Summary
הצגנו כי תחריט של הננו-ארכיטקטורה לתוך התקנים מיקרו-אלקטרודה תאיים עשוי להפחית את התגובה הדלקתית ויש לו את הפוטנציאל לשפר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. השיטות המתוארות כאן מתווה גישה לחרוט ננו-ארכיטקטורות לפני השטח של מיקרואלקטרודות שאינן תפקודי ופונקציונלי בודד.
Abstract
עם ההתקדמות בטכנולוגיית האלקטרוניקה והייצור, המיקרואלקטרודות התאיים עברו שיפורים משמעותיים המאפשרים ייצור של מיקרואלקטרודות מתוחכמות ברזולוציה גבוהה יותר ויכולות מורחבות. ההתקדמות בטכנולוגיית הייצור תמכה בפיתוח של אלקטרודות ביוגיתיים, המטרה לשלב בצורה חלקה לתוך המוח מקומכימה, להפחית את התגובה נוירודלקתית נצפתה לאחר החדרת אלקטרודה ולשפר את איכות ו אריכות ימים של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעסיק גישה ביותונית שסווגו לאחרונה כננו אדריכלות. השימוש בליתוגרפיה של קרן יון ממוקדת (פרפור) היה מנוצל בפרוטוקול זה כדי לחרוט תכונות הננו אדריכלות מסוימים לתוך המשטח של לא פונקציונלי ופונקציונלי יחיד מיקרואלקטרודות מיקרו. חריטה ננו-ארכיטקטורות לתוך משטח האלקטרודה הצביעו על שיפורים אפשריים של תאימות ופונקציונליות של המכשיר מושתל. אחד היתרונות של שימוש פרפור הוא היכולת לחרוט על התקנים מיוצרים, בניגוד במהלך הייצור של המכשיר, הקלה על אפשרויות ללא גבולות כדי לשנות מכשירים רפואיים רבים שלאחר הייצור. הפרוטוקול המוצג במסמך זה יכול להיות מותאם עבור סוגי חומרים שונים, הננו-ארכיטקטורה תכונות, וסוגי התקנים. הגדלת פני השטח של מכשירים רפואיים מושתלים יכולה לשפר את ביצועי המכשיר ואת האינטגרציה לתוך הרקמה.
Introduction
מיקרואלקטרודות תאיים (IME) הן אלקטרודות פולשניות המספקות אמצעי ממשק ישיר בין התקנים חיצוניים לבין האוכלוסיות הנוירואליות בתוך קליפת המוח1,2. טכנולוגיה זו היא כלי רב ערך עבור הקלטת פוטנציאל פעולה עצבית כדי לשפר את היכולת של מדענים לחקור פונקציה עצבית, הבנה מראש של מחלות נוירולוגיות ולפתח טיפולים פוטנציאליים. מיקרואלקטרודה תאיים, משמש כחלק מערכות ממשק המוח (BMI), מאפשר הקלטה של פוטנציאל פעולה מקבוצות יחיד או קטן של נוירונים כדי לזהות כוונות מוטוריות שניתן להשתמש כדי לייצר פלטי פונקציונלי3. למעשה, מערכות BMI בהצלחה שימשו למטרות תותבות וטיפוליות, כגון רכשה sensorimotor בקרת קצב להפעלת סמן מחשב בחולים עם טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)4 ופציעות חוט השדרה5 ושחזור התנועה אצל אנשים הסובלים tetraplegia כרונית6.
למרבה הצער, עורכי שיטות קלט אינם מצליחים להקליט בעקביות לאורך זמן עקב מצבי כשל מספר הכוללים גורמים מכניים, ביולוגיים וחומריים7,8. התגובה נוירודלקתית המתרחשת לאחר השתלת האלקטרודה נחשבת לאתגר ניכר לתרום כישלון אלקטרודה9,10,11,12,13,14. התגובה נוירודלקתית היא ביוזמת במהלך הכניסה הראשונית של ה-IME אשר מנתקת את מכשול המוח בדם, נזקים המוח המקומי בתוך כימומה ומשבש את הרשתות גליה והנוירואליות15,16. זו תגובה חריפה מאופיין על ידי הפעלת תאים גליה (microglia/מקרופאגים ו astrocytes), אשר שחרור pro דלקתית מולקולות נוירומורביות סביב האתר שתל17,18,19,20. הפעלה כרונית של תאים גליה תוצאות תגובת גוף זר מאופיין על ידי היווצרות של צלקת גליה בידוד אלקטרודה מרקמת מוח בריא7,9,12,13,17,21,22. בסופו של דבר, הינדרינג היכולת של האלקטרודה להקליט פוטנציאל הפעולה העצבי, בשל המכשול הפיזי בין האלקטרודה לבין הנוירונים ואת ניוון ומוות של נוירונים23,24,25.
הכישלון המוקדם של המיקרואלקטרודות התאיים הביא למחקר רב בהתפתחות של אלקטרודות הדור הבא, עם דגש על אסטרטגיות ביואיטיים26,27,28,29,30. עניין מיוחד לפרוטוקול המתואר כאן, הוא השימוש בננו-ארכיטקטורה כמחלקה של שינויים משטח ביואידיני עבור עורכי שיטות ה-31. זה כבר הוקם כי משטחים מחקה את הארכיטקטורה של הטבע בסביבה vivo יש תגובה סתיימים משופר32,33,34,35,36. לפיכך, ההשערה משכנעת פרוטוקול זה הוא כי הניתוק בין הארכיטקטורה הגסה של רקמת המוח והארכיטקטורה החלקה של המיקרואלקטרודות התאיים עשוי לתרום לתגובת גוף האדם הנוירודלקתית וכרונית ל-Ime (לסקירה מלאה מתייחסים לקים et al.31). בעבר הצגנו כי ניצול של התכונות ננו-ארכיטקטורה דומה האדריכלות של המוח מטריתאי מטריקס מפחית את סמנים דלקתיים האסטרוציטוט מן התאים המתורבתות על מצעים ננו-אדריכלי, לעומת משטחי שליטה שטוח הן מודלים vivo מבחנה לשעבר ומדגמים של נוירודלקת37,38. יתר על כן, הצגנו את היישום של קרן יון ממוקדת (פרפור) להדפס לחרוט ננו-ארכיטקטורות ישירות על בדיקה סיליקון הביא באופן משמעותי הכדאיות העצבית מוגברת ביטוי נמוך יותר של גנים אנטי דלקתיות מבעלי חיים מושתל עם בדיקה ננו אדריכלות בהשוואה לקבוצה בקרת חלקה26. לפיכך, מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לתאר את השימוש בליטוגרפיה פרפור כדי לחרוט ננו-ארכיטקטורות על מכשירים מיקרואלקטרודה מתוצרת תאיים. פרוטוקול זה נועד לחרוט ננו אדריכלות בגודל תכונות לתוך משטחי סיליקון של שאנקס מיקרואלקטרודה תאיים ניצול הן אוטומטי וידני תהליכים. שיטות אלה אינן מסובכת, מיוחלות, והוא יכול בהחלט להיות ממוטב עבור חומרי התקן שונים בגדלים תכונות הרצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: בצע את השלבים הבאים תוך לבישת ציוד ההגנה האישי המתאים, כגון חלוק מעבדה וכפפות.
1. הרכבה ללא פונקציונלי בדיקה סיליקון עבור קרן יון ממוקד (פרפור) ליתוגרפיה
הערה: עבור ההליך המלא המתאר את הייצור של וופל SOI עם 1,000 הבדיקות, אנא פנה אל Ereifej ואח '39.
- לבודד רצועה של 2-3 בדיקה סיליקון מן הסיליקון על מבודד (SOI) וופל המכיל 1,000 בדיקה. אין ליצור רצועות המכילות יותר משלושה בדיקה סיליקון. זה עשוי להגדיל את הסיכויים הרכבה רופף עלול לגרום חוסר יישור וכתוצאה מכך לחרוט בצורה שגויה.
הערה: רצועות/רגשים לא באופן יציב על stub אלומיניום יכול לגרום שני סיבוכים: 1) כאשר השלב עובר לעבוד על הסעיף הבא, יהיו תנודות הטחינה לא יהיה מדויק עד הבדיקה מתיישב 2) זה יכול לגרום וריאציה גבוהה ולהיות מחוץ למישור המיקוד.- בעוד ללבוש כפפות, להשתמש מלקחיים עדינים להפעיל לחץ סביב הגששים כדי לשבור מקטע קטן המכיל שניים עד שלושה ברגשים.
- נקו בזהירות את בדיקת הסיליקון של כל האבק והפסולת לפני תחריט פרפור. הכינו 6 הצלחות קלקר על ידי ליטוף 3 מ ל/טוב של 95% אתנול לתוך שלוש בארות.
- בזהירות להרים את רצועת לחתוך של בדיקה סיליקון באמצעות טיפ דק או מלקחיים ואקום ולמקם אותו לתוך מסננת תאים. מניחים רק רצועה אחת של הבדיקות סיליקון לכל מסננת כדי למנוע שבירת הבדיקות. מניחים את הסננת המכילה את הרצועה בדיקה סיליקון לתוך הבאר הראשונה המכילה 95% אתנול לניקוי. לשמור על מסננת בבאר הראשונה עבור 5 דקות.
- להעביר את המיסננת המכילה את הבדיקות סיליקון מן הבאר הראשונה ולמקם אותו לתוך השני היטב המכיל 95% אתנול במשך 5 דקות נוספות. חזור פעם נוספת. בבאר השלישית
- מניחים את הסננת המכיל את בדיקה סיליקון מנוקה על צלחת פוליארבאואתילן לאוויר יבש. עשה את הצעד הזה בשכונה סטרילית. כדי למנוע זיהום מאבק
- מניחים את רצועת האוויר היבש של הבדיקות הסיליקון במיכל אטום להובלה ל-SEM-פרפור. עוטפים את מסננת המכיל את הדגימות אוויר מיובש עם ניילון או אלומיניום לעטוף נייר להובלה ו/או אחסון כדי לשמור על ניקיון.
- השתמש עדין או מלקחיים ואקום כדי להרים בזהירות את הרצועה נקי של בדיקה סיליקון ומניחים אותם על stub אלומיניום נקי (משמש הדמיה SEM-פרפור/תחריט) כדי להתכונן להרכבה.
- השתמש קיסם (או מכשיר מצוין אחר כמו חוט חשמלי דק), למקום טיפה זעירה (~ 10 μL) של צבע כסף על קצה מצע הסיליקון סביב הגששים. לאבטח את הרצועה על ידי הפצת צבע כסף סביב הצדדים של מצע הסיליקון סביב הגשוש. הניחו לצבע הכסוף להתייבש לגמרי לפני הצבת ספח האלומיניום לתוך ה-SEM-פרפור.
הערה: היזהרו לא לקבל צבע כסף על הסכין של האלקטרודה כי זה החלק כי יהיה חרוט. אם רצועת הבדיקות אינה מעוגנת באופן מאובטח לספח אלומיניום, רצועת עשוי לנוע במהלך העיבוד או יש מטוס מוקד אחר, ובכך וכתוצאה מכך כרסום שגוי על ידי פרפור. כמה רצועות של בדיקה סיליקון ניתן לרכוב על stub אלומיניום אותו, וודא שיש רווח בשפע בין הרצועות כדי לאפשר הסרה של stub לאחר תחריט. הדבר יאפשר חריטה יעיל יותר של מספר רב של רגשים באמצעות התכונה האוטומטית המתוארת להלן.
2. יישור פרפור לבדיקות סיליקון
- לחץ על כפתור פתח בלשונית בקרת הקורה לפרוק את התא. הקש Shift + F3 כדי לבצע את השלב הביתי. אשר את הבחירה על-ידי בחירה בלחצן ' שלב הבית ' בחלון המוקפץ.
הערה: הפעלת השלב הביתי היא צעד מונע כדי להבטיח שציר השלב ייקרא כהלכה על-ידי התוכנה והמיקרוסקופ במצב טוב. - לאחר השלמת השלב הביתי, הזז את השלב לקואורדינטות X = 70 מ"מ, Y = 70 מ"מ, Z = 0 מ"מ, T = 0 °, R = 0 °. לאחר פרקו החדר, הכניסו כפפות ניטריל נקיות ופתחו את דלת החדר.
הערה: בהתאם ליישום המשתמש הקודם, ייתכן שיהיה צורך לשנות את מתאם השלב. מתאמי הבמה הסטנדרטיים (למשל, בסגנון פיי) ניתן להסיר על ידי הסרת הדופק המרכזי נגד כיוון השעון ומותקן על ידי עם כיוון השעון לתוך צלחת סיבוב של הבמה. - הכנס את ספח האלומיניום המחזיק את הגששים לחלק העליון של מתאם הבמה. אבטח את stub האלומיניום על-ידי הידוק הבורג הקבוע בצד מתאם השלב. השתמש במפתח הברגים ההקסדצימליים 1.5 mm עבור משימה זו.
- התאם את גובה מתאם השלב על-ידי הפיכת המתאם כיוון השעון לנמוכה יותר או כנגד כיוון השעון כדי להעלות אותו. אבטח את מתאם הבמה לצלחת הסיבוב על ידי הפעלת האגוז הנועל בכיוון השעון עד האגוז מאובטח נגד צלחת סיבוב הבמה. החזק את מתאם הבמה ביד השנייה כדי למנוע את סיבוב המתאם והדגימות תוך הידוק אגוז הנעילה של האצטרובל.
הערה: השתמש במד הגובה שסופק כדי לקבוע את הגובה המתאים. החלק העליון של stub האלומיניום צריך להיות בגובה זהה לקו המקסימום המוצג על מד הגובה. במהלך הידוק אגוז קונוס יכול לגרום נזק לבמה ומתאם. תשתמש במספיק כוח. כדי לאבטח את הדגימות - לרכוש תמונת מצלמת ניווט. הנדנדה בזהירות את הזרוע מצלמת הניווט פתוח עד שהוא עוצר. שלב המיקרוסקופ יהיה באופן אוטומטי עבור מיקום מתחת למצלמה. צפה בתמונה החיה המוצגת ברביע 3 של ממשק המשתמש של המיקרוסקופ (UI).
- לאחר שרמת הבהירות אוטומטית מתאימה לרמה המתאימה, השג את התמונה על-ידי דחיפת הלחצן למטה במסגרת הכן של המצלמה. הקפד להמתין לסיום רכישת התמונה כולה, המצוינת על-ידי סמל הפסקה המופיע ברביע 3 וההארה של המצלמה מבוטלת. . זה לוקח בערך 10 ס מ הנדנדה את זרוע המצלמה חזרה למצב סגור. . הבמה תחזור לתנוחה המקורית
- סגור בזהירות את דלת תא המיקרוסקופ. צפה תמונת מצלמה CCD ברביע 4 בעת סגירת הדלת. ודא כי דגימות והבמה הם מרחק בטוח הרחק מכל מרכיב קריטי בחדר המיקרוסקופ.
- בחר את החץ למטה שליד הלחצן משאבה בכרטיסיה בקרת הקרן. בחר משאבה עם לחצן ניקוי לדוגמה בתוכנת UI כדי להפעיל את משאבת ואקום קאמרית בנוי מנקה פלזמה. ודא שהדלת אטומה על-ידי דחיפה עדינה על פני הדלת כאשר המשאבה פועלת. המתן כ 8 דקות עבור זמן שאיבה וניקוי מחזור פלזמה לחדר המיקרוסקופ להסתיים.
הערה: ניתן לאשר באמצעות משיכת בעדינות את דלת החדר, שעליה להישאר סגורה אם המערכת נמצאת תחת ואקום. - לאחר שהסמל בפינה הימנית התחתונה של ממשק המשתמש הופך לירוק, לחץ על לחצן ההתעוררות בלשונית בקרת הקרן אשר מפעילה את האלקטרון ואת קרני היונים. בחר ברביע 1 והגדר את אות הקרן לקרן האלקטרונים (אם לא נקבעה כבר), הגדר רביע 2 לקרן יון (אם לא נקבעה כבר).
- הגדר מתח SEM כדי 5 kV, להגדיר את קרן SEM הנוכחי 0.20 nA, להגדיר גלאי SEM כדי ETD, להגדיר מצב גלאי אלקטרון משני. הגדר מתח פרפור כדי 30 kV, הגדר קרן פרפור הנוכחי 24 הרשות, הגדר גלאי פרפור כדי גלאי קרח, להגדיר מצב גלאי לאלקטרון המשני.
- לחץ פעמיים על בדיקה סיליקון בתמונה המצלמה ניווט, רביע 3 כדי להזיז את הבמה למיקום משוער של הגשוש. לחץ על רביע 1 כדי לבחור אותו כמו רביע פעיל ולחץ על כפתור ההשהיה כדי להפעיל את הסריקה SEM. הגדר את זמן הסריקה עד 300 ns וביטול שילוב הסריקה, שילוב שורות ומסגרת בממוצע. הגדר את סיבוב הסריקה ל-0 בכרטיסיה בקרת הקרן ולחץ לחיצה ימנית על מתאם הקרן הדו ובחר באפס.
- כוונן את ההגדלה לערך המינימלי על-ידי הפיכת כפתור ההגדלה נגד כיוון השעון בחלונית MUI. התאימו את בהירות התמונה והניגודיות בעזרת הידיות בחלונית MUI או בסמל סרגל הכלים ' בהירות ניגודיות אוטומטית '.
- להזיז את השלב על ידי כפול שמאלה-לחיצה על העכבר על תכונה כדי למרכז אותו, או על ידי לחיצה על גלגל העכבר והפעלת מצב העכבר ג'ויסטיק. להעביר את בדיקת הסיליקון הרצויה כדי להיות בדוגמת למרכז של תמונת SEM.
- אתר קצה או תכונות אחרות כגון חלקיק אבק או שריטה. הגדל את ההגדלה ל-2, 000x על-ידי הפיכת כפתור ההגדלה לכיוון השעון. כוונן את המיקוד של ה-SEM על-ידי הפיכת ידיות המיקוד הגסים והעדינים ב-MUI עד להתמקדות בתמונה. לאחר שהתמונה ממוקדת, בחרו בדגימת הקישור Z ללחצן ' מרחק עבודה ' בסרגל הכלים.
- ודא שהפעולה הושלמה על-ידי התבוננות בקואורדינטות של ציר Z בכרטיסיית הניווט. הערך צריך להיות כ 11 מ"מ. סוג ב 4.0 mm במיקום הציר Z ולדחוף את הלחצן Go אל עם העכבר או ללחוץ על מקש enter במקלדת ואת השלב תעבור מרחק עבודה 4 מ"מ.
- להזיז את השלב X ו-Y כדי לאתר את הכתף של לווין הסיליקון. מקם אותו קרוב למרכז ה-SEM ככל האפשר. לשנות את ההטיה בשלב 52 ° על ידי הקלדת "52" ב קואורדינטת T ו להכות להיכנס. שים לב אם הכתף של המקדח מופיע למעלה או למטה בתמונה. השתמש במחוון ' שלב Z ' כדי להביא את הכתף של המקדח חזרה למרכז תמונת ה-SEM. כוונן רק את מיקום Z, אל תזיז את הציר X, Y, T או R.
- הפעל את הפקודה המוכללת "xT ליישר תכונה" הממוקמת בתפריט הנפתח בשלב. להשתמש בעכבר כדי ללחוץ על שתי נקודות במקביל לקצה של הגשוש. ודא שלחצן האפשרויות האופקי נבחר בחלון המוקפץ ולחץ על סיום. השלב יסתובב כדי ליישר את הגשוש עם ציר X של הבמה. כוונן את השלב ב-X, Y באמצעות העכבר כדי לשים את הכתף התחתונה של הגשוש במרכז תמונת ה-SEM שוב.
הערה: הנקודה הראשונה צריכה להיות לכיוון אחיזת המקדח והנקודה השנייה צריכה להיות לכיוון נקודת הבדיקה. - בחר את פרפור ברביע 2 וודא שהזרם הנוכחי הוא עדיין 24 pA. הגדר את ההגדלה ל-5, 000x וזמן ההתעכב על 100 ns. הקלד Ctrl-F בלוח המקשים כדי להגדיר את המוקד פרפור ל 13.0 מ"מ. בכרטיסיה בקרת הקורה, לחץ לחיצה ימנית במתאם stigmator 2d ובחר באפס וגם, לחץ לחיצה ימנית במתאם הקרן Shift דו-ממדי ובחר באפס. הגדר את סיבוב הסריקה ל-0 ° ולאחר מכן לחץ על לחצן בהירות הניגודיות האוטומטית בסרגל הכלים.
- חפשו תמונה של הכתף של המקדח ברביע 2. השתמש בכלי תצלום בזק כדי לרכוש תמונה עם ה-פרפור. לאשר את הכתף הבדיקה היא במרכז התמונה פרפור, אם לא, לחץ פעמיים על הכתף בדיקה כדי להעביר אותו למרכז. הזז את השלב שמאלה על ידי דחיפת מקש החץ השמאלי במקלדת כ 10-15 פעמים. צלם תמונה אחרת ובדוק אם צד הגשוש עדיין נמצא במרכז ה-פרפור.
הערה: אם לא, סיבוב הבמה חייב להיות מותאם מעט. אם הגשוש נמצא מעל למרכז התמונה, יש לסובב את הבמה בכיוון השלילי. אם הגשוש נמצא מתחת למרכז, יש לסובב את הבמה בכיוון השעון. הזן סבב compucentric מוקד יחסית של 0.01 עד 0.2 מעלות בהתאם לדרך הנחוצה כדי ליישר את הגשוש. - חזור על שלבים 2.16 כדי 2.17 פעמים רבות ככל הנדרש עד קצה הכתף בדיקה הוא מיושר לחלוטין עם ציר X של הבמה, (הקצה נשאר במרכז של פרפור תוך כדי תנועה שמאלה).
- באמצעות פרפור, להזיז את הבמה בחזרה לכתף התחתונה של הגשוש. שמור את מיקום הבמה ברשימת המיקום על-ידי לחיצה על לחצן הוסף . לשנות את קרן פרפור הנוכחי כדי 2.5 nA ולוודא את ההגדלה של פרפור עדיין 5000x. הפעל את פונקציית הניגודיות של הבהירות האוטומטית והגדר את הזמן להתעכב על 100 ns.
- להכות את כפתור ההשהיה כדי להתחיל סריקה. כוונן את המיקוד והאסטיציה, במהירות האפשרית, תוך שימוש בידיות המיקוד הגסים והעדינים, ובידיות הstigmator X ו-Y בלוח MUI. להכות את כפתור ההשהיה כדי לעצור את סריקת פרפור.
3. כתיבת תהליך אוטומטי לתחריט
- הפעל את התוכנה על-ידי איתור הקובץ בתפריט התחל של Windows (כלומר, הפעלה/מתכנתים/החברה/היישום S\tempanes). הצב את חלון התוכנה בצג הצדדי כך שממשק המשתמש לא יהיה מכוסה. פתח את הקובץ לצורך בדיקה של הבדיקות הסיליקון על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן פתיחה. הפנה את דפדפן windows למיקום קובץ ה-script של התוכנה (קובץ משלים 1 -שם הקובץ הוא "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime. jbj").
- בתוך התוכנה, בחר את התפריט הנפתח מיקרוסקופ ובחר Set מקור הבמה. בתוך התוכנה, בחר את התפריט הנפתח מיקרוסקופ ולאחר מכן בחר כיול גלאים.
- על מיקרוסקופ UI, לחץ בתוך Quad 1 פעם עם העכבר כדי לבחור Quad 1. התעלם מההוראות האחרות המוצגות בחלון המוקפץ, הן אינן נחוצות עבור פרוייקט זה. לחץ על אישור כדי להפעיל את הכיול. התהליך ייקח בערך 5 דקות. לוודא שגלאי הקרח והגלידה. זה בסדר אם לגלאים אחרים. יש כשלים בכיול
- בתוך התוכנה, בחר את התפריט הנפתח מיקרוסקופ ובחר להפעיל כדי להתחיל את רצף הלחץ. כשהתבנית תושלם, סגור את התוכנה.
הערה: התוכנה תיקח למעלה מ-3 ו-4 עבור פונקציות ההיערכות והיישור. . התסריט ייקח כ -12 שעות לרוץ בזמן שהתסריט פועל, אל תשנה שום פרמטר במיקרוסקופ. - Hit "פורקן" בתוך המיקרוסקופ ממשק משתמש בקרת קרן לכבות את קורות המיקרוסקופ ולהתחיל את מחזור האוורור. בעוד החדר הוא אוורור, להזיז את הבמה לקואורדינטות X = 70 מ"מ, Y = 70 mm, Z = 0 מ"מ, T = 0 °, R = 0 °. לאחר פרקו החדר, הניחו את כפפות הניטריל הנקיות ופתחו את דלת החדר.
- שחרר את הבורג שנקבע במתאם ה-stub באמצעות מפתח הברגים הקסדצימאלי של 1.5 מ"מ. הסר את stub אלומיניום המכיל את המקדח בדוגמת מהחדר. סגור בזהירות את דלת תא המיקרוסקופ. צפה תמונת מצלמה CCD ברביע 4 בעת סגירת הדלת. ודא שמתאם הבמה הוא מרחק בטוח הרחק מרכיב קריטי כלשהו בחדר המיקרוסקופ.
- בחר את החץ למטה לצד לחצן המשאבה בכרטיסיה בקרת הקרן. בחר משאבת כפתור כדי להתחיל את המשאבה ואקום קאמרית. ודא שהדלת אטומה על-ידי דחיפה עדינה על פני הדלת כאשר המשאבה פועלת.
הערה: ניתן לאשר באמצעות משיכת בעדינות את דלת החדר, שעליה להישאר סגורה אם המערכת נמצאת תחת ואקום. זמן השאיבה יהיה 5 דקות בקירוב. רק צד אחד של החללית יכול להיות חרוט במהלך ריצה אחת. - אם החלק הקדמי והאחורי של המכשיר דורש תחריט, ולאחר מכן להסיר בזהירות את הרצועה החרוטה של בדיקות סיליקון לאחר בדיקת החרוט הסופי והדמיה בצד הקדמי (אם יש צורך בתמונות). מתמוסס את צבע הכסף עם אצטון, על ידי בזהירות באמצעות בינג/צחצוח אצטון על צבע כסף. בזהירות להפוך את הרצועה סביב האחורי, לטעון מחדש, ליישר לחרוט בעקבות השלבים המתוארים לעיל.
4. בדיקת האיכול הסופי והדמיה
- לאחר הטחינה להשלים לוודא את אחידות של סעיפים שונים באמצעות הדמיה SEM בהגדלה גבוהה יותר.
הערה: הדמיה בזווית מוטה מאפשרת הערכה טובה יותר של הווריאציה בעומק הטחינה. תשומת לב מיוחדת תינתן לאזורי המעבר בין מיקומי הטחינה. - התמונה הדגימות שוב לאחר הטחינה עם מיקרוסקופ אופטי.
הערה: הקווים התקופתיים משפיעים על אפקט שבירה המעניק צבעים שונים כפונקציה של זווית ההדמיה. אם הצבע אינו רציף יחד עם החללית כי הוא אינדיקציה ברורה של ההפרעה בקווים המוחלק.
5. הרכבה בדיקה סיליקון פונקציונלי עבור תחריט פרפור
- הסר בעדינות את אלקטרודה הסיליקון הפונקציונלית מאריזתו. השתמש מלקחיים כדי להרים בזהירות את הכרטיסייה מגן פלסטיק המכסה את הראש בשלב. התחל להרים פינה אחת של הלשונית למעלה מהדבק הדביק המחזיק אותו במקומו והמשך להרים עד שכל האלקטרודה תוסר.
- בזהירות להדק את האלקטרודה עם הומוסטטיסטיקה כדי להתכונן להרכבה לתוך מסגרת סטריאוטקאית. בעוד מחזיק את הלשונית מכוסה עם מלקחיים, בעדינות המקום מעוקל הפסטטיסטיקה סביב הפיר הירוק מעל הצינור סיליקון, עם החלק העקום של הפסטטיסטיקה פונה כלפי מעלה לכיוון הלשונית. נעל את הדימום במקום כדי להבטיח את האלקטרודה לא לנשור מ הדימום.
- הסר בעדינות את כרטיסיית ההגנה הפלסטית המכסה את השלב הראשי. בזמן החזקת האלקטרודות עם הדימום, הצמד בזהירות את האלקטרודה לתוך המסגרת הסטריאוטקלית לניקוי.
- מילוי 3 צלחות פטרי עם 95% אתנול (~ 10 מ"ל לכל צלחת פטרי). מניחים את צלחת פטרי תחת האלקטרודה שנטענה לתוך המסגרת הסטריאוטקאית לניקוי. הנמך את האלקטרודה באיטיות על-ידי הפיכת המיקרומניפולציה כלפי מטה (100 μm/s) כך שהלהב מתחת לפני האתנול של 95%.
הערה: היזהרו לא להפוך את המיקרומניפולציה מהר מדי או עמוק מדי, זה יכול לגרום האלקטרודה לשבור (כלומר, האלקטרודה לא צריך לגעת צלחת פטרי). - להשאיר את הסכין האלקטרודה ב 95% אתנול עבור 5 דקות, ולאחר מכן להעלות באיטיות את האלקטרודה מתוך 95% אתנול על ידי הפיכת המיקרומניפולציה כלפי מעלה (100 μm/s). חזור על שלב זה פעמיים נוספות, עבור סך של שלוש שטיפות. הניחו לאלקטרודות להתייבש באוויר למשך חמש דקות.
- השתמש באותה טכניקה להרכבת האלקטרודה לתוך המסגרת הסטריאוטקאית, כדי להסיר את האלקטרודה מהמסגרת הסטריאוטקאית. הציבו בזהירות את הפסטטיסטיקה סביב פיר האלקטרודה. לאחר ההחזרי המים, שחררו את האלקטרודה מהמסגרת הסטריאוטקאית, החזר את כרטיסיית ההגנה הפלסטית המכסה את השלב הראשי, והחזר את האלקטרודות הנקובות לתוך האריזה.
6. תחריט בדיקה סיליקון פונקציונלי באמצעות פרפור
- הר האלקטרודות התפקודית הפונקציונלי ניקוי על דוכן אלומיניום. בזהירות להרים את האלקטרודה הפונקציונלית סיליקון פונקציונלי באמצעות מלקחיים ולהסיר את הלשונית מגן מן הבמה. מניחים את סכין האלקטרודה על stub אלומיניום כך שהוא לא נתלה על כל קצה, ולאחר מכן באמצעות חתיכה קטנה של הקלטת Cu או פחמן מוליך, להצמיד את השלב הקדמי באופן מאובטח stub אלומיניום.
הערה: לחלופין, מחזיק מחסנית פרופיל נמוך יכול לשמש כדי להחזיק את האלקטרודה למטה. להיזהר לא לגעת בסכין האלקטרודה. - בעקבות השלבים המתוארים לעיל (סעיף 2), הצב את האלקטרודה בגובה המימוקד וודא שהאלקטרודה נמצאת בנקודת הצירוף של הקורות ה-SEM ו-פרפור. יישר את הסכין עם כיוון האיקס של הבמה.
- הגדר את ה-פרפור לזרם האופטימלי לטחינת הדרוש את הננו-ארכיטקטורה וודא שהמוקד והstigmation תוקנו כראוי. הכן מערך קווים עם הריווח והאורך הרצוי כדי לכסות את שדה התצוגה של הסכין (500 יקרומטר סעיפים). כוונן את אורכי השורה כתחריט מקבל את הלהב למקטעים דקים יותר.
הערה: בעת צריבה של האלקטרודה הפונקציונלית, לא ניתן להוסיף fiducial סימונים כדי להפוך את התהליך לאוטומטי. לכן, הזזת בין מקטעי המשנה (~ 500 μm) מתבצעת באופן ידני. - לאחר הטחינה של החלק הראשון, הקפידו לבדוק את איכות הטחינה לפני המעבר לחלק הבא. חזור על שלב 6.3 כדי לחרוט את החלק הבא של הסכין. יישר את הקווים המ, מהמקטע הקודם לתבניות המשמשות למקטע הבא כדי למנוע מרווחים גדולים בין הרצפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרפור-אדריכלות בעיצוב ננו-ארכיטקטורה על משטחים של שאנק בודד רגשים
ניצול השיטות המתוארות כאן, הבדיקות התאיים היו חרוטים עם ננו-ארכיטקטורות ספציפיות בעקבות פרוטוקולים שנקבעו39. הממדים והצורה של העיצוב ננו-אדריכלות המתוארים בשיטות אלה יושמו מן הקודם בתוצאות מחוץ לגופית המתאר ירידה של תא גליה תגובתיות כאשר מתורבתים עם עיצוב ננו אדריכלות המתואר כאן37,38. השיטות המתוארות כאן מנוצל קרן יון גליום ממוקדת (פרפור) כדי לחרוט ננו בקנה מידה חריצים מקבילים לתוך המשטח של לא פונקציונלי בודד שאנק הסיליקון בדיקה מיקרואלקטרודה, כפי שתוארה בעבר39. חריצים מקבילים ננו חרוטים לאורך הסכין של הישבן של המקדח באמצעות סקריפט אוטומטי שנכתב בתוכנה. הממדים הסופיים של הננו-ארכיטקטורה החרוטים היו 200 ננומטר מקבילים רחבים, במרווחים 300 ננומטר, והיה לו עומק של 200 nm (איור 1). השימוש פרפור לחרוט ננו ארכיטקטורות לתוך משטח המכשיר מאפשר חריטה של עיצובים מדויקים לתוך מכשירים מיוצרים.
תחריט ננו-אדריכלות לתוך השפעה רגשים התאיים על דלקת נוירוטית
בנתונים אלה שדווחו קודם לכן, הבדיקות התאיים עם הננו-ארכיטקטורות חרוטים הושתל בתוך קליפת החולדות במשך שבועיים או ארבעה שבועות (n = 4 לכל נקודת זמן) ולעומת בעלי חיים בשליטה מושתל עם הבדיקות החלקות המכילות לא הדפסים ננו-אדריכלות (n = 4 לכל נקודה)39. אחד המנגנונים של כישלון הפרעה הפריסה הקלינית של מיקרואלקטרודות תאיים היא התגובה הנוירודלקתית הנגרמת מהפרעה המוח בתוך מחסום במוח בדם9,10,11,12,15. תיאור מלא של התגובה נוירודלקתית נצפתה לאחר השרשה מיקרואלקטרודה התאיים ניתן למצוא בסקירות הבאות13,14,22. היכולת של מיקרואלקטרודות תאיים להקליט פוטנציאל הפעולה של הנוירונים הוא תלוי במרחק של הגופים עצביים בריאים מן ההקלטה מיקרואלקטרודהה40באתר. לכן, המחקר דיווחו בעבר העריכו את הדלקת הנוירוטית סביב האתר השתלת בדיקה תאיים על ידי כימות סמנים היסטולוגית לדחיסות עצבית, הפעלת תא גליה וביטוי גנים של סמנים proinflammatory39. הדגשים ממחקר זה מוצגים להלן כדי לייצג את תחריט השפעות ננו-ארכיטקטורות לתוך משטח המקדח היה על דלקת מוחי.
ההשפעות של ננו חרוט-אדריכלות על צפיפות תא העצב
כדי לקבוע כיצד חריטה ננו-ארכיטקטורות לתוך משטח הבדיקה של המכשיר, הצפיפות העצבית מיידית סביב השתל, הגרעין העצבי היה מוכתם וכימות באופן שמתאר בעבר את השיטות האימונוהיסטוכימיה39,41. לא היו הבדלים משמעותיים של צפיפות הנוירונים סביב הננו-אדריכלות ושליטה הבדיקות ב 2שבועותפוסט השרשה (איור 2א). עם זאת, היו נוירונים באופן משמעותי יותר סביב בדיקה ננו-אדריכלות במרחק 100-150 יקרומטר מהאתר השתל לעומת שתלים בקרה חלקה (p < 0.05 לעומת שולטת) (איור 2ב) ב 4 שבועות פוסט השרשה. התגלה גם כי הייתה מגמה מוגברת של צפיפות עצבית המקיפה את הננו-אדריכלות בעלי החיים לאורך זמן, מנוגד את המגמה ירידה של צפיפות עצבית סביב שתלים בקרה (איור 2). יש קשר ישיר המתאר תגובה נוירודלקתית מוחלט ביחד עם צפיפות גבוהה יותר של נוירונים קיימא סביב המיקרואלקטרודה, תוצאות יכולת מוגברת עבור microelectrode לספק הקלטות איכות15,40,42. לכן, כאשר לפרש נתונים הצפיפות העצבית, צפיפות גבוהה יותר של נוירונים סביב אתר השתל עשוי להצביע על תגובה נוירודלקתית המופחת ואיכות הקלטה משופרת ויציבות ממיקרואלקטרודות תאיים.
ההשפעות של ננו חרוט-אדריכלות על סמנים מולקולריים נוירודלקתיות
היסטולוגיה מספיק כדי לזהות את התאים סביב אתר השתל; עם זאת, חסר רגישות וספציפיות לאפיון הפנוטיפים של התאים הסובבים. מכאן, שיטות ניצול ביטוי גנים כמותיים המועסקים לכמת את הביטוי הגן היחסי של סמנים נוירודלקתיות, כדי להבין את האפקט ננו-ארכיטקטורה יש על פנוטיפ של התאים39. מספר סמנים נוירודלקתיים נחקרו במחקר שדווחו בעבר. כאן רק שניים יודגש כי הם ספציפיים לתאי מיקרוגלייה, על מנת לדון כיצד הפנוטיפים שלהם יכול להיות שונה. האשכול של בידול 14 (CD14) הוא קולטן דפוס הזיהוי על הקרום של מיקרוגלייה מזהה חיידקים אותות השביל דלקתית לאחר פציעה/השרשה43,44,45. תחמוצת החנקן סטנדרטים (NOS2), הוא סמן לחץ חמצוני מבוטא microglia/מקרופאגים כי הוא קשור לייצור מוגבר של סמנים proinflammatory46,47.
בנתונים שדווחו קודם לכן, לא היו הבדלים משמעותיים של CD14 ביטוי גנטי יחסי בין ננו-ארכיטקטורה ושתלים שליטה בשני או ארבעה שבועות שלאחר ההשתלה. בעיקר, היה ירידה משמעותית (p < 0.05) של CD14 ביטוי גנטי יחסי של שניים עד ארבעה שבועות סביב באתר שתלים ננו אדריכלות ', המציין ירידה אפשרית בדלקת (מסומן על ידי * באיור 3א). באופן דומה, לא היו הבדלים משמעותיים של NOS2 ביטוי גנטי יחסי בין ננו-אדריכלות ושתלים שליטה בשבועיים. עם זאת, היה פחות משמעותית (p < 0.05) NOS2 הביטוי הגנטי היחסי סביב השתל ננו אדריכלות לעומת שתל השליטה בארבעה שבועות post-השרשה (מסומן על ידי באיור 3ב). יתר על כן, הייתה עלייה משמעותית בין 2 ל 4 שבועות של NOS2 ביטוי גנטי יחסית סביב שתלים בשליטה (מסומן על ידי * באיור 3B), ואין הבדלים שנצפו סביב שתלים ננו אדריכלות לאורך זמן, עוד המציין ירידה פוטנציאלית של דלקת סביב שתלים ננו אדריכלות. כאשר מדובר בפענוח נתונים אלה, חשוב להבין את התפקוד של הגנים המוכמת. לדוגמה, ירידות של גנים פרו-דלקתיים מצביעים על ירידה סבירה בתגובה דלקתית סביב אתר האלקטרודה, בעוד גידול בסוגים אלה של גנים מציע עלייה בסבירות דלקת.
פרפור/ננו חרוט-אדריכלות על משטחים של מיקרואלקטרודות שאנק אחד פונקציונלי
המחקר דיווחו בעבר היה מבטיח תוצאות הוכחת עלייה קלה של צפיפות תא העצב ואת הירידה הפוטנציאלית של מיקרוגליה פנוטיפים דלקתיים סביב באתר ננו אדריכלות בדיקה השתל. כדי לחקור את התרגום של התוצאות האלה כדי פונקציונליות האלקטרודה, מיקרואלקטרודה אחת פונקציונלי בודד הסיליקון היה חרוט עם עיצוב הננו-ארכיטקטורה זהה כמו שאינו פונקציונלי בדיקה מיקרואלקטרודה בודדת סיליקון, ניצול פרוטוקול חריטה דומה. ההבדל היחיד במתודולוגיה לחריטה הננו-ארכיטקטורה שצוין היה כי הפרוטוקול של אלקטרודות פונקציונלי לא יכול להיות אוטומטי, כמו לא היה חומר המצע נוסף כדי ליצור סימונים fiducial. כך, האלקטרודה פונקציונלי היה חרוט באופן ידני על ידי יישור מחדש את הקורה כל 500 μm, כפי שמתואר בפרוטוקול לעיל. התחריטים האחרונים היו 200 ננומטר שורות מקבילות רחב, במרווחים 300 ננומטר בנפרד, והיה לו עומק של 200 nm (איור 4).
אפקטים של ננו חרוט-אדריכלות לתוך מיקרואלקטרודות תאיים על אלקטרופיזיולוגיה
הקלטות מיקרואלקטרודה מוצלחת מאוד מבוססת על הסמיכות של הנוירונים סביב אתרי השתל, את שלמות המכשיר ואת השידור האמין של פעילות יחידה יחידה מהמוח8,40,48,49. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות הוקלטו באמצעות מדדים מוקלטים שנאספו פעמיים בשבוע במשך שמונה שבועות. המדדים שנוצלו במחקר זה היו, אחוז הערוצים הקלטה יחידות יחיד, המוני המוני יחידות מוקלטות, ויחס אות לרעש (SNR). טיפול בעלי חיים מוסדיים והשימוש ועדות (IACUC) בבית החולים לואי סטוקס קליבלנד המרכז הרפואי אישר את כל ההליכים בעלי חיים. העכברושים הזוג חולדות (8-10 בן שבועות ושקילה ~ 225 g) היו מושתלים עם יחיד שאנק סיליקון מיקרואלקטרודה, עם שהוזכרו לעיל ננו אדריכלות (n = 1) או את הפקדים חלק (n = 6). שום ניתוח סטטיסטי לא בוצע על הנתונים האלה, כפי שהיה אחד ננו-ארכיטקטורה מיקרואלקטרודה מושתל למחקר הוכחת המושג פיילוט. עם זאת, התוצאות האלקטרופיזיולוגיות הקולקטיבית מראה אחוז מוגבר של ערוצים הקלטה יחידות יחיד (איור 5א), הגברה מקסימלית (איור 5B) של יחידות מוקלטות, ו SNR (איור 5ג) מן מיקרואלקטרודות nano-אדריכלות לעומת מיקרואלקטרודות חלק בקרת, מבטיחים. תוצאות אלה מצביעות על כך שתחריט של הננו-ארכיטקטורה לפני השטח של מיקרואלקטרודות עשוי לגרום לאיכות משופרת ואריכות ימים של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. הערכה נוספת עם גודל דגימה מוגברת נחוצה כדי לאמת את הממצאים הראשוניים.
איור 1: פרפור שטחים ננו-ארכיטקטורה על משטחים של שאנק בודד בבדיקות. SEM תמונות של בדיקה שאינו פונקציונלי יחיד הסיליקון שאנק עם פרפור שחרוט בארכיטקטורות ננו לאורך הישבן של הסכין. (א) תמונות מרוכבות של התחריט כולו לאחר הבדיקה המוצגת בהגדלה של 120x, סרגל קנה מידה = 400 μm. הסימנים הfiducial, (קופסה מרובעת עם סמל + עובר את זה), חרוטים לאורך מצע הסיליקון המקיף את הגשוש. תמונות SEM מוגדל של העצה בדיקה מוצגים (ב) ב 1, 056x הגדלה (סרגל קנה מידה = 40 μm), (ג) ב 3, 500x הגדלה (סרגל קנה מידה = 10 μm), ו (ד) ב 10, 000X הגדלה, סרגל קנה מידה = 4 μm. איור זה שונה מהפניה39. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההשפעות של ננו חרוט-אדריכלות על צפיפות תא העצב. הישרדות עצבית מוצגת כאחוז מאזור הרקע של אותם בעלי חיים במרחקים של 50 יקרומטר פחי הרחק מהאתר שתל. (א) לא הבדלים משמעותיים של הישרדות עצבית נצפו בין המשטחים החלקים (בקרה) ושתלים nanopatterned ב 2 שבועות שלאחר ההשתלה. (ב) הייתה הישרדות עצבית גבוהה באופן משמעותי סביב השתלים nanopatterned במרחק של 100-150 יקרומטר בהשוואה למשטחים חלקים (p < 0.05) ב 4 שבועות לאחר השרשה. דמויות מייצגות של נוירונים (ירוק מוכתם), עם המתאר הצהוב המתאר את אתר ההשתלה, ו "P" המציין את הצד החרוט של מיקרואלקטרודה, סרגל קנה מידה = 100 μm. איור זה השתנה מ-39. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ההשפעות של ננו חרוט-אדריכלות על סמנים מולקולריים נוירודלקתיים. רקמת נאסף סביב 500 יקרומטר רדיוס של אתר ההשתלה הן שתלים nanopatterned ובקרה. הביטוי הגנטי היחסי של סמנים דלקתיים היה ככמת לעומת שני סוגי השתל (ההבדלים מסומנים על ידי על הגרף; p < 0.05) כמו גם לאורך זמן (ההבדלים מסומנים על ידי * על הגרף; p < 0.05). (א) ביטוי גנטי יחסי של CD14 ירד באופן משמעותי סביבשתליםnanopatterned בין שניים עד ארבעה שבועות (*). (ב) היה ביטוי גנטי יחסי נמוך באופן משמעותי של NOS2 סביב nanopattern שתל לעומת שליטה בארבעה שבועות () והייתה עלייה משמעותית של NOS2 משתיים עד ארבעה שבועות סביב שתלים בשליטה חלקה (*). איור זה שונה מהפניה39. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פרפור/ננו תחריט אדריכלות על משטחים של מיקרואלקטרודות שאנק בודד פונקציונלי. הכניסה בפינה הימנית העליונה מציגה את מיקרואלקטרודה מנוצל במחקר זה ליד אגורה כדי לתאר את הגודל של האלקטרודה (קו שחור דק). התמונות SEM של המיקרואלקטרודות שאנק עם פרפור החרוט ננו ארכיטקטורות לאורך החלק האחורי של הסכין. הלהב כולו מוצג בראש ב 600x הגדלה (סרגל קנה מידה = 50 μm), בעוד ההזחה מתארת את פני השטח nanopatterned ב 25, 000x הגדלה, סרגל קנה מידה = 1 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ההשפעות של ננו-ארכיטקטורה חרוטה לתוך מיקרואלקטרודות התאיים על אלקטרופיזיולוגיה. הערכה של מדדים אלקטרופיסיולוגיים גילתה מגמה מבטיחה מוגברת של מעלה (a) אחוז של ערוצים הקלטה יחידות יחיד, (ב) הגברה מקסימלית של יחידות מוקלטות, ו (ג) יחס האות לרעש מן המיקרואלקטרודה החרוט עם ננו ארכיטקטורות לעומת אלקטרודות בקרה חלקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הקלטת אלקטרופיזיולוגיה של מיקרואלקטרודות מושתלים עם שאנק בודד עם פרפור חרוט ננו-ארכיטקטורות. אחד האתגרים של שימוש פרפור לחרוט ננו-ארכיטקטורות על מכשירים microelectrode מיוצר הוא הסיכון של קצר מקצרים הקלטה קשרים. ציר ה-x מתאר את זמן ההקלטה בשניות, וציר ה-y מציג את ערוצי האלקטרודות בהקלטה של פוטנציאל פעולה עצבי. כל קו ממוספר בציר-y מייצג ערוץ אלקטרודה שונה, כאשר ערוץ מספר 1 הוא הערך השני ו -16 הוא העמוק ביותר. התיבות האדומות מתווה את הערוצים הקצרים, ואילו התיבות הכחולות מתווה את הערוצים עם פעילות עצבית גלויה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול הייצור המתואר כאן משתמש ליתוגרפיה ממוקדת קרן יון כדי להפוך ביעילות והשבוק ננו-ארכיטקטורות לתוך המשטח של שאינו פונקציונלי ופונקציונלי יחיד מיקרואלקטרודות סיליקון. קרן יון ממוקדת (פרפור) ליתוגרפיה מאפשר אבלציה סלקטיבית של משטח המצע באמצעות קרן יון ממוקדת דק50,51. פרפור הוא טכניקת כתיבה ישירה שיכולה לייצר תכונות שונות עם רזולוציה ננומטרי ויחס גובה-רוחב גבוה50,52,53. כדי ליצור את התכונות בגודל שונים, את הגודל של קרן יון הנוכחי יכול להיות ממוטב כדי לשנות את קרן יון בגודל ספוט בטווח של 3 ננומטר כדי 2 יקרומטר50,51. כמה יתרונות כלליים של שימוש פרפור כדי לחרוט תכונות על משטחים הם: 1) זה יכול לשמש על מגוון רחב של חומרים, כולל סיליקון, מתכות, פולימרים53,54,55,56, 2) פרפור ניתן לבצע על משטחים שאינם מישורי, ו 3) פרפור ניתן להשתמש לאחר עיבוד על התקנים בודדים57.
כאן, שימש פרפור בשילוב עם מיקרוסקופ SEM ותוכנה המשמש לכתיבת סקריפט אוטומטי מיוחדות לחריטה תכונות ספציפיות לתוך שאינם פונקציונליים בדיקה בודדת. הסקריפט כולל פרמטרים הנדרשים (2.5 nA יון קרן הנוכחי ו 30 kV מתח) כדי לחרוט את הריווח המדויק הרצוי (200 nm מקבילים רחב חריצים, במרווחים 300 ננומטר בנפרד 20 ננומטר עמוק). ממדי האלקטרודה עלו על שדה הראייה של ה-פרפור, כך שהקטעים בוצעו במיקומים מרובים. על מנת להפוך את התהליך, fiducial סימנים חרוטים בצד של גיליון הסיליקון מחזיק את הבדיקות במקום, כדי לאפשר לתוכנה לאתר במדויק את הקווים בתבנית על הסכין המקדח. הfiducials היו נחוצים מכיוון שתנועת הבמה יצרה אי ודאות גדולה (~ 5 μm) במיקום אזור הדפוס ביחס לשדה התצוגה של קרן היונים. מיקום הfiducials על גיליון הסיליקון מותר על פרפור לאתר את אזורי דפוס מבלי לסרוק ישירות את הקרן על הסכין, אשר עלול לזהם או לפגוע הסכין המקדח. תהליך החריטה האוטומטי כולו עבור שעבוד אחד לקח כ 12 שעות כדי להשלים ודרש ללא התערבות המפעיל לאחר התחלת העיבוד. באופן קולקטיבי, את היתרונות של שימוש פרפור כדי לחרוט תכונות לתוך הסכין בדיקה סיליקון היו היכולת להפוך את התכונות בגודל ננומטר להפוך את תהליך החריטה, ואת היכולת לחרוט על המחקר מפוברק. למרות שלפרפור יש הטבות בשפע, אחד החסרונות של שימוש בשיטת הייצור הוא קצב התפוקה האיטי שבסופו של דבר מגביל את הפוטנציאל לייצור המוני של מכשירים עם ננו-ארכיטקטורות לפני השטח שלהם58. לחילופין, שיטות ייצור אחרות מנוצל כדי ליצור גדלים תכונות וגאומטריות של עניין, אולי בקצב מהיר יותר בהפקות המוני, כוללים ליתוגרפיה של קרן האלקטרונים ו-nanoimprint ליתוגרפיה59,60,61,62,63,64,65. עם זאת, שיטות אלה אינן מאפשרות חריטה של תכונות ננו-אדריכלות לתוך מכשירים מיוצרים. באופן מסורתי שיטות אלה מנוצלים במהלך תהליך הייצור על גיליון של סיליקון או פולימר, אשר ניתן להשתמש בו במורד המדרגות עיבוד כדי להמציא את השקר הסופי.
האלקטרודות תפקודית לא הצליחו לעבור תהליך אוטומטי עקב לא כל חומר שמסביב סביב סכין האלקטרודה שבה לכלול fiducial לתוך הריצה. לכן, האלקטרודות הפונקציונלית היו מיושרים באופן ידני ונחרט בסעיפים 500 יקרומטר לאורך הלהב, באמצעות אותו הזרם יון ומתח כמו ההפעלה האוטומטית כדי להבטיח את אותם גדלים של תכונות. הקרן היה צריך להיות ידנית ינה לאחר השלמת כל מרווח 500 יקרומטר ולהגדיר לחרוט את הסעיף הבא. תהליך היישור הידני של הדפוסים כל 500 יקרומטר עלול לגרום נזק למבני ננו או מבנים שאינם תואמים את הגיאומטריה המיועדת. הדבר נובע פעמים חשיפה ארוכה קרן יון צריך יישור ידני66. זה היה אחד הקשיים שנתקלו בתחריט הידני. בשל סיבוך זה, שני מגעים הקלטה היו קצרים מקוצר ולא הצליחו להקליט פוטנציאל הפעולה העצבית (איור 6). איור 6 מדגים מקטע הקלטה אלקטרופיסיולוגית של בעל החיים מושתל באלקטרודה ננו-ארכיטקטורה. הארגזים הכחולים מתווה את הערוצים הקלטת פוטנציאל פעולה חזק, בהשוואה לתיבות אדומות המציין את שני הערוצים מתים. מכאן, אחד האתגרים של שימוש בחריטה באופן ידני על אלקטרודות שלאחר הייצור היא כי יש סיכוי כי הקרן יכול קצר מעגל הקשר ולמנוע מהם הקלטה. האתגר הזה הוא משופר כאשר מנסה לחרוט את הצד הקדמי של אלקטרודות בודד שאנק סיליקון, שבו ההקלטה המגעים והעקבות הם לאורך הלהב כולו של האלקטרודה. למרות שזה אפשרי לחרוט את הסיליקון סביב הקשר ההקלטה ועקבות, אזהרה נוספת מומלץ כדי למנוע נזק וירידה בביצועים של יכולות הקלטה של האלקטרודה.
כפי שהוזכר קודם לכן, הפרפור יכול להיות מנוצל על חומרים שונים כדי לחרוט תכונות רבות גיאומטריות מנסה לתוך המשטח. עם זאת, חשוב לציין כי הפרמטרים לחרוט גיאומטריות, כגון קווים לתוך החומרים השונים, הם מסובכים לחזות. במיוחד עבור דפוסי קו, רוחב הקו והעומק הם תלויים מאוד פרמטרים רבים כגון מתח האצה, קרן זרם, לשכון זמן, מרווח פיקסל, חיים של הצמצם וסוג החומר. פרמטר נוסף שנובע ממיטוב הוא הזמן הכולל לטחנת כל שורה. ניתן להשיג קווים צרים יותר ועמוקים יותר באמצעות זרמי קרן קטנים יותר; עם זאת, הזמן תבנית עבור שאנק החללית שלמה היה להאריך למספר ימים, וזה לא מעשי. לפיכך, למרות שניתן למטב את הפרוטוקול המוצג כאן, יהיה קשה מאוד לתאר את הפרמטרים לחומרים לא ידועים. בפתרון בעיות בפרמטרים של הבדיקות הסיליקון המתוארות בפרוטוקול זה, מספר חתכים בסיליקון נעשו כדי להעריך כיצד התנאים המשתנים השפיעו על רוחב ועומק הקו. ברגע התנאים הוערכו הצליחו לחרוט את גודל התכונה הספציפית ואת הגיאומטריה של עניין (200 nm קווים רחבים שהיו 200 ננומטר עמוק), פרמטרים אלה שימשו כדי לכתוב את הסקריפט תוכנה. קובץ ה-script שימש לשליטה בריווח של כל שורה, ממרכז למרכז, שפרוטוקול זה הוא 300 ננומטר. מחקרים עתידיים ניצול סיליקון מצעים/התקנים הדורשים גדלים תכונה במאות nanometers, יכול להשתמש בפרמטרים המתוארים בפרוטוקול זה כנקודת התחלה לפתרון בעיות בתנאים הדרושים כדי ליצור את גודל התכונה הרצויה. אופטימיזציה נוספת ופתרון בעיות של תנאי החריטה יידרש עבור מצעים/מתקנים פולימריים/מתכת. באופן כללי, באמצעות פרפור לחריטה ננו-ארכיטקטורות לתוך משטחי החומר מאפשר שליטה מספיק וגמישות בתכונות גיאומטריות, שימוש בחומרים תואמים רבים, ומספר סוגי פני השטח, כולל מכשירים מיוצרים. תוצאות הנציג הציג כאן הפגינו הטבות פוטנציאליות שנצפו במחקרים שלנו ניצול פרפור לחרוט ננו-ארכיטקטורות לתוך המשטח של מיקרואלקטרודות תאיים: 1) הגדלת צפיפות עצבית 2) הפחתת סמנים נוירודלקתיים סביב התקנים מושתלים עם ננו-ארכיטקטורות, כמו גם 3) ממצאים ראשוניים המתאר איכות משופרת של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות לאורך זמן. כמו כן, התעסוקה והאופטימיזציה של הפרוטוקול המתואר תחריט העיצוב ננו-אדריכלות לתוך המשטח של חומר יכול להיות מנוצל כדי לשפר את הפונקציונליות של מכשירים רפואיים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי ארצות הברית (ארה ב) המחלקה לענייני ותיקי מחקר שיקום ושירותי פיתוח פרסים: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) ו #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). התוכן אינו מייצג את התצוגות של ארה ב. משרד לענייני יוצאי צבא או ממשלת ארצות הברית. המחברים רוצים להודות פיי ושות (כיום חלק מדעית תרמופישר) לסיוע הצוות ושימוש במכשור, אשר סייעה בפיתוח הסקריפטים המשמשים במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
References
- Salcman, M., Bak, M. J. A new chronic recording intracortical microelectrode. Medical and Biological Engineering. 14 (1), 42-50 (1976).
- Im, C., Seo, J. -M. A review of electrodes for the electrical brain signal recording. Biomedical Engineering Letters. 6 (3), 104-112 (2016).
- Donoghue, J. Bridging the Brain to the World: A Perspective on Neural Interface Systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
- Gilja, V., et al. Clinical translation of a high-performance neural prosthesis. Nature medicine. 21 (10), 1142-1145 (2015).
- Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17849-17854 (2004).
- Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping in a person with tetraplegia through brain-controlled muscle stimulation: a proof-of-concept demonstration. Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
- Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neurosciences. 6 (1), 48-67 (2015).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Michelson, N. J., et al. Multi-scale, multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
- Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
- Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
- Ravikumar, M., et al. The Roles of Blood-derived Macrophages and Resident Microglia in the Neuroinflammatory Response to Implanted Intracortical Microelectrodes. Biomaterials. 0142 (35), 8049-8064 (2014).
- Hermann, J., Capadona, J. Understanding the Role of Innate Immunity in the Response to Intracortical Microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
- Ereifej, E. S., et al. Implantation of Intracortical Microelectrodes Elicits Oxidative Stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00009 (2018).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
- Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862 (2017).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 7 (3), 315-326 (1999).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
- Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11 (5), 056014 (2014).
- Wei, X., et al. Nanofabricated Ultraflexible Electrode Arrays for High-Density Intracortical Recording. Advanced Science. , 1700625 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Kim, Y., et al. Nano-Architectural Approaches for Improved Intracortical Interface Technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chemical Neurosciences. 1 (1), 36-48 (2010).
- Ding, H., Millet, L. J., Gillette, M. U., Popescu, G. Actin-driven cell dynamics probed by Fourier transform light scattering. Biomedical Optical Express. 1 (1), 260-267 (2010).
- Kotov, N. A., et al.
- Curtis, A. S., et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Trans Nanobioscience. 3 (1), 61-65 (2004).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5 (1), 13406 (2011).
- Ereifej, E. S., et al. Nanopatterning effects on astrocyte reactivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (6), 1743-1757 (2013).
- Ereifej, E. S., Cheng, M. M. -C., Mao, G., VandeVord, P. J. Examining the inflammatory response to nanopatterned polydimethylsiloxane using organotypic brain slice methods. Journal of Neuroscience Methods. 217 (1-2), 17-25 (2013).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
- Buzsáki, G.
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
- Sladek, Z., Rysanek, D. Expression of macrophage CD14 receptor in the course of experimental inflammatory responses induced by lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. Veterinarni Medicina. 53 (7), 347-357 (2008).
- Janova, H., et al. CD14 is a key organizer of microglial responses to CNS infection and injury. Glia. , (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Ulevitch, R. J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell Science. 117 (14), 2865-2867 (2004).
- Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences. 75 (6), 639-653 (2004).
- Kozai, T. D., et al. Comprehensive chronic laminar single-unit, multi-unit, and local field potential recording performance with planar single shank electrode arrays. Journal of Neurosciences Methods. 242, 15-40 (2015).
- Kozai, T. D., et al. Mechanical failure modes of chronically implanted planar silicon-based neural probes for laminar recording. Biomaterials. 37, 25-39 (2015).
- Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. FIB-nanostructured surfaces and investigation of bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Transactions on Nanobioscience. 7 (1), 1-10 (2008).
- Lehrer, C., Frey, L., Petersen, S., Ryssel, H. Limitations of focused ion beam nanomachining. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures Processing, Measurement, and Phenomena. 19 (6), 2533-2538 (2001).
- Watkins, R., Rockett, P., Thoms, S., Clampitt, R., Syms, R.
- Veerman, J., Otter, A., Kuipers, L., Van Hulst, N. High definition aperture probes for near-field optical microscopy fabricated by focused ion beam milling. Applied Physics Letters. 72 (24), 3115-3117 (1998).
- Lanyon, Y. H., Arrigan, D. W. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. Sensors and Actuators B: Chemical. 121 (1), 341-347 (2007).
- Menard, L. D., Ramsey, J. M. Fabrication of sub-5 nm nanochannels in insulating substrates using focused ion beam milling. Nano Letters. 11 (2), 512-517 (2010).
- Ziberi, B., Cornejo, M., Frost, F., Rauschenbach, B. Highly ordered nanopatterns on Ge and Si surfaces by ion beam sputtering. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (22), 224003 (2009).
- Reyntjens, S., Puers, R. A review of focused ion beam applications in microsystem technology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 11 (4), 287 (2001).
- Heyderman, L., David, C., Kläui, M., Vaz, C., Bland, J. Nanoscale ferromagnetic rings fabricated by electron-beam lithography. Journal of Applied Physics. 93 (12), 10011-10013 (2003).
- Baquedano, E., Martinez, R. V., Llorens, J. M., Postigo, P. A. Fabrication of Silicon Nanobelts and Nanopillars by Soft Lithography for Hydrophobic and Hydrophilic Photonic Surfaces. Nanomaterials. 7 (5), 109 (2017).
- Eom, H., et al. Nanotextured polymer substrate for flexible and mechanically robust metal electrodes by nanoimprint lithography. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (45), 25171-25179 (2015).
- Li, K., Morton, K., Veres, T., Cui, B. 5.11 Nanoimprint Lithography and Its Application in Tissue Engineering and Biosensing. Comprehensive Biotechnology. , 125-139 (2011).
- Dong, B., Zhong, D., Chi, L., Fuchs, H. Patterning of conducting polymers based on a random copolymer strategy: Toward the facile fabrication of nanosensors exclusively based on polymers. Advanced Materials. 17 (22), 2736-2741 (2005).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Wilkinson, C. D. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (4), 973-979 (2008).
- Tseng, A. A., Chen, K., Chen, C. D., Ma, K. J. Electron beam lithography in nanoscale fabrication: recent development. IEEE Transactions on Electronics Packaging Manufacturing. 26 (2), 141-149 (2003).
- Yang, Y., Leong, K. W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 478-495 (2010).
- Vermeij, T., Plancher, E., Tasan, C. Preventing damage and redeposition during focused ion beam milling: The "umbrella" method. Ultramicroscopy. 186, 35-41 (2018).
