Summary
Mostramos que a gravura da nanoarquitetura em dispositivos de microeletrodo intracortical pode reduzir a resposta inflamatória e tem o potencial de melhorar as gravações eletrofisiológicas. Os métodos descritos aqui descrevem uma abordagem para gravar nano-arquiteturas na superfície de microeletrodos intracortical de silício de haste única não funcionais e funcionais.
Abstract
Com os avanços na eletrônica e na tecnologia de fabricação, os microeletrodos intracortical passaram por melhorias substanciais que permitem a produção de microeletrodos sofisticados com maior resolução e capacidades ampliadas. O progresso na tecnologia de fabricação tem apoiado o desenvolvimento de eletrodos biomiméticos, que visam integrar-se perfeitamente no parenchyma cerebral, reduzir a resposta neuroinflamatória observada após a inserção de eletrodos e melhorar a qualidade e longevidade das gravações eletrofisiológicas. Aqui descrevemos um protocolo para empregar uma abordagem biomimética recentemente classificada como nanoarquitetura. O uso de litografia de feixe de íons focados (FIB) foi utilizado neste protocolo para gravar características específicas da nanoarquitetura na superfície de microeletrodos intracortical de pernil único não funcionais e funcionais. A gravura nanoarquiteturas na superfície do eletrodo indicou possíveis melhorias da biocompatibilidade e funcionalidade do dispositivo implantado. Um dos benefícios do uso do FIB é a capacidade de gravar em dispositivos manufaturados, ao contrário durante a fabricação do dispositivo, facilitando possibilidades ilimitadas de modificar inúmeros dispositivos médicos pós-fabricação. O protocolo aqui apresentado pode ser otimizado para vários tipos de materiais, recursos de nanoarquitetura e tipos de dispositivos. Aumentar a superfície dos dispositivos médicos implantados pode melhorar o desempenho do dispositivo e a integração no tecido.
Introduction
Microeletrodos Intracortical (IME) são eletrodos invasivos que fornecem um meio de interligar diretamente entre dispositivos externos e as populações neuronais dentro do córtex cerebral1,2. Esta tecnologia é uma ferramenta inestimável para o registro de potenciais de ação neural para melhorar a capacidade dos cientistas de explorar a função neuronal, avançar a compreensão de doenças neurológicas e desenvolver terapias potenciais. O microeletrodo Intracortical, usado como parte dos sistemas brain machine interface (IMC), permite o registro de potenciais de ação de um indivíduo ou pequenos grupos de neurônios para detectar intenções motoras que podem ser usadas para produzir saídas funcionais3. Na verdade, os sistemas de IMC têm sido usados com sucesso para fins protéticos e terapêuticos, como o controle do ritmo sensório-motor adquirido para operar um cursor de computador em pacientes com esclerose lateral amiotrófica (ELA)4 e lesões na medula espinhal5 e restaurar o movimento em pessoas que sofrem de telegia crônica6.
Infelizmente, imes muitas vezes não conseguem gravar de forma consistente ao longo do tempo devido a vários modos de falha que incluem mecânicos, biológicos e materiais fatores7,8. Acredita-se que a resposta neuroinflamatória que ocorre após a implantação do eletrodo seja um desafio considerável que contribui para a falha do eletrodo9,10,11,12,13, 14. A resposta neuroinflamatória é iniciada durante a inserção inicial do IME que corta a barreira cerebral do sangue, danifica o parenchyma cerebral local e interrompe as redes gliais e neuronais15,16. Esta resposta aguda é caracterizada pela ativação de células gliais (microglia/macrófagos e astrócitos), que liberam moléculas pró-inflamatórias e neurotóxicas ao redor do local do implante17,18,19,20. A ativação crônica das células gliais resulta em uma reação corporal estrangeira caracterizada pela formaçãode uma cicatriz glial isolando o eletrodo do tecido cerebral saudável7,9,12,13, 17,21,22. Em última análise, dificultando a capacidade do eletrodo para registrar potenciais de ação neuronal, devido à barreira física entre o eletrodo e os neurônios e a degeneração e morte dos neurônios23,24,25.
O fracasso precoce dos microeletrodos intracortical trouxe pesquisas consideráveis no desenvolvimento de eletrodos de próxima geração, com ênfase em estratégias biomiméticas26,27,28,29,30. De particular interesse para o protocolo descrito aqui, é o uso da nano-arquitetura como uma classe de alterações de superfície biomimética para IMEs31. Estabeleceu-se que as superfícies que imitam a arquitetura do ambiente in vivo natural têm uma resposta biocompatível melhorada32,33,34,35,36. Assim, a hipótese que obrigando este protocolo é que a descontinuidade entre a arquitetura áspera do tecido cerebral e a arquitetura suave dos microeletrodos intracortical pode contribuir para a resposta neuroinflamatória e crônica do corpo estranho às IMEs implantadas (para uma revisão completa refere-se a Kim et al.31). Já mostramos anteriormente que a utilização de características nanoarquitetura semelhantes à arquitetura de matriz extracelular do cérebro reduz marcadores inflamatórios astrócitos de células cultivadas em substratos nano-arquiteturados, em comparação com superfícies de controle plano em modelos in vitro e ex vivo de neuroinflamação37,38. Além disso, mostramos que a aplicação da litografia de feixe de íons focados (FIB) para gravar nanoarquiteturas diretamente em sondas de silício resultou em um aumento significativo da viabilidade neuronal e menor expressão de genes pró-inflamatórios de animais implantados com as sondas de nanoarquitetura em comparação com o grupo de controle suave26. Portanto, o objetivo do protocolo apresentado aqui é descrever o uso da litografia fib para gravar nanoarquiteturas em dispositivos de microeletrodo intracortical fabricados. Este protocolo foi projetado para gravar características do tamanho de nanoarquitetura em superfícies de silício de hastes de microeletrodos intracortical utilizando processos automatizados e manuais. Estes métodos são descomplicados, reproduzíveis e certamente podem ser otimizados para vários materiais de dispositivos e tamanhos de recurso desejados.
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Protocol
NOTA: Faça as seguintes etapas ao desgastar o equipamento protetor pessoal apropriado, tal como um revestimento de laboratório e luvas.
1. Montagem de sonda de silício não funcional para litografia de feixe de íons focados (FIB)
NOTA: Para o procedimento completo que descreve a fabricação da bolacha soi com as 1.000 sondas, consulte a Ereifej et al.39.
- Isolar uma tira de 2-3 sondas de silício do silício em isolante (SOI) wafer contendo 1.000 sondas. Não faça tiras contendo mais de três sondas de silício. Isso pode aumentar as chances de montagem solta e pode causar desalinhamento, resultando na FIB para gravar incorretamente.
NOTA: Tiras / sondas não firmemente sentado no canhoto de alumínio pode causar duas complicações: 1) quando o estágio se move para trabalhar na próxima seção, haverá vibrações e a moagem não será preciso até que a sonda se instala e 2) pode causar uma alta variação e estar fora do plano de foco.- Ao usar luvas, use fórceps finos para colocar pressão em torno das sondas para quebrar uma pequena seção contendo duas a três sondas.
- Limpe cuidadosamente a sonda de silício de toda a poeira e detritos antes da gravação da FIB. Prepare uma placa de poliestireno de 6 poços, canalizando 3 mL/bem de 95% de etanol em três poços.
- Cuidadosamente pegar a tira cortada de sondas de silício usando ponta fina ou fórceps de vácuo e colocá-lo em filtro celular. Coloque apenas uma tira de sondas de silício por filtro para evitar quebrar as sondas. Coloque o filtro contendo as sondas de silício tira no primeiro poço contendo 95% de etanol para limpeza. Mantenha o filtro no primeiro poço por 5 min.
- Mova o filtro contendo as sondas de silício a partir do primeiro poço e colocá-lo no segundo poço contendo 95% de etanol para mais 5 min. Repita mais uma vez no terceiro poço.
- Coloque o filtro contendo as sondas de silício limpa em uma placa de politetrafluoroetileno ao ar seco. Faça esta etapa em uma capa estéril para evitar a contaminação da poeira.
- Coloque a faixa seca de sondas de silício em um recipiente selado para o transporte para o SEM-FIB. Envolva o filtro contendo as amostras secas com um envoltório de folha de plástico ou alumínio para transporte e/ou armazenamento para manter a limpeza.
- Use fine tipped ou fórceps de vácuo para pegar cuidadosamente a tira limpa de sondas de silício e colocá-los em um toco de alumínio limpo (usado para imagens SEM-FIB / gravura) para se preparar para a montagem.
- Use um palito (ou outro instrumento fino derrubado como um fio elétrico fino), para colocar uma pequena gota (~ 10 μL) de tinta prateada na borda do substrato de silício em torno das sondas. Proteja a tira para baixo espalhando a pintura de prata em torno dos lados do substrato do silicone que cerca a ponta de prova. Deixe a tinta prateada secar completamente antes de colocar o toco de alumínio no SEM-FIB.
NOTA: Tenha cuidado para não obter tinta prateada na haste do eletrodo, porque essa é a parte que será gravada. Se a tira das pontas de prova não é escorada firmemente ao esboço de alumínio, a tira pode mover-se durante o processamento ou ter um plano de foco diferente, tendo por resultado assim a moagem incorreta pelo FIB. Diversas tiras de pontas de prova do silicone podem ser montadas no mesmo esboço de alumínio, certificando-se que há um espaço amplo entre as tiras para permitir a remoção do esboço após o etching. Isso permitirá uma gravação mais eficiente de várias sondas usando o recurso automatizado descrito abaixo.
2. Alinhar a FIB para as sondas de silício
- Clique no botão de ventilação na aba de controle de feixe para desabafar a câmara. Press Shift+F3 para se apresentar em casa. Confirme a seleção selecionando o botão Home Stage na janela pop-up.
NOTA: Executar a operação de fase doméstica é um passo preventivo para garantir que o eixo de palco seja lido corretamente pelo software e o microscópio esteja em boas condições. - Depois que a fase inicial estiver completa, mova o palco para coordenadas X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0°, R = 0°. Uma vez que a câmara é ventilada, colocar luvas de nitrile limpo e abrir a porta da câmara.
NOTA: Dependendo do aplicativo do usuário anterior, pode ser necessário alterar o adaptador de estágio. Os adaptadores de palco padrão (por exemplo, estilo FEI) podem ser removidos desaparafusando o parafuso central no sentido anti-horário e instalados parafusando no sentido horário na placa de rotação do palco. - Insira o toco de alumínio segurando as sondas no topo do adaptador de palco. Fixe o coto de alumínio apertando o parafuso do jogo no lado do adaptador do estágio. Use a chave de 30 mm de 1,5 mm para esta tarefa.
- Ajuste a altura do adaptador de palco, transformando o adaptador no sentido horário para baizá-lo ou no sentido anti-horário para levantá-lo. Fixe o adaptador de palco para a placa de rotação, transformando a porca de cone de bloqueio no sentido horário até que a porca esteja segura contra a placa de rotação de palco. Segure o adaptador de palco com a outra mão para evitar a rotação do adaptador e amostras, apertando a porca cone de bloqueio.
NOTA: Use o medidor de altura fornecido para determinar a altura apropriada. A parte superior do stub de alumínio deve ser a mesma altura que a linha máxima mostrada no calibre da altura. Sobre apertar a porca do cone pode causar dano ao estágio e ao adaptador. Use apenas força suficiente para proteger as amostras. - Adquirir uma imagem da câmera de navegação. Balance cuidadosamente o braço da câmera de navegação aberto até que ele pare. O estágio do microscópio mover-se-á automaticamente para uma posição abaixo da câmera. Assista à imagem ao vivo mostrada no Quadrante 3 da interface do usuário do microscópio (UI).
- Uma vez que o nível de brilho auto se ajusta a um nível adequado, adquirir a imagem, empurrando o botão para baixo no suporte da câmera. Certifique-se de esperar para a aquisição de imagem inteira para terminar, que é indicado por um símbolo de pausa que aparece no Quadrante 3 e a iluminação da câmera desligar. Isso leva aproximadamente 10 s. Balance o braço da câmera de volta para a posição fechada. O palco voltará à posição original.
- Feche cuidadosamente a porta da câmara do microscópio. Assista à imagem da câmera CCD no Quadrante 4 enquanto fecha a porta. Certifique-se de que as amostras e o estágio estejam a uma distância segura de qualquer componente crítico na câmara do microscópio.
- Selecione a seta para baixo ao lado do botão Bomba na aba de controle de feixe. Selecione Bomba com botão de limpeza de amostras no software de interface do dia para iniciar a bomba de vácuo de câmara e construída em aspirador de plasma. Certifique-se que a porta está selada empurrando delicadamente na cara da porta quando a bomba funcionar. Aguarde aproximadamente 8 min para o tempo de bombeamento e ciclo de limpeza de plasma para a câmara do microscópio a ser concluída.
NOTA: Um selo de vácuo pode ser confirmado puxando suavemente a porta da câmara, que deve permanecer fechada se o sistema estiver vácuo. - Uma vez que o ícone no canto inferior direito da interface do dia fica verde, pressione o botão Wake-Up na aba de controle de feixe que liga os feixes de elétrons e íons. Selecione o quadrante 1 e defina o sinal de feixe para feixe de elétrons (se não for definido já), definir quadrante 2 a feixe de íons (se não definido já).
- Defina a tensão SEM para 5 kV, defina a corrente de feixe SEM para 0,20 nA, defina o detector SEM para ETD, defina o modo detector de elétrons secundários. Defina a tensão da FIB para 30 kV, defina a corrente do feixe FIB para 24 pA, defina o detector fib para detector de gelo, defina o modo detector para o elétron secundário.
- Clique duas vezes na sonda de silício na imagem da câmera de navegação, quadrante 3 para mover o palco para a localização aproximada da sonda. Clique no quadrante 1 para selecioná-lo como o quadrante ativo e aperte o botão de pausa para iniciar a digitalização do SEM. Defina o tempo de digitalização habitar a 300 ns e desligar o scan interlacing,integração da linha,e quadro de média. Ajuste a rotação da varredura a 0 na aba do controle do feixe e clique direito no ajustador 2d do deslocamento do feixe e selecione zero.
- Ajuste a ampliação ao valor mínimo girando o botão de ampliação no sentido anti-horário no painel MUI. Ajuste o brilho e o contraste da imagem usando os botões no painel MUI ou o ícone da barra de ferramentas Auto Contrast Brightness.
- Mova o palco por dupla esquerda clicando no mouse em um recurso para centralá-lo, ou pressionando para baixo a roda do mouse e ativando o modo mouse joystick. Mova a sonda de silício desejada para ser modelada para o centro da imagem SEM.
- Localizar uma borda ou outras características, como uma partícula de poeira ou zero. Aumentar a ampliação para 2.000x, transformando o botão de ampliação no sentido horário. Ajuste o foco do SEM girando os botões grosseiros e finos do foco no MUI até que a imagem esteja no foco. Uma vez que a imagem está em foco, selecione a amostra De Link Z para o botão de distância de trabalho na barra de ferramentas.
- Confirme que a operação foi concluída olhando para a coordenada z-eixo na guia de navegação. O valor deve ser de aproximadamente 11 mm. Digite 4,0 mm na posição do eixo Z e aperte o botão Go To com o mouse ou aperte a tecla de entrada no teclado e o palco se mova para 4 mm de distância de trabalho.
- Mova o palco em X e Y para localizar o ombro da sonda de silício. Posicioná-lo o mais próximo possível do centro do SEM. Mude a inclinação do palco para 52° digitando "52" na coordenada T e batendo entrar. Observe se o ombro da sonda parece se mover para cima ou para baixo na imagem. Use o controle deslizante do Estágio Z para trazer o ombro da sonda de volta ao centro da imagem SEM. Ajuste somente a posição de Z, não mova x, Y, T, ou eixo de R.
- Executar o built in "xT Align Feature" comando localizado no palco drop down menu. Use o mouse para clicar em dois pontos paralelos à borda da sonda. Certifique-se de que o botão de rádio horizontal seja selecionado na janela pop-up e clique no acabamento. O palco girará para alinhar a sonda com o eixo X do palco. Ajuste o estágio em X,Y usando o mouse para colocar o ombro inferior da sonda no centro da imagem SEM novamente.
NOTA: O primeiro ponto deve ser para o aperto da sonda e o segundo ponto deve ser para o ponto da sonda. - Selecione o FIB no quadrante 2 e certifique-se que a corrente do feixe é ainda 24 pA. Defina a ampliação para 5.000x e o tempo de habitação para 100 ns. Digite Ctrl-F no teclado para definir o foco FIB para 13,0 mm. Na aba de controle de feixe, clique direito no ajustador 2d estigmator e selecione zero e, também, clique direito no ajustador Beam Shift 2d e selecione zero. Defina a rotação da digitalização para 0° e aperte o botão de brilho de contraste automático na barra de ferramentas.
- Procure uma imagem do ombro da ponta de prova no quadrante 2. Use a ferramenta instantâneo para adquirir uma imagem com a FIB. Confirme que o ombro da sonda está no centro da imagem da FIB, se não, clique duas vezes no ombro da sonda para movê-lo para o centro. Mova o palco para a esquerda, empurrando a chave da seta esquerda no teclado aproximadamente 10-15 vezes. Tire outro instantâneo e observe se o lado da sonda ainda está no centro da FIB.
NOTA: Se não, a rotação do estágio deve ser ajustada ligeiramente. Se a sonda estiver acima do centro da imagem, o palco deve ser girado na direção negativa. Se a sonda estiver abaixo do centro, o palco deve ser girado no sentido horário. Digite uma rotação compucentric relativa de 0,01 a 0,2 graus, dependendo de que maneira é necessária para alinhar a sonda. - Repita os passos 2.16 a 2.17 quantas vezes for em medida o necessário até que a borda do ombro da sonda esteja perfeitamente alinhada com o eixo X do palco,(a borda permanece no centro da FIB enquanto se move para a esquerda).
- Usando o FIB, mova o palco de volta para o ombro inferior da sonda. Salve a posição de palco na lista de posição clicando no botão Adicionar. Mude a corrente do feixe fib para 2,5 nA e certifique-se de que a ampliação da FIB ainda é 5000x. Executar a função de contraste de brilho automático e definir o tempo de habitar FIB para 100 ns.
- Aperte o botão de pausa para começar a digitalizar. Ajuste o foco da FIB e o astigmatismo, o mais rápido e precisamente possível, usando os botões de foco grosseiros e finos, e os botões estigmateiro X e Y no painel MUI. Aperte o botão de pausa para parar a digitalização da FIB.
3. Escrever um processo automatizado para gravura
- Iniciar o software, localizando-o no menu inicial do Windows (ou seja, Start\Programs\FEI Company\Applications\Nanobuilder). Posicione a janela de software no monitor lateral para que a ui não seja encoberta. Abra o arquivo para modelar as sondas de silício clicando em arquivo e, em seguida, aberto. Direcione o navegador windows para a localização do script de software(Arquivo Suplementar 1 - o nome do arquivo é "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
- Dentro do software, selecione o menu de queda do microscópio e selecione a origem do palco set. Dentro do software, selecione o menu de queda do microscópio e, em seguida, selecione Calibrar Detectores.
- Na ui do microscópio, clique no Quad 1 uma vez com o mouse para selecionar quad 1. Ignore as outras instruções mostradas na janela pop-up, eles não são necessários para este projeto. Clique OK para iniciar a calibração. O processo levará cerca de 5 min. Certifique-se de que os detectores De ETD e ICE calibram. Está tudo bem se outros detectores tiverem falhas de calibração.
- Dentro do software, selecione o menu de dropdown do microscópio e escolha execute para iniciar a sequência de padronização. Quando o padrão estiver completo, feche o software.
NOTA: O software assumirá quad 3 e 4 para as funções de padronização e alinhamento. O script levará aproximadamente 12 h para ser executado. Enquanto o script está em execução, não altere nenhum parâmetro no microscópio. - Hit "Vent" na aba de controle de feixe de ui microscópio para desligar os feixes de microscópio e iniciar o ciclo de ventilação. Enquanto a câmara está desabafando, mova o palco para coordenadas X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0°, R = 0°. Uma vez que a câmara é ventilada, colocar luvas de nitrile limpo e abrir a porta da câmara.
- Solte o parafuso conjunto no adaptador de toco usando a chave de feitiço de 1,5 mm. Retire o toco de alumínio contendo a sonda padrão da câmara. Feche cuidadosamente a porta da câmara do microscópio. Assista à imagem da câmera CCD no Quadrante 4 enquanto fecha a porta. Certifique-se de que o adaptador de palco está a uma distância segura de qualquer componente crítico na câmara do microscópio.
- Selecione a seta para baixo ao lado do botão Bomba na aba de controle de feixe. Certifique-se que a porta está selada empurrando delicadamente na cara da porta quando a bomba funcionar.
NOTA: Um selo de vácuo pode ser confirmado puxando suavemente a porta da câmara, que deve permanecer fechada se o sistema estiver vácuo. O tempo de bombeamento será de aproximadamente 5 min. Apenas um lado da sonda pode ser gravado durante uma única corrida. - Se a parte frontal e traseira da sonda requer gravura, em seguida, retire cuidadosamente a tira gravada de sondas de silício depois de verificar o último etch e imagem do lado da frente (se as imagens são necessárias). Dissolva a tinta prateada com acetona, cautelosamente dabbing / escovar a acetona sobre a tinta prateada. Vire cuidadosamente a faixa em torno da parte traseira, re-montar, alinhar e gravar seguindo os passos descritos acima.
4. Verificando o Etch final e imagem
- Uma vez que a moagem é completa verificar a uniformidade das diferentes seções usando imagens SEM em uma ampliação maior.
NOTA: A imagem latente no ângulo inclinado permite uma avaliação melhor da variação na profundidade do moagem. Deve ser dada especial atenção às regiões de transição entre os locais de moagem. - Imagem das amostras novamente após a moagem com um microscópio óptico.
NOTA: As linhas moídicas periódicas resultam em um efeito de refração dando origem a cores diferentes em função do ângulo de imagem. Se a cor não é contínua, juntamente com a sonda que é uma indicação clara da interrupção nas linhas moídas.
5. Montagem de uma sonda de silício funcional para a gravação da FIB
- Remova delicadamente o elétrodo funcional do silicone de seu empacotamento. Use fórceps para levantar cuidadosamente a guia protetora de plástico que cobre o palco da cabeça. Comece levantar um canto da aba acima da colagem pegajosa que prende a no lugar e mantenha levantar até que o elétrodo inteiro esteja removido.
- Cuidadosamente apertar o eletrodo com hemostats para se preparar para a montagem no quadro estereotaxic. Ao prender a aba coberta com os fórceps, coloc delicadamente hemostats curvados em torno do eixo verde acima do shank do silicone, com a parte curvada dos hemostats que enfrentam para cima para a aba. Trave os hemostats no lugar para assegurar-se de que o elétrodo não deixe cair fora de os hemostats.
- Retire delicadamente a aba protetora de plástico que cobre o palco da cabeça. Ao prender o elétrodo com os hemostats, grampee com cuidado o elétrodo no frame stereotaxic para a limpeza.
- Encha 3 placas de Petri com 95% de etanol (~10 mL por placa de Petri). Coloque a placa de Petri o eletrodo que é montado no quadro estereotipado para limpeza. Lentamente abaixe o eletrodo, transformando o micromanipulador para baixo (100 μm/s) para que o shank seja submerso no etanol de 95%.
NOTA: Tenha cuidado para não transformar o micromanipulador muito rápido ou muito profundo, isso pode causar o eletrodo para quebrar (ou seja, o eletrodo não deve tocar a placa de Petri). - Deixe o fioto de eletrodo no etanol de 95% por 5 min e, em seguida, levante lentamente o eletrodo do etanol de 95%, transformando o micromanipulador para cima (100 μm/s). Repita este passo mais duas vezes, para um total de três lavações. Deixe o eletrodo secar por cinco minutos.
- Use a mesma técnica para montar o eletrodo no quadro estereotipado, para remover o eletrodo do quadro estereotaxico. Coloque cuidadosamente os hemostats ao redor do eixo do eletrodo. Uma vez que os hemostats são apertados, libere o elétrodo do frame stereotaxic, devolva a aba protetora plástica que cobre o estágio principal, e põr o elétrodo limpado de novo em seu empacotamento.
6. Sonda de Silício Funcional de gravura usando FIB
- Monte o eletrodo de silício funcional limpo em um suporte de alumínio. Cuidadosamente pegar o eletrodo de silício funcional limpo usando fórceps e remover a guia protetora do palco da cabeça. Coloque o haste de eletrodo no canhoto de alumínio para que ele não paire sobre qualquer borda, em seguida, usando um pequeno pedaço de ou fita condutora de carbono, pino do farol com segurança para o canhoto de alumínio.
NOTA: Alternativamente, um suporte de clipe de baixo perfil pode ser usado para segurar o eletrodo para baixo. Tenha cuidado para não tocar o shank eletrodo. - Seguindo os passos descritos acima (Seção 2), posicione o eletrodo na altura eucêntrica e certifique-se de que o eletrodo esteja no ponto de coincidência dos feixes sem e FIB. Alinhe a haste com a direção "X" do palco.
- Defina a FIB como a corrente ideal para a moagem da nanoarquitetura necessária e certifique-se de que o foco e o estigma sejam devidamente corrigidos. Prepare uma variedade de linhas com espaçamento e comprimento desejados para cobrir o campo de visão da haste (500 seções μm). Ajuste os comprimentos da linha enquanto a gravura começ abaixo do shank às seções mais finas.
NOTA: Ao gravar o eletrodo funcional, não é possível adicionar marcas fiduciais para automatizar o processo. Portanto, mover-se entre as sub-seções (~500 μm) é feito manualmente. - Depois que a moagem da primeira seção estiver concluída, certifique-se de verificar a qualidade da moagem antes de passar para a próxima seção. Repita o passo 6.3 para gravar a próxima seção do shank. Alinhar as linhas moídas da seção anterior para os padrões utilizados para a próxima seção para evitar grandes lacunas entre as corridas.
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Representative Results
FIB gravado Nano-arquitetura nas superfícies de sondas intracortical único shank
Utilizando os métodos descritos aqui, sondas intracortical foram gravadas com nano-arquiteturas específicas seguindo protocolos estabelecidos39. Dimensões e forma do projeto nano-arquitetura descrito nestes métodos foram implementados a partir de resultados in vitro anteriores, retratando uma diminuição na reatividade das células gliais, quando cultivada com o projeto de nano-arquitetura descrito aqui37,38. Os métodos descritos aqui utilizaram um feixe de íons de gálio focado (FIB) para gravar sulcos paralelos nanoescala na superfície de sondas de microeletrodo de silício de pernil único não funcionais, como descrito anteriormente39. Os sulcos paralelos em nanoescala foram gravados ao longo da haste da parte traseira da sonda usando um script automatizado escrito no software. As dimensões finais da nano-arquitetura gravada eram 200 linhas paralelas de largura, espaçadas 300 nm de distância, e tinham uma profundidade de 200 nm (Figura 1). O uso da FIB para gravar nano-arquiteturas em uma superfície do dispositivo permite a gravação de projetos precisos em dispositivos manufaturados.
Gravado Nano-arquitetura em investigações intracortical efeito sobre neuroinflamação
Nestes dados previamente relatados, as pontas de prova intracortical com nano-arquiteturas gravadas foram implantadas no córtex dos ratos para duas ou quatro semanas (n=4 por o ponto de tempo) e comparadas aos animais de controle implantados com as pontas de prova lisas que não contêm gravuras da nano-arquitetura (n=4 por o ponto de tempo)39. Um dos mecanismos de falha que impede a implantação clínica de microeletrodos intracortical é a resposta neuroinflamatória induzida por interromper o parenchyma cerebral e a barreira hematológica9,10,11,12,15. Uma descrição completa da resposta neuroinflamatória observada após a implantação intracortical de microeletrodos pode ser encontrada nas seguintes revisões13,14,22. A capacidade dos microeletrodos intracortical para gravar potenciais de ação dos neurônios é dependente da distância dos corpos neuronais saudáveis do local de gravação de microeletrodos intracortical40. Portanto, o estudo previamente relatado avaliou a neuroinflamação em torno do local de implantação da sonda intracortical, quantificando marcadores histológicos para densidade neuronal, ativação de células gliais e expressão gênica de marcadores proinflamatórios39. Destaques desse estudo são apresentados abaixo para representar os efeitos gravura nano-arquiteturas na superfície da sonda teve sobre a neuroinflamação.
Efeitos da nano-arquitetura gravada na densidade do neurônio
Para determinar como a gravura nano-arquiteturas na superfície da sonda afeta a densidade neuronal imediatamente ao redor do implante, os núcleos neuronais foram manchados e quantificados utilizando métodos de imunohistoquímica anteriormentedescrevendo 39,41. Não houve diferenças significativas de densidades neuronais em torno das sondas de nanoarquitetura e controle em 2 semanas após a implantação (Figura 2A). No entanto, havia significativamente mais neurônios em torno das sondas de nanoarquitetura a 100-150 μm de distância do local do implante em comparação com os implantes de controle suave (p < 0,05 vs controles) (Figura 2B) em 4 semanas após a implantação. Verificou-se também que havia uma tendência aumentada de densidade neuronal em torno das sondas nano-arquitetura ao longo do tempo, contrastando a tendência diminuída da densidade neuronal em torno dos implantes de controle (Figura 2). Há uma relação direta que descreve uma resposta neuroinflamatória mitigada juntamente com uma maior densidade de neurônios viáveis em torno do microeletrodo, resulta em uma maior capacidade para o microeletrodo para fornecer gravações de qualidade15,40,42. Portanto, ao interpretar dados de densidade neuronal, uma maior densidade de neurônios ao redor do local do implante pode indicar uma resposta neuroinflamatória diminuída e potencialmente melhor qualidade de gravação e estabilidade de microeletrodos intracortical.
Efeitos da nano-arquitetura gravada em marcadores moleculares neuroinflamatórios
Histologia é suficiente para identificar as células em torno de um local de implante; no entanto, falta-lhe a sensibilidade e especificidade para caracterizar o fenótipo das células circundantes. Assim, métodos que utilizam a análise quantitativa da expressão gênica foram empregados para quantificar a expressão gênica relativa de marcadores neuroinflamatórios, a fim de compreender o efeito que a nanoarquitetura tem sobre o fenótipo das células39. Vários marcadores neuroinflamatórios foram investigados no estudo relatado anteriormente. Aqui apenas dois serão destacados que são específicos para as células microglia, a fim de discutir como seu fenótipo pode ter sido alterado. O aglomerado de diferenciação 14 (CD14) é um receptor de reconhecimento de padrões na membrana da microglia que reconhece bactérias e sinaliza a via inflamatória após lesão/implantação43,44,45. O synthase do óxido nítrico (NOS2), é um marcador oxidativo do esforço expressado no microglia/macrófagos que é associado com uma produção aumentada de marcadores proinflammatory46,47.
Nos dados previamente relatados, não havia nenhuma diferença significativa da expressão relativa do gene CD14 entre implantes da nano-arquitetura e do controle em dois ou quatro semanas após-implantação. Notavelmente, houve uma diminuição significativa (p < 0,05) da expressão gênica relativa CD14 de duas a quatro semanas em torno do local dos implantes de nanoarquitetura, indicando uma possível diminuição na inflamação (denotada por * na Figura 3A). Da mesma forma, não houve diferenças significativas de expressão gênica relativa nos2 entre nanoarquitetura e implantes de controle em duas semanas. No entanto, houve significativamente menos (p < 0,05) NOS2 expressão genética relativa em torno do implante de nanoarquitetura em comparação com o implante de controle em quatro semanas pós-implantação (denotada por # na Figura 3B). Além disso, houve um aumento significativo de 2 para 4 semanas de expressão gênica relativa nos2 em torno dos implantes de controle (denotado por * na Figura 3B), e não há diferenças observadas em torno dos implantes de nanoarquitetura ao longo do tempo, indicando ainda mais uma potencial diminuição da inflamação em torno dos implantes nano-arquitetura. Ao interpretar esses dados, é importante entender a função do gene que está sendo quantificado. Por exemplo, diminuições de genes pró-inflamatórios indicam uma provável diminuição na resposta inflamatória ao redor do local do eletrodo, enquanto um aumento desses tipos de genes sugere um provável aumento na inflamação.
FIB gravado Nano-arquitetura nas superfícies de microeletrodos funcionais de pernil único
O estudo relatado previamente teve resultados prometedores que demonstram um aumento ligeiro da densidade do neurônio e a diminuição potencial no fenótipo inflamatório do microglia em torno do local do implante da ponta de prova da nano-arquitetura. Para investigar a tradução desses resultados para a funcionalidade do eletrodo, um microeletrodo funcional de silício de pernil foi gravado com o mesmo design de nanoarquitetura que as sondas de microeletrodo de silício de pernil único não funcionais, utilizando um protocolo semelhante de gravura fib. A única diferença na metodologia para a gravação da nanoarquitetura especificada foi que o protocolo para os eletrodos funcionais não poderia ser automatizado, pois não havia material de substrato extra para criar marcas fiduciais. Assim, o eletrodo funcional foi gravado manualmente usando fib re-alinhar o feixe a cada 500 μm, como descrito no protocolo acima. As gravuras finais foram 200 nm linhas paralelas de largura, espaçadas 300 nm de distância, e tinha uma profundidade de 200 nm (Figura 4).
Efeitos da nanoarquitetura gravada em microeletrodos intracortical na eletrofisiologia
Gravações de microeletrodos intracortical bem-sucedidas dependem da proximidade dos neurônios ao redor dos locais de implante, da integridade do dispositivo e da transmissão confiável da atividade de unidade única do cérebro8,40,48,49. Gravações eletrofisiológicas foram quantificadas utilizando métricas gravadas coletadas duas vezes por semana ao longo de oito semanas. As métricas utilizadas neste estudo foram, o percentual de canais de registro de unidades individuais, amplitudemáxima de unidades registradas e razão sinal-ruído (SNR). Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico de Assuntos de Veteranos de Louis Stokes Cleveland aprovaram todos os procedimentos animais. Ratos Sprague Dawley (8-10 semanas de idade e pesando ~ 225 g) foram implantados com microeletrodo de silício de haste único, com a nanoarquitetura acima mencionada (n=1) ou os controles suaves (n=6). Nenhuma análise estatística foi realizada sobre esses dados, pois havia um microeletrodo nanoarquitetura implantado para um estudo piloto de prova de conceito. No entanto, os resultados eletrofisiológicos coletivos que mostram um aumento da porcentagem de canais registrando unidades individuais(Figura 5A),amplitudes máximas(Figura 5B)de unidades registradas, e SNR(Figura 5C)dos microeletrodos nanoarquitetura em comparação com os microeletrodos de controle suave, são promissores. Estes resultados indicam que a gravura da nano-arquitetura na superfície dos microeletrodos pode potencialmente resultar em melhor qualidade e aumento da longevidade das gravações eletrofisiológicas. Uma avaliação mais adicional com tamanho aumentado da amostra é necessária verificar estes resultados preliminares.
Figura 1: FIB gravado nano-arquitetura nas superfícies de sondas intracortical único shank. Imagens SEM das sondas de silício de pernil único não funcionais com fib gravado nano-arquiteturas ao longo da parte traseira do shank. (A) Imagens compostas de toda a gravura do posto de sonda mostrada na ampliação 120x, Barra de escala = 400 μm. As marcas fiduciais, (caixa quadrada com um símbolo + passando por ele), são gravadas ao longo do substrato de silício em torno da sonda. Imagens ampliadas de SEM da ponta da sonda são mostradas em (B) em ampliação de 1.056x (Barra de escala = 40 μm), (C)a ampliação de 3.500 x (Barra de escala = 10 μm), e (D) em ampliação de 10.000 x, barra de escala = 4 μm. Este número foi modificado a partir da referência39. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Efeitos da nanoarquitetura gravada na densidade neuronal. A sobrevivência neuronal é apresentada como uma porcentagem da região de fundo dos mesmos animais em distâncias de 50 μm de distância do local do implante. (A) Não foram observadas diferenças significativas de sobrevivência neuronal entre as superfícies lisas (controle) e os implantes nanopadronizados às 2 semanas após a implantação. (B)Houve uma sobrevivência neuronal significativamente maior em torno dos implantes nanopadronizados na distância de 100-150 μm em comparação com superfícies lisas (p < 0,05) em 4 semanas após a implantação. Imagens representativas de neurônios (verde manchado), com o contorno amarelo representando o local da implantação, e o "P" denotando o lado gravado do microeletrodo, Barra de Escala = 100 μm. Este número foi modificado a partir de39. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Efeitos da nanoarquitetura gravada em marcadores moleculares neuroinflamatórios. O tecido foi coletado em torno do raio de 500 μm do local da implantação para os implantes nanopatterned e do controle. A expressão gênica relativa dos marcadores inflamatórios foi quantitativamente comparada entre os dois tipos de implante (as diferenças são denotadas por # no gráfico; p < 0,05), bem como ao longo do tempo (as diferenças são denotadas por * no gráfico; p < 0,05). (A)A expressão genética relativa do CD14 diminuiu significativamente em torno de implantes nanopadronizados de duas para quatro semanas (*). (B) Houve uma expressão gênica relativa significativamente menor de NOS2 em torno do implante de nanopadrão em comparação com o controle em quatro semanas (#) e houve um aumento significativo de NOS2 de duas para quatro semanas em torno de implantes de controle suave (*). Este número foi modificado a partir da referência39. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: FIB gravado nano-arquitetura nas superfícies de microeletrodos funcionais de pernil único. A inserção no canto superior direito exibe o microeletrodo utilizado neste estudo ao lado de um centavo para retratar o tamanho do haste eletrodo (linha preta fina). Imagens sem dos microeletrodos shank com FIB gravado nano-arquiteturas ao longo da parte traseira do shank. O shank inteiro é mostrado na parte superior na ampliação de 600x (barra da escala = 50 μm), quando a inserção descrever a superfície nanopatterned na ampliação de 25.000x, barra da escala = 1 μm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Efeitos da nanoarquitetura gravada em microeletrodos intracortical na eletrofisiologia. A avaliação das métricas eletrofisiológicas descobriu uma tendência preliminar promissora de(A)percentual de canais registrando únicas unidades(B)de unidades registradas, e(C)relação sinal-ruído do microeletrodo gravado com nanoarquiteturas em comparação com os eletrodos de controle suave. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Gravação de eletrofisiologia dos microeletrodos funcionais implantados de shank com nanoarquiteturas gravadas pela FIB. Um dos desafios do uso da FIB para gravar nanoarquiteturas em dispositivos de microeletrodos fabricados é o risco de curto-circuito de contatos de gravação. O eixo x retrata o tempo de gravação em segundos, e o eixo y mostra os canais de eletrodos gravando potenciais de ação neuronal. Cada linha numerada no eixo y representa um canal de eletrodo diferente, com o canal número 1 sendo o mais raso e 16 sendo o mais profundo. As caixas vermelhas descrevem os canais de curto-circuito, enquanto as caixas azuis descrevem canais com atividade neuronal visível. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
O protocolo de fabricação delineado aqui utiliza litografia de feixe de íons focados para efetivamente e reprodutivelmente gravar nano-arquiteturas na superfície de microeletrodos de silício de pernil único não funcionais e funcionais. A litografia focada em feixe de íons (FIB) permite a ablação seletiva da superfície do substrato usando um feixe de íons finamente focado50,51. FIB é uma técnica de escrita direta que pode produzir várias características com resolução em nanoescala e alta proporção de aspecto50,52,53. A fim de criar as várias características de tamanho, a magnitude da corrente de feixe de íons pode ser otimizada para alterar o tamanho do ponto do feixe de íons dentro de um intervalo de 3 nm a 2 μm50,51. Algumas vantagens gerais de usar FIB para gravar características em superfícies são: 1) pode ser usada em uma grande variedade de materiais, incluindo o silicone, os metais, e os polímeros53,54,55,56, 2)FIB pode ser executado em superfícies non-planar, e 3) FIB pode ser usado para o borne-processamento em dispositivos individuais57.
Aqui, fib foi usado em combinação com um microscópio SEM e software usado para escrever um script automatizado especializado para gravar recursos específicos em sondas de pernil único não funcionais. O roteiro incluiu parâmetros necessários (corrente de feixe de íons de 2,5 nA e 30 kV tensão) para gravar o espaçamento exato desejado (200 nm de largura sulcos paralelos, espaçados 300 nm de distância e 20 nm de profundidade). As dimensões do eletrodo excederam o campo de visão da FIB, de modo que o padrão foi realizado em múltiplas posições de palco. A fim de automatizar o processo, marcas fiduciais foram gravadas no lado da folha de silício segurando as sondas no lugar, para permitir que o software localizasse com precisão as linhas padronizadas no pernil da sonda. Os fiducials eram necessários porque o movimento do estágio criou uma incerteza grande (~5 μm) na posição da área do teste padrão no que diz respeito ao campo de vista do feixe do íon. A colocação dos fiducials na folha de silício permitiu que a FIB localizasse as áreas padrão sem digitalizar diretamente o feixe no fio de ponta, o que poderia contaminar ou danificar o fio da sonda. Todo o processo de gravura automatizado para um shank levou aproximadamente 12 h para ser concluído e não exigiu nenhuma intervenção do operador após o início do padrão. Coletivamente, os benefícios do uso da FIB para gravar recursos no pernil de sonda de silício foram a capacidade de fazer características do tamanho de nanômetros, automatizar o processo de gravação e a capacidade de gravar em uma sonda fabricada. Embora fib tem grandes benefícios, uma das desvantagens de usar este método de fabricação é a taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de produção lenta que, em última análise, limita o potencial de produção em massa de dispositivos com nano-arquiteturas em sua superfície58. Alternativamente, outros métodos de fabricação utilizados para criar tamanhos de recursos e geometrias de interesse, talvez a taxas mais rápidas e em produções de massa, incluem litografia de feixe de elétrons e litografia nanomarca59,60,62,63,64,65. No entanto, esses métodos não permitem a gravação de recursos de nanoarquitetura em dispositivos fabricados. Tradicionalmente, esses métodos são utilizados durante o processo de fabricação em uma folha de silício ou polímero, que pode ser usado em etapas de processamento a jusante para fabricar o engano final.
Os eletrodos funcionais foram incapazes de passar por um processo automatizado devido a não ter qualquer material circundante em torno do haste de eletrodo em que para incluir marcas fiduciais na corrida. Portanto, os eletrodos funcionais foram manualmente alinhados e gravados em 500 seções μm ao longo da haste, usando a mesma corrente de íon e tensão que a execução automatizada para garantir os mesmos tamanhos de recurso. O feixe teve que ser realinhado manualmente após ter terminado cada intervalo de 500 μm e ajustado acima para gravar a seção seguinte. O processo de realinhamento manual dos padrões a cada 500 μm pode potencialmente levar a nanoestruturas ou estruturas danificadas que não correspondem à geometria pretendida. Isto é devido a tempos de exposição mais longos o feixe de íons precisa para o alinhamento manual66. Esta foi uma das dificuldades encontradas com a gravura manual. Devido a essa complicação, dois contatos de gravação foram curto-circuito e foram incapazes de gravar potenciais de ação neuronal (Figura 6). A Figura 6 demonstra um segmento de gravação ao vivo eletrofisiológico do animal implantado com o eletrodo nanoarquitetura. As caixas azuis descrevem os canais que registram fortes potenciais de ação, em comparação com as caixas vermelhas que denotam os dois canais mortos. Assim, um dos desafios do uso de gravura manual da FIB em eletrodos pós-fabricados é que há uma chance de que o feixe possa curto-circuito contatos e impedi-los de gravação. Este desafio é aprimorado ao tentar gravar o lado frontal dos eletrodos de silício de haste única, em que os contatos de gravação e traços estão ao longo de toda a haste do eletrodo. Embora seja viável gravar o silício em torno dos contatos e traços de gravação, cuidado extra é aconselhado a evitar danos e diminuição do desempenho das capacidades de gravação do eletrodo.
Como mencionado anteriormente, fib pode ser utilizado em vários materiais para gravar inúmeras geometrias recurso na superfície. No entanto, é importante notar que os parâmetros para gravar geometrias, como linhas nos vários materiais, são complicados de prever. Particularmente para padrões de linha, a largura e profundidade da linha são fortemente dependentes de muitos parâmetros, como a tensão acelerada, corrente de feixe, tempo de habitação, espaçamento de pixels, vida útil da abertura e tipo de material. Outro parâmetro que resulta da otimização é o tempo total para moer cada linha. Linhas mais estreitas e mais profundas poderiam ser alcançadas usando correntes de feixe menores; entretanto, o tempo do teste padrão para um shank inteiro da ponta de prova estenderia aos dias múltiplos, que não é prático. Assim, embora seja viável otimizar o protocolo aqui apresentado, seria extremamente difícil descrever os parâmetros para materiais desconhecidos. Ao solucionar os parâmetros para as sondas de silício descritas neste protocolo, numerosos cortes de teste no silício foram feitos para avaliar como as condições de mudança afetaram a largura e as profundidades da linha. Assim que as condições avaliadas foram capazes de gravar o tamanho da característica específica e geometria de interesse (200 nm linhas de largura que foram 200 nm de profundidade), esses parâmetros foram usados para escrever o script de software. O roteiro foi usado para controlar o espaçamento de cada linha, de centro a centro, que neste protocolo é de 300 nm. Estudos futuros utilizando substratos/dispositivos de silício que exigem tamanhos de recursos em centenas de nanômetros podem usar os parâmetros descritos neste protocolo como ponto de partida para solucionar problemas nas condições necessárias para criar os tamanhos de recurso desejados. Mais otimização e solução de problemas das condições de gravação serão necessárias para substratos/dispositivos metálicos e polímeros. No geral, a utilização da FIB para gravura em nanoarquiteturas em superfícies materiais permite amplo controle e flexibilidade nas geometrias de recursos, uso de inúmeros materiais compatíveis e vários tipos de superfície, incluindo dispositivos manufaturados. Os resultados representativos aqui apresentados demonstraram os benefícios potenciais observados em nossos estudos de utilização da FIB para gravar nanoarquiteturas na superfície de microeletrodos intracortical: 1) aumento da densidade neuronal e 2) redução de marcadores neuroinflamatórios em torno de dispositivos implantados com nanoarquiteturas, bem como 3) resultados preliminares que retratam a melhoria da qualidade das gravações eletrofisiológicas ao longo do tempo. Da mesma forma, o emprego e otimização do protocolo descrito gravando características de nanoarquitetura na superfície de um material pode ser utilizado para melhorar a funcionalidade de inúmeros dispositivos médicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelos prêmios do Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento de Reabilitação de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos (EUA): #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) e #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA ou do Governo dos Estados Unidos. Os autores gostariam de agradecer à FEI Co. (Agora parte da Thermofisher Scientific) pela assistência e uso da instrumentação por pessoal, o que ajudou no desenvolvimento dos roteiros utilizados nesta pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
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