Summary
Wir haben gezeigt, dass die Radierung der Nanoarchitektur in intracortische Mikroelektrodengeräte die Entzündungsreaktion reduzieren kann und das Potenzial hat, elektrophysiologische Aufnahmen zu verbessern. Die hier beschriebenen Methoden skizzieren einen Ansatz, Nano-Architekturen in die Oberfläche nicht-funktioneller und funktioneller Einschaftssilizium-Intracortical-Mikroelektroden zu ätzen.
Abstract
Mit Fortschritten in der Elektronik und Fertigungstechnologie wurden intracortische Mikroelektroden erheblich verbessert, was die Herstellung anspruchsvoller Mikroelektroden mit größerer Auflösung und erweiterten Fähigkeiten ermöglicht. Der Fortschritt in der Fertigungstechnologie hat die Entwicklung von biomimetischen Elektroden unterstützt, die darauf abzielen, sich nahtlos in das Hirnparenchym zu integrieren, die neuroinflammatorische Reaktion nach dem Einsetzen der Elektroden zu reduzieren und die Qualität und Langlebigkeit elektrophysiologischer Aufnahmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um einen biomimetischen Ansatz zu verwenden, der vor kurzem als Nano-Architektur klassifiziert wurde. Die Verwendung der fokussierten Ionenstrahllithographie (FIB) wurde in diesem Protokoll verwendet, um spezifische Nano-Architektur-Features in die Oberfläche nicht-funktionaler und funktioneller intracortischer Einzelschaft-Mikroelektroden zu ätzen. Das Ätzen von Nano-Architekturen in die Elektrodenoberfläche zeigte mögliche Verbesserungen der Biokompatibilität und Funktionalität des implantierten Geräts an. Einer der Vorteile der Verwendung von FIB ist die Fähigkeit, auf hergestellten Geräten zu ätzen, im Gegensatz zu während der Herstellung des Geräts, die unbegrenzte Möglichkeiten, zahlreiche medizinische Geräte nach der Herstellung zu modifizieren. Das hier vorgestellte Protokoll kann für verschiedene Materialtypen, Nanoarchitektur-Features und Gerätetypen optimiert werden. Die Erweiterung der Oberfläche implantierter medizinischer Geräte kann die Geräteleistung und Die Integration in das Gewebe verbessern.
Introduction
Intracortische Mikroelektroden (IME) sind invasive Elektroden, die eine Möglichkeit der direkten Verbindung zwischen externen Geräten und den neuronalen Populationen innerhalb der Großhirnrinde1,2bieten. Diese Technologie ist ein unschätzbares Werkzeug zur Aufzeichnung neuronaler Wirkungspotenziale, um die Fähigkeit der Wissenschaftler zu verbessern, die neuronale Funktion zu erforschen, das Verständnis neurologischer Erkrankungen zu fördern und potenzielle Therapien zu entwickeln. Die intracortische Mikroelektrode, die als Teil von Brain Machine Interface (BMI)-Systemen verwendet wird, ermöglicht die Aufzeichnung von Aktionspotentialen von einzelnen oder kleinen Gruppen von Neuronen, um motorische Absichten zu erkennen, die verwendet werden können, um funktionale Ausgänge zu erzeugen3. Tatsächlich wurden BMI-Systeme erfolgreich für prothetische und therapeutische Zwecke eingesetzt, wie z. B. die erworbene sensorimotorische Rhythmussteuerung, um einen Computercursor bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose (ALS)4 und Rückenmarksverletzungen5 zu bedienen und die Bewegung bei Menschen mit chronischer Tetraplegiewiederherzustellen 6.
Leider können IMEs im Laufe der Zeit aufgrund mehrerer Fehlermodi, die mechanische, biologische und materielleFaktoren7,8, enthalten, oft nicht konstant aufzeichnen. Die neuroentzündliche Reaktion, die nach der Elektrodenimplantation auftritt, wird als eine erhebliche Herausforderung angesehen, die zum Elektrodenversagen beiträgt9,10,11,12,13,14. Die neuroentzündliche Reaktion wird während der ersten Insertion des IME initiiert, das die Blut-Hirn-Schranke durchbricht, das lokale Hirnparenchym schädigt und gliale und neuronale Netzwerke15,16stört. Diese akute Reaktion ist durch die Aktivierung von Gliazellen (Mikroglia/Makrophagen und Astrozyten) gekennzeichnet, die pro-inflammatorische und neurotoxische Moleküle um die Implantatstelle17,18,19,20freisetzen. Die chronische Aktivierung von Gliazellen führt zu einer Fremdkörperreaktion, die durch die Bildung einer Glianarbe gekennzeichnet ist, die die Elektrode aus gesundem Hirngewebe isoliert7,9,12,13,17,21,22. Letztlich, Behinderung der Fähigkeit der Elektrode, neuronale Wirkungspotentiale aufzuzeichnen, aufgrund der physikalischen Barriere zwischen der Elektrode und den Neuronen und der Degeneration und des Todes von Neuronen23,24,25.
Das frühe Versagen intracortischer Mikroelektroden hat zu beträchtlicher Forschung in der Entwicklung von Elektroden der nächsten Generation geführt, mit Schwerpunkt auf biomimetischen Strategien26,27,28,29,30. Von besonderem Interesse für das hier beschriebene Protokoll ist die Verwendung der Nanoarchitektur als eine Klasse biomimetischer Oberflächenveränderungen für IMEs31. Es wurde festgestellt, dass Oberflächen, die die Architektur der natürlichen in vivo Umgebung imitieren, eine verbesserte biokompatible Reaktion haben32,33,34,35,36. Daher ist die Hypothese, die dieses Protokoll überzeugt, dass die Diskontinuität zwischen der rauen Architektur des Hirngewebes und der glatten Architektur der intracortischen Mikroelektroden zur neuroinflammatorischen und chronischen Fremdkörperreaktion auf implantierte IMEs beitragen kann (für eine vollständige Überprüfung beziehen Sie sich auf Kim et al.31). Wir haben bereits gezeigt, dass die Nutzung von Nano-Architektur-Features ähnlich der extrazellulären Matrix-Architektur des Gehirns astrozytäre Entzündungsmarker von Zellen reduziert, die auf nano-architekturierten Substraten kultiviert werden, im Vergleich zu flachen Kontrollflächen sowohl in vitro als auch ex vivo-Modellen der Neuroentzündung37,38. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Anwendung fokussierter Ionenstrahl-Lithographie (FIB) auf Etch-Nano-Architekturen direkt auf Siliziumsonden führte, was zu einer signifikant erhöhten neuronalen Lebensfähigkeit und einer geringeren Expression von entzündungshemmenden Genen von Tieren führte, die mit den Nano-Architektur-Sonden implantiert wurden, im Vergleich zur glatten Kontrollgruppe26. Daher ist der Zweck des hier vorgestellten Protokolls, die Verwendung der FIB-Lithographie zu beschreiben, um Nano-Architekturen auf hergestellten intracortischen Mikroelektrodengeräten zu ätzen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um nano-Architektur-Große Features in Siliziumoberflächen intracortischer Mikroelektrodenschäfte zu ätzen, die sowohl automatisierte als auch manuelle Prozesse verwenden. Diese Methoden sind unkompliziert, reproduzierbar und können sicherlich für verschiedene Gerätematerialien und gewünschte Funktionsgrößen optimiert werden.
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Protocol
HINWEIS: Gehen Sie die folgenden Schritte vor, während Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung wie Labormantel und Handschuhe tragen.
1. Montage nicht-funktionaler Siliziumsonde für Fokussierte Ionenstrahl (FIB) Lithographie
HINWEIS: Das vollständige Verfahren zur Beschreibung der Herstellung des SOI-Wafers mit den 1.000 Sonden finden Sie unter Ereifej et al.39.
- Isolieren Sie einen Streifen von 2-3 Siliziumsonden aus dem Silizium auf Isolator (SOI) Wafer mit 1.000 Sonden. Erstellen Sie keine Streifen, die mehr als drei Siliziumsonden enthalten. Dies kann die Wahrscheinlichkeit einer lockeren Montage erhöhen und zu Fehlausrichtungen führen, die dazu führen, dass die FIB falsch ätzt.
HINWEIS: Streifen/Sonden, die nicht fest auf dem Aluminiumstummel sitzen, können zwei Komplikationen verursachen: 1) Wenn sich die Bühne bewegt, um auf dem nächsten Abschnitt zu arbeiten, wird es Vibrationen geben und das Fräsen wird nicht genau sein, bis sich die Sonde legt und 2) es kann eine hohe Variation verursachen und apriorisch aus der Fokusebene sein.- Verwenden Sie beim Tragen von Handschuhen feine Zangen, um Druck um die Sonden auszuüben, um einen kleinen Abschnitt mit zwei bis drei Sonden abzubrechen.
- Reinigen Sie die Siliziumsonde vor der FIB-Ätzung sorgfältig von Staub und Schmutz. Bereiten Sie eine 6 Brunnen-Polystyrolplatte vor, indem Sie 3 ml/Well von 95% Ethanol in drei Brunnen pfeifen.
- Nehmen Sie den geschnittenen Streifen von Siliziumsonden vorsichtig mit feiner Spitze oder Vakuumzange auf und legen Sie ihn in das Zellsieb. Legen Sie nur einen Streifen Siliziumsonden pro Sieb, um ein Brechen der Sonden zu verhindern. Legen Sie das Sieb mit den Silikonsondenstreifen zur Reinigung in den ersten Brunnen, der 95 % Ethanol enthält. Halten Sie das Sieb im ersten Brunnen für 5 min.
- Bewegen Sie das Sieb mit den Siliziumsonden vom ersten Brunnen und legen Sie es in den zweiten Brunnen, der 95% Ethanol enthält, für weitere 5 min. Wiederholen Sie dies noch einmal im dritten Brunnen.
- Das Sieb mit den gereinigten Siliziumsonden auf eine Polytetrafluorethylenplatte legen, um es an der Luft zu trocknen. Führen Sie diesen Schritt in einer sterilen Haube durch, um Eine Kontamination durch Staub zu vermeiden.
- Legen Sie den luftgetrockneten Streifen von Siliziumsonden in einen versiegelten Behälter für den Transport zum SEM-FIB. Wickeln Sie das Sieb mit den luftgetrockneten Proben mit einer Kunststoff- oder Aluminiumfolienfolie für den Transport und/oder die Lagerung, um die Reinigung aufrechtzuerhalten.
- Verwenden Sie fein gekippte oder Vakuumzangen, um den sauberen Streifen von Siliziumsonden vorsichtig aufzunehmen und auf einen sauberen Aluminiumstummel (verwendet für DIE SEM-FIB-Bildgebung/Ätzung) zu legen, um sich auf die Montage vorzubereiten.
- Verwenden Sie einen Zahnstocher (oder ein anderes fein gekipptes Instrument wie einen dünnen elektrischen Draht), um einen winzigen Tropfen (ca. 10 l) Silberfarbe am Rand des Siliziumsubstrats, das die Sonden umgibt, zu platzieren. Sichern Sie den Streifen nach unten, indem Sie die silberne Farbe um die Seiten des Siliziumsubstrats, das die Sonde umgibt, verteilen. Lassen Sie die silberne Farbe vollständig trocknen, bevor Sie den Aluminiumstummel in den SEM-FIB legen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, keine silberne Farbe auf den Schaft der Elektrode zu bekommen, denn das ist der Teil, der geätzt wird. Ist der Sondenstreifen nicht sicher am Aluminiumstummel verankert, kann sich der Streifen während der Verarbeitung bewegen oder eine andere Brennebene haben, was zu einem falschen Fräsen durch die FIB führt. Mehrere Streifen von Siliziumsonden können auf den gleichen Aluminium-Stummel montiert werden, um sicherzustellen, dass zwischen den Streifen genügend Platz vorhanden ist, um nach dem Ätzen eine Entfernung aus dem Stub zu ermöglichen. Dies ermöglicht eine effizientere Ätzung mehrerer Sonden mithilfe der unten beschriebenen automatisierten Funktion.
2. Ausrichtung der FIB an den Siliziumsonden
- Klicken Sie auf die Entlüftungstaste in der Balkensteuerungs-Registerkarte, um die Kammer zu entlüften. Drücken Sie Shift+F3, um die Heimbühne auszuführen. Bestätigen Sie die Auswahl, indem Sie im Popup-Fenster die Schaltfläche "Startphase" auswählen.
HINWEIS: Das Ausführen des Heimstadiumbetriebs ist ein vorbeugender Schritt, um sicherzustellen, dass die Bühnenachse von der Software korrekt gelesen wird und das Mikroskop in gutem Zustand ist. - Nachdem die Home-Phase abgeschlossen ist, verschieben Sie die Stufe auf die Koordinaten X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0°, R = 0°. Sobald die Kammer entlüftet ist, saubere Nitrilhandschuhe anziehen und die Kammertür öffnen.
HINWEIS: Je nach Anwendung des vorherigen Benutzers kann es erforderlich sein, den Bühnenadapter zu ändern. Die Standard-Bühnenadapter (z.B. FEI-Stil) können durch Abschrauben der Zentralschraube gegen den Uhrzeigersinn entfernt und im Uhrzeigersinn in die Drehplatte der Bühne eingeschraubt werden. - Stecken Sie den Aluminiumstummel, der die Sonden hält, in die Oberseite des Bühnenadapters. Sichern Sie den Aluminium-Stummel, indem Sie die eingestellte Schraube an der Seite des Bühnenadapters anziehen. Verwenden Sie für diese Aufgabe den 1,5 mm Sechskantschlüssel.
- Passen Sie die Höhe des Bühnenadapters an, indem Sie den Adapter im Uhrzeigersinn drehen, um ihn zu senken, oder gegen den Uhrzeigersinn, um ihn anzuheben. Befestigen Sie den Bühnenadapter an der Rotationsplatte, indem Sie die Verriegelungskegelmutter im Uhrzeigersinn drehen, bis die Mutter gegen die Bühnenrotationsplatte gesichert ist. Halten Sie den Bühnenadapter mit der anderen Hand, um die Drehung des Adapters und der Proben zu verhindern, während Sie die Verriegelungskegelmutter anziehen.
HINWEIS: Verwenden Sie das angegebene Höhenmessgerät, um die entsprechende Höhe zu bestimmen. Die Oberseite des Aluminiumstummels sollte die gleiche Höhe wie die maximale Linie auf dem Höhenmesser haben. Über das Anziehen der Kegelmutter kann die Bühne und der Adapter beschädigt werden. Verwenden Sie nur genügend Kraft, um die Proben zu sichern. - Erfassen Sie ein Navigationskamerabild. Schwenken Sie vorsichtig den Arm der Navigationskamera öffnen, bis er anhält. Die Mikroskopstufe bewegt sich automatisch an eine Position unter der Kamera. Sehen Sie sich das Live-Bild in Quadrant 3 der Mikroskop-Benutzeroberfläche (UI) an.
- Sobald sich die Helligkeitsstufe automatisch auf eine entsprechende Stufe anpasst, erfassen Sie das Bild, indem Sie die Taste auf der Kamerahalterung nach unten drücken. Warten Sie unbedingt, bis die gesamte Bildaufnahme abgeschlossen ist, die durch ein Pausensymbol in Quadrant 3 und das Ausschalten der Beleuchtung der Kamera angezeigt wird. Dies dauert ca. 10 s. Schwingen Sie den Kameraarm zurück in die geschlossene Position. Die Bühne kehrt zur ursprünglichen Position zurück.
- Schließen Sie die Mikroskopkammertür vorsichtig. Sehen Sie sich das CCD-Kamerabild in Quadrant 4 beim Schließen der Tür an. Stellen Sie sicher, dass die Proben und die Stufe einen sicheren Abstand zu jeder kritischen Komponente in der Mikroskopkammer haben.
- Wählen Sie den Abwärtspfeil neben der Pump-Taste in der Strahlsteuerung Tab. Wählen Sie Pumpe mit ProbeReinigung Taste in der UI-Software, um die Kammer-Vakuumpumpe zu starten und eingebautPlasmareiniger. Stellen Sie sicher, dass die Tür versiegelt ist, indem Sie sanft auf die Türfläche drücken, während die Pumpe läuft. Warten Sie ca. 8 min, bis die Pumpzeit und der Plasmareinigungszyklus für die Mikroskopkammer abgeschlossen sind.
HINWEIS: Eine Vakuumdichtung kann durch sanftes Ziehen an der Kammertür bestätigt werden, die geschlossen bleiben sollte, wenn sich das System unter Vakuum befindet. - Sobald das Symbol in der unteren rechten Ecke der Benutzeroberfläche grün wird, drücken Sie die Wake-Up-Taste in der Balkensteuerungsregisterkarte, die den Elektronen- und Ionenstrahl einschaltet. Wählen Sie Quadrant 1 und stellen Sie das Strahlsignal auf Elektronenstrahl (wenn nicht bereits eingestellt), stellen Quadrant 2 auf Ionenstrahl (wenn nicht bereits eingestellt).
- Sem-Spannung auf 5 kV einstellen, SEM-Strahlstrom auf 0,20 nA einstellen, SEM-Detektor auf ETD einstellen, Detektormodus auf Sekundäres Elektron einstellen. FiB-Spannung auf 30 kV einstellen, FIB-Strahlstrom auf 24 pA einstellen, FIB-Detektor auf ICE-Detektor einstellen, Detektormodus auf das Sekundärelektron einstellen.
- Doppelklicken Sie auf die Siliziumsonde im Navigationskamerabild, Quadrant 3, um die Bühne an die ungefähre Position der Sonde zu bewegen. Klicken Sie auf Quadrant 1, um ihn als aktiven Quadranten auszuwählen, und klicken Sie auf die Pause-Taste, um den SEM-Scan zu starten. Stellen Sie die Scanverweilzeit auf 300 ns ein, und deaktivieren Sie scan-Interlacing, Linienintegrationund Frame-Mittelung. Stellen Sie die Scanrotation in der Trägersteuerungs-Registerkarte auf 0 und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Balkenverschiebungs-2d-Regler und wählen Sie Nullaus.
- Passen Sie die Vergrößerung auf den Minimalwert an, indem Sie den Vergrößerungsknopf auf dem MUI-Panel gegen den Uhrzeigersinn drehen. Passen Sie die Bildhelligkeit und den Kontrast mithilfe der Knöpfe auf dem MUI-Panel oder dem Symbol auto Contrast Brightness Toolbar an.
- Bewegen Sie die Bühne, indem Sie entweder mit der linken Maustaste auf ein Feature klicken, um es zu zentrieren, oder indem Sie das Mausrad nach unten drücken und den Joystick-Mausmodus aktivieren. Bewegen Sie die gewünschte Siliziumsonde, die gemustert werden soll, in die Mitte des SEM-Bildes.
- Suchen Sie eine Kante oder andere Merkmale wie staubpartikel oder Kratzer. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 2.000x, indem Sie den Vergrößerungsknopf im Uhrzeigersinn drehen. Passen Sie den Fokus des SEM an, indem Sie die groben und feinen Fokusknöpfe auf dem MUI drehen, bis das Bild im Fokus steht. Sobald das Bild im Fokus ist, wählen Sie die Schaltfläche Beispiel Z mit Arbeitsabstand in der Symbolleiste verknüpfen aus.
- Bestätigen Sie, dass der Vorgang abgeschlossen wurde, indem Sie sich die Z-Achsen-Koordinate auf der Navigationsregisterkarte ansehen. Der Wert sollte ca. 11 mm betragen. Geben Sie 4,0 mm in die Position der Z-Achse ein und drücken Sie die Taste Go To mit der Maus oder drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur und die Bühne bewegt sich auf 4 mm Arbeitsabstand.
- Bewegen Sie die Bühne in X und Y, um die Schulter der Siliziumsonde zu lokalisieren. Positionieren Sie es so nah wie möglich an der Mitte des SEM. Ändern Sie die Stufenneigung auf 52°, indem Sie in der T-Koordinate "52" eingeben und enter drücken. Beobachten Sie, ob sich die Schulter der Sonde im Bild nach oben oder unten zu bewegen scheint. Verwenden Sie den Schieberegler Stage Z, um die Schulter der Sonde wieder in die Mitte des SEM-Bildes zu bringen. Passen Sie nur die Z-Position an, bewegen Sie nicht die X-, Y-, T- oder R-Achse.
- Führen Sie den integrierten Befehl "xT Align Feature" aus, der sich im Dropdown-Menü der Bühne befindet. Klicken Sie mit der Maus auf zwei Punkte parallel zum Rand der Sonde. Stellen Sie sicher, dass das horizontale Optionsfeld im Popup-Fenster ausgewählt ist, und klicken Sie auf Fertig stellen. Die Bühne wird gedreht, um die Sonde an der X-Achse der Bühne auszurichten. Passen Sie die Bühne in X,Y mit der Maus an, um die untere Schulter der Sonde wieder in die Mitte des SEM-Bildes zu stellen.
HINWEIS: Der erste Punkt sollte sich auf den Griff der Sonde und den zweiten Punkt in Richtung des Punkts der Sonde richten. - Wählen Sie die FIB in Quadrant 2 und stellen Sie sicher, dass der Strahlstrom immer noch 24 pA ist. Stellen Sie die Vergrößerung auf 5.000x und die Verweilzeit auf 100 ns. Geben Sie Strg-F auf der Tastatur ein, um den FIB-Fokus auf 13,0 mm einzustellen. Klicken Sie auf der Registerkarte Balkensteuerung mit der rechten Maustaste in den Stigmator 2d-Einsteller und wählen Sie Null aus, und klicken Sie außerdem mit der rechten Maustaste in die Beam Shift 2d-Einstellertaste und wählen Sie Null. Stellen Sie die Scandrehung auf 0° ein und drücken Sie die Taste für die automatische Kontrasthelligkeit in der Symbolleiste.
- Suchen Sie nach einem Bild der Sondenschulter in Quadrant 2. Verwenden Sie das Snapshot-Tool, um ein Bild mit der FIB zu erfassen. Bestätigen Sie, dass sich die Sondenschulter in der Mitte des FIB-Bildes befindet, wenn nicht, doppelklicken Sie auf die Sondenschulter, um sie in die Mitte zu verschieben. Bewegen Sie die Bühne nach links, indem Sie die linke Pfeiltaste auf der Tastatur etwa 10-15 Mal drücken. Erstellen Sie einen weiteren Schnappschuss und beobachten Sie, ob sich die Sondenseite noch in der Mitte der FIB befindet.
HINWEIS: Wenn nicht, muss die Stufenrotation leicht eingestellt werden. Wenn sich die Sonde über dem Bildmittelpunkt befindet, muss die Bühne in die negative Richtung gedreht werden. Wenn sich die Sonde unter der Mitte befindet, muss die Bühne im Uhrzeigersinn gedreht werden. Geben Sie eine relative compuzentrische Drehung von 0,01 bis 0,2 Grad ein, je nachdem, welche Weise zum Ausrichten der Sonde erforderlich ist. - Wiederholen Sie die Schritte 2.16 bis 2.17 so oft wie nötig, bis der Rand der Sondenschulter perfekt an der X-Achse der Bühne ausgerichtet ist (die Kante bleibt in der Mitte der FIB, während sie sich nach links bewegt).
- Bewegen Sie die Bühne mit dem FIB zurück zur unteren Schulter der Sonde. Speichern Sie die Bühnenposition in der Positionsliste, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken. Ändern Sie den FIB-Strahlstrom auf 2,5 nA und stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung der FIB immer noch 5000x beträgt. Führen Sie die automatische Helligkeitskontrastfunktion aus und stellen Sie die FIB-Verweilzeit auf 100 ns ein.
- Drücken Sie die Pause-Taste, um mit dem Scannen zu beginnen. Passen Sie den FIB-Fokus und den Astigmatismus so schnell und präzise wie möglich an, indem Sie die Grob- und Feinfokusknöpfe und die X- und Y-Stigmator-Regler auf dem MUI-Panel verwenden. Drücken Sie die Pause-Taste, um das FIB-Scannen zu stoppen.
3. Schreiben eines automatisierten Prozesses für die Radierung
- Starten Sie die Software, indem Sie sie im Windows-Startmenü suchen (d. h. Start-Programme, FEI-Unternehmen, Anwendungen, Nanobuilder). Positionieren Sie das Softwarefenster auf dem Seitenmonitor, damit die Benutzeroberfläche nicht verdeckt ist. Öffnen Sie die Datei zum Mustern der Silizium-Sonden, indem Sie auf Datei klicken, und öffnenSie dann . Richten Sie den Windows-Browser an den Speicherort des Softwareskripts(Zusatzdatei 1 - der Dateiname ist "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
- Wählen Sie innerhalb der Software das Dropdown-Menü des Mikroskops aus und wählen Sie Bühnenursprung festlegen. Wählen Sie innerhalb der Software das Dropdown-Menü des Mikroskops aus und wählen Sie dann Detektoren kalibrieren.
- Klicken Sie auf der Mikroskop-Benutzeroberfläche einmal mit der Maus auf Quad 1, um Quad 1 auszuwählen. Ignorieren Sie die anderen Anweisungen im Popup-Fenster, sie sind für dieses Projekt nicht erforderlich. Klicken Sie auf OK, um die Kalibrierung zu starten. Der Vorgang dauert ca. 5 min. Stellen Sie sicher, dass die ETD- und ICE-Detektoren kalibriert werden. Es ist in Ordnung, wenn andere Detektoren Kalibrierungsfehler haben.
- Wählen Sie innerhalb der Software das Dropdown-Menü des Mikroskops aus und wählen Sie Ausführen aus, um die Mustersequenz zu starten. Wenn das Muster abgeschlossen ist, schließen Sie die Software.
HINWEIS: Die Software übernimmt Quad 3 und 4 für die Musterungs- und Ausrichtungsfunktionen. Die Ausführung des Skripts dauert ca. 12 h. Während das Skript ausgeführt wird, ändern Sie keinen Parameter auf dem Mikroskop. - Drücken Sie "Vent" in der Mikroskop-UI-Beam-Control-Registerkarte, um die Mikroskopstrahlen herunterzufahren und den Entlüftungszyklus zu starten. Während die Kammer entlüftet, verschieben Sie die Bühne auf die Koordinaten X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0°, R = 0°. Sobald die Kammer entlüftet ist, saubere Nitrilhandschuhe anziehen und die Kammertür öffnen.
- Lösen Sie die Setschraube am Stubenadapter mit dem 1,5 mm Hexschlüssel. Entfernen Sie den Aluminiumstummel, der die gemusterte Sonde enthält, aus der Kammer. Schließen Sie die Mikroskopkammertür vorsichtig. Sehen Sie sich das CCD-Kamerabild in Quadrant 4 beim Schließen der Tür an. Stellen Sie sicher, dass der Bühnenadapter einen sicheren Abstand zu jeder kritischen Komponente in der Mikroskopkammer hat.
- Wählen Sie den Abwärtspfeil neben der Pump-Taste in der Balkensteuerung. Wählen Sie Pump-Taste, um die Kammer-Vakuumpumpe zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Tür versiegelt ist, indem Sie sanft auf die Türfläche drücken, während die Pumpe läuft.
HINWEIS: Eine Vakuumdichtung kann durch sanftes Ziehen an der Kammertür bestätigt werden, die geschlossen bleiben sollte, wenn sich das System unter Vakuum befindet. Die Pumpzeit beträgt ca. 5 min. Nur eine Seite der Sonde kann während eines einzigen Durchlaufs geätzt werden. - Wenn die Vorder- und Rückseite der Sonde eine Ätzung erfordert, entfernen Sie vorsichtig den geätzten Streifen von Siliziumsonden, nachdem Sie die endgültige Ätzung überprüft und die Vorderseite geabbildung gemacht haben (falls Bilder benötigt werden). Lösen Sie die silberne Farbe mit Aceton auf, indem Sie den Aceton vorsichtig auf die Silberfarbe streicheln.. Drehen Sie den Streifen vorsichtig auf die Rückseite, montieren Sie ihn nach den oben beschriebenen Schritten wieder an, richten Sie ihn aus und ätzen Sie.
4. Überprüfen der endgültigen Ätze und Bildgebung
- Sobald das Fräsen abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Homogenität der verschiedenen Abschnitte mit SEM-Bildgebung bei einer höheren Vergrößerung.
HINWEIS: Die Bildgebung im geneigten Winkel ermöglicht eine bessere Beurteilung der Variation in der Frästiefe. Besondere Aufmerksamkeit sollte den Übergangsregionen zwischen den Frässtandorten gewidmet werden. - Stellen Sie die Proben nach dem Fräsen mit einem optischen Mikroskop wieder ab.
HINWEIS: Die periodisch gefrästen Linien führen zu einem Brechungseffekt, der in Abhängigkeit vom Bildwinkel zu unterschiedlichen Farben führt. Wenn die Farbe nicht kontinuierlich zusammen mit der Sonde ist, ist dies ein klarer Hinweis auf die Störung in den gefrästen Linien.
5. Montage einer funktionalen Siliziumsonde für die FIB-Ätzung
- Entfernen Sie vorsichtig die funktionelle Siliziumelektrode aus der Verpackung. Verwenden Sie Zangen, um die Kunststoff-Schutzlasche, die die Kopfstufe bedeckt, vorsichtig zu heben. Beginnen Sie, eine Ecke der Lasche aus dem klebrigen Kleber zu heben, der sie an Ort und Stelle hält, und heben Sie weiter, bis die gesamte Elektrode entfernt ist.
- Klemmen Sie die Elektrode vorsichtig mit Hämostaten, um sich auf die Montage in den stereotaxic-Rahmen vorzubereiten. Während Sie die abgedeckte Lasche mit der Zange halten, legen Sie vorsichtig gekrümmte Hämostate um den grünen Schaft über dem Siliziumschaft, wobei der gekrümmte Teil der Hämostate nach oben zur Lasche zeigt. die Hämostate.
- Entfernen Sie vorsichtig die Kunststoff-Schutzlasche, die die Kopfstufe bedeckt. Während Sie die Elektrode mit den Hämostaten halten, klemmen Sie die Elektrode vorsichtig in den stereotaxic-Rahmen für die Reinigung.
- Füllen Sie 3 Petrischalen mit 95% Ethanol (ca. 10 ml pro Petrischale). Legen Sie die Petrischale unter die Elektrode, die zur Reinigung in den stereotaxic Rahmen montiert ist. Senken Sie die Elektrode langsam, indem Sie den Mikromanipulator nach unten (100 m/s) drehen, so dass der Schaft in das 95% Ethanol getaucht wird.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Mikromanipulator nicht zu schnell oder zu tief zu drehen, dies kann dazu führen, dass die Elektrode bricht (d. h., die Elektrode sollte die Petrischale nicht berühren). - Lassen Sie den Elektrodenschaft im 95% Ethanol für 5 min, und heben Sie dann langsam die Elektrode aus dem 95% Ethanol, indem Sie den Mikromanipulator nach oben drehen (100 m/s). Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male, für insgesamt drei Wähbe. Lassen Sie die Elektrode fünf Minuten lang trocknen.
- Verwenden Sie die gleiche Technik für die Montage der Elektrode in den stereotaxic Rahmen, um die Elektrode aus dem stereotaxic Rahmen zu entfernen. Legen Sie die Hämostate vorsichtig um den Schaft der Elektrode. Sobald die Hämostate fest geklammert sind, lassen Sie die Elektrode aus dem stereotaxic Rahmen, geben Sie die Kunststoff-Schutzlasche zurück, die die Kopfstufe bedeckt, und legen Sie die gereinigte Elektrode wieder in ihre Verpackung.
6. Ätzen funktionale Siliziumsonde mit FIB
- Montieren Sie die gereinigte funktionale Siliziumelektrode auf einem Aluminiumständer. Nehmen Sie die gereinigte funktionelle Siliziumelektrode vorsichtig mit Zangen auf und entfernen Sie die Schutzlasche von der Kopfbühne. Legen Sie den Elektrodenschaft auf den Aluminium-Stummel, damit er nicht über irgendeine Kante hängt, dann mit einem kleinen Stück Cu oder Carbon leitfähiges Band, pin die Kopfbühne sicher an den Aluminium-Stub.
HINWEIS: Alternativ kann ein Low-Profile-Cliphalter verwendet werden, um die Elektrode niedrig zu halten. Achten Sie darauf, den Elektrodenschaft nicht zu berühren. - Nach den oben beschriebenen Schritten (Abschnitt 2) positionieren Sie die Elektrode in euzentrischer Höhe und stellen Sie sicher, dass sich die Elektrode am Zufallspunkt der SEM- und FIB-Strahlen befindet. Richten Sie den Schaft an der "X"-Richtung der Bühne aus.
- Stellen Sie die FIB auf den optimalen Strom für das Fräsen der erforderlichen Nano-Architektur und stellen Sie sicher, dass Fokus und Stigmation richtig korrigiert werden. Bereiten Sie ein Array von Linien mit dem gewünschten Abstand und der gewünschten Länge vor, um das Sichtfeld des Schafts (500 m Abschnitte) abzudecken. Passen Sie die Linienlängen an, wenn die Radierung den Schaft auf die dünneren Abschnitte herunterbekommt.
HINWEIS: Beim Ätzen der Funktionselektrode ist es nicht möglich, Handelszeichen hinzuzufügen, um den Prozess zu automatisieren. Daher erfolgt das Verschieben zwischen den Unterabschnitten (ca. 500 m) manuell. - Nachdem das Fräsen des ersten Abschnitts abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass Sie die Fräsqualität überprüfen, bevor Sie zum nächsten Abschnitt übergehen. Wiederholen Sie Schritt 6.3, um den nächsten Abschnitt des Schafts zu ätzen. Richten Sie die gefrästen Linien aus dem vorherigen Abschnitt an den Mustern aus, die für den nächsten Abschnitt verwendet werden, um große Lücken zwischen den Durchläufen zu vermeiden.
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Representative Results
FIB geätzte Nano-Architektur auf den Oberflächen von Einzelnen Shank Intracortical Sonden
Unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden wurden intracortische Sonden mit spezifischen Nano-Architekturen nach etablierten Protokollen39geätzt. Dimensionen und Form des in diesen Methoden beschriebenen Nano-Architektur-Designs wurden aus früheren In-vitro-Ergebnissen umgesetzt, die eine Abnahme der Gliazellreaktivität darstellen, wenn sie mit dem hier beschriebenen Nano-Architektur-Design kultiviert wird37,38. Die hier beschriebenen Methoden verwendeten einen fokussierten Gallium-Ionenstrahl (FIB), um nanoskalige parallele Nuten in die Oberfläche nicht-funktioneller Einschenkelsilizium-Mikroelektrodensonden zu ätzen, wie zuvorbeschrieben 39. Die nanoskaligen Parallelrillen wurden entlang des Schafts der Rückseite der Sonde geätzt, indem ein automatisiertes Skript in der Software geschrieben wurde. Die endgültigen Abmessungen der geätzten Nanoarchitektur waren 200 nm breite parallele Linien, 300 nm voneinander entfernt, und hatten eine Tiefe von 200 nm (Abbildung 1). Die Verwendung von FIB zum Ätzen von Nano-Architekturen in eine Geräteoberfläche ermöglicht das Ätzen präziser Konstruktionen in hergestellte Geräte.
Geätzte Nano-Architektur in intracortische Sonden Wirkung auf Neuroinflammation
In diesen zuvor berichteten Daten wurden die intracortischen Sonden mit geätzten Nano-Architekturen entweder zwei oder vier Wochen lang in den Kortex von Ratten implantiert (n=4 pro Zeitpunkt) und verglichen mit Kontrolltieren, die mit glatten Sonden implantiert wurden, die keine Nano-Architektur-Ätzungen (n=4 pro Zeitpunkt) enthalten39. Einer der Mechanismen des Versagens, die den klinischen Einsatz von intracortischen Mikroelektroden behindern, ist die neuroinflammatorische Reaktion, die durch die Störung des Blutparenchyms und der Bluthirnschranke9,10,11,12,15induziert wird. Eine vollständige Beschreibung der neuroinflammatorischen Reaktion, die nach der intracortischen Mikroelektrodenimplantation beobachtet wurde, finden Sie in den folgenden Bewertungen13,14,22. Die Fähigkeit von intracortischen Mikroelektroden, Aktionspotentiale aus Neuronen aufzuzeichnen, hängt von der Entfernung der gesunden neuronalen Körper von der intracortischen Mikroelektroden-Aufzeichnungsstelle40ab. Daher evaluierte die zuvor berichtete Studie die Neuroinflammation um die intracortische Sondenimplantationsstelle, indem histologische Marker für neuronale Dichte, Gliazellaktivierung und Genexpression von proinflammatorischen Markern quantifiziert wurden39. Im Folgenden werden Highlights aus dieser Studie vorgestellt, die die Auswirkungen darstellen, die das Ätzen von Nano-Architekturen in die Sondenoberfläche auf Neuroinflammation hatte.
Auswirkungen der geätzten Nano-Architektur auf die Neuronendichte
Um zu bestimmen, wie das Ätzen von Nano-Architekturen in die Oberfläche der Sonde die neuronale Dichte unmittelbar um das Implantat herum beeinflusst, wurden die neuronalen Kerne gefärbt und quantifiziert, wobei zuvor die immunhistochemischen Methoden39,41beschrieben wurden. Es gab keine signifikanten Unterschiede der Neuronendichten rund um die Nanoarchitektur und Kontrollsonden bei 2 Wochen nach der Implantation (Abbildung 2A). Allerdings gab es um die Nano-Architektur-Sonden in 100-150 m Entfernung von der Implantatstelle deutlich mehr Neuronen als bei den glatten Kontrollimplantaten (p < 0,05 vs. Kontrollen) (Abbildung 2B) nach 4 Wochen nach der Implantation. Es wurde auch festgestellt, dass es einen erhöhten Trend der neuronalen Dichte um die Nano-Architektur-Sonden im Laufe der Zeit, kontrastiert den verringerten Trend der neuronalen Dichte um die Kontrollimplantate (Abbildung 2). Es gibt eine direkte Beziehung, die eine gemilderte neuroentzündliche Reaktion in Verbindung mit einer höheren Dichte von lebensfähigen Neuronen rund um die Mikroelektrode darstellt, führt zu einer erhöhten Fähigkeit für die Mikroelektrode, qualitativ hochwertige Aufnahmen15,40,42. Daher kann bei der Interpretation neuronaler Dichtedaten eine höhere Dichte von Neuronen um die Implantatstelle auf eine verringerte neuroinflammatorische Reaktion und potenziell verbesserte Aufzeichnungsqualität und -stabilität durch intracortische Mikroelektroden hindeuten.
Auswirkungen der geätzten Nano-Architektur auf neuroinflammatorische molekulare Marker
Histologie reicht aus, um die Zellen um eine Implantatstelle herum zu identifizieren; Es fehlt jedoch die Empfindlichkeit und Spezifität für die Charakterisierung des Phänotyps der umgebenden Zellen. Daher wurden Methoden zur quantitativen Genexpressionsanalyse eingesetzt, um die relative Genexpression neuroinflammatorischer Marker zu quantifizieren, um die Auswirkungen der Nanoarchitektur auf den Phänotyp der Zellen zu verstehen39. In der zuvor berichteten Studie wurden mehrere neuroinflammatorische Marker untersucht. Hier werden nur zwei hervorgehoben, die spezifisch für Mikroglia-Zellen sind, um zu diskutieren, wie ihr Phänotyp verändert worden sein kann. Der Differenzierungscluster 14 (CD14) ist ein Mustererkennungsrezeptor auf der Mikrogliamembran, der Bakterien erkennt und den Entzündungsweg nach Verletzung/Implantation43,44,45signalisiert. Stickoxid-Synthase (NOS2), ist ein oxidativer Stressmarker in Mikroglia/Makrophagen ausgedrückt, der mit einer erhöhten Produktion von proinflammatorischen Markern46,47verbunden ist.
In den zuvor gemeldeten Daten gab es keine signifikanten Unterschiede der relativen Genexpression von CD14 zwischen Nanoarchitektur und Kontrollimplantaten bei zwei- oder vierwöchiger Nachimplantation. Insbesondere gab es eine signifikante Abnahme (p < 0,05) der relativen Genexpression von CD14 von zwei bis vier Wochen um den Standort der Nanoarchitekturimplantate, was auf eine mögliche Abnahme der Entzündung hindeutet (in Abbildung 3A). In ähnlicher Weise gab es keine signifikanten Unterschiede der NOS2-relativen Genexpression zwischen Nano-Architektur und Kontrollimplantaten nach zwei Wochen. Allerdings gab es signifikant weniger (p < 0,05) NOS2 relative Genexpression um das Nano-Architektur-Implantat im Vergleich zum Kontrollimplantat bei vier Wochen nach der Implantation (bezeichnet durch in Abbildung 3B). Darüber hinaus gab es einen signifikanten Anstieg der relativen NOS2-Genexpression um die Kontrollimplantate von 2 bis 4 Wochen (in Abbildung 3 B) ist ein signifikanter Anstieg der NOS2-Relativgenexpression zu verzeichnen (in Abbildung 3B)wird jedoch kein Unterschied zwischen den Nano-Architektur-Implantaten beobachtet, was auf eine mögliche Abnahme der Entzündung um die Nano-Architektur-Implantate hindeutet. Bei der Interpretation dieser Daten ist es wichtig, die Funktion des zu quantifizierenden Gens zu verstehen. Zum Beispiel deuten Abnahmen von pro-inflammatorischen Genen auf eine wahrscheinliche Abnahme der Entzündungsreaktion um die Elektrodenstelle hin, während eine Zunahme dieser Arten von Genen auf eine wahrscheinliche Zunahme der Entzündung hindeutet.
FIB geätzte Nano-Architektur auf den Oberflächen funktionaler Single Shank Microelectrodes
Die zuvor berichtete Studie hatte vielversprechende Ergebnisse, die eine leichte Zunahme der Neuronendichte und die mögliche Abnahme des mikrogliaentzündlichen Phänotyps um die Nano-Architektur-Sondenimplantat-Site zeigten. Um die Übersetzung dieser Ergebnisse in die Elektrodenfunktionalität zu untersuchen, wurde eine funktionale Einzelschaftsilizium-Mikroelektrode mit dem gleichen Nano-Architektur-Design wie die nicht-funktionalen Single-Schaft-Silizium-Mikroelektrodensonden geätzt, wobei ein ähnliches FIB-Ätzprotokoll verwendet wurde. Der einzige Unterschied in der Methodik zum Ätzen der angegebenen Nanoarchitektur bestand darin, dass das Protokoll für die Funktionselektroden nicht automatisiert werden konnte, da es kein zusätzliches Substratmaterial gab, um treue Markierungen zu erstellen. So wurde die Funktionselektrode manuell mit FIB geätzt, indem der Strahl alle 500 m neu ausgerichtet wurde, wie im obigen Protokoll beschrieben. Die abschließenden Radierungen waren 200 nm breite parallele Linien, 300 nm voneinander entfernt, und hatten eine Tiefe von 200 nm (Abbildung 4).
Auswirkungen geätzter Nano-Architektur in intracortische Mikroelektroden auf die Elektrophysiologie
Erfolgreiche intracortische Mikroelektrodenaufnahmen sind abhängig von der Nähe der Neuronen um die Implantatstellen, der Integrität des Geräts und der zuverlässigen Übertragung der Einzeleinheitsaktivität aus dem Gehirn8,40,48,49. Elektrophysiologische Aufnahmen wurden quantifiziert, wobei die aufgezeichneten Metriken, die zweimal pro Woche über acht Wochen gesammelt wurden, verwendet wurden. Die in dieser Studie verwendeten Metriken waren der Prozentsatz der Kanäle, die einzelne Einheiten aufzeichneten, maximale Amplituden aufgezeichneter Einheiten und das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Die Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) am Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center genehmigten alle tiertierischen Verfahren. Sprague Dawley-Ratten (8-10 Wochen alt und mit einem Gewicht von 225 g) wurden mit einer einzigen Schaftsilizium-Mikroelektrode mit der oben genannten Nano-Architektur (n=1) oder den glatten Kontrollen (n=6) implantiert. Es wurde keine statistische Analyse zu diesen Daten durchgeführt, da für eine Proof-of-Concept-Pilotstudie eine Nanoarchitektur-Mikroelektrode implantiert wurde. Nichtsdestotrotz sind kollektive elektrophysiologische Ergebnisse, die einen erhöhten Prozentsatz der Kanäle zeigen, die einzelne Einheiten aufzeichnen (Abbildung 5A), maximale Amplituden (Abbildung 5B) der aufgezeichneten Einheiten und SNR (Abbildung 5C) aus den Nanoarchitektur-Mikroelektroden im Vergleich zu den glatten Kontrollmikroelektroden, vielversprechend. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ätzung der Nanoarchitektur in die Oberfläche von Mikroelektroden potenziell zu einer verbesserten Qualität und einer erhöhten Langlebigkeit elektrophysiologischer Aufnahmen führen kann. Eine weitere Bewertung mit erhöhtem Stichprobenumfang ist erforderlich, um diese vorläufigen Ergebnisse zu überprüfen.
Abbildung 1: FIB Geätzte Nano-Architektur auf den Oberflächen von Einzelnen Shank Intracortical Sonden. SEM-Bilder der nicht-funktionalen Single-Schaft-Silizium-Sonden mit FIB-geätzten Nano-Architekturen entlang der Rückseite des Schafts. (A) Zusammengesetzte Bilder der gesamten Sondenpostätzung, die bei 120-facher Vergrößerung, Skalenstange = 400 m dargestellt wird. Die Treuhandzeichen (Quadratkasten mit einem + Symbol, das durch sie geht), werden entlang des Siliziumsubstrats, das die Sonde umgibt, geätzt. Vergrößerte SEM-Bilder der Sondenspitze sind in (B) bei 1.056-facher Vergrößerung (Scale bar = 40 m), (C) bei 3.500x Vergrößerung (Scale bar = 10 m) und (D) bei 10.000x Vergrößerung, Scale bar = 4 m dargestellt. Diese Zahl wurde ab Referenz39geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswirkungen der geätzten Nano-Architektur auf die Neuronendichte. Das neuronale Überleben wird als Prozentsatz der Hintergrundregion von denselben Tieren in Entfernungen von 50 m von der Implantatstelle dargestellt. (A) Es wurden keine signifikanten Unterschiede des neuronalen Überlebens zwischen den glatten Oberflächen (Kontrolle) und den nanomusterten Implantaten nach 2 Wochen nach der Implantation beobachtet. (B) Bei den nanogemusterten Implantaten im Abstand von 100-150 m gab es ein signifikant höheres neuronales Überleben im Vergleich zu glatten Oberflächen (p < 0,05) nach 4 Wochen nach der Implantation. Repräsentative Bilder von Neuronen (grün gefleckt), mit dem gelben Umriss, der die Implantationsstelle darstellt, und dem "P", das die geätzte Seite der Mikroelektrode bezeichnet, Skalenbalken = 100 m. Diese Zahl wurde von39geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswirkungen der geätzten Nano-Architektur auf neuroinflammatorische molekulare Marker. Für die nanogemusterten und kontrollierbaren Implantate wurde gewebe im Umkreis von ca. 500 m der Implantationsstelle gesammelt. Die relative Genexpression von Entzündungsmarkern wurde quantitativ zwischen beiden Implantattypen (die Unterschiede werden im Graphen durch das Zeichen von n im Graphen; p < 0,05) sowie im Laufe der Zeit bezeichnet (die Unterschiede werden im Graphen durch * bezeichnet; p < 0,05). (A) Die relative Genexpression von CD14 verringerte sich um nanomusterte Implantate von zwei bis vier Wochen signifikant (*). (B) Es gab eine signifikant geringere relative Genexpression von NOS2 um Nanomusterimplantat im Vergleich zur Kontrolle nach vier Wochen () und es gab einen signifikanten Anstieg von NOS2 von zwei auf vier Wochen um glatte Kontrollimplantate (*). Diese Zahl wurde ab Referenz39geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: FIB Geätzte Nano-Architektur auf den Oberflächen von funktionalen Single Shank Microelektroden. Der Einschub in der oberen rechten Ecke zeigt die Mikroelektrode, die in dieser Studie verwendet wird, neben einem Dime, um die Größe des Elektrodenschafts (dünne schwarze Linie) darzustellen. SEM-Bilder der Mikroelektroden schaft mit FIB geätzten Nano-Architekturen entlang der Rückseite des Schafts. Der gesamte Schaft wird oben bei einer 600-fachen Vergrößerung dargestellt (Scale bar = 50 m), während der Einschub die nanogemusterte Oberfläche bei 25.000x Vergrößerung, Scale bar = 1 m) darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Auswirkungen der geätzten Nano-Architektur in intracortische Mikroelektroden auf die Elektrophysiologie. Die Auswertung elektrophysiologischer Metriken ergab einen vielversprechenden vorläufigen Anstieg des Trends von (A) der Kanäle, die einzelne Einheiten aufzeichneten, (B) maximale Amplituden von aufgezeichneten Einheiten und (C) Signal-Rausch-Verhältnis von der Mitnano-Architektur geätzten Mikroelektrode im Vergleich zu den glatten Regelelektroden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Elektrophysiologie-Aufnahme von implantierten Funktionalen Single Shank Microelektroden mit FIB geätzten Nano-Architekturen. Eine der Herausforderungen bei der Verwendung von FIB zum Ätzen von Nanoarchitekturen auf hergestellten Mikroelektrodengeräten ist das Risiko von Kurzschlussaufnahmekontakten. Die x-Achse zeigt die Aufnahmezeit in Sekunden und die y-Achse zeigt die Elektrodenkanäle an, die neuronale Aktionspotentiale aufzeichnen. Jede nummerierte Linie auf der y-Achse stellt einen anderen Elektrodenkanal dar, wobei Kanal Nummer 1 die flachste und 16 die tiefste ist. Die roten Felder umreißen die kurzgeschlossenen Kanäle, während die blauen Kästchen Kanäle mit sichtbarer neuronaler Aktivität umreißen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Das hier skizzierte Fertigungsprotokoll nutzt fokussierte Ionenstrahllithographie, um Nanoarchitekturen effektiv und reproduzierbar in die Oberfläche nicht-funktionaler und funktioneller Einzelschaftsilizium-Mikroelektroden einzuätzen. Fokussierte Ionenstrahl-Lithographie (FIB) ermöglicht die selektive Ablation der Substratoberfläche durch verwendung eines fein fokussierten Ionenstrahls50,51. FIB ist eine Direktschreibtechnik, die verschiedene Funktionen mit nanoskaliger Auflösung und hohem Seitenverhältnisvon 50,52,53erzeugen kann. Um die verschiedenen Größenmerkmale zu erzeugen, kann die Größe des Ionenstrahlstroms optimiert werden, um die Ionenstrahl-Spotgröße in einem Bereich von 3 nm bis 2 m50,51zu ändern. Einige allgemeine Vorteile der Verwendung von FIB, um Features auf Oberflächen zu ätzen, sind: 1) es kann auf einer Vielzahl von Materialien verwendet werden, einschließlich Silizium, Metalle und Polymere53,54,55,56, 2) FIB kann auf nicht-planaren Oberflächen durchgeführt werden, und 3) FIB kann für die Nachbearbeitung auf einzelnen Geräten verwendet werden57.
Hier wurde FIB in Kombination mit einem SEM-Mikroskop und einer Software verwendet, um ein spezielles automatisiertes Skript zum Ätzen bestimmter Merkmale in nicht-funktionale Einzelschaftssonden zu schreiben. Das Skript enthielt die erforderlichen Parameter (2,5 nA Ionenstrahlstrom und 30 kV Spannung), um den gewünschten exakten Abstand zu ätzen (200 nm breite parallele Nuten, abstand 300 nm auseinander und 20 nm tief). Die Abmessungen der Elektrode überstiegen das Sichtfeld für die FIB, so dass die Musterung in mehreren Stufenpositionen durchgeführt wurde. Um den Prozess zu automatisieren, wurden Fiducial-Marken in die Seite des Siliziumblechs geätzt, das die Sonden an Ort und Stelle hält, damit die Software die gemusterten Linien auf dem Sondenschaft genau lokalisieren kann. Die Treuhänder waren notwendig, weil die Bühnenbewegung eine große Unsicherheit in der Lage des Musterbereichs in Bezug auf das Ionenstrahlfeld erzeugte. Die Platzierung der Treuhänder auf dem Siliziumblech ermöglichte es der FIB, die Musterbereiche zu lokalisieren, ohne den Strahl auf dem Sondenschaft direkt zu scannen, was den Sondenschaft möglicherweise kontaminieren oder beschädigen könnte. Der gesamte automatisierte Ätzprozess für einen Schaft dauerte ca. 12 h und erforderte nach dem Start der Musterung keinen Bedienereingriff. Zusammengenommen waren die Vorteile der Verwendung von FIB, um Funktionen in den Silizium-Sondenschaft zu ätzen, die Fähigkeit, nanometergroße Features herzustellen, den Ätzprozess zu automatisieren und die Fähigkeit, auf einer hergestellten Sonde zu ätzen. Obwohl FIB reichlich Vorteile hat, ist einer der Nachteile dieser Fertigungsmethode die langsame Durchsatzrate, die letztlich das Potenzial für die Massenproduktion von Geräten mit Nano-Architekturen in ihre Oberfläche einschränkt58. Alternativ, andere Herstellungsmethoden verwendet, um Feature-Größen und Geometrien von Interesse zu erstellen, vielleicht mit schnelleren Geschwindigkeiten und bei Massenproduktionen, gehören Elektronenstrahl-Lithographie und Nanoimprint-Lithographie59,60,61,62,63,64,65. Diese Methoden erlauben jedoch nicht das Ätzen von Nano-Architektur-Features in hergestellte Geräte. Traditionell werden diese Verfahren während des Herstellungsprozesses auf einem Blatt Silizium oder Polymer verwendet, das dann in nachgelagerten Verarbeitungsschritten verwendet werden kann, um die endgültige Täuschung herzustellen.
Die Funktionselektroden waren nicht in der Lage, einen automatisierten Prozess zu durchlaufen, da kein umgebendes Material um den Elektrodenschaft herum vorhanden war, in dem Treuhandmarken in den Lauf eingeschlossen werden sollten. Daher wurden die Funktionselektroden manuell ausgerichtet und in 500 m Abschnitten entlang des Schafts geätzt, mit dem gleichen Ionenstrom und der gleichen Spannung wie der automatisierte Lauf, um die gleichen Funktionsgrößen zu gewährleisten. Der Strahl musste nach Abschluss jedes 500-m-Intervalls manuell neu ausgerichtet und für den nächsten Abschnitt eingerichtet werden. Der Prozess der manuellen Neuausrichtung der Muster alle 500 m kann potenziell zu beschädigten Nanostrukturen oder Strukturen führen, die nicht der beabsichtigten Geometrie entsprechen. Dies ist auf längere Belichtungszeiten zurückzuführen, die der Ionenstrahl für die manuelle Ausrichtungbenötigt 66. Dies war eine der Schwierigkeiten, die bei der manuellen Radierung aufgetreten sind. Aufgrund dieser Komplikation waren zwei Aufnahmekontakte kurzgeschlossen und konnten neuronale Wirkungspotentiale nicht aufzeichnen (Abbildung 6). Abbildung 6 zeigt ein elektrophysiologisches Live-Aufnahmesegment des tieres, das mit der Nano-Architektur-Elektrode implantiert wurde. Die blauen Felder umreißen die Kanäle, die starke Aktionspotenziale aufzeichnen, im Vergleich zu den roten Feldern, die die beiden toten Kanäle bezeichnen. Eine der Herausforderungen bei der manuellen FIB-Ätzung auf nachgefertigten Elektroden besteht daher darin, dass die Möglichkeit besteht, dass der Strahl Kontakte kurzschließen und an der Aufnahme hindern kann. Diese Herausforderung wird verstärkt, wenn versucht wird, die Vorderseite einzelner Schaftsiliziumelektroden zu ätzen, bei denen sich die Aufnahmekontakte und Spuren entlang des gesamten Schafts der Elektrode befinden. Obwohl es möglich ist, das Silizium um die Aufnahmekontakte und Spuren herum zu ätzen, ist zusätzliche Vorsicht geboten, um Schäden und eine verminderte Leistung der Aufnahmefähigkeiten der Elektrode zu vermeiden.
Wie bereits erwähnt, kann FIB auf verschiedenen Materialien eingesetzt werden, um zahlreiche Merkmalsgeometrien in die Oberfläche zu ätzen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Parameter für Ätzgeometrien, wie Linien in die verschiedenen Materialien, kompliziert vorherzusagen sind. Insbesondere bei Linienmustern sind Linienbreite und -tiefe stark von vielen Parametern wie Beschleunigungsspannung, Strahlstrom, Verweilzeit, Pixelabstand, Lebensdauer der Blende und Materialtyp abhängig. Ein weiterer Parameter, der sich aus der Optimierung ergibt, ist die Gesamtzeit zum Fräsen jeder Linie. Schmalere und tiefere Linien könnten mit kleineren Strahlströmen erreicht werden; Die Musterzeit für einen ganzen Sondenschaft würde sich jedoch auf mehrere Tage erstrecken, was nicht praktikabel ist. Obwohl es zwar möglich ist, das hier vorgestellte Protokoll zu optimieren, wäre es also außerordentlich schwierig, die Parameter für unbekannte Materialien zu beschreiben. Bei der Fehlerbehebung der in diesem Protokoll beschriebenen Parameter für die Siliziumsonden wurden zahlreiche Testschnitte in Silizium vorgenommen, um zu bewerten, wie sich die sich ändernden Bedingungen auf die Linienbreite und -tiefe auswirkten. Sobald die ausgewerteten Bedingungen in der Lage waren, die spezifische Feature-Größe und Geometrie von Interesse zu ätzen (200 nm breite Linien, die 200 nm tief waren), wurden diese Parameter verwendet, um das Softwareskript zu schreiben. Das Skript wurde verwendet, um den Abstand jeder Zeile zu steuern, von Mitte zu Mitte, die in diesem Protokoll 300 nm ist. Zukünftige Studien, in denen Siliziumsubstrate/-geräte verwendet werden, die Funktionsgrößen in Hunderten von Nanometern erfordern, können die in diesem Protokoll beschriebenen Parameter als Ausgangspunkt für die Fehlerbehebung der Bedingungen verwenden, die erforderlich sind, um die gewünschten Feature-Größen zu erstellen. Für Metall- und Polymersubstrate/-geräte sind weitere Optimierungen und Fehlerbehebungen der Ätzbedingungen erforderlich. Insgesamt ermöglicht die Verwendung von FIB zum Ätzen von Nanoarchitekturen in Materialoberflächen eine ausreichende Kontrolle und Flexibilität bei Merkmalsgeometrien, die Verwendung zahlreicher kompatibler Materialien und verschiedeneoberflächentypen, einschließlich hergestellter Geräte. Repräsentative Ergebnisse, die hier vorgestellt wurden, zeigten die potenziellen Vorteile, die in unseren Studien beobachtet wurden, fiB zu nutzen, um Nano-Architekturen in die Oberfläche von intraortischen Mikroelektroden zu ätzen: 1) erhöhte neuronale Dichte und 2) Reduktion neuroinflammatorischer Marker um implantierte Geräte mit Nano-Architekturen sowie 3) vorläufige Ergebnisse, die eine verbesserte Qualität elektrophysiologischer Aufnahmen im Laufe der Zeit darstellen. Ebenso kann der Einsatz und die Optimierung der beschriebenen Protokollätzen Nano-Architektur-Features in die Oberfläche eines Materials verwendet werden, um die Funktionalität von zahlreichen medizinischen Geräten zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom United States (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service Awards unterstützt: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) und #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). Der Inhalt stellt nicht die Ansichten des U.S. Department of Veterans Affairs oder der Regierung der Vereinigten Staaten dar. Die Autoren danken FEI Co. (Jetzt Teil von Thermofisher Scientific) für die Unterstützung und den Einsatz von Instrumenten durch das Personal, die bei der Entwicklung der in dieser Forschung verwendeten Skripte halfen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
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