변의 염증의 잠재적인 감소를 나타낸다. 이 데이터를 해석할 때, 정량화되는 유전자의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 예를 들면, 프로 염증 성 유전자의 감소는 전극 사이트 의 주위에 선동적인 반응에 있는 가능성 있는 감소를 표시합니다, 유전자의 이 모형에 있는 증가는 염증에 있는 가능성 증가를 건의하는 반면.
FIB 에칭 나노 아키텍처 기능 단일 생크 마이크로 전극의 표면에
이전에 보고된 연구는 나노 아키텍처 프로브 임플란트 부위 주변의 미세글리아 염증 표현형의 잠재적인 감소와 뉴런 밀도의 경미한 증가를 보여주는 유망한 결과를 가졌다. 이러한 결과를 전극 기능으로 의하여 번역하기 위해, 기능성 단일 생크 실리콘 마이크로전극은 유사한 FIB 에칭 프로토콜을 활용하여 비기능적 단일 생크 실리콘 마이크로전극 프로브와 동일한 나노 아키텍처 설계로 에칭되었다. 지정된 나노 아키텍처를 에칭하는 방법론의 유일한 차이점은 피추리얼 마킹을 만드는 여분의 기판 재료가 없었기 때문에 기능성 전극에 대한 프로토콜을 자동화 할 수 없다는 것이었습니다. 따라서, 기능적 전극은 상기 프로토콜에 기재된 바와 같이 빔을 500 μm마다 재정렬함으로써 FIB를 이용하여 수동으로 에칭되었다. 최종 에칭은 200 nm 폭의 평행선이었고, 300 nm 간격으로, 200 nm의 깊이를가졌다(도 4).
전기 생리학에 대한 내피질 마이크로 전극에 에칭 된 나노 아키텍처의 효과
성공적인 피질 내 미세 전극 기록은 임플란트 부위 주변의 뉴런의 근접성, 장치의 무결성 및 뇌로부터의 단일 단위 활동의 신뢰할 수 있는전송에 의존한다 8,40, 48,49. 전기 생리학적 기록은 8주에 걸쳐 일주일에 두 번 수집된 기록된 메트릭을 활용하여 정량화되었습니다. 이 연구에서 활용된 메트릭은 단일 단위를 기록하는 채널의 백분율, 기록된 단위의 최대 진폭 및 신호 대 잡음 비(SNR)였습니다. 루이 스토크스 클리블랜드 재향 군인 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)는 모든 동물 절차를 승인했습니다. 스프라그 다울리 랫트(8-10주 령 ~225 g)를 단일 생크 실리콘 마이크로전극으로 이식하였고, 상기 언급된 나노 아키텍처(n=1) 또는 스무스 컨트롤(n=6)을 하였다. 개념 증명 파일럿 연구를 위해 이식된 나노 아키텍처 마이크로 전극이 하나 있었기 때문에 이 데이터에 대한 통계 적 분석은 수행되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 단일단위(도5A),최대 진폭(도 5B)을 기록한 채널의 증가된 백분율을 나타내는 집단 전기생리학적 결과는, 매끄러운 제어 마이크로전극에 비해 나노 아키텍처 미세전극으로부터의 최대 진폭(도5B)과SNR(그림5C)이유망하다. 이러한 결과는 나노 아키텍처를 마이크로 전극 의 표면에 에칭하면 잠재적으로 품질이 향상되고 전기 생리학적 기록의 수명이 증가 할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 예비 결과를 검증하려면 샘플 크기 증가를 위한 추가 평가가 필요합니다.
그림 1: 단일 생크 내외 프로브의 표면에 FIB 에칭 나노 아키텍처. 생크의 뒷면을 따라 FIB 에칭 나노 아키텍처를 가진 비기능성 단일 생크 실리콘 프로브의 SEM 이미지. (A)120배 배율로 표시된 전체 프로브 포스트 에칭의 합성 이미지, 배율 표시줄 = 400 μm. fiducial 마크(+ 기호가 있는 정사각형 상자)는 프로브를 둘러싼 실리콘 기판을 따라 에칭됩니다. 프로브 팁의 확대된 SEM 이미지는(B)1,056x 배율(스케일 바 = 40 μm),(C)3,500x 배율(스케일 바 = 10 μm) 및(D)10,000x 배율, 배율 막대 = 4 μm에 도시되어 있다. 이 그림은 참조39에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 에칭된 나노 아키텍처가 뉴런 밀도에 미치는 영향. 뉴런 생존은 임플란트 부위로부터 50 μm 쓰레기통의 거리에서 동일한 동물로부터 배경 영역의 백분율로 제시된다. (a)이식 후 2주 동안 매끄러운 표면(대조군)과 나노패턴 임플란트 사이에 신경 생존의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. (b)4주 이식 후 매끄러운 표면(p&0.05)에 비해 100-150 μm 거리에서 나노패턴 임플란트 주위의 신경 생존율이 현저히 높았다. 뉴런의 대표적인 이미지(스테인드 그린)는 이식 부위를 나타내는 노란색 윤곽선과, 및 미세전극의 에칭면을 나타내는 "P", 스케일 바 = 100 μm. 이 수치는39에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 신경 염증 성 분자 마커에 에칭 된 나노 아키텍처의 효과. 조직은 나노패턴 및 대조군 임플란트 둘 다에 대해 이식 부위의 약 500 μm 반경을 수집하였다. 염증성 마커의 상대적인 유전자 발현은 두 임플란트 유형(그래프에서 #으로 표시되는 차이; p&0.05)뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 정량적으로 비교되었다(차이는 그래프에 *로 표시된다; p&05). (A)CD14의 상대유전자 발현은 나노패턴 임플란트 주변에서 2~4주(*)로 현저히 감소하였다. (b)나노패턴 임플란트 주변의 NOS2의 상대적 유전자 발현이 4주(#)에서 대조군과 비교하여 현저히 낮았으며, 원활한 대조군 임플란트 주위에서 2~4주 정도의 NOS2가 현저히 증가하였다(*). 이 그림은 참조39에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FIB 에칭 나노 아키텍처기능 단일 생크 마이크로 전극의 표면에. 오른쪽 상단 모서리에 있는 인셋은 전극 생크(얇은 검은색 선)의 크기를 묘사하는 동전 옆에 이 연구에서 활용된 마이크로전극을 표시합니다. 생크의 뒷면을 따라 FIB 에칭 나노 아키텍처와 마이크로 전극 생크의 SEM 이미지. 전체 생크는 600x 배율(배율 표시줄 = 50 μm)으로 상단에 표시되고, 인세트는 25,000x 배율, 배율 막대 = 1 μm에서 나노 패턴 표면을 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 에칭 된 나노 아키텍처가 전기 생리학에 대한 피질 내 미세 전극에 미치는 영향. 전기생리학적 지표의 평가는 단일 단위를 기록하는 채널의(A)비율,(B)기록된 단위의 최대 진폭, 및(C)나노 아키텍처로 에칭된 마이크로 전극으로부터의 신호 대 잡음 비의 유망한 예비 증가 추세를 발견하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: FIB 에칭 나노 아키텍처를 가진 이식된 기능적인 단 하나 생크 마이크로 전극에서 전기 생리학 기록. 제조 된 마이크로 전극 장치에서 나노 아키텍처를 에칭하기 위해 FIB를 사용하는 과제 중 하나는 단락 기록 접점은 위험합니다. x축은 몇 초 만에 기록 시간을 나타내고 y축은 뉴런 동작 전위를 기록하는 전극 채널을 나타낸다. y축의 각 번호가 매겨진 선은 다른 전극 채널을 나타내며 채널 번호 1은 가장 얕고 16은 가장 깊은 채널을 나타냅니다. 빨간색 상자는 단락 된 채널을 설명하지만 파란색 상자는 눈에 보이는 신경 활동이있는 채널을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 제조 프로토콜은 집중된 이온 빔 리소그래피를 사용하여 비기능적이고 기능적인 단일 생크 실리콘 마이크로 전극의 표면에 나노 아키텍처를 효과적이고 재현가능하게 식각합니다. 초점 이온 빔(FIB) 리소그래피는 미세하게 집중된 이온빔(50,51)을이용하여 기판 표면의 선택적 절제를 허용한다. FIB는 나노 스케일 해상도와 높은 종횡비50,52,53으로다양한 기능을 생성 할 수있는 직접 쓰기 기술입니다. 다양한 크기의 피쳐를 생성하기 위해, 이온 빔 전류의 크기는 3 nm 에서 2 μm50,51의범위 내에서 이온 빔 스팟 크기를 변경하도록 최적화될 수 있다. 표면에 피처를 에칭하기 위해 FIB를 사용하는 몇 가지 일반적인 장점은 다음과 같습니다: 1) 실리콘, 금속 및 폴리머53,54,55,56,2) FIB를 포함한 다양한 재료에 사용될 수 있으며, 3) FIB는 개별장치(57)에서후처리에 사용될 수 있다.
여기서, FIB는 특정 기능을 비기능성 단일 생크 프로브에 에칭하기 위한 특수 자동화된 스크립트를 작성하는 데 사용되는 SEM 현미경 및 소프트웨어와 함께 사용되었다. 스크립트에는 원하는 정확한 간격(200nm 너비 병렬 홈, 간격 300nm 간격, 간격 300nm, 깊이 20nm)을 에칭하는 데 필요한 파라미터(2.5nA 이온 빔 전류 및 30kV 전압)가 포함되어 있습니다. 전극의 치수는 FIB의 시야를 초과하므로 패터닝은 여러 스테이지 위치에서 수행되었습니다. 공정을 자동화하기 위해, 소프트웨어가 프로브 생크에서 패턴 라인을 정확하게 찾을 수 있도록 프로브를 제자리에 놓고 실리콘 시트의 측면에 fiducial 마크를 에칭했습니다. 이온 빔 시야에 대하여 패턴 영역의 위치에 큰(~5 μm) 불확실성을 생성했기 때문에 피추처가 필요했습니다. FIB가 프로브 생크의 빔을 직접 스캔하지 않고도 실리콘 시트에 신탁을 배치하여 프로브 생크를 오염시키거나 손상시킬 수 있습니다. 한 생크에 대한 전체 자동 에칭 프로세스는 완료하는 데 약 12시간이 걸렸으며 패터닝이 시작된 후 작업자의 개입이 필요하지 않았습니다. 전체적으로 FIB를 사용하여 실리콘 프로브 생크에 기능을 에칭하면 나노미터 크기의 기능을 만들고, 에칭 공정을 자동화하고, 제작 된 프로브에 에칭 할 수있는 능력이 있었습니다. FIB는 많은 이점을 가지고 있지만,이 제조 방법을 사용하는 단점 중 하나는 궁극적으로 표면(58)에나노 아키텍처와 장치의 대량 생산의 잠재력을 제한 느린 처리량 속도입니다. 양자 택일로, 관심의 기능 크기 및 기하학을 만드는 데 활용 된 다른 제조 방법, 아마도 빠른 속도와 대량 생산에서, 전자 빔 리소그래피 및 나노 임프린트 리소그래피59,60,61,62,63,64,65를포함한다. 그러나, 이러한 방법은 제조 된 장치에 나노 아키텍처 기능의 에칭을 허용하지 않습니다. 전통적으로 이러한 방법은 실리콘 또는 폴리머 시트의 제조 공정 중에 사용되며, 이는 최종 속임수를 제조하기 위해 다운스트림 처리 단계에서 사용될 수 있습니다.
기능성 전극은 전극 생크 주변에 전극 생크 주변에 피덕실 마크를 포함시키는 주변 물질이 없기 때문에 자동화된 공정을 거칠 수 없었습니다. 따라서 기능성 전극은 생크를 따라 500 μm 섹션에 수동으로 정렬되고 에칭되었으며, 자동 실행과 동일한 이온 전류 및 전압을 사용하여 동일한 피처 크기를 보장합니다. 빔은 각 500 μm 간격을 완료한 후 수동으로 재정렬하고 다음 섹션을 에칭하도록 설정해야 했습니다. 500 μm마다 패턴을 수동으로 재정렬하는 과정은 잠재적으로 의도된 형상과 일치하지 않는 손상된 나노 구조 또는 구조로 이어질 수 있습니다. 이는 수동정렬(66)에필요한 이온 빔의 노출 시간이 길기 때문입니다. 이것은 수동 에칭으로 인해 발생하는 어려움 중 하나였습니다. 이 합병증으로 인해, 두 개의 기록 접촉은 단락되었고 뉴런 작용 전위를 기록할 수없었다(그림 6). 도 6은 나노 아키텍처 전극을 이식한 동물로부터의 전기생리학적 라이브 레코딩 세그먼트를 도시한다. 파란색 상자는 두 개의 죽은 채널을 나타내는 빨간색 상자와 비교하여 강력한 동작 잠재력을 기록하는 채널을 간략하게 설명합니다. 따라서 제조 후 전극에서 수동 FIB 에칭을 사용하는 과제 중 하나는 빔이 단락 접점을 단락시키고 기록하지 못하게 할 가능성이 있다는 것입니다. 이 과제는 단일 생크 실리콘 전극의 전면을 에칭하려고 할 때 향상된데, 이 때 기록 접촉과 트레이스가 전극의 전체 생크를 따라 있습니다. 기록 접지 및 트레이스 주위에 실리콘을 에칭하는 것이 가능하지만, 전극의 기록 기능의 손상 및 성능 저하를 피하기 위해 특별한주의를 기울이는 것이 좋습니다.
앞서 언급했듯이 FIB는 다양한 재질에 활용하여 수많은 피쳐 형상을 표면에 에칭할 수 있습니다. 그러나 다양한 재질에 선과 같은 형상을 식각하는 매개변수는 예측하기가 복잡하다는 점에 유의해야 합니다. 특히 라인 패턴의 경우 선 폭과 깊이는 가속 전압, 빔 전류, 거동시간, 픽셀 간격, 조리개 수명 및 재료 유형과 같은 많은 매개변수에 크게 의존합니다. 최적화로 인한 또 다른 매개변수는 각 줄을 밀링하는 총 시간입니다. 더 작은 빔 전류를 사용하여 더 좁고 깊은 선을 얻을 수 있습니다. 그러나 전체 프로브 생크의 패턴 시간은 여러 날로 연장되며 이는 실용적이지 않습니다. 따라서 여기에 제시된 프로토콜을 최적화하는 것이 가능하지만 알려지지 않은 물질에 대한 매개 변수를 설명하는 것은 매우 어려울 것입니다. 이 프로토콜에 설명된 실리콘 프로브의 파라미터를 트러블슈팅할 때, 변화하는 조건이 라인 폭과 깊이에 미치는 영향을 평가하기 위해 실리콘의 수많은 테스트 컷이 만들어졌습니다. 평가된 조건이 특정 피처 크기 및 관심 지오메트리를 에칭할 수 있게 되자마자(200 nm 깊이의 200nm 폭 선) 이러한 파라미터를 사용하여 소프트웨어 스크립트를 작성했습니다. 스크립트는 이 프로토콜에서 300 nm인 중앙에서 중심으로 각 줄의 간격을 제어하는 데 사용되었습니다. 수백 나노미터의 피처 크기를 필요로 하는 실리콘 기판/장치를 활용한 향후 연구는 이 프로토콜에 설명된 매개 변수를 원하는 피처 크기를 만드는 데 필요한 조건을 해결하는 출발점으로 사용할 수 있습니다. 금속 및 폴리머 기판/장치에는 에칭 조건의 추가 최적화 및 문제 해결이 필요합니다. 전반적으로 나노 아키텍처를 재료 표면에 에칭하기 위해 FIB를 활용하면 기능 형상, 수많은 호환 재료 사용 및 제조 된 장치를 포함한 여러 표면 유형에서 충분한 제어 및 유연성을 제공합니다. 본 명세서에 제시된 대표적인 결과는 FIB를 사용하여 나노 아키텍처를 피질 내 미세 전극의 표면에 에칭하는 우리의 연구에서 관찰된 잠재적인 이점을 입증하였다: 1) 신경 밀도 증가 및 2) 나노 아키텍처를 가진 이식된 장치 주위의 신경 염증 마커의 감소, 뿐만 아니라 3) 시간이 지남에 따라 전기 생리학적 기록의 향상된 품질을 묘사하는 예비 연구 결과. 마찬가지로, 나노 아키텍처 특징을 물질의 표면으로 에칭하는 기술된 프로토콜의 고용 및 최적화는 수많은 의료 기기의 기능을 향상시키는 데 활용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 미국(미국) 재향 군인 재활 연구 및 개발 서비스 상(#RX001664-01A1(CDA-1, Ereifej) 및 #RX002628-01A1(CDA-2, Ereifej)에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 미국 재향군인회 또는 미국 정부의 견해를 나타내지 않습니다. 저자는 FEI Co. (지금 Thermofisher 과학의 일부) 직원 지원 및 계측의 사용에 감사드립니다, 이는이 연구에 사용되는 스크립트를 개발하는 데 도움이.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
References
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