Mostramos que a gravura da nanoarquitetura em dispositivos de microeletrodo intracortical pode reduzir a resposta inflamatória e tem o potencial de melhorar as gravações eletrofisiológicas. Os métodos descritos aqui descrevem uma abordagem para gravar nano-arquiteturas na superfície de microeletrodos intracortical de silício de haste única não funcionais e funcionais.
Com os avanços na eletrônica e na tecnologia de fabricação, os microeletrodos intracortical passaram por melhorias substanciais que permitem a produção de microeletrodos sofisticados com maior resolução e capacidades ampliadas. O progresso na tecnologia de fabricação tem apoiado o desenvolvimento de eletrodos biomiméticos, que visam integrar-se perfeitamente no parenchyma cerebral, reduzir a resposta neuroinflamatória observada após a inserção de eletrodos e melhorar a qualidade e longevidade das gravações eletrofisiológicas. Aqui descrevemos um protocolo para empregar uma abordagem biomimética recentemente classificada como nanoarquitetura. O uso de litografia de feixe de íons focados (FIB) foi utilizado neste protocolo para gravar características específicas da nanoarquitetura na superfície de microeletrodos intracortical de pernil único não funcionais e funcionais. A gravura nanoarquiteturas na superfície do eletrodo indicou possíveis melhorias da biocompatibilidade e funcionalidade do dispositivo implantado. Um dos benefícios do uso do FIB é a capacidade de gravar em dispositivos manufaturados, ao contrário durante a fabricação do dispositivo, facilitando possibilidades ilimitadas de modificar inúmeros dispositivos médicos pós-fabricação. O protocolo aqui apresentado pode ser otimizado para vários tipos de materiais, recursos de nanoarquitetura e tipos de dispositivos. Aumentar a superfície dos dispositivos médicos implantados pode melhorar o desempenho do dispositivo e a integração no tecido.
Microeletrodos Intracortical (IME) são eletrodos invasivos que fornecem um meio de interligar diretamente entre dispositivos externos e as populações neuronais dentro do córtex cerebral1,2. Esta tecnologia é uma ferramenta inestimável para o registro de potenciais de ação neural para melhorar a capacidade dos cientistas de explorar a função neuronal, avançar a compreensão de doenças neurológicas e desenvolver terapias potenciais. O microeletrodo Intracortical, usado como parte dos sistemas brain machine interface (IMC), permite o registro de potenciais de ação de um indivíduo ou pequenos grupos de neurônios para detectar intenções motoras que podem ser usadas para produzir saídas funcionais3. Na verdade, os sistemas de IMC têm sido usados com sucesso para fins protéticos e terapêuticos, como o controle do ritmo sensório-motor adquirido para operar um cursor de computador em pacientes com esclerose lateral amiotrófica (ELA)4 e lesões na medula espinhal5 e restaurar o movimento em pessoas que sofrem de telegia crônica6.
Infelizmente, imes muitas vezes não conseguem gravar de forma consistente ao longo do tempo devido a vários modos de falha que incluem mecânicos, biológicos e materiais fatores7,8. Acredita-se que a resposta neuroinflamatória que ocorre após a implantação do eletrodo seja um desafio considerável que contribui para a falha do eletrodo9,10,11,12,13, 14. A resposta neuroinflamatória é iniciada durante a inserção inicial do IME que corta a barreira cerebral do sangue, danifica o parenchyma cerebral local e interrompe as redes gliais e neuronais15,16. Esta resposta aguda é caracterizada pela ativação de células gliais (microglia/macrófagos e astrócitos), que liberam moléculas pró-inflamatórias e neurotóxicas ao redor do local do implante17,18,19,20. A ativação crônica das células gliais resulta em uma reação corporal estrangeira caracterizada pela formaçãode uma cicatriz glial isolando o eletrodo do tecido cerebral saudável7,9,12,13, 17,21,22. Em última análise, dificultando a capacidade do eletrodo para registrar potenciais de ação neuronal, devido à barreira física entre o eletrodo e os neurônios e a degeneração e morte dos neurônios23,24,25.
O fracasso precoce dos microeletrodos intracortical trouxe pesquisas consideráveis no desenvolvimento de eletrodos de próxima geração, com ênfase em estratégias biomiméticas26,27,28,29,30. De particular interesse para o protocolo descrito aqui, é o uso da nano-arquitetura como uma classe de alterações de superfície biomimética para IMEs31. Estabeleceu-se que as superfícies que imitam a arquitetura do ambiente in vivo natural têm uma resposta biocompatível melhorada32,33,34,35,36. Assim, a hipótese que obrigando este protocolo é que a descontinuidade entre a arquitetura áspera do tecido cerebral e a arquitetura suave dos microeletrodos intracortical pode contribuir para a resposta neuroinflamatória e crônica do corpo estranho às IMEs implantadas (para uma revisão completa refere-se a Kim et al.31). Já mostramos anteriormente que a utilização de características nanoarquitetura semelhantes à arquitetura de matriz extracelular do cérebro reduz marcadores inflamatórios astrócitos de células cultivadas em substratos nano-arquiteturados, em comparação com superfícies de controle plano em modelos in vitro e ex vivo de neuroinflamação37,38. Além disso, mostramos que a aplicação da litografia de feixe de íons focados (FIB) para gravar nanoarquiteturas diretamente em sondas de silício resultou em um aumento significativo da viabilidade neuronal e menor expressão de genes pró-inflamatórios de animais implantados com as sondas de nanoarquitetura em comparação com o grupo de controle suave26. Portanto, o objetivo do protocolo apresentado aqui é descrever o uso da litografia fib para gravar nanoarquiteturas em dispositivos de microeletrodo intracortical fabricados. Este protocolo foi projetado para gravar características do tamanho de nanoarquitetura em superfícies de silício de hastes de microeletrodos intracortical utilizando processos automatizados e manuais. Estes métodos são descomplicados, reproduzíveis e certamente podem ser otimizados para vários materiais de dispositivos e tamanhos de recurso desejados.
O protocolo de fabricação delineado aqui utiliza litografia de feixe de íons focados para efetivamente e reprodutivelmente gravar nano-arquiteturas na superfície de microeletrodos de silício de pernil único não funcionais e funcionais. A litografia focada em feixe de íons (FIB) permite a ablação seletiva da superfície do substrato usando um feixe de íons finamente focado50,51. FIB é uma técnica de escrita direta que pode produzir várias caracterís…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelos prêmios do Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento de Reabilitação de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos (EUA): #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) e #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA ou do Governo dos Estados Unidos. Os autores gostariam de agradecer à FEI Co. (Agora parte da Thermofisher Scientific) pela assistência e uso da instrumentação por pessoal, o que ajudou no desenvolvimento dos roteiros utilizados nesta pesquisa.
16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates – 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |