Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Сосредоточенная литография Ионного Луча для наноархитектур etch в микроэлектроды

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60004
Automatic Translation
1, 2,4, 5, 6, 2,3,4
1Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, 2Veteran Affairs Ann Arbor Healthcare System, 3Department of Neurology, School of Medicine, University of Michigan, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 5Michigan Center for Materials Characterization, University of Michigan, 6Carl Zeiss SMT, Inc.

Summary

Мы показали, что травление наноархитектуры в внутрикортикальные микроэлектродные устройства могут уменьшить воспалительные реакции и имеет потенциал для улучшения электрофизиологических записей. Описанные в нем методы намечают подход к наноархитектуре на поверхности нефункциональных и функциональных однохвостового кремния интракортикальных микроэлектродов.

Abstract

Благодаря достижениям в области электроники и технологии изготовления интракортикальные микроэлектроды претерпели значительные улучшения, позволяющие производство сложных микроэлектродов с большим разрешением и расширенными возможностями. Прогресс в технологии изготовления поддерживает развитие биомиметических электродов, которые направлены на бесшовную интеграцию в мозг паренхимы, уменьшить нейровоспалительный ответ наблюдается после вставки электрода и улучшить качество и долговечность электрофизиологических записей. Здесь мы описываем протокол использования биомиметического подхода, недавно классифицированного как нано-архитектура. Использование сфокусированной литографии ионного луча (FIB) было использовано в этом протоколе для вытравливать специфические особенности наноархитектуры на поверхности нефункциональных и функциональных однохвостовных интракортикальных микроэлектродов. Выгравирование наноархитектур в поверхность электрода указывает на возможные улучшения биосовместимости и функциональности имплантированного устройства. Одним из преимуществ использования FIB является возможность травления на изготовленных устройствах, в отличие от во время изготовления устройства, облегчая безграничные возможности для изменения многочисленных медицинских устройств после производства. Представленный в настоящем году протокол может быть оптимизирован для различных типов материалов, функций наноархитектуры и типов устройств. Увеличение поверхности имплантированных медицинских устройств может улучшить производительность устройства и интеграцию в ткани.

Introduction

Интракортикальные микроэлектроды (IME) являются инвазивными электродами, которые обеспечивают средство прямого столкновения между внешними устройствами и нейронными популяциями внутри коры головного мозга1,2. Эта технология является бесценным инструментом для записи нейронных потенциалов действия для улучшения способности ученых исследовать функции нейронов, заранее понимание неврологических заболеваний и развивать потенциальные методы лечения. Интракортикальный микроэлектрод, используемый как часть систем Brain Machine Interface (ИМТ), позволяет записывать потенциалы действия от отдельных или небольших групп нейронов для обнаружения моторных намерений, которые могут быть использованы для производства функциональных выходов3. В самом деле, ИМТ системы успешно используются для протезирования и терапевтических целей, таких как приобретенные сенсорного управления ритмом для работы компьютерного курсора у пациентов с амиотрофическим боковой склероз (ALS)4 и спинного мозгатравмы 5 и восстановления движения у людей, страдающих от хронической тетраплегии6.

К сожалению, IMEs часто не в состоянии записывать последовательно с течением времени из-за нескольких режимов отказа, которые включают механические, биологические и материальные факторы7,8. Нейровоспалительный ответ, происходящий после имплантации электрода, считается значительной проблемой, способствующей отказу электрода9,10,11,12,13,14. Нейровоспалительный ответ инициируется во время первоначальной вставки IME, который отделяет гематоэнцефалический барьер, повреждает местный мозг паренхимы и нарушает глиальные и нейронные сети15,16. Эта острая реакция характеризуется активацией глиальных клеток (микроглии/макрофагов и астроцитов), которые высвобождают провоспалительные и нейротоксические молекулы вокруг имплантата17,18,19,20. Хроническая активация глиальных клеток приводит к реакции инородного тела, характеризующейся образованием глиального шрама, изолируя электрод из здоровой ткани мозга7,9,12,13,17,21,22. В конечном счете, препятствуя способности электрода записывать нейронные потенциалы действия, из-за физического барьера между электродом и нейронами и дегенерации и смерти нейронов23,24,25.

Ранний отказ интракортикальных микроэлектродов привел к значительным исследованиям в области разработки электродов следующего поколения, с акцентом на биомиметические стратегии26,27,28,29,30. Особый интерес представляет описанный здесь протокол, который является использование наноархитектуры как класса биомиметических изменений поверхности для IMEs31. Установлено, что поверхности, имитирующие архитектуру естественной среды in vivo, имеют улучшенную биосовместимую реакцию32,33,34,35,36. Таким образом, гипотеза убедительных этот протокол является то, что разрыв между грубой архитектуры ткани мозга и гладкой архитектуры интракортикальных микроэлектродов может способствовать нейровоспалительных и хронических инородных реакции организма на имплантированные IMEs (для полного обзора относятся к Ким и др.31). Мы уже показали, что использование нано-архитектуры функции похожи на внеклеточной архитектуры матрицы мозга уменьшает астроцитов воспалительных маркеров из клеток, культивированных на нано-архитектурной субстраты, по сравнению с плоскими поверхностями управления в обоих в пробирке и ex vivo модели нейровоспаления37,38. Кроме того, мы показали применение сфокусированной ионной луча (FIB) литографии для вытравливания наноархитектур непосредственно на кремниевых зондов привело к значительному увеличению жизнеспособности нейронов и более низкой экспрессии провоспалительных генов у животных, имплантированных с нано-архитектурными зондами по сравнению с гладкой контрольной группой26. Таким образом, цель протокола, представленного здесь, заключается в описании использования литографии FIB для вытравливать наноархитектуры на изготовленных внутрикортикальных микроэлектродных устройствах. Этот протокол был разработан для вытравливание нано-архитектуры размера функций в кремниевых поверхностей внутрикортикальных микроэлектродов хвостовики с использованием автоматизированных и ручных процессов. Эти методы являются несложными, воспроизводимыми и, безусловно, могут быть оптимизированы для различных материалов устройства и желаемых размеров функций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте следующие шаги во время ношения надлежащего личного защитного оборудования, таких как лабораторное пальто и перчатки.

1. Монтаж нефункциональный кремний зонд для фокусированной ионной балки (FIB) Литография

ПРИМЕЧАНИЕ: Для полной процедуры, описывающей изготовление SOI с 1000 зондов, пожалуйста, обратитесь к Ereifej и др.39.

  1. Изолировать полосу из 2-3 кремниевых зондов из кремния на изоляторе (SOI) пластины, содержащие 1000 зондов. Не делайте полоски, содержащие более трех кремниевых зондов. Это может увеличить шансы на свободное монтаж и может привести к несогласованности в результате FIB etch неправильно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полосы / зонды не твердо сидит на алюминиевой заглушки может вызвать два осложнения: 1) когда этап движется к работе на следующем разделе, не будет вибраций и фрезерования не будет точной, пока зонд оседает и 2) это может вызвать высокие изменения и быть вне фокуса плоскости.
    1. Во время ношения перчаток, используйте тонкие щипцы, чтобы оказать давление вокруг зондов, чтобы разорвать небольшой раздел, содержащий от двух до трех зондов.
  2. Тщательно очистите кремниевый зонд от всей пыли и мусора до офорта FIB. Подготовьте 6 скважинполистировочная пластина путем пайпетирования 3 мл/колодца 95% этанола в три скважины.
    1. Тщательно подобрать вырезать полосу кремниевых зондов с помощью тонкой кончик или вакуумные щипцы и поместить его в ячейку ситечко. Поместите только одну полосу кремниевых зондов на ситечко, чтобы предотвратить нарушение зондов. Поместите ситечко, содержащий кремниевые зонды полосы в первый колодец, содержащий 95% этанола для очистки. Держите ситечко в первом колодце в течение 5 минут.
    2. Переместите ситечко, содержащее кремниевые зонды из первого колодца, и поместите его во второй колодец, содержащий 95% этанола еще на 5 мин. Повторите еще раз в третьем колодце.
    3. Поместите ситечко, содержащий очищенные кремниевые зонды, на политетрафтороэтиленную пластину, чтобы высушить воздух. Сделайте этот шаг в стерильных капюшон, чтобы избежать загрязнения от пыли.
  3. Поместите высушенную на воздухе полосу кремниевых зондов в герметичный контейнер для транспортировки в SEM-FIB. Оберните ситечко, содержащее высушенные на воздухе образцы, пластиковой или алюминиевой фольгой для транспортировки и/или хранения для поддержания очистки.
  4. Используйте тонкие наконечником или вакуумные щипцы, чтобы тщательно подобрать чистую полосу кремниевых зондов и поместить их на чистую алюминиевую заглушку (используется для SEM-FIB изображения / травления), чтобы подготовиться к монтажу.
  5. Используйте зубочистку (или другой тонкий наконечником инструмент, как тонкий электрический провод), чтобы поместить крошечную каплю (10 л) серебряной краски на краю кремниевого субстрата, окружающего зонды. Закрепите полосу вниз, распространяя серебряную краску по бокам кремниевого субстрата, окружающего зонд. Разрешить серебряную краску, чтобы полностью высохнуть перед размещением алюминиевой заглушки в SEM-FIB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не получить серебряную краску на хвостовик электрода, потому что это часть, которая будет травления. Если полоса зондов не надежно закреплена на алюминиевой заглушке, полоса может перемещаться во время обработки или иметь другой фокусный план, что приводит к неправильному фрезерному фрезерования СО FIB. Несколько полос кремния зонды могут быть установлены на той же алюминиевой заглушки, убедившись, что есть достаточно места между полосами, чтобы для удаления из заглушки после травления. Это позволит более эффективно офорт нескольких зондов с помощью автоматизированной функции, описанной ниже.

2. Приведение FIB к силиконовым зондам

  1. Нажмите на кнопку вентиляции в вкладке управления лучом, чтобы выпустить камеру. Пресс Shift-F3 для выполнения домашней сцены. Подтвердите выбор, выбрав кнопку Home Stage в всплывающем окне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запуск домашней стадии операции является превентивным шагом для обеспечения стадии оси читаются правильно программного обеспечения и микроскоп находится в хорошем состоянии.
  2. После завершения домашней стадии переместите сцену в координаты X - 70 мм, Y - 70 мм, 0 мм, Т - 0, R - 0. После того, как камера вентилируемые, наденьте чистые нитриловые перчатки и открыть дверь камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от приложения предыдущего пользователя, может потребоваться изменить адаптер стадии. Стандартные адаптеры этапа (например, тип FEI) можно извлечь путем unscrewing центральный bolt против часовой стрелки и установлены путем завинчивания по часовой стрелке в пластину вращения этапа.
  3. Вставьте алюминиевую заглушку, держащую зонды в верхней части адаптера сцены. Закрепите алюминиевую заглушку, затягивая сет-винт на боковой части адаптера. Используйте 1,5-мм гекс-гаечный ключ для этой задачи.
  4. Отрегулируйте высоту адаптера этапа, повернув адаптер по часовой стрелке, чтобы снизить его или против часовой стрелки, чтобы поднять его. Закрепите адаптер стадии к пластине вращения путем поворачивать запирая гайку конуса по часовой стрелке до тех пор пока гайка не будет безопасна против плиты вращения этапа. Держите адаптер сцены с другой стороны, чтобы предотвратить вращение адаптера и образцов, затягивая замок конусгайца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте предусмотренный датчик высоты для определения соответствующей высоты. Верхняя часть алюминиевой заглушки должна быть такой же высоты, как и максимальная линия, показанная на датчике высоты. Над затягивать гайку конуса может причинить повреждение к этапу и адаптеру. Только использовать достаточно силы для обеспечения образцов.
  5. Приобретите изображение навигационной камеры. Осторожно раскачивайте руку навигационной камеры, пока она не остановится. Стадия микроскопа автоматически переходит в положение под камерой. Смотреть живое изображение, отображаемые в квадранте 3 пользовательского интерфейса микроскопа (UI).
    1. Как только уровень яркости авто подстраивается под соответствующий уровень, приобретите изображение, нажав кнопку вниз на кронштейн камеры. Не забудьте дождаться завершения полного приобретения изображения, что указываетна символом паузы, появляющимся в квадранте 3, и освещением выключения камеры. Это занимает около 10 с. Качели руку камеры обратно в закрытое положение. Этап вернется в исходное положение.
  6. Аккуратно закройте дверь камеры микроскопа. Смотреть CCD изображение камеры в квадранте 4, закрывая дверь. Убедитесь, что образцы и этап находятся на безопасном расстоянии от любого важного компонента в камере микроскопа.
  7. Выберите стрелку вниз рядом с кнопкой насоса в вкладке управления лучом. Выберите насос с кнопкой очистки образца в программном обеспечении UI для запуска камерного вакуумного насоса и встроенного в плазменный очиститель. Убедитесь, что дверь запечатана, осторожно нажав на лицо двери в то время как насос работает. Подождите около 8 минут для накачки времени и плазменного цикла очистки для микроскопа камеры будет завершена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вакуумное уплотнение может быть подтверждено, аккуратно потянув на дверь камеры, которая должна оставаться закрытой, если система находится в вакууме.
  8. Как только значок в правом нижнем углу uI позеленеет, нажмите кнопку Wake-Up в вкладке управления лучом, которая включает электронные и ионные лучи. Выберите квадрант 1 и установите луч сигнала на электронный луч (если не установлен о том, что уже установлен), установите квадрант 2 на ионный луч (если уже не установлен).
    1. Установите напряжение SEM до 5 кВ, установите ток луча SEM до 0,20 nA, установите детектор SEM на ETD, установите режим детектора на вторичный электрон. Установите напряжение FIB до 30 кВ, установите пучок FIB до 24 pA, установите детектор FIB на детектор ICE, установите режим детектора на вторичный электрон.
  9. Дважды нажмите на кремниевый зонд в изображении навигационной камеры, квадрант 3, чтобы переместить сцену в приблизительное расположение зонда. Нажмите на квадрант 1, чтобы выбрать его в качестве активного квадранта и нажмите кнопку паузы, чтобы начать сканирование SEM. Установите время сканирования до 300 нс и выключите скан-переплетение, интеграцию строки усреднение кадра. Установите сканирование вращения до 0 в вкладке управления лучом и правой кнопкой мыши на пучка сдвиг 2d регулятор и выберите ноль.
  10. Отрегулируйте увеличение до минимального значения, повернув ручку увеличения против часовой стрелки на панели MUI. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения, используя ручки на панели MUI или значок панели инструментов Auto Contrast Brightness.
  11. Переместите сцену либо двойным левым нажатием мыши на функцию, чтобы центрировать его, или нажав вниз колесо мыши и активации режима мыши джойстика. Переместите нужный кремниевый зонд для узорчатого в центр изображения SEM.
  12. Найдите край или другие объекты, такие как частица пыли или царапина. Увеличьте увеличение до 2000x, повернув ручку увеличения по часовой стрелке. Отрегулируйте фокус SEM путем поворачивать грубые и тонкие ручки фокуса на MUI до тех пор пока изображение не будет в фокусе. После того, как изображение находится в фокусе, выберите образец ссылки на кнопку рабочего расстояния в панели инструментов.
  13. Подтвердите, что операция была завершена, посмотрев на координатку оси в вкладке навигации. Значение должно быть примерно 11 мм. Введите 4,0 мм в положении оси и нажмите кнопку Go To с помощью мыши или нажмите ключ входа на клавиатуре и этап будет двигаться на 4 мм рабочего расстояния.
  14. Переместите сцену в X и Y, чтобы найти плечо кремниевого зонда. Расположите его как можно ближе к центру SEM. Измените наклон стадии до 52 ", введя в "52" в T координат и удара введите. Обратите внимание на то, будет ли плечо зонда двигаться вверх или вниз на изображении. Используйте ползунок Stage, чтобы вернуть плечо зонда к центру изображения SEM. Только отрегулируйте положение , не двигайте оси X, Y, T или R.
  15. Запустите встроенную в"xT выровнять функцию"команда, расположенная в стадии, упускайте меню. Используйте мышь, чтобы нажать на две точки параллельно краю зонда. Убедитесь, что горизонтальная кнопка радио выбрана в всплывающем окне и нажмите отделку. Этап будет вращаться, чтобы привести зонд в соответствие с оси X сцены. Отрегулируйте сцену в X, Y с помощью мыши, чтобы положить нижнее плечо зонда в центре изображения SEM снова.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая точка должна быть к захвату зонда, а вторая точка должна быть к точке зонда.
  16. Выберите FIB в квадранте 2 и убедитесь, что луч ток по-прежнему 24 pA. Установите увеличение до 5000x и время пребывания до 100 нс. Введите Ctrl-F на клавиатуре, чтобы установить фокус FIB до 13,0 мм. В вкладке управления лучом, правой кнопкой мыши в стигматор 2d регулятор и выбрать ноль, а также, правый клик в Beam Shift 2d регулятор и выберите ноль. Установите вращение сканирования на 0 градусов и нажмите кнопку автоматической контрастности яркости в панели инструментов.
  17. Ищите изображение зонда плечо в квадранте 2. Используйте инструмент моментального снимка для получения изображения с помощью FIB. Подтвердите, что плечо зонда находится в центре изображения FIB, если нет, дважды щелкните по плечу зонда, чтобы переместить его в центр. Переместите сцену влево, нажав левый ключ стрелки на клавиатуре примерно 10-15 раз. Сделать еще один снимок и посмотреть, находится ли сторона зонда в центре FIB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет, то вращение этапа должно быть слегка скорректировано. Если зонд находится над центром изображения, этап должен вращаться в отрицательном направлении. Если зонд находится ниже центра, этап должен вращаться по часовой стрелке. Введите относительное компуцентрическое вращение от 0,01 до 0,2 градуса в зависимости от того, какой путь необходим для выравнивания зонда.
  18. Повторите шаги от 2,16 до 2,17 столько раз, сколько необходимо, пока край плеча зонда не будет идеально выровнен с осью X сцены (край остается в центре FIB при движении влево).
  19. Используя FIB, переместите сцену обратно в нижнее плечо зонда. Сохранить положение сцены в списке позиций, нажав кнопку Добавить. Измените ток луча FIB до 2,5 nA и убедитесь, что увеличение FIB по-прежнему 5000x. Запустите функцию автоматического контрастности яркости и установите время пребывания FIB до 100 нс.
  20. Нажмите кнопку паузы, чтобы начать сканирование. Отрегулируйте фокус FIB и астигматизм, как быстро и точно как по возможности, используя грубые и точные ручки фокусировки, и ручки стигмы X и Y на панели MUI. Нажмите кнопку паузы, чтобы остановить сканирование FIB.

3. Написание автоматизированного процесса для вытравления

  1. Запустите программное обеспечение, разместив его в меню запуска Windows (нат., Наисот-программы/FEI Компания-Приложения-Nanobuilder). Расположите окно программного обеспечения на боковом мониторе, чтобы uI не был прикрыт. Откройте файл для узора кремниевых зондов, нажав файл, а затем открыть. Направьте браузер Windows к расположению программного сценария(Дополнительный файл 1 - название файла "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
  2. В рамках программного обеспечения выберите меню выпадения микроскопа и выберите происхождение этапа. В рамках программного обеспечения выберите меню выпадения микроскопа, а затем выберите детекторы калибровки.
  3. На микроскопе uI, нажмите в квадроцикле 1 один раз с помощью мыши, чтобы выбрать квадроцикл 1. Игнорировать другие инструкции, указанные в всплывающем окне, они не являются необходимыми для этого проекта. Нажмите OK, чтобы начать калибровку. Процесс займет около 5 минут. Убедитесь, что ETD и ICE детекторы калибруйте. Это нормально, если какие-либо другие детекторы имеют сбои калибровки.
  4. В программном обеспечении выберите меню выпадения микроскопа и выберите Выполнение, чтобы начать последовательность шаблонов. Когда шаблон будет завершен, закройте программное обеспечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение возьмет на себя quad 3 и 4 для шаблонирования и выравнивания функций. Для запуска скрипта потребуется около 12 ч. Пока скрипт работает, не изменяйте ни одного параметра на микроскопе.
  5. Хит "Vent" в микроскоп UI луч управления вкладке, чтобы закрыть микроскоп лучей и начать цикл вентиляции. В то время как камера вентиляции, переместить сцену к координатам X - 70 мм, Y - 70 мм, 0 мм, Т 0, R . После того, как камера вентилируемые, надеть чистые нитриловые перчатки и вытащить дверь камеры.
  6. Освободите сет-винт на адаптере заглушки, используя гаечный ключ 1,5 мм. Удалите алюминиевую заглушку, содержащую узорчатый зонд, из камеры. Аккуратно закройте дверь камеры микроскопа. Смотреть CCD изображение камеры в квадранте 4, закрывая дверь. Убедитесь, что адаптер сцены находится на безопасном расстоянии от любого важного компонента в камере микроскопа.
  7. Выберите стрелку вниз рядом с кнопкой насоса в вкладке управления лучом. Выберите кнопку насоса, чтобы запустить камерный вакуумный насос. Убедитесь, что дверь запечатана, осторожно нажав на лицо двери в то время как насос работает.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вакуумное уплотнение может быть подтверждено, аккуратно потянув на дверь камеры, которая должна оставаться закрытой, если система находится в вакууме. Время накачки составит около 5 мин. Только одна сторона зонда может быть выгравирована в течение одного запуска.
  8. Если передняя и задняя сторона зонда требует травления, то осторожно удалите выгравированную полоску кремниевых зондов после проверки окончательного etch и визуализации передней стороны (если изображения необходимы). Растворите серебряную краску с ацетоном, осторожно dabbing / щеткой ацетон на серебряной краской. Аккуратно поверните полосу вокруг на заднюю, повторно смонтировать, выровнять и etch следующие шаги, описанные выше.

4. Проверка окончательного Etch и изображений

  1. После того, как фрезерование завершено проверить единообразие различных разделов с помощью SEM изображений при более высоком увеличении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение под наклонным углом позволяет лучше оценить изменение глубины фрезерования. Особое внимание следует уть регионам перехода между мукомольной локациями.
  2. Изображение образцов снова после фрезерования с оптическим микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Периодические фрезерованные линии приводят к эффекту преломления, порождающим различные цвета в зависимости от угла изображения. Если цвет не является непрерывным вместе с зондом, что является четким указанием на нарушение в фрезерованных линий.

5. Монтаж функционального кремниевого зонда для офорта FIB

  1. Аккуратно удалите функциональный кремниевый электрод из упаковки. Используйте щипцдляние тщательно поднять пластиковую защитную вкладку, закрывающую главную сцену. Начните поднимать один угол вкладки вверх от липкого клея, удерживая его на месте, и продолжайте поднимать, пока весь электрод не будет удален.
  2. Тщательно зажимая электрод гемостатами, чтобы подготовиться к монтажу в стереотаксической раме. Удерживая покрытую вкладку щипками, аккуратно поместите изогнутые гемостаты вокруг зеленого вала над силиконовым хвостовиком, с изогнутой частью гемостатов, обращенных вверх к вкладке. гемостаты.
  3. Аккуратно снимите пластиковую защитную вкладку, закрывающую главную сцену. Удерживая электрод с гемосатами, тщательно закрепите электрод в стереотаксической раме для очистки.
  4. Заполните 3 блюда Петри с 95% этанола (10 мл на чашку Петри). Поместите чашку Петри под электрод, который крепится в стереотаксической раме для очистки. Медленно опустите электрод, повернув микроманипулятор вниз (100 мкм/с), чтобы хвостовик погружался в 95% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не превратить микроманипулятор слишком быстро или слишком глубоко, это может привести к электроду сломаться (т.е. электрод не должен касаться чашки Петри).
  5. Оставьте хвостовик электрода в 95% этанола в течение 5 минут, а затем медленно поднять электрод из 95% этанола, повернув микроманипулятор вверх (100 мкм /с). Повторите этот шаг еще два раза, в общей сложности три стирания. Дайте электроду высохнуть в течение пяти минут.
  6. Используйте ту же технику для установки электрода в стереотаксической раме, чтобы удалить электрод из стереотаксической рамы. Аккуратно поместите гемостаты вокруг вала электрода. После того, как гемостаты сжаты плотно, отпустите электрод из стереотаксической рамы, верните пластиковую защитную вкладку, закрывающую главную сцену, и положите очищенный электрод обратно в упаковку.

6. Офорт функциональный кремний зонд с использованием FIB

  1. Установите очищенный функциональный электрод кремния на алюминиевый стенд. Аккуратно подберите очищенный функциональный кремний электрод с помощью щипц и снимите защитную вкладку со сцены головы. Поместите хвостовик электрода на алюминиевую заглушку, чтобы он не висел над любым краем, затем с помощью небольшого куска Cu или углеродной проводящих ленты, приколоть хедстейш надежно алюминиевой заглушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, низкопрофильный держатель клипа может быть использован для удержания электрода вниз. Будьте осторожны, чтобы не коснуться электрода хвостовик.
  2. Следуя описанным выше шагам (раздел 2), поставьте электрод на эвцентрическую высоту и убедитесь, что электрод находится в точке совпадения лучей SEM и FIB. Выровнять хвостовик с "X" направление сцены.
  3. Установите FIB на оптимальный ток для фрезерования требуемой наноархитектуры и убедитесь, что фокус и стигматизация должным образом исправлены. Подготовьте массив линий с желаемым интервалом и длиной, чтобы покрыть поле зрения хвостовика (500 мкм секций). Отрегулируйте длину линии по мере того как травление получает вниз хвостовик к более тонким разделам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При траве функционального электрода, это не возможно добавить фидуциальные знаки для автоматизации процесса. Таким образом, перемещение между подразделами (500 мкм) осуществляется вручную.
  4. После того, как фрезерование первой секции завершено, убедитесь, что проверить качество фрезерования, прежде чем перейти к следующему разделу. Повторите шаг 6.3, чтобы вытравить следующую секцию хвостовика. Выровнять измельченные линии из предыдущего раздела с шаблонами, используемыми для следующего раздела, чтобы предотвратить большие зазоры между пробегами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FIB выгравированная наноархитектура на поверхностях однострочных интракортикальных зондов
Используя описанные здесь методы, интракортикальные зонды были выгравированы с конкретными нано-архитектурами после установленных протоколов39. Размеры и форма нано-архитектуры дизайн, описанный в этих методах были реализованы из предыдущих результатов in vitro, изображающих снижение активности глиальных клеток, когда культивируется с нано-архитектуры дизайн описан здесь37,38. Методы, описанные здесь, использовали сфокусированный ионный луч галлия (FIB) для вытравливать наноразмерные параллельные канавки на поверхность нефункциональных однонаправленных кремниевых микроэлектродных зондов, как ранее описано39. Наномасштабные параллельные канавки были выгравированы вдоль хвостовика задней стороны зонда с помощью автоматизированного скрипта, написанного в программном обеспечении. Окончательные размеры травленной наноархитектуры были 200 нм шириной параллельных линий, расположенных 300 нм друг от друга, и имел глубину 200 нм(рисунок 1). Использование FIB для вытравливания наноархитектур в поверхность устройства позволяет отравить точные конструкции в изготовленные устройства.

Вытравленная нано-архитектура в интракортикальные зонды Влияние на нейровоспаление
В этом ранее сообщалось данных, интракортикальные зонды с травлень нано-архитектуры были имплантированы в коре крыс в течение двух или четырех недель (n'4 в точке времени) и по сравнению с контрольными животными имплантированных с гладкими зондами, не содержащими нано-архитектуры офортов (n'4 в точке времени)39. Одним из механизмов отказа, препятствующего клиническому внедрению интракортикальных микроэлектродов, является нейровоспалительный ответ, вызванный нарушением гефенхимы мозга и гематоэнцефалического барьера9,10,11,15. Полное описание нейровоспалительных ответ наблюдается после интракортической имплантации микроэлектродов можно найти в следующих обзорах13,14,22. Способность интракортикальных микроэлектродов фиксировать потенциалдействия нейронов зависит от расстояния здоровых нейрональных тел от интракортикального микроэлектрода40. Таким образом, ранее сообщалось исследование оценили нейровоспаление вокруг интракортикального зонда имплантации сайте путем количественной гистологические маркеры для нейронной плотности, глиальной активации клеток и экспрессии генов провоспалительных маркеров39. Основные моменты из этого исследования представлены ниже, чтобы представить эффекты травления нано-архитектуры в поверхности зонда было на нейровоспаление.

Эффекты вытравленных нано-архитектуры на плотность нейронов
Чтобы определить, как травление нано-архитектур ы в поверхности зонда влияет на плотность нейронов непосредственно вокруг имплантата, нейрональные ядра были окрашены и количественно использования ранее описывающих иммуногистохимии методы39,41. Существовали никаких значительных различий плотности нейронов вокруг нано-архитектуры и контроля зондов на 2 недели после имплантации(Рисунок 2A). Тем не менее, было значительно больше нейронов вокруг нано-архитектуры зондов на расстоянии 100-150 мкм от места имплантата по сравнению с гладкой имплантатов управления (р/л; 0,05 против элементов управления) (Рисунок 2B) на 4 недели после имплантации. Было также установлено, что существует повышенная тенденция плотности нейронов, окружающих нано-архитектурных зондов с течением времени, контрастируя снижение тенденции плотности нейронов вокруг контрольных имплантатов(рисунок 2). Существует прямая связь, изображающая смягчить нейровоспалительных ответ в сочетании с более высокой плотностью жизнеспособных нейронов, окружающих микроэлектрод, приводит к повышению способности для микроэлектрода, чтобы обеспечить качество записей15,40,42. Поэтому при интерпретации данных о плотности нейронов более высокая плотность нейронов вокруг места имплантации может свидетельствовать о снижение нейровоспалительных реакции и потенциальном улучшении качества и стабильности записи внутрикортикальных микроэлектродов.

Эффекты наноархитектуры etched на нейровоспалительные молекулярные маркеры
Гистология достаточна для идентификации клеток вокруг места имплантации; однако, ему не хватает чувствительности и специфичности для характеристики фенотипа окружающих клеток. Таким образом, методы, используя количественный анализ экспрессии генов были использованы для количественной оценки относительной экспрессии генов нейровоспалительных маркеров, для того, чтобы понять влияние нано-архитектуры оказывает на фенотип клеток39. Несколько нейровоспалительных маркеров были исследованы в ранее сообщалось исследование. Здесь только два будут выделены, которые являются специфическими для микроглии клеток, для того, чтобы обсудить, как их фенотип, возможно, были изменены. Кластер дифференциации 14 (CD14) является рецептором распознавания образов на мембране микроглии, который распознает бактерии и сигнализирует воспалительный путь после травмы / имплантации43,44,45. Синтаза оксида азота (NOS2), является окислительным маркером стресса, выраженным в микроглии/макрофагах, который связан с увеличением производства провоспалительных маркеров46,47.

В ранее сообщенных данных не было существенных различий относительной экспрессии генов CD14 между наноархитектурой и контрольными имплантатами при двух- или четырехнеделях после имплантации. Примечательно, что произошло значительное снижение (p qlt; 0.05) относительной экспрессии генов CD14 от двух до четырех недель вокруг сайта нано-архитектурных имплантатов, что указывает на возможное уменьшение воспаления (обозначается на рисунке 3А). Аналогичным образом, не было существенных различий в экспрессии относительного гена NOS2 между наноархитектурой и контрольными имплантатами в течение двух недель. Тем не менее, было значительно меньше (p qlt; 0.05) NOS2 относительное выражение гена вокруг нано-архитектурного имплантата по сравнению с контрольным имплантатом в течение четырех недель после имплантации (обозначено на рисунке 3B). Кроме того, было значительное увеличение от 2 до 4 недель NOS2 относительной экспрессии генов вокруг контрольных имплантатов (обозначается на рисунке 3B), и никаких различий наблюдается вокруг нано-архитектуры имплантатов с течением времени, что свидетельствует о потенциальном снижении воспаления вокруг нано-архитектуры имплантатов. При интерпретации этих данных важно понимать функцию количественного анализа гена. Например, уменьшение провоспалительных генов указывает на вероятное снижение воспалительной реакции вокруг участка электрода, в то время как увеличение этих типов генов предполагает вероятное увеличение воспаления.

FIB выгравированная наноархитектура на поверхностях функциональных одноместных микроэлектродов хвостовика
Ранее сообщалось исследование были многообещающие результаты, демонстрирующие небольшое увеличение плотности нейронов и потенциальное снижение микроглии воспалительный фенотип вокруг нано-архитектуры зонд имплантата сайта. Чтобы исследовать перевод этих результатов на функциональность электрода, функциональный микроэлектрод кремния хвостовика был выгравирован с тем же дизайном нано-архитектуры, что и нефункциональные одноцветные кремниевые микроэлектродные зонды, используя аналогичный протокол офорта FIB. Единственное отличие в методологии травления указанной наноархитектуры заключалось в том, что протокол для функциональных электродов не мог быть автоматизирован, поскольку не было дополнительного субстрата для создания фидуциальной маркировки. Таким образом, функциональный электрод был вручную выгравирован с помощью FIB путем перевыравнивания пучка каждые 500 мкм, как описано в протоколе выше. Окончательные офорты были 200 нм шириной параллельных линий, расположенных 300 нм друг от друга, и имел глубину 200 нм(рисунок 4).

Эффекты наноархитектуры в интракортикальные микроэлектроды на электрофизиологию
Успешные внутрикортикальные записи микроэлектродов зависят от близости нейронов вокруг имплантата, целостности устройства и надежной передачи активности одного блока от мозга8,40,48,49. Электрофизиологические записи были количественно с использованием записанных метрик, собранных два раза в неделю в течение восьми недель. Метрики, использованные в данном исследовании, были, процент каналов записи отдельных единиц, максимальные амплитуды записанных единиц, и соотношение сигнала к шуму (SNR). Институциональные комитеты по уходу за животными и использованию (IACUC) в медицинском центре по делам ветеранов Луи Стокса Кливленда одобрили все процедуры для животных. Крысы Sprague Dawley (8-10 недель и весом 225 г) были имплантированы с однохвостым кремниевым микроэлектродом, с вышеупомянутой наноархитектурой (n'1) или плавным управлением (n'6). Статистический анализ на этих данных не проводился, так как был имплантирован один микроэлектрод наноархитектуры для экспериментального исследования, удостоверяем концепции. Тем не менее, коллективные электрофизиологические результаты, показывающие повышенный процент каналов записи отдельных единиц(Рисунок 5A), максимальные амплитуда(рисунок 5B) зарегистрированных единиц, и SNR(Рисунок 5C) от микроэлектродов наноархитектуры по сравнению с гладкими микроэлектродов управления, являются многообещающими. Эти результаты показывают, что вытравление наноархитектуры на поверхности микроэлектродов потенциально может привести к улучшению качества и увеличению долговечности электрофизиологических записей. Для проверки этих предварительных выводов необходима дальнейшая оценка с увеличением размера выборки.

Figure 1
Рисунок 1: FIB вытравленная наноархитектура на поверхностях однострочных интракортикальных зондов. SEM изображения нефункциональных одного хвостовика кремния зондов с FIB травления нано-архитектур вдоль задней хвостовик. (A) Композитные изображения всего зонда после травления показано на 120x увеличение, шкала бар 400 мкм. Фидуциальные знаки ,квадратная коробка с символом, проходящим через него), выгравированы вдоль кремниевого субстрата, окружающего зонд. Увеличенные SEM изображения наконечника зонда показаны в (B) на 1,056x увеличение (шкала бар 40 мкм), (C) на 3500x увеличение (шкала бар 10 мкм), и (D) на 10000x увеличение, шкала бар 4 мкм. Эта цифра была изменена со ссылки39. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние вытравленной наноархитектуры на плотность нейронов. Выживаемость нейронов представлена в процентах от фоновой области от тех же животных на расстоянии 50 мкм бункеров от места имплантата. (A) Никаких значительных различий в выживаемости нейронов не наблюдалось между гладкими поверхностями (контроль) и нанопаттернированными имплантатами в течение 2 недель после имплантации. (B) Существовал значительно выше, нейронной выживания вокруг нанопаттернированных имплантатов на расстоянии 100-150 мкм по сравнению с гладкими поверхностями (p qlt; 0.05) на 4 недели после имплантации. Представитель изображения нейронов (окрашенные зеленый), с желтым контуром, изображающим место имплантации, и "P", обозначающий травленную сторону микроэлектрода, шкала бар 100 мкм. Эта цифра была изменена с39. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Эффекты наноархитектуры etched на нейровоспалительных молекулярных маркеров. Ткань была собрана около 500 мкм радиуса места имплантации для нанопаттернов и контрольных имплантатов. Относительная экспрессия генов воспалительных маркеров была количественно сравнена между обоими типами имплантатов (различия обозначаются на графике; р-л; 0,05), а также с течением времени (различия обозначаются на графике; p qlt; 0.05). (A) Относительная экспрессия гена CD14 значительно уменьшилась вокруг нанопаттернированных имплантатов от двух до четырех недель. (B) Существовал значительно меньшее относительное выражение гена NOS2 вокруг наношаблона имплантата по сравнению с контролем в течение четырех недель (я) и было значительное увеличение NOS2 от двух до четырех недель вокруг гладкой имплантатов управления (я). Эта цифра была изменена со ссылки39. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: FIB Вытравленная наноархитектура на поверхностях функциональных одноместных микроэлектродов хвостовика. Ввод в правом верхнем углу отображает микроэлектрод, используемый в этом исследовании рядом с копейки, чтобы изобразить размер хвостовика электрода (тонкая черная линия). SEM изображения микроэлектродов хвостовик с FIB травления нано-архитектуры вдоль задней части хвостовика. Весь хвостовик показан в верхней части при 600x увеличение (шкала бар 50 мкм), в то время как всет изображает нанопаттернированной поверхности на 25000x увеличение, шкала бар 1 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Эффекты наноархитектуры в интракортикальные микроэлектроды на электрофизиологии. Оценка электрофизиологических метрик обнаружила многообещающую предварительную повышенную тенденцию (A) процент каналов записи отдельных единиц, (B) максимальные амплитуда зарегистрированных единиц, и (C) соотношение сигнала к шуму от микроэлектрода выгравированы с нано-архитектур по сравнению с гладкой электродов управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Электрофизиология Запись из имплантированных функциональных однохвостых микроэлектродов с FIB Вытравленные нано-архитектуры. Одной из проблем использования FIB для вытравливания наноархитектур на изготовленных микроэлектродных устройствах является риск короткого замыкания записи контактов. X-ось изображает время записи в секундах, а y-оси показывает электродные каналы записи нейрональных потенциалов действия. Каждая пронумерованные линии на y-оси представляет собой другой канал электрода, с каналом номер 1 является самым мелким и 16 является самым глубоким. Красные ящики очерчивают короткозамые каналы, в то время как синие коробки начертают каналы с видимой нейронной активностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В описанном здесь протоколе изготовления используется сфокусированная литография ионного луча для эффективного и воспроизводимого наноархитектуры на поверхности нефункциональных и функциональных микроэлектродов кремния хвостовика. Сфокусированная ионная лучевая (FIB) литография позволяет селективной абляции поверхности субстрата с помощью мелко сфокусированного ионного луча50,51. FIB является прямой записи техники, которые могут производить различные функции с разрешением наноразмерного и высокого соотношения сторон50,52,53. Для того, чтобы создать различные размеры функций, величина тока ионного луча может быть оптимизирована, чтобы изменить размер пятна ионного луча в пределах 3 нм до 2 мкм50,51. Некоторые общие преимущества использования FIB для вытравливание особенностей на поверхностях: 1) он может быть использован на широкий спектр материалов, в том числе кремния, металлов и полимеров53,54,55,56, 2) FIB может быть выполнена на непланарных поверхностей, и 3) FIB может быть использован для пост-обработки на отдельных устройствах57.

Здесь FIB использовался в сочетании с микроскопом SEM и программным обеспечением, используемым для написания специализированного автоматизированного скрипта для офорта специфических функций в нефункциональные однохвостые зонды. Сценарий включал параметры, необходимые (2,5 н.а. ионного луча тока и 30 кВ напряжение), чтобы вытравить точный интервал желаемого (200 нм шириной параллельных канавок, расположенных 300 нм друг от друга и 20 нм глубиной). Размеры электрода превышали поле зрения для FIB, поэтому узор был выполнен в нескольких сценических положениях. Для того, чтобы автоматизировать процесс, фидуциальные знаки были выгравированы в сторону кремниевого листа проведения зондов на месте, чтобы позволить программному обеспечению точно найти узорчатые линии на хвостовике зонда. Фидуциалы были необходимы, потому что сценическое движение создало большую (5 мкм) неопределенность в расположении области шаблона по отношению к ионному пумку зрения. Размещение фидуциалийцев на кремниевом листе позволило FIB найти области шаблона без непосредственного сканирования пучка на хвостовике зонда, который потенциально может загрязнить или повредить хвостовик зонда. Весь автоматизированный процесс травления для одного хвостовика занял около 12 ч, чтобы завершить и не требует вмешательства оператора после начала узора. В совокупности, преимущества использования FIB, чтобы вытравить функции в хвостовик кремния зонда были возможность сделать нанометровые размерные функции, автоматизировать процесс травления, и способность etch на изготовленном зонде. Хотя FIB имеет обильные преимущества, одним из недостатков использования этого метода изготовления является медленная скорость пропускной связи, что в конечном итоге ограничивает потенциал для массового производства устройств с нано-архитектурв в их поверхности58. Кроме того, другие методы изготовления, используемые для создания размеров объектов и геометрии интереса, возможно, более быстрыми темпами и при массовых производствах, включают в себя электронную лучевую литографию и литографию наноимпринта59,60,61,62,63,64,65. Однако эти методы не позволяют отравить наноархитектурные объекты в изготовленных устройствах. Традиционно эти методы используются в процессе изготовления на листе кремния или полимера, который затем может быть использован в вниз по течению этапов обработки для изготовления окончательного обмануть.

Функциональные электроды были неспособны пройти автоматизированный процесс из-за не иметь любой окружающий материал вокруг хвостовика электрода в который включить фидуциальные метки в бег. Таким образом, функциональные электроды были вручную выровнены и выгравированы на 500 мкм разделов вдоль хвостовика, используя тот же ионный ток и напряжение, как автоматизированный запуск, чтобы обеспечить те же размеры функции. Луч должен был быть вручную перестроен после завершения каждого интервала 500 мкм и настроить, чтобы вытравить следующий раздел. Процесс ручной перестройки шаблонов каждые 500 мкм потенциально может привести к повреждению наноструктур или структур, которые не соответствуют намеченной геометрии. Это связано с более длительным разом экспозиции ионного луча для ручного выравнивания66. Это была одна из трудностей, с которыми сталкивалась ручная травления. Из-за этого осложнения, два записи контактов были короткого замыкания и не смогли записать нейронных потенциалов действия(Рисунок 6). На рисунке 6 показан электрофизиологический сегмент живой записи от животного, имплантированного наноархитектурным электродом. Синие ящики наметить каналы записи сильных потенциалов действия, по сравнению с красными ящиками, обозначающими два мертвых каналов. Таким образом, одна из проблем использования ручного офорта FIB на электродах пост-производства заключается в том, что существует вероятность того, что луч может коротко замыкаться и предотвратить их запись. Эта задача усиливается при попытке вытравить переднюю сторону одного хвостовика кремния электродов, в которых записи контактов и следов вдоль всего хвостовика электрода. Хотя это возможно, чтобы etch кремния вокруг записи контактов и следов, дополнительная осторожность рекомендуется, чтобы избежать повреждения и снижение производительности записи возможностей электрода.

Как упоминалось ранее, FIB может быть использован на различных материалах, чтобы вытравить многочисленные геометрии объектов в поверхности. Однако важно отметить, что параметры геометрии вытравливается, такие как линии в различные материалы, сложно предсказать. Особенно для линейных узоров ширина и глубина линии сильно зависят от многих параметров, таких как ускорение напряжения, лучток, время пребывания, расстояние пикселей, срок службы диафрагмы и тип материала. Другим параметром, который является результатом оптимизации, является общее время для смея каждой линии. Узкие и более глубокие линии могут быть достигнуты с помощью меньших балочных токов; однако, время картины для всего хвостовика зонда расширило бы до множественных дней, которые не практически. Таким образом, хотя оптимизация протокола, представленного здесь, представляется возможным, описать параметры неизвестных материалов будет чрезвычайно сложно. При устранении неполадок параметров кремниевых зондов, описанных в этом протоколе, были сделаны многочисленные испытательные сокращения кремния для оценки того, как изменяющиеся условия повлияли на ширину и глубину линии. Как только оцененные условия смогли вытравить определенный размер объекта и геометрию интереса (200 нм шириной линий, которые были 200 нм глубиной), эти параметры были использованы для написания программного сценария. Скрипт использовался для управления расстоянием между каждой строкой от центра к центру, что в этом протоколе составляет 300 нм. Будущие исследования, используя кремниевые субстраты/устройства, требующие размеров объектов в сотнях нанометров, могут использовать параметры, описанные в этом протоколе, в качестве отправной точки для устранения неполадок в условиях, необходимых для создания желаемых размеров объектов. Для металлических и полимерных субстратов/устройств потребуется дальнейшая оптимизация и устранение неполадок в условиях травления. В целом, использование FIB для травления наноархитектур в материальные поверхности позволяет достаточно контролировать и гибкость в геометрии объектов, использовании многочисленных совместимых материалов и нескольких типов поверхности, включая изготовленные устройства. Представленные в настоящем докладе репрезентативные результаты продемонстрировали потенциальные преимущества, наблюдаемые в наших исследованиях использования FIB для вытравливания наноархитектурна на поверхности интракортикальных микроэлектродов: 1) увеличение плотности нейронов и 2) снижение нейровоспалительных маркеров вокруг имплантированных устройств с наноархитектурами, а также 3) предварительные выводы, изображающие улучшение качества электрофизиологических записей с течением времени. Аналогичным образом, занятость и оптимизация описанного протокола травления нано-архитектуры особенности на поверхности материала могут быть использованы для улучшения функциональности многочисленных медицинских устройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Департаментом США по делам ветеранов реабилитации исследований и развития Службы наград: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) и #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). Содержание не отражает мнения Министерства США по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов. Авторы хотели бы поблагодарить FEI Co. (теперь часть Thermofisher Scientific) за помощь персонала и использование приборов, которые помогли в разработке сценариев, используемых в этом исследовании.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-Channel ZIF-Clip Headstage Tucker Davis Technologies ZC16 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrapped Thomas Scientific 1213F04 Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder Tucker Davis Technologies Z-ROD32 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml Ted Pella 16023 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter Hemostat Fine Science Tools 13013-14 Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double Coated Ted Pella 16084-7 The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well Sigma Aldrich CLS3736-100EA Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11251-30 Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs Fisher Scientific 22-032-600 Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm Ted Pella 16148 Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll Fisher Scientific 01-213-101 Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes Fisher Scientific 02-617-149 Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrode NeuroNexus A1x16-3mm-100-177 http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holder KOPF Model 1772 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument KOPF Model 900-U Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly KOPF Model 960 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') Ted Pella 807-5 https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V Ted Pella 520-1-220 Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver Paint Ted Pella 16062 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab Thermo Fisher Scientific Helios G2 650 This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salcman, M., Bak, M. J. A new chronic recording intracortical microelectrode. Medical and Biological Engineering. 14 (1), 42-50 (1976).
  2. Im, C., Seo, J. -M. A review of electrodes for the electrical brain signal recording. Biomedical Engineering Letters. 6 (3), 104-112 (2016).
  3. Donoghue, J. Bridging the Brain to the World: A Perspective on Neural Interface Systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
  4. Gilja, V., et al. Clinical translation of a high-performance neural prosthesis. Nature medicine. 21 (10), 1142-1145 (2015).
  5. Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17849-17854 (2004).
  6. Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping in a person with tetraplegia through brain-controlled muscle stimulation: a proof-of-concept demonstration. Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
  7. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  8. Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
  9. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
  10. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
  11. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
  12. Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neurosciences. 6 (1), 48-67 (2015).
  13. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
  14. Michelson, N. J., et al. Multi-scale, multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
  15. Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
  16. Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
  17. Ravikumar, M., et al. The Roles of Blood-derived Macrophages and Resident Microglia in the Neuroinflammatory Response to Implanted Intracortical Microelectrodes. Biomaterials. 0142 (35), 8049-8064 (2014).
  18. Hermann, J., Capadona, J. Understanding the Role of Innate Immunity in the Response to Intracortical Microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
  19. Ereifej, E. S., et al. Implantation of Intracortical Microelectrodes Elicits Oxidative Stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00009 (2018).
  20. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  21. Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
  22. Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862 (2017).
  23. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  24. Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
  25. Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 7 (3), 315-326 (1999).
  26. Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
  27. Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11 (5), 056014 (2014).
  28. Wei, X., et al. Nanofabricated Ultraflexible Electrode Arrays for High-Density Intracortical Recording. Advanced Science. , 1700625 (2018).
  29. Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
  30. Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
  31. Kim, Y., et al. Nano-Architectural Approaches for Improved Intracortical Interface Technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
  32. Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chemical Neurosciences. 1 (1), 36-48 (2010).
  33. Ding, H., Millet, L. J., Gillette, M. U., Popescu, G. Actin-driven cell dynamics probed by Fourier transform light scattering. Biomedical Optical Express. 1 (1), 260-267 (2010).
  34. Kotov, N. A., et al. Nanomaterials for Neural Interfaces. Advanced Materials. 21 (40), 3970-4004 (2009).
  35. Curtis, A. S., et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Trans Nanobioscience. 3 (1), 61-65 (2004).
  36. Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5 (1), 13406 (2011).
  37. Ereifej, E. S., et al. Nanopatterning effects on astrocyte reactivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (6), 1743-1757 (2013).
  38. Ereifej, E. S., Cheng, M. M. -C., Mao, G., VandeVord, P. J. Examining the inflammatory response to nanopatterned polydimethylsiloxane using organotypic brain slice methods. Journal of Neuroscience Methods. 217 (1-2), 17-25 (2013).
  39. Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
  40. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  41. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
  42. Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
  43. Sladek, Z., Rysanek, D. Expression of macrophage CD14 receptor in the course of experimental inflammatory responses induced by lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. Veterinarni Medicina. 53 (7), 347-357 (2008).
  44. Janova, H., et al. CD14 is a key organizer of microglial responses to CNS infection and injury. Glia. , (2015).
  45. Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Ulevitch, R. J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today. 14 (3), 121-125 (1993).
  46. Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell Science. 117 (14), 2865-2867 (2004).
  47. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences. 75 (6), 639-653 (2004).
  48. Kozai, T. D., et al. Comprehensive chronic laminar single-unit, multi-unit, and local field potential recording performance with planar single shank electrode arrays. Journal of Neurosciences Methods. 242, 15-40 (2015).
  49. Kozai, T. D., et al. Mechanical failure modes of chronically implanted planar silicon-based neural probes for laminar recording. Biomaterials. 37, 25-39 (2015).
  50. Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. FIB-nanostructured surfaces and investigation of bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Transactions on Nanobioscience. 7 (1), 1-10 (2008).
  51. Lehrer, C., Frey, L., Petersen, S., Ryssel, H. Limitations of focused ion beam nanomachining. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures Processing, Measurement, and Phenomena. 19 (6), 2533-2538 (2001).
  52. Watkins, R., Rockett, P., Thoms, S., Clampitt, R., Syms, R. Focused ion beam milling. Vacuum. 36 (11-12), 961-967 (1986).
  53. Veerman, J., Otter, A., Kuipers, L., Van Hulst, N. High definition aperture probes for near-field optical microscopy fabricated by focused ion beam milling. Applied Physics Letters. 72 (24), 3115-3117 (1998).
  54. Lanyon, Y. H., Arrigan, D. W. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. Sensors and Actuators B: Chemical. 121 (1), 341-347 (2007).
  55. Menard, L. D., Ramsey, J. M. Fabrication of sub-5 nm nanochannels in insulating substrates using focused ion beam milling. Nano Letters. 11 (2), 512-517 (2010).
  56. Ziberi, B., Cornejo, M., Frost, F., Rauschenbach, B. Highly ordered nanopatterns on Ge and Si surfaces by ion beam sputtering. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (22), 224003 (2009).
  57. Reyntjens, S., Puers, R. A review of focused ion beam applications in microsystem technology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 11 (4), 287 (2001).
  58. Heyderman, L., David, C., Kläui, M., Vaz, C., Bland, J. Nanoscale ferromagnetic rings fabricated by electron-beam lithography. Journal of Applied Physics. 93 (12), 10011-10013 (2003).
  59. Baquedano, E., Martinez, R. V., Llorens, J. M., Postigo, P. A. Fabrication of Silicon Nanobelts and Nanopillars by Soft Lithography for Hydrophobic and Hydrophilic Photonic Surfaces. Nanomaterials. 7 (5), 109 (2017).
  60. Eom, H., et al. Nanotextured polymer substrate for flexible and mechanically robust metal electrodes by nanoimprint lithography. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (45), 25171-25179 (2015).
  61. Li, K., Morton, K., Veres, T., Cui, B. 5.11 Nanoimprint Lithography and Its Application in Tissue Engineering and Biosensing. Comprehensive Biotechnology. , 125-139 (2011).
  62. Dong, B., Zhong, D., Chi, L., Fuchs, H. Patterning of conducting polymers based on a random copolymer strategy: Toward the facile fabrication of nanosensors exclusively based on polymers. Advanced Materials. 17 (22), 2736-2741 (2005).
  63. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Wilkinson, C. D. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (4), 973-979 (2008).
  64. Tseng, A. A., Chen, K., Chen, C. D., Ma, K. J. Electron beam lithography in nanoscale fabrication: recent development. IEEE Transactions on Electronics Packaging Manufacturing. 26 (2), 141-149 (2003).
  65. Yang, Y., Leong, K. W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 478-495 (2010).
  66. Vermeij, T., Plancher, E., Tasan, C. Preventing damage and redeposition during focused ion beam milling: The "umbrella" method. Ultramicroscopy. 186, 35-41 (2018).

Tags

Биоинженерия выпуск 155 сфокусированная ионная лучевая литография интракортикальные микроэлектроды наноархитектура электрофизиология нейровоспаление биосовместимость
Сосредоточенная литография Ионного Луча для наноархитектур etch в микроэлектроды
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahajan, S., Sharkins, J. A.,… More

Mahajan, S., Sharkins, J. A., Hunter, A. H., Avishai, A., Ereifej, E. S. Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes. J. Vis. Exp. (155), e60004, doi:10.3791/60004 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter