Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fokusert ion Beam litografi å etse nano-arkitekturer i Microelectrodes

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60004
Automatic Translation
1, 2,4, 5, 6, 2,3,4
1Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, 2Veteran Affairs Ann Arbor Healthcare System, 3Department of Neurology, School of Medicine, University of Michigan, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 5Michigan Center for Materials Characterization, University of Michigan, 6Carl Zeiss SMT, Inc.

Summary

Vi har vist at den etsing av nano-arkitektur i intracortical microelectrode enheter kan redusere inflammatorisk respons og har potensial til å forbedre elektrofysiologisk innspillinger. Metodene beskrevet her skissere en tilnærming til etch nano-arkitekturer inn i overflaten av ikke-funksjonell og funksjonell enkelt skaft silisium intracortical microelectrodes.

Abstract

Med fremskritt innen elektronikk og fabrikasjon teknologien, intracortical microelectrodes ha gjennomgått innholdsrik forbedringer muliggjør det produksjon av sofistikert microelectrodes med betydelig resolution og expanded evnene. Fremdriften i produksjonsteknologi har støttet utviklingen av BioMimetic elektroder, som har som mål å sømløst integreres i hjernens parenchyma, redusere neuroinflammatory responsen observert etter elektrode innsetting og forbedre kvaliteten og lang levetid for elektrofysiologisk innspillinger. Her beskriver vi en protokoll for å ansette en BioMimetic tilnærming nylig klassifisert som nano-arkitektur. Bruken av fokuserte ion Beam litografi (LØGN) ble benyttet i denne protokollen til å etse spesifikke nano-arkitektur funksjoner inn i overflaten av ikke-funksjonell og funksjonell enkelt skaft intracortical microelectrodes. Etsing nano-arkitekturer inn i elektrode overflaten indikerte mulige forbedringer av biokompatibilitet og funksjonaliteten til den implantert enheten. En av fordelene med å bruke LØGN er evnen til å etse på produserte enheter, i motsetning til under fabrikasjon av enheten, tilrettelegging grenseløse muligheter til å endre mange medisinske enheter etter produksjon. Protokollen som presenteres her, kan optimaliseres for ulike materialtyper, Nano-arkitektur funksjoner og typer enheter. Augmenting overflaten av implantert medisinsk utstyr kan forbedre enhetens ytelse og integrering i vevet.

Introduction

Intracortical Microelectrodes (IME) er invasiv elektroder som gir et middel for direkte grensesnitt mellom eksterne enheter og neuronal populasjoner inne i cerebral cortex1,2. Denne teknologien er et uvurderlig verktøy for opptak nevrale handling potensialer for å forbedre vitenskapsmenn evne til å utforske neuronal funksjon, forhånd forståelse av nevrologiske sykdommer og utvikle potensielle terapier. Intracortical microelectrode, brukes som en del av Brain Machine Interface (BMI) systemer, gjør opptak av handlingen potensialer fra en person eller små grupper av neurons å oppdage motoriske intensjoner som kan brukes til å produsere funksjonelle utganger3. Faktisk, BMI systemer har blitt brukt for protese og terapeutiske formål, slik som ervervet Sensorimotor rytme kontroll for å drive en datamaskin markøren hos pasienter med amyotrofisk lateral sklerose (ALS)4 og ryggmargsskader5 og gjenopprette bevegelsen i mennesker som lider av kronisk tetraplegi6.

Dessverre, IME ofte ikke å spille inn konsekvent over tid på grunn av flere feil moduser som inkluderer mekaniske, biologiske og materielle faktorer7,8. Neuroinflammatory-responsen som oppstår etter at elektrode elektroden er antatt å være en betydelig utfordring som bidrar til elektrode svikt9,10,11,12,13,14. Den neuroinflammatory responsen er initiert under den første innsetting av IME som bryter blod hjerne barrieren, skader den lokale hjernen parenchyma og forstyrrer gliacellene og neuronal nettverk15,16. Denne akutte responsen er karakterisert ved aktiveringen av gliacellene celler (mikroglia/makrofager og astrocytter), som frigjør Pro-inflammatoriske og nevrotoksiske molekyler rundt implantatet området17,18,19,20. Den kroniske aktiveringen av gliacellene celler resulterer i en fremmedlegeme reaksjon karakterisert ved dannelsen av en gliacellene arr isolere elektroden fra friske hjernevevet7,9,12,13,17,21,22. Til syvende og sist hindrer elektroden evne til å registrere neuronal handling potensialer, på grunn av den fysiske barrieren mellom elektroden og neurons og degenerasjon og død av neurons23,24,25.

Den tidlige svikt i intracortical microelectrodes har ført til betydelig forskning i utviklingen av neste generasjons elektroder, med vekt på BioMimetic strategier26,27,28,29,30. Av spesiell interesse for protokollen som er beskrevet her, er bruken av nano-arkitekturen som en klasse for BioMimetic overflate endringer for IME31. Det er fastslått at overflater som etterligner arkitekturen til det naturlige in vivo-miljøet, har en forbedret biokompatiblerespons 32,33,34,35,36. Dermed er hypotesen overbevisende denne protokollen at diskontinuitet mellom den grove arkitekturen i hjernevevet og glatt arkitektur av intracortical microelectrodes kan bidra til neuroinflammatory og kroniske fremmedlegemer respons på implantert IME (for en full gjennomgang referere til Kim et al.31). Vi har tidligere vist at bruken av nano-arkitektur funksjoner som ligner på hjernens ekstracellulære Matrix Architecture reduserer astrocytt inflammatoriske markører fra celler kultivert på nano-architectured underlag, sammenlignet med flat kontroll overflater i både in vitro og ex vivo-modeller av nevroinflammasjon37,38. Videre har vi vist anvendelsen av fokusert ion Beam (LØGN) litografi til etch nano-arkitekturer direkte på silisium sonder resulterte i betydelig økt neuronal levedyktighet og lavere uttrykk for Pro-inflammatoriske gener fra dyr implantert med Nano-arkitektur sonder i forhold til jevn kontrollgruppe26. Derfor formålet med protokollen som presenteres her er å beskrive bruken av LØGN litografi å etse nano-arkitekturer på produsert intracortical microelectrode enheter. Denne protokollen ble utviklet for å etse nano-arkitektur størrelse funksjoner i silisium overflater av intracortical microelectrode Shanks utnytte både automatiserte og manuelle prosesser. Disse metodene er ukomplisert, reproduserbar, og kan sikkert være optimalisert for ulike enhets materialer og ønsket funksjon størrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: gjør følgende trinn når du bruker riktig personlig verneutstyr, for eksempel en Laboratoriefrakk og hansker.

1. montering av ikke-funksjonell silisium probe for fokusert ion Beam (LØGN) Litografi

Merk: for hele prosedyren som beskriver fabrikasjon av SOI wafer med 1 000 sonder, Vennligst referer til Ereifej et al.39.

  1. Isolere en stripe av 2-3 silisium sonder fra silisium på isolator (SOI) wafer inneholder 1 000 sonder. Ikke gjør strimler som inneholder mer enn tre silisium sonder. Dette kan øke sjansene for løs montering og kan føre til forskyvning resulterer i liten LØGN å etse feil.
    Merk: strips/sonder sitter ikke fast på aluminium stub kan forårsake to komplikasjoner: 1) når scenen beveger seg til å arbeide på neste avsnitt, vil det være vibrasjoner og fresing vil ikke være nøyaktig før sonden ro og 2) det kan føre til en høy variasjon og være ute av fokus planet.
    1. Mens iført hansker, bruk fine tang for å legge press rundt sonder for å bryte av en liten seksjon som inneholder to til tre sonder.
  2. Forsiktig rengjøre silisium sonden av alt støv og rusk før LØGN etsing. Forbered en 6 brønn polystyren plate ved pipettering 3 mL/brønn av 95% etanol i tre brønner.
    1. Nøye plukke opp kuttet stripe av silisium sonder med fine tips eller vakuum tang og plassere den i celle sil. Plasser bare en stripe av silisium sonder per sil for å hindre bryte sonder. Plasser sil som inneholder silisium sonder stripen i den første brønnen som inneholder 95% etanol for rengjøring. Hold sil i første brønn i 5 min.
    2. Flytt sil som inneholder silisium sonder fra første brønn og plassere den i den andre brønnen som inneholder 95% etanol for ytterligere 5 min. Gjenta en gang i den tredje brønnen.
    3. Plasser sil som inneholder renset silisium sonder på en polytetrafluoretylen plate til lufttørke. Gjør dette trinnet i en steril hette for å unngå forurensning fra støv.
  3. Plasser luft-tørket stripe av silisium sonder i en forseglet container for transport til SEM-liten LØGN. Pakk sil som inneholder luft-tørket prøver med plast eller aluminiumsfolie wrap for transport og/eller lagring for å opprettholde rengjøring.
  4. Bruk fine tippet eller vakuum tang for å nøye plukke opp den rene stripe av silisium sonder og plassere dem på en ren aluminium spire (brukes for SEM-LØGN Imaging/etsing) for å forberede for montering.
  5. Bruk en tannpirker (eller andre fine tippet instrument som en tynn elektrisk wire), for å plassere en liten dråpe (~ 10 μL) av sølv maling på kanten av silisium underlaget rundt sonder. Fest stripen ned ved å spre sølvet malingen rundt på sidene av silisium underlaget rundt sonden. La sølv maling tørke helt før du plasserer aluminium stub i SEM-liten LØGN.
    Merk: Vær forsiktig så du ikke får sølv maling på skaftet av elektroden fordi det er den delen som vil bli etset. Hvis stripe av sonder ikke er forsvarlig forankret til aluminium stub, kan stripen bevege seg under behandling eller har et annet fokal plan, og dermed resulterer i feil fresing av liten LØGN. Flere strimler av silisium sonder kan monteres på samme aluminiums spire, noe som gjør at det er rikelig med plass mellom stripene for å tillate fjerning fra stub etter etsing. Dette vil gi mer effektiv etsing av flere sonder ved hjelp av den automatiserte funksjonen som er beskrevet nedenfor.

2. justere liten LØGN til Silicon sonder

  1. Klikk på vent -knappen i stråle kontroll kategorien for å lufte kammeret. Trykk SKIFT + F3 for å utføre en startside. Bekreft valget ved å velge Home Stage -knappen i popup-vinduet.
    Merk: Hvis du kjører hjem scene operasjonen er et forebyggende trinn for å sikre at scenen aksen leses riktig av programvaren og mikroskopet er i god stand.
  2. Etter at Home Stage er fullført, flytter du scenen til koordinater X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. Når kammeret er ventilert, ta på ren nitril hansker og åpne kammer døren.
    Merk: avhengig av den forrige brukerens program, kan det være nødvendig å endre scenen adapter. Standard etappe adaptere (for eksempel FEI-stil) kan fjernes ved å skru den midtre bolten mot klokken og installeres ved å skru urviseren inn i rotasjons platen på scenen.
  3. Sett inn aluminiums stub som holder sonder i toppen av scene adapteren. Fest aluminiums stub ved å stramme sett skruen på siden av scene adapteren. Bruk 1,5 mm nøkkel for denne oppgaven.
  4. Juster høyden på scene adapteren ved å dreie adapteren med klokken for å senke den eller mot klokken for å heve den. Fest scene adapteren til rotasjons platen ved å dreie låsemutteren med klokken til mutteren er sikret mot dreieplaten på etappen. Hold scenen adapter med den andre hånden for å hindre rotasjon av adapteren og prøvene mens du strammer låse membran mutteren.
    Merk: Bruk den med følgende høydemåleren til å bestemme riktig høyde. Toppen av aluminium stub bør være samme høyde som den maksimale linjen som vises på høydemåleren. Over stramme membran mutteren kan forårsake skade på scenen og adapter. Bruk bare nok kraft for å sikre prøvene.
  5. Skaff deg et navigasjons kamera bilde. Sving navigasjons kameraarmen forsiktig opp til den stopper. Mikroskopet vil automatisk flytte seg til en posisjon under kameraet. Se live-bildet som vises i kvadrant 3 i brukergrensesnittet for mikroskop (UI).
    1. Når lysstyrkenivået automatisk justeres til et passende nivå, henter du bildet ved å trykke på knappen på kamera braketten. Pass på å vente på at hele bilde anskaffelsen er ferdig, noe som indikeres med et pause symbol som vises i kvadrant 3 og belysningen av kameraet slås av. Dette tar ca. 10 s. sving kameraarmen tilbake til lukket stilling. Scenen vil gå tilbake til den opprinnelige posisjonen.
  6. Lukk mikroskop kammer døren nøye. Se bilde av CCD-kameraet i kvadrant 4 mens du lukker døren. Sørg for at prøvene og scenen er en trygg avstand fra enhver kritisk komponent i mikroskop kammeret.
  7. Velg pil ned ved siden av pumpe-knappen i kategorien stråle kontroll. Velg pumpe med prøve rensing knappen i UI programvare for å starte kammeret vakuum pumpen og bygget i plasma renere. Pass på at døren er forseglet ved forsiktig å skyve på forsiden av døren mens pumpen er i gang. Vent i omtrent 8 min for pumpe tid og plasma rengjøringssyklus for at mikroskop kammeret skal være ferdig.
    Merk: en vakuum forsegling kan bekreftes ved å trekke forsiktig i kammer døren, som skal forbli lukket hvis systemet er under vakuum.
  8. Når ikonet i nederste høyre hjørne av UI blir grønt, trykker du på Wake-up-knappen i strålen kontroll kategorien som slår på elektron og Ion bjelker. Velg kvadrant 1 og sett strålen signal til elektronstråle (hvis det ikke er satt allerede), sett kvadrant 2 til ion strålen (hvis den ikke er satt allerede).
    1. Sett SEM spenning til 5 kV, sett SEM stråle strøm til 0,20 nA, sett SEM detektor til ETD, sett detektor modus til sekundær Electron. Sett LØGN spenning til 30 kV, sett LØGN stråle strøm til 24 pA, sett løgndetektor til ICE detektor, sett detektor modus til videregående elektron.
  9. Dobbeltklikk på silisium sonden i navigasjons kameraet bildet, kvadrant 3 for å flytte scenen til omtrentlig plassering av sonden. Klikk på kvadrant 1 for å velge den som den aktive kvadrant og trykk på pauseknappen for å starte SEM skanning. Still skanningen dvele tid til 300 NS og slå av Scan sammenflettede, linje integrasjon, og ramme snitt. Sett skanne rotasjon til 0 i stråle kontroll fanen og høyreklikk på strålen Skift 2D justering og velg null.
  10. Juster forstørrelsen til minimumsverdien ved å dreie forstørrelses knotten mot klokken på MUI-panelet. Juster bildets lysstyrke og kontrast ved hjelp av bryterne på MUI-panelet eller verktøylinjeikonet for automatisk kontrast lysstyrke .
  11. Flytt scenen ved enten å dobbeltklikke musen på en funksjon for å sentrere den, eller ved å trykke ned musehjulet og aktivere styrespak mus modus. Flytt ønsket silisium sonde for å bli mønstret inn i midten av SEM-bildet.
  12. Finn en kant eller andre funksjoner, for eksempel en støv partikkel eller ripe. Øk forstørrelsen til 2, 000x ved å dreie forstørrelses knotten med urviseren. Juster fokus for SEM ved å dreie grov og fin fokus knotter på MUI til bildet er i fokus. Når bildet er i fokus, velger du koblingen sample Z til arbeidsavstand knappen i verktøylinjen.
  13. Kontroller at operasjonen ble fullført ved å se på en Z-akse-koordinat i navigasjons fanen. Verdien skal være ca. 11 mm. Skriv inn 4,0 mm i Z-aksen posisjon og trykk gå til knappen med musen eller trykk på Enter-tasten på tastaturet og scenen vil flytte til 4 mm arbeidsavstand.
  14. Flytt scenen i X og Y for å finne skulderen på silisium sonden. Plasser den så nær sentrum av SEM som mulig. Endre etappe vinkelen til 52 ° ved å skrive inn "52" i T-koordinaten og trykke ENTER. Observer om skulderen på sonden ser ut til å flytte opp eller ned i bildet. Bruk trinn Z glidebryteren for å bringe skulderen på sonden tilbake til midten av SEM-bildet. Du må bare justere Z-posisjonen, ikke flytte X-, Y-, T-eller R-aksen.
  15. Løpe det bygget inne "XT innrette ansiktstrekk" kommandere lokalisert inne det scene miste ned meny. Bruk musen til å klikke på to punkter parallelt med kanten av sonden. Kontroller at den horisontale radioknappen er valgt i popup-vinduet og klikk finish. Scenen vil rotere for å justere sonden med X-aksen på scenen. Juster scenen i X, Y ved hjelp av musen for å sette den nedre skulder av sonden i midten av SEM bildet igjen.
    Merk: det første punktet bør være mot sonden grep og det andre punktet skal være mot sonden punkt.
  16. Velg liten LØGN i kvadrant 2 og sørg for at strålen strømmen er fortsatt 24 pA. Sett forstørrelsen til 5, 000x og dvele tid til 100 NS. Skriv CTRL-F på tastaturet for å sette liten løgn fokus til 13,0 mm. Inne strålen administrere tab, rett falle i staver inne det stigmator 2D innstilt og velge null og, likeledes, rett falle i staver inne strålen Skift 2D innstilt og velge null. Sett skanne rotasjonen til 0 ° og trykk på knappen for automatisk kontrast lysstyrke på verktøylinjen.
  17. Se etter et bilde av sonden skulderen i kvadrant 2. Bruk Snapshot verktøyet til å tilegne seg et bilde med liten løgn. Bekreft sonden skulderen er i sentrum av liten LØGN bildet, hvis ikke, dobbeltklikk på sonden skulderen for å flytte den til sentrum. Flytt scenen til venstre ved å trykke på venstre piltast på tastaturet omtrent 10-15 ganger. Ta et øyeblikksbilde og observere om sonden siden er fortsatt i sentrum av liten LØGN.
    Merk: Hvis ikke, må etappe rotasjonen justeres litt. Hvis proben er over bilde senteret, må scenen roteres i den negative retningen. Hvis sonden er under midten, må scenen roteres med klokken. Angi en relativ compucentric rotasjon på 0,01 til 0,2 grader, avhengig av hvilken vei som er nødvendig for å justere proben.
  18. Gjenta trinn 2,16 til 2,17 så mange ganger som nødvendig til kanten av sonden skulderen er perfekt på linje med X-aksen på scenen, (kanten forblir i midten av liten LØGN mens du beveger deg til venstre).
  19. Bruke liten LØGN, flytte scenen tilbake til den nedre skulder av sonden. Lagre scene posisjonen i stillings listen ved å klikke på Legg til -knappen. Endre LØGN stråle strøm til 2,5 nA og sørge for at forstørrelsen av liten LØGN er fortsatt 5000x. Kjør automatisk lysstyrke kontrast funksjon og angi LØGN boksen dvele tid til 100 NS.
  20. Trykk på pauseknappen for å starte skanningen. Juster LØGN fokus og astigmatisme, så raskt og presist som mulig, ved hjelp av grov og fin fokus knotter, og X og Y stigmator knotter på MUI-panelet. Trykk på pauseknappen for å stoppe LØGN skanning.

3. skrive en automatisert prosess for etsing

  1. Start programvaren ved å finne den i Windows Start-menyen (dvs. Start\Programs\FEI Company\Applications\Nanobuilder). Plasser programvare vinduet på side skjermen slik at BRUKERGRENSESNITTET ikke dekkes. Åpne filen for mønster av silisium-sonder ved å klikke på fil og deretter Åpne. Direkte Windows-nettleseren til plasseringen av programvaren script (supplerende fil 1 -filnavnet er "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime. jbj").
  2. Velg rullegardinmenyen for mikroskopet i programvaren, og velg Angi etappe opprinnelse. Velg rullegardinmenyen for mikroskopet i programvaren, og velg deretter Kalibrer detektorer.
  3. På mikroskop GRENSESNITTET klikker du i Quad 1 én gang med musen for å velge Quad 1. Ignorer de andre instruksjonene som vises i popup-vinduet, de er ikke nødvendige for dette prosjektet. Klikk OK for å starte kalibreringen. Prosessen vil ta ca 5 min. Sørg for at ETD-og ICE-detektoren kalibrerer. Det er OK hvis noen andre detektorer har Kalibreringsfeil.
  4. I programvaren velger du rullegardinmenyen for mikroskopet og velger Utfør for å starte mønster sekvensen. Når mønsteret er fullført, lukker du programvaren.
    Merk: programvaren vil ta over Quad 3 og 4 for mønsteret og justering funksjoner. Manuskriptet ville ta ca 12 h å løpe. Når skriptet kjører, må du ikke endre noen parameter på mikroskopet.
  5. Hit "vent" i mikroskopet UI strålen kontroll-kategorien for å slå av mikroskop bjelker og starte ventilen syklus. Mens kammeret er venting, flytte scenen til koordinater X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. Når kammeret er ventilert, ta på ren nitril hansker og trekke åpne kammer døren.
  6. Løsne festeskruen på stub-adapteren med 1,5 mm nøkkel. Fjern aluminiums stub som inneholder mønstret sonde fra kammeret. Lukk mikroskop kammer døren nøye. Se bilde av CCD-kameraet i kvadrant 4 mens du lukker døren. Kontroller at fase adapteren er en trygg avstand fra alle kritiske komponenter i mikroskop kammeret.
  7. Velg pil ned ved siden av pumpe knappen i kategorien stråle kontroll. Velg pumpe knapp for å starte kammer vakuumpumpen. Pass på at døren er forseglet ved forsiktig å skyve på forsiden av døren mens pumpen er i gang.
    Merk: en vakuum forsegling kan bekreftes ved å trekke forsiktig i kammer døren, som skal forbli lukket hvis systemet er under vakuum. Pumpe tiden vil være ca 5 min. Bare én side av proben kan være etset under en enkelt løpetur.
  8. Hvis fremre og bakre side av sonden krever etsing, deretter forsiktig fjerne etset stripe av silisium sonder etter å ha sjekket den endelige etch og Imaging forsiden (Hvis bildene er nødvendig). Oppløse sølvet maling med aceton, ved forsiktig dabbing/børsting av aceton på sølv maling. Vend forsiktig stripen rundt til baksiden, re-montere, justere og etse følge trinnene som er beskrevet ovenfor.

4. kontroll av Final etch og Imaging

  1. Når fresing er fullført verifisere ensartethet av de ulike delene ved hjelp av SEM Imaging på et høyere forstørrelse.
    Merk: Imaging ved skrå vinkel gir en bedre vurdering av variasjonen i malings dybden. Spesiell oppmerksomhet bør gis til overgangen regionene mellom fresing steder.
  2. Bilde prøvene igjen etter fresing med et optisk mikroskop.
    Merk: de periodiske valset linjene resulterer i en brytnings effekt som gir opphav til forskjellige farger som en funksjon av bildevinkelen. Hvis fargen ikke er sammenhengende sammen med sonden som er en klar indikasjon på avbrudd i de valset linjer.

5. montere en funksjonell Silicon probe for LØGN etsing

  1. Fjern den funksjonelle silisium elektroden forsiktig fra emballasjen. Bruk tang for å nøye løfte plast beskyttende kategorien som dekker hodet scenen. Start å løfte et hjørne av tappen opp fra klebrig lim som holder den på plass og holde løfte til hele elektroden er fjernet.
  2. Klem forsiktig elektroden med hemostats for å klargjøre for montering i stereotaxic ramme. Mens du holder den dekkede kategorien med tang, forsiktig plassere buede hemostats rundt den grønne skaftet over silisium skaft, med den buede delen av hemostats vendt oppover mot kategorien. lås hemostats på plass for å sikre at elektroden ikke vil falle ut av hemostats.
  3. Fjern forsiktig plasten beskyttende kategorien som dekker hodet scenen. Mens du holder elektroden med hemostats, klem forsiktig elektroden inn i stereotaxic ramme for rengjøring.
  4. Fyll 3 Petri retter med 95% etanol (~ 10 mL per Petri parabol). Plasser Petri parabolen under elektroden som er montert i stereotaxic ramme for rengjøring. Senk langsomt elektroden ved å dreie micromanipulator nedover (100 μm/s) slik at skaftet er nedsenket i 95% etanol.
    Merk: Vær forsiktig så du ikke vrir micromanipulator for fort eller for dypt, dette kan føre til at elektroden brytes (det vil si at elektroden ikke bør berøre Petri parabolen).
  5. La elektrode skaftet stå i 95% etanol i 5 min, og løft elektroden langsomt ut av 95% etanol ved å dreie micromanipulator oppover (100 μm/s). Gjenta dette trinnet to ganger til, til sammen tre vasker. La elektroden lufttørke i fem minutter.
  6. Bruk samme teknikk for montering av elektroden i stereotaxic ramme, for å fjerne elektroden fra stereotaxic ramme. Plasser hemostats forsiktig rundt akselen på elektroden. Når hemostats er foldet stramt, slipper elektroden fra stereotaxic ramme, returnere plast beskyttende kategorien som dekker hodet scenen, og sette den rengjøres elektroden tilbake i emballasjen.

6. etsing funksjonell silisium probe bruke LØGN

  1. Monter den rengjort funksjonelle silisium elektroden på en aluminiums stativ. Ta forsiktig opp den rene funksjonelle silisium elektroden ved hjelp av pinsett og fjern den beskyttende fliken fra headstage. Plasser elektrode skaftet på aluminium stub slik at den ikke henger over noen kant, deretter ved hjelp av et lite stykke Cu eller karbon ledende tape, PIN headstage sikkert til aluminium stub.
    Merk: du kan også bruke en lavprofils klips holder til å holde elektroden nede. Pass på at elektrode skaftet ikke berøres.
  2. Følg trinnene som er beskrevet ovenfor (avsnitt 2), plasser elektroden på eucentric høyde og sørg for at elektroden er på sammentreff punktet av SEM og liten LØGN bjelker. Juster skaftet med "X" retning av scenen.
  3. Sett liten LØGN til den optimale strøm for fresing de nødvendige nano-arkitektur og sørge for at fokus og stigmation er riktig korrigert. Forbered en rekke linjer med ønsket avstand og lengde for å dekke synsfeltet til skaftet (500 μm seksjoner). Juster linjelengder som etsing kommer ned skaftet til tynnere seksjoner.
    Merk: Når du etsing den funksjonelle elektroden, er det ikke mulig å legge til fiducial merker for å automatisere prosessen. Derfor, flytte mellom sub-seksjoner (~ 500 μm) gjøres manuelt.
  4. Etter at fresing av den første delen er fullført, må du kontrollere malings kvaliteten før du går videre til neste del. Gjenta trinn 6,3 for å etse neste del av skaftet. Juster de valset linjene fra forrige avsnitt til mønstrene som brukes i neste del, for å forhindre store mellomrom mellom kjøringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Liten LØGN etset nano-arkitektur på overflater av single skaft Intracortical sonder
Utnytte metodene som er beskrevet her, intracortical sonder ble etset med spesifikke nano-arkitekturer følgende etablerte protokoller39. Dimensjoner og form av nano-arkitektur design beskrevet i disse metodene ble gjennomført fra tidligere in vitro resultater som viser en nedgang i gliacellene celle reaktivitet når kultivert med Nano-arkitektur design beskrevet her37,38. Metodene som er beskrevet her benyttet en fokusert Gallium ion Beam (liten LØGN) til etch nanoskala parallelle riller inn i overflaten av ikke-funksjonell enkelt skaft silisium microelectrode sonder, som tidligere beskrevet39. De nanoskala parallelle sporene ble etset langs skaftet på baksiden av sonden ved hjelp av et automatisert skript skrevet i programvaren. De endelige dimensjonene av etset nano-arkitekturen var 200 NM brede parallelle linjer, linjeavstand 300 NM fra hverandre, og hadde en dybde på 200 NM (figur 1). Bruk av liten LØGN for å etse nano-arkitekturer inn i en enhet overflate gjør det mulig for etsing av presise design i produserte enheter.

Etset nano-arkitektur i Intracortical sonder effekt på Nevroinflammasjon
I dette tidligere rapporterte data, ble intracortical sonder med etset nano-arkitekturer implantert i cortex på rotter for enten to eller fire uker (n = 4 per gang punkt) og sammenlignet med kontroll dyr implantert med glatte sonder inneholder ingen nano-arkitektur etsninger (n = 4 per gang punkt)39. En av mekanismene for svikt hindrer den kliniske distribusjonen av intracortical microelectrodes er neuroinflammatory respons indusert fra å forstyrre hjernen parenchyma og Blood Brain Barrier9,10,11,12,15. En fullstendig beskrivelse av neuroinflammatory respons observert etter intracortical microelectrode implantation finnes i følgende vurderinger13,14,22. Evnen til å intracortical microelectrodes til å registrere handling potensialer fra neurons er avhengig av avstanden til sunne neuronal organer fra intracortical microelectrode innspillingen nettstedet40. Derfor, den tidligere rapporterte studien evaluerte nevroinflammasjon rundt intracortical sonde implantation området ved kvantifisere histologiske markører for neuronal tetthet, gliacellene celle aktivering og genuttrykk for proinflammatoriske markører39. Høydepunkter fra at studien er presentert nedenfor for å representere virkningene etsing nano-arkitekturer inn i sonden overflaten hadde på nevroinflammasjon.

Effekter av etset nano-arkitektur på Nevron Density
For å finne ut hvordan etsing nano-arkitekturer inn i sonden overflate effekter neuronal tetthet umiddelbart rundt implantatet, neuronal kjerner ble beiset og kvantifisert utnytte tidligere beskriver immunhistokjemi metoder39,41. Det var ingen vesentlige forskjeller i Nevron tettheten rundt nano-arkitektur og kontroll sonder på 2 uker etter implantation (figur 2A). Men det var betydelig mer neurons rundt nano-arkitektur sonder på 100-150 μm avstand fra implantatet området i forhold til den glatte kontroll implantater (p < 0,05 vs kontroller) (figur 2B) ved 4 uker etter implantation. Det ble også funnet at det var en økt trend med neuronal tetthet rundt nano-arkitektur sonder over tid, kontrasterende den reduserte trenden med neuronal tetthet rundt kontroll implantater (figur 2). Det er et direkte forhold som viser et dempet neuroinflammatory respons kombinert med en høyere tetthet av levedyktige neurons rundt microelectrode, resulterer i en økt evne til microelectrode å gi kvalitet innspillinger15,40,42. Derfor, når tolke neuronal tetthet data, en høyere tetthet av neurons rundt implantatet nettstedet kan indikere en minsket neuroinflammatory respons og potensielt bedre opptakskvalitet og stabilitet fra intracortical microelectrodes.

Effekter av etset nano-arkitektur på Neuroinflammatory Molecular markører
Histologi er nok for å identifisere cellene rundt et implantat nettsted; imidlertid mangler den følsomhet og spesifisitet for karakteriserer fenotype av de omkringliggende cellene. Derfor metoder utnytte kvantitative genuttrykk analyse ble brukt til å kvantifisere den relative genuttrykk for neuroinflammatory markører, for å forstå effekten nano-arkitekturen har på fenotype av cellene39. Flere neuroinflammatory markører ble undersøkt i den tidligere rapporterte studien. Her bare to vil bli uthevet som er spesifikke for mikroglia celler, for å diskutere hvordan deres fenotype kan ha blitt endret. Den klynge av differensiering 14 (CD14) er et mønster anerkjennelse reseptor på membranen av mikroglia som gjenkjenner bakterier og signaliserer den inflammatoriske stien etter skade/implantation43,44,45. Nitrogenoksid syntase (NOS2), er et oksidativt stress markør uttrykt i mikroglia/makrofager som er forbundet med en økt produksjon av proinflammatoriske markører46,47.

I tidligere rapporterte data var det ingen vesentlige forskjeller mellom CD14 relative genuttrykk mellom nano-arkitekturen og kontroll implantater ved enten to-eller fire ukers etter implantat. Spesielt var det en betydelig nedgang (p < 0,05) av CD14 relative genuttrykk fra to til fire uker rundt nano-arkitektur implantater ' nettsted, noe som indikerer en mulig reduksjon i betennelse (betegnet av * i Figur 3a). Tilsvarende var ingen vesentlige forskjeller i NOS2 relative genuttrykk mellom nano-arkitektur og kontroll implantater på to uker. Det var imidlertid signifikant mindre (p < 0,05) NOS2 relative genuttrykk rundt nano-arkitektur implantatet i forhold til kontroll implantatet på fire uker etter implantation (betegnet av # i Figur 3B). Videre var det en betydelig økning fra 2 til 4 uker med NOS2 relative genuttrykk rundt kontroll implantater (betegnet av * i Figur 3B), og ingen forskjeller observert rundt nano-arkitektur implantater over tid, ytterligere indikerer en potensiell reduksjon av betennelse rundt nano-arkitektur implantater. Når du tolker disse dataene, er det viktig å forstå funksjonen av genet som kvantifisert. For eksempel, reduksjon av Pro-inflammatoriske gener indikerer en sannsynlig reduksjon i inflammatorisk respons rundt elektroden området, mens en økning i disse typer gener antyder en sannsynlig økning i betennelse.

Liten LØGN etset nano-arkitektur på overflater av funksjonell enkelt skaft Microelectrodes
Den tidligere rapporterte studien hadde lovende resultater demonstrere en svak økning av Nevron tetthet og den potensielle nedgangen i mikroglia inflammatorisk fenotype rundt nano-arkitektur sonde implantat området. For å undersøke oversettelsen av disse resultatene til elektrode funksjonalitet, en funksjonell enkelt skaft silisium microelectrode ble etset med samme nano-arkitektur design som den ikke-funksjonelle enkelt skaft silisium microelectrode sonder, utnytte en lignende LØGN-etsing-protokoll. Den eneste forskjellen i metodikken for etsing den angitte nano-arkitekturen var at protokollen for de funksjonelle elektrodene ikke kunne automatiseres, da det ikke fantes noe ekstra substrat materiale for å skape fiducial markeringer. Dermed ble den funksjonelle elektroden manuelt etset ved hjelp av LØGN ved å re-samkjøre strålen hver 500 μm, som beskrevet i protokollen ovenfor. Den endelige etsninger var 200 NM brede parallelle linjer, linjeavstand 300 NM fra hverandre, og hadde en dybde på 200 NM (Figur 4).

Effekter av etset nano-arkitektur i Intracortical Microelectrodes på elektrofysiologi
Vellykket intracortical microelectrode innspillinger er avhengig av nærhet av neurons rundt implantatet nettsteder, integriteten til enheten og pålitelig overføring av enkelt enhet aktivitet fra hjernen8,40,48,49. Elektrofysiologisk innspillinger ble kvantifisert utnytte registrerte beregninger samlet to ganger per uke over åtte uker. Beregningene benyttet i denne studien var, prosentandelen av kanaler innspilling enkeltenheter, maksimal amplituder av innspilte enheter, og signal-til-støy-forhold (SNR). Den institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUC) ved Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center godkjent alle dyr prosedyrer. Sprague Dawley rotter (8-10 uker gammel og veier ~ 225 g) ble implantert med enkelt skaft silisium microelectrode, med den ovenfor nevnte nano-arkitekturen (n = 1) eller glatte kontroller (n = 6). Ingen statistisk analyse ble utført på disse dataene, som det var en nano-arkitektur microelectrode implantert for en proof-of-Concept pilotstudie. Likevel, kollektive elektrofysiologisk resultater viser en økt prosentandel av kanaler opptak enkeltenheter(figur 5A), maksimal amplituder (figur 5B) av innspilte enheter, og SNR (figur 5C) fra nano-arkitektur microelectrodes forhold til den glatte kontroll microelectrodes, er lovende. Disse resultatene tyder på at etsing av nano-arkitekturen inn i overflaten av microelectrodes kan potensielt føre til bedre kvalitet og økt levetid på elektrofysiologisk innspillinger. Ytterligere evaluering med økt utvalgsstørrelse er nødvendig for å verifisere disse foreløpige funnene.

Figure 1
Figur 1: løgn etset nano-arkitektur på overflater av single skaft Intracortical sonder. SEM bilder av den ikke-funksjonelle enkelt skaft silisium sonder med LØGN etset nano-arkitekturer langs baksiden av skaftet. (A) sammensatte bilder av hele sonden etter etsing vist ved 120x forstørrelse, Scale bar = 400 μm. Den fiducial merker, (firkantet boks med et + symbol går gjennom det), er etset langs silisium underlaget rundt sonden. Forstørrede SEM-bilder av sonde spissen vises i (B) ved 1, 056x forstørrelse (Scale bar = 40 μm), (C) ved 3, 500x forstørrelse (Scale bar = 10 μm), og (D) ved 10, 000x forstørrelse, Scale bar = 4 μm. Dette tallet er endret fra referanse39. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: effekter av etset nano-arkitektur på Nevron Density. Neuronal overlevelse er presentert som en prosentandel av bakgrunnen regionen fra de samme dyrene i avstander på 50 μm binger bort fra implantatet området. (A) det ble ikke observert vesentlige forskjeller i neuronal overlevelse mellom de glatte overflatene (kontroll) og nanopatterned implantater på 2 uker etter implantation. (B) det var en signifikant høyere neuronal overlevelse rundt de nanopatterned implantater på 100-150 μm avstand sammenlignet med glatte overflater (p < 0,05) ved 4 uker etter implantation. Representative bilder av neurons (farget grønn), med den gule omrisset som skildrer implantation området, og "P" betegner den etset siden av microelectrode, Scale bar = 100 μm. Dette tallet er endret fra39. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: effekter av etset nano-arkitektur på Neuroinflammatory Molecular markører. Tissue ble samlet inn rundt 500 μm radius av implantation stedet for både nanopatterned og kontroll implantater. Relativ genuttrykk for inflammatoriske markører var kvantitativt sammenlignet mellom begge implantat typer (forskjellene er merket med # på grafen; p < 0,05) så vel som over tid (forskjellene er betegnet av * på grafen; p < 0,05). (A) relative genuttrykk for CD14 signifikant redusert rundt nanopatterned implantater fra to til fire uker (*). (B) det var en betydelig mindre relative genuttrykk for NOS2 rundt nanopattern implantat i forhold til kontroll på fire uker (#) og det var en betydelig økning på NOS2 fra to til fire uker rundt glatte kontroll implantater (*). Dette tallet er endret fra referanse39. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: løgn etset nano-arkitektur på overflater av funksjonell enkelt skaft Microelectrodes. Den innfelte i øvre høyre hjørne viser microelectrode benyttet i denne studien ved siden av en krone for å skildre størrelsen på elektrode skaftet (tynn svart linje). SEM bilder av microelectrodes skaft med liten LØGN etset nano-arkitekturer langs baksiden av skaftet. Hele skaftet er vist øverst på 600x forstørrelse (Scale bar = 50 μm), mens innfelt viser nanopatterned overflaten ved 25, 000x forstørrelse, Scale bar = 1 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: effekter av etset nano-arkitektur i Intracortical Microelectrodes på elektrofysiologi. Evaluering av elektrofysiologisk beregninger oppdaget en lovende foreløpig økt trend av (a) prosentandel av kanaler opptak enkeltenheter, (B) maksimal amplituder av innspilte enheter, og (C) signal-til-støy-forhold fra microelectrode etset med Nano-arkitekturer i forhold til de glatte kontroll elektrodene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: elektrofysiologi opptak fra implantert funksjonell enkelt skaft Microelectrodes med løgn etset nano-arkitekturer. En av utfordringene ved å bruke liten LØGN til etch nano-arkitekturer på produsert microelectrode enheter er risikoen for kortslutning opptak kontakter. X-aksen viser Innspillingstiden i sekunder, og y-aksen angir neuronal tiltak for elektrode kanalene. Hver nummererte linje på y-aksen representerer en annen elektrode kanal, der kanalnummer 1 er grunneste og 16 er den dypeste. De røde boksene beskriver de kortsluttet kanalene, mens de blå boksene skisserer kanaler med synlig neuronal aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den fabrikasjon protokollen skissert her utnytter fokusert ion Beam litografi til effektivt og reproduserbar etch nano-arkitekturer inn i overflaten av ikke-funksjonell og funksjonell enkelt skaft silisium microelectrodes. Fokusert ion Beam (løgn) litografi gjør det mulig for selektiv ablasjon av underlaget overflaten ved hjelp av en fint fokusert ion Beam50,51. Liten løgn er en direkte-skrive teknikk som kan produsere ulike funksjoner med nanoskala oppløsning og høyt størrelsesforhold50,52,53. For å skape de ulike størrelse funksjoner, kan omfanget av ion Beam strømmen optimaliseres for å endre ion Beam spot størrelse innenfor et område på 3 NM til 2 μm50,51. Noen generelle fordelene ved å bruke løgn til etch funksjoner på overflater er: 1) den kan brukes på et bredt utvalg av materialer, inkludert silisium, metaller, og polymerer53,54,55,56, 2) liten løgn kan utføres på ikke-Planar overflater, og 3) løgn kan brukes til etterbehandling på individuelle enheter57.

Her ble LØGN brukt i kombinasjon med en SEM mikroskop og programvare som brukes til å skrive en spesialisert automatisert script for etsing bestemte funksjoner i ikke-funksjonell enkelt skaft sonder. Skriptet inkluderte parametere som kreves (2,5 nA ion Beam strøm og 30 kV spenning) til etch den nøyaktige avstanden ønsket (200 NM bredt parallelle grooves, linjeavstand 300 NM fra hverandre og 20 NM dyp). Dimensjonene av elektroden overskredet synsfeltet for liten LØGN, slik at mønsteret ble utført i flere trinn posisjoner. For å automatisere prosessen, fiducial merker ble etset inn i siden av silisium arket holder sonder på plass, slik at programvaren til å nøyaktig finne Mønstrede linjer på sonden skaftet. Fiducials var nødvendig fordi scenen bevegelse skapte en stor (~ 5 μm) usikkerhet i plasseringen av mønsteret området med hensyn til ion strålen synsfelt. Plassering av fiducials på silisium ark tillatt for liten LØGN å finne mønster områder uten direkte skanning strålen på sonden skaftet, som potensielt kan forurense eller skade sonden skaftet. Hele den automatiserte etsing prosessen for ett skaft tok cirka 12 timer å fullføre og krevde ingen operatør intervensjon etter at mønsteret ble startet. Kollektivt, fordelene ved å bruke LØGN til etch funksjoner i silisium sonde skaftet var evnen til å gjøre nanometer store funksjoner, automatisere etsing prosessen, og kapasiteten til etch på en fabrikkert sonde. Selv om liten LØGN har store fordeler, en av ulempene ved å bruke denne fabrikasjon metoden er treg gjennomstrømming rate som til slutt begrenser potensialet for masseproduksjon av enheter med Nano-arkitekturer i deres overflate58. Alternativt, andre fabrikasjon metoder benyttes til å lage funksjonen størrelser og geometri av interesse, kanskje raskere priser og på masse produksjoner, inkluderer elektronstråle litografi og nanoimprint litografi59,60,61,62,63,64,65. Men disse metodene ikke tillater for etsing av nano-arkitektur funksjoner i produserte enheter. Tradisjonelt disse metodene er benyttet under fabrikasjon prosessen på et ark med silisium eller polymer, som deretter kan brukes i nedstrøms behandling trinn for å dikte den endelige bedra.

De funksjonelle elektrodene var ikke i stand til å gjennomgå en automatisert prosess på grunn av ikke å ha noe omkringliggende materiale rundt elektrode skaftet der å inkludere fiducial merker i oppkjøringen. Derfor, de funksjonelle elektrodene ble manuelt justert og etset på 500 μm seksjoner langs skaftet, ved hjelp av samme ion strøm og spenning som den automatiserte kjøre for å sikre samme funksjon størrelser. Strålen måtte manuelt realigned etter å ha fullført hvert 500 μm intervall og satt opp til etch neste avsnitt. Prosessen med manuell omstilling av mønstrene hver 500 μm kan potensielt føre til skadede nanostrukturer eller strukturer som ikke samsvarer med den tiltenkte geometrien. Dette er på grunn av lengre eksponeringstider ion strålen behov for manuell justering66. Dette var en av vanskelighetene oppstått med manuell etsing. På grunn av denne komplikasjon var to opptaks kontakter kortsluttet og klarte ikke å spille inn neuronal tiltak (figur 6). Figur 6 demonstrerer et elektrofysiologisk Live opptaks segment fra dyret implantert med Nano-arkitektur elektroden. De blå boksene skissere kanaler opptak sterke handling potensialer, i forhold til de røde boksene som viser de to døde kanaler. Derfor, en av utfordringene ved å bruke manuelle liten LØGN etsing på post-produserte elektroder er at det er en sjanse for at strålen kan kortslutning kontakter og hindre dem fra innspillingen. Denne utfordringen er forbedret når du forsøker å etse forsiden av enkelt skaft silisium elektroder, der innspillingen kontakter og spor er langs hele skaftet av elektroden. Selv om det er mulig å etse silisium rundt innspillingen kontakter og spor, er ekstra forsiktighet anbefales for å unngå skade og redusert ytelse av innspillingen evner av elektroden.

Som tidligere nevnt, kan LØGN utnyttes på ulike materialer for å etse mange funksjon geometri inn i overflaten. Det er imidlertid viktig å merke seg at parametrene for å etse geometri, for eksempel linjer i de ulike materialene, er kompliserte å forutsi. Spesielt for linjemønstre, linjen bredde og dybde er sterkt avhengig av mange parametre som akselererende spenning, stråle strøm, botid, pikselavstand, levetid av blenderåpning og materialtype. En annen parameter som er et resultat av optimaliseringen, er total tid til å Mill hver linje. Smalere og dypere linjer kan oppnås ved hjelp av mindre stråle strømmer; Men mønsteret tid for en hel sonde skaftet ville forlenge til flere dager, noe som ikke er praktisk. Derfor, selv om det er mulig å optimalisere protokollen som presenteres her, ville det være overmåte vanskelig å beskrive parametrene for ukjente materialer. I feilsøking parametrene for silisium sonder beskrevet i denne protokollen, mange test kutt i silisium ble gjort for å evaluere hvordan endrede forhold påvirket linjen bredde og dybder. Så snart de evaluerte forholdene var i stand til å etse den spesifikke funksjonen størrelse og geometri av interesse (200 NM brede linjer som var 200 NM dyp), disse parametrene ble brukt til å skrive programvare skriptet. Skriptet ble brukt til å kontrollere avstanden mellom hver linje, fra sentrum til sentrum, som i denne protokollen er 300 NM. Fremtidige studier som bruker silisium underlag/enheter som krever funksjons størrelser i hundrevis av nanometer, kan bruke parametrene som er beskrevet i denne protokollen som et utgangspunkt for feilsøking av betingelsene som trengs for å skape de ønskede funksjons størrelsene. Ytterligere optimalisering og feilsøking av etsing forholdene vil være nødvendig for metall og polymer underlag/enheter. Overall, utnytte liten LØGN for etsing nano-arkitekturer i materielle overflater gir god kontroll og fleksibilitet i funksjon geometri, bruk av mange kompatible materialer, og flere overflate typer, inkludert produserte enheter. Representative resultater presentert her demonstrerte de potensielle fordelene observert i våre studier av å utnytte LØGN til etch nano-arkitekturer inn i overflaten av intracortical microelectrodes: 1) økt neuronal tetthet og 2) reduksjon av neuroinflammatory markører rundt implantert enheter med Nano-arkitekturer, samt 3) foreløpige funn som viser forbedret kvalitet på elektrofysiologisk innspillinger over tid. Likeledes kan Sysselsetting og optimalisering av de beskrevne protokollen etsing nano-arkitektur funksjoner inn i overflaten av et materiale utnyttes til å forbedre funksjonaliteten til mange medisinske enheter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av USA (US) Department of Veterans Affairs rehabilitering forskning og utvikling service Awards: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) og #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). Innholdet representerer ikke synspunktene til US Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA. Forfatterne vil gjerne takke FEI co (nå en del av Thermofisher Scientific) for personalet assistanse og bruk av instrumentering, som hjalp til med å utvikle skriptene som brukes i denne forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16-Channel ZIF-Clip Headstage Tucker Davis Technologies ZC16 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrapped Thomas Scientific 1213F04 Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder Tucker Davis Technologies Z-ROD32 The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml Ted Pella 16023 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter Hemostat Fine Science Tools 13013-14 Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double Coated Ted Pella 16084-7 The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well Sigma Aldrich CLS3736-100EA Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11251-30 Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs Fisher Scientific 22-032-600 Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell Strainer Fisher Scientific 08-771-1 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm Ted Pella 16148 Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll Fisher Scientific 01-213-101 Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes Fisher Scientific 02-617-149 Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrode NeuroNexus A1x16-3mm-100-177 http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holder KOPF Model 1772 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument KOPF Model 900-U Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly KOPF Model 960 Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') Ted Pella 807-5 https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V Ted Pella 520-1-220 Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver Paint Ted Pella 16062 https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab Thermo Fisher Scientific Helios G2 650 This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salcman, M., Bak, M. J. A new chronic recording intracortical microelectrode. Medical and Biological Engineering. 14 (1), 42-50 (1976).
  2. Im, C., Seo, J. -M. A review of electrodes for the electrical brain signal recording. Biomedical Engineering Letters. 6 (3), 104-112 (2016).
  3. Donoghue, J. Bridging the Brain to the World: A Perspective on Neural Interface Systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
  4. Gilja, V., et al. Clinical translation of a high-performance neural prosthesis. Nature medicine. 21 (10), 1142-1145 (2015).
  5. Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17849-17854 (2004).
  6. Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping in a person with tetraplegia through brain-controlled muscle stimulation: a proof-of-concept demonstration. Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
  7. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  8. Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
  9. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
  10. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
  11. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
  12. Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neurosciences. 6 (1), 48-67 (2015).
  13. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
  14. Michelson, N. J., et al. Multi-scale, multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
  15. Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
  16. Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
  17. Ravikumar, M., et al. The Roles of Blood-derived Macrophages and Resident Microglia in the Neuroinflammatory Response to Implanted Intracortical Microelectrodes. Biomaterials. 0142 (35), 8049-8064 (2014).
  18. Hermann, J., Capadona, J. Understanding the Role of Innate Immunity in the Response to Intracortical Microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
  19. Ereifej, E. S., et al. Implantation of Intracortical Microelectrodes Elicits Oxidative Stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00009 (2018).
  20. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  21. Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
  22. Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862 (2017).
  23. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  24. Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
  25. Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 7 (3), 315-326 (1999).
  26. Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
  27. Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11 (5), 056014 (2014).
  28. Wei, X., et al. Nanofabricated Ultraflexible Electrode Arrays for High-Density Intracortical Recording. Advanced Science. , 1700625 (2018).
  29. Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
  30. Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
  31. Kim, Y., et al. Nano-Architectural Approaches for Improved Intracortical Interface Technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
  32. Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chemical Neurosciences. 1 (1), 36-48 (2010).
  33. Ding, H., Millet, L. J., Gillette, M. U., Popescu, G. Actin-driven cell dynamics probed by Fourier transform light scattering. Biomedical Optical Express. 1 (1), 260-267 (2010).
  34. Kotov, N. A., et al. Nanomaterials for Neural Interfaces. Advanced Materials. 21 (40), 3970-4004 (2009).
  35. Curtis, A. S., et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Trans Nanobioscience. 3 (1), 61-65 (2004).
  36. Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5 (1), 13406 (2011).
  37. Ereifej, E. S., et al. Nanopatterning effects on astrocyte reactivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (6), 1743-1757 (2013).
  38. Ereifej, E. S., Cheng, M. M. -C., Mao, G., VandeVord, P. J. Examining the inflammatory response to nanopatterned polydimethylsiloxane using organotypic brain slice methods. Journal of Neuroscience Methods. 217 (1-2), 17-25 (2013).
  39. Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
  40. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  41. Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
  42. Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
  43. Sladek, Z., Rysanek, D. Expression of macrophage CD14 receptor in the course of experimental inflammatory responses induced by lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. Veterinarni Medicina. 53 (7), 347-357 (2008).
  44. Janova, H., et al. CD14 is a key organizer of microglial responses to CNS infection and injury. Glia. , (2015).
  45. Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Ulevitch, R. J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today. 14 (3), 121-125 (1993).
  46. Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell Science. 117 (14), 2865-2867 (2004).
  47. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences. 75 (6), 639-653 (2004).
  48. Kozai, T. D., et al. Comprehensive chronic laminar single-unit, multi-unit, and local field potential recording performance with planar single shank electrode arrays. Journal of Neurosciences Methods. 242, 15-40 (2015).
  49. Kozai, T. D., et al. Mechanical failure modes of chronically implanted planar silicon-based neural probes for laminar recording. Biomaterials. 37, 25-39 (2015).
  50. Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. FIB-nanostructured surfaces and investigation of bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Transactions on Nanobioscience. 7 (1), 1-10 (2008).
  51. Lehrer, C., Frey, L., Petersen, S., Ryssel, H. Limitations of focused ion beam nanomachining. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures Processing, Measurement, and Phenomena. 19 (6), 2533-2538 (2001).
  52. Watkins, R., Rockett, P., Thoms, S., Clampitt, R., Syms, R. Focused ion beam milling. Vacuum. 36 (11-12), 961-967 (1986).
  53. Veerman, J., Otter, A., Kuipers, L., Van Hulst, N. High definition aperture probes for near-field optical microscopy fabricated by focused ion beam milling. Applied Physics Letters. 72 (24), 3115-3117 (1998).
  54. Lanyon, Y. H., Arrigan, D. W. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. Sensors and Actuators B: Chemical. 121 (1), 341-347 (2007).
  55. Menard, L. D., Ramsey, J. M. Fabrication of sub-5 nm nanochannels in insulating substrates using focused ion beam milling. Nano Letters. 11 (2), 512-517 (2010).
  56. Ziberi, B., Cornejo, M., Frost, F., Rauschenbach, B. Highly ordered nanopatterns on Ge and Si surfaces by ion beam sputtering. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (22), 224003 (2009).
  57. Reyntjens, S., Puers, R. A review of focused ion beam applications in microsystem technology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 11 (4), 287 (2001).
  58. Heyderman, L., David, C., Kläui, M., Vaz, C., Bland, J. Nanoscale ferromagnetic rings fabricated by electron-beam lithography. Journal of Applied Physics. 93 (12), 10011-10013 (2003).
  59. Baquedano, E., Martinez, R. V., Llorens, J. M., Postigo, P. A. Fabrication of Silicon Nanobelts and Nanopillars by Soft Lithography for Hydrophobic and Hydrophilic Photonic Surfaces. Nanomaterials. 7 (5), 109 (2017).
  60. Eom, H., et al. Nanotextured polymer substrate for flexible and mechanically robust metal electrodes by nanoimprint lithography. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (45), 25171-25179 (2015).
  61. Li, K., Morton, K., Veres, T., Cui, B. 5.11 Nanoimprint Lithography and Its Application in Tissue Engineering and Biosensing. Comprehensive Biotechnology. , 125-139 (2011).
  62. Dong, B., Zhong, D., Chi, L., Fuchs, H. Patterning of conducting polymers based on a random copolymer strategy: Toward the facile fabrication of nanosensors exclusively based on polymers. Advanced Materials. 17 (22), 2736-2741 (2005).
  63. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Wilkinson, C. D. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (4), 973-979 (2008).
  64. Tseng, A. A., Chen, K., Chen, C. D., Ma, K. J. Electron beam lithography in nanoscale fabrication: recent development. IEEE Transactions on Electronics Packaging Manufacturing. 26 (2), 141-149 (2003).
  65. Yang, Y., Leong, K. W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 478-495 (2010).
  66. Vermeij, T., Plancher, E., Tasan, C. Preventing damage and redeposition during focused ion beam milling: The "umbrella" method. Ultramicroscopy. 186, 35-41 (2018).

Tags

Bioteknologi fokusert ion Beam litografi intracortical microelectrodes Nano-arkitektur elektrofysiologi nevroinflammasjon biokompatibilitet
Fokusert ion Beam litografi å etse nano-arkitekturer i Microelectrodes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahajan, S., Sharkins, J. A.,… More

Mahajan, S., Sharkins, J. A., Hunter, A. H., Avishai, A., Ereifej, E. S. Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes. J. Vis. Exp. (155), e60004, doi:10.3791/60004 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter