Summary
We hebben aangetoond dat het etsen van nano-architectuur in intracorticale micro-elektrode-apparaten de ontstekingsreactie kan verminderen en de potentie heeft om elektrofysiologische opnames te verbeteren. De hierin beschreven methoden schetsen een benadering van etch nano-architecturen in het oppervlak van niet-functionele en functionele enkelvoudige schacht silicium intracorticale micro elektroden.
Abstract
Met de vooruitgang in elektronica en Fabricagetechnologie hebben intracorticale micro elektroden aanzienlijke verbeteringen ondergaan waardoor de productie van geavanceerde micro elektroden met een grotere resolutie en uitgebreide capaciteiten mogelijk is. De vooruitgang in de Fabricagetechnologie heeft de ontwikkeling van biomimetische elektroden, die tot doel hebben om naadloos te integreren in de hersen parenchym ondersteund, verminderen van de neuroinflammatoire respons waargenomen na elektrode inbrengen en verbeteren van de kwaliteit en levensduur van elektrofysiologische opnames. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van een biomimetische aanpak onlangs geclassificeerd als nano-architectuur. Het gebruik van gerichte Ion Beam lithografie (FIB) werd gebruikt in dit protocol om specifieke nano-architectuur kenmerken etch in het oppervlak van niet-functionele en functionele enkelvoudige schacht intracorticale micro elektroden. Het etsen van nano-architecturen in het elektrode oppervlak gaf mogelijke verbeteringen van biocompatibiliteit en functionaliteit van het geïmplanteerde apparaat aan. Een van de voordelen van het gebruik van FIB is de mogelijkheid om te etch op gefabriceerde apparaten, in tegenstelling tot tijdens de fabricage van het apparaat, het faciliteren van grenzeloze mogelijkheden om te wijzigen van talrijke medische apparaten na de productie. Het protocol dat hierin wordt gepresenteerd, kan worden geoptimaliseerd voor verschillende Materiaaltypen, nano-architectuur functies en soorten apparaten. Het uitbreiden van het oppervlak van geïmplanteerde medische hulpmiddelen kan de prestaties van het apparaat en de integratie in het weefsel te verbeteren.
Introduction
Intracorticale micro elektroden (IME) zijn invasieve elektroden die een middel bieden voor directe interfacing tussen externe apparaten en de neuronale populaties in de hersenschors1,2. Deze technologie is een waardevol hulpmiddel voor het opnemen van neurale actie potentialen ter verbetering van het vermogen van wetenschappers om neuronale functie te verkennen, vooraf begrip van neurologische ziekten en ontwikkelen van potentiële therapieën. Intracorticale micro-elektrode, gebruikt als een onderdeel van de Brain Machine Interface (BMI) systemen, maakt opname van actie potentialen van een individuele of kleine groepen van neuronen om motorische bedoelingen die kunnen worden gebruikt voor de productie van functionele uitgangen3detecteren. In feite zijn BMI-systemen met succes gebruikt voor prothetische en therapeutische doeleinden, zoals verworven sensorimotorische ritme beheersing om een computer cursor te bedienen bij patiënten met Amyotrofische laterale sclerose (als)4 en ruggenmerg blessures5 en het herstel van de beweging bij mensen die lijden aan chronische quadriplegie6.
Helaas, ime's vaak niet consistent opnemen in de tijd als gevolg van verschillende storings modi die mechanische, biologische en materiële factoren7,8bevatten. De neuroinflammatoire reactie die optreedt na de implantatie van de elektrode wordt beschouwd als een aanzienlijke uitdaging die bijdraagt aan het falen van de elektrode9,10,11,12,13,14. De neuroinflammatoire reactie wordt geïnitieerd tijdens de initiële inbrengen van de IME die de bloed-hersen barrière sijdeert, beschadigt de lokale hersen parenchym en verstoort gliacellen en neuronale netwerken15,16. Deze acute respons wordt gekenmerkt door de activering van gliacellen (Microglia/macrofagen en astrocyten), die pro-inflammatoire en neurotoxische moleculen vrijgeven rond de implantatieplaats17,18,19,20. De chronische activatie van gliacellen resulteert in een vreemde lichaams reactie die wordt gekenmerkt door de vorming van een gliacellen litteken dat de elektrode isoleert van gezond hersenweefsel7,9,12,13,17,21,22. Uiteindelijk, belemmeren van het vermogen van de elektrode om neuronale actie potentialen opnemen, als gevolg van de fysieke barrière tussen de elektrode en de neuronen en de degeneratie en de dood van neuronen23,24,25.
Het vroegtijdig falen van intracorticale micro elektroden heeft geleid tot een aanzienlijk onderzoek in de ontwikkeling van de volgende generatie elektroden, met de nadruk op biomimetische strategieën26,27,28,29,30. Van bijzonder belang voor het hier beschreven protocol, is het gebruik van nano-architectuur als een klasse van biomimetische oppervlakte veranderingen voor Ime's31. Er is vastgesteld dat oppervlakken die de architectuur van de natuurlijke in vivo omgeving nabootsen een verbeterde biocompatibele respons32,33,34,35,36hebben. Dus, de hypothese dwingende dit protocol is dat de discontinuïteit tussen de ruwe architectuur van het hersenweefsel en de gladde architectuur van de intracorticale micro elektroden kan bijdragen aan de neuroinflammatoire en chronische buitenlandse lichaam reactie op geïmplanteerde Ime's (voor een volledige beoordeling verwijzen naar Kim et al.31). We hebben eerder aangetoond dat het gebruik van nano-architectuur functies die vergelijkbaar zijn met de extracellulaire matrix architectuur van de hersenen, de ontstekingsmarkers van astrocyten uit cellen die zijn gekweekt op nano-gecultiveerde substraten vermindert, vergeleken met vlakke controle oppervlakken in zowel in vitro als ex vivo-modellen van neuro ontsteking37,38. Bovendien hebben we aangetoond dat de toepassing van gerichte ionen straal (FIB)-lithografie op etch-nano-architecturen rechtstreeks op silicium sondes resulteerde in significant verhoogde neuronale levensvatbaarheid en lagere expressie van pro-inflammatoire genen van dieren geïmplanteerd met de nano-architectuur probes in vergelijking met de soepele controlegroep26. Daarom is het doel van het hier gepresenteerde protocol om het gebruik van FIB-lithografie te beschrijven voor etch-nano-architecturen op gefabriceerde intracorticale micro elektrode-apparaten. Dit protocol is ontworpen om nano-architectuur formaat kenmerken te etsen in silicium oppervlakken van intracorticale micro-elektrode schachten die zowel geautomatiseerde als handmatige processen maken. Deze methoden zijn ongecompliceerd, reproduceerbaar en kunnen zeker worden geoptimaliseerd voor verschillende apparaatmaterialen en gewenste functie groottes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Voer de volgende stappen uit terwijl u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, zoals een Labcoat en handschoenen.
1. montage niet-functionele silicium sonde voor gerichte ionen straal (FIB) lithografie
Opmerking: voor de volledige procedure die de fabricage van de SOI wafer met de 1.000 sondes beschrijft, verwijzen wij u naar Ereifej et al.39.
- Isoleer een strook van 2-3 silicium sondes uit de silicium op isolator (SOI) wafer met 1.000 sondes. Maak geen strips die meer dan drie siliconen voelers bevatten. Dit kan de kans op losse montage vergroten en kan leiden tot een verkeerde uitlijning waardoor de FIB niet goed wordt geetst.
Opmerking: strips/sondes die niet stevig op de aluminium stub zitten kunnen twee complicaties veroorzaken: 1) wanneer het podium beweegt om aan de volgende sectie te werken, zullen er trillingen zijn en het frezen zal niet nauwkeurig zijn totdat de sonde zich vestigt en 2) het kan een hoge variatie veroorzaken en buiten het scherpstel vlak zijn.- Gebruik tijdens het dragen van handschoenen een fijne tang om druk rond de sondes te plaatsen om een klein gedeelte met twee tot drie voelers af te breken.
- Reinig voorzichtig de siliconen sonde van alle stof en vuil voorafgaand aan FIB etsen. Bereid een 6-piep polystyreen plaat voor door 3 mL/putjes van 95% ethanol in drie putten te pipetteren.
- Pak de snij strook siliconen voelers voorzichtig op met behulp van fijne punt-of vacuüm Tang en plaats deze in de celzeef. Plaats slechts één strook silicium sondes per zeef om te voorkomen dat de sondes breken. Plaats de zeef met de silicium sondes in de eerste put met 95% ethanol voor reiniging. Houd de zeef in de eerste put gedurende 5 min.
- Verplaats de zeef met de silicium sondes uit de eerste put en plaats deze in de tweede put met 95% ethanol voor nog eens 5 min. Herhaal opnieuw in de derde put.
- Plaats de zeef met de gereinigde silicium voelers op een polytetrafluorethyleen plaat aan de lucht drogen. Doe deze stap in een steriele capuchon om verontreiniging door stof te voorkomen.
- Plaats de Luchtgedroogde strook silicium sondes in een verzegelde container voor transport naar de SEM-FIB. Wikkel de zeef met de Luchtgedroogde monsters met een plastic of aluminiumfolie wrap voor transport en/of opslag om de reiniging te handhaven.
- Gebruik fijn getipt of vacuüm tang om de schone strook siliconen sondes zorgvuldig op te pikken en plaats ze op een schone aluminium stub (gebruikt voor SEM-FIB Imaging/etsen) ter voorbereiding op de montage.
- Gebruik een tandenstoker (of ander fijn getipt instrument als een dunne elektrische draad), om een kleine druppel (~ 10 μL) zilver verf op de rand van het silicium substraat rond de sondes te plaatsen. Zet de strook vast door de zilveren verf aan de zijkanten van het silicium substraat rond de sonde te spreiden. Laat de zilveren verf volledig drogen voordat u de aluminium stub in de SEM-FIB plaatst.
Let op: Wees voorzichtig niet te krijgen zilver verf op de schacht van de elektrode, want dat is het deel dat zal worden geëtst. Als de strook van sondes niet goed verankerd is aan de aluminium stub, kan de strook bewegen tijdens de verwerking of een ander brandpuntsvlak hebben, wat resulteert in onjuist frezen door de FIB. Verschillende strips van silicium sondes kunnen op dezelfde aluminium stub worden gemonteerd, zodat er voldoende ruimte is tussen de strips om het verwijderen van de stub na het etsen mogelijk te maken. Dit zal leiden tot efficiëntere etsen van meerdere probes met behulp van de geautomatiseerde functie die hieronder wordt beschreven.
2. de FIB op de silicium sondes uitlijnen
- Klik op de vent -knop in de Beam Control-Tab om de kamer te ventilen. Druk op SHIFT + F3 om de thuis fase uit te voeren. Bevestig de selectie door de knop Home stage te selecteren in het pop-upvenster.
Opmerking: het uitvoeren van de Home stage-bewerking is een preventieve stap om ervoor te zorgen dat de stage-as correct wordt gelezen door de software en de Microscoop verkeert in goede staat. - Nadat de thuis fase is voltooid, verplaatst u het werkgebied naar coördinaten X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. Zodra de kamer is geventileerd, zet u schone nitril handschoenen en opent u de kamer deur.
Opmerking: afhankelijk van de toepassing van de vorige gebruiker kan het nodig zijn om de stage adapter te wijzigen. De standaard podium adapters (bijv. FEI-stijl) kunnen worden verwijderd door de centrale bout linksom te schroeven en te installeren door rechtsom in de rotatie plaat van het werkgebied te schroeven. - Plaats de aluminium stub die de sondes in de bovenkant van de stage-adapter houdt. Bevestig de aluminium stub door de set-schroef aan de zijkant van de stage-adapter aan te spannen. Gebruik de 1,5 mm inbussleutel voor deze taak.
- Pas de hoogte van de stage-adapter aan door de adapter met de klok mee te draaien om deze te verlagen of linksom om deze te verhogen. Bevestig de stage adapter aan de rotatie plaat door de moer van de Vergrendel kegel rechtsom te draaien tot de moer stevig is tegen de fase rotatie plaat. Houd de stage adapter met de andere hand om de rotatie van de adapter en samples te voorkomen terwijl u de Vergrendel kegel moer aanscherpt.
Opmerking: gebruik de meegeleverde hoogtemeter om de juiste hoogte te bepalen. De bovenkant van de aluminium stub moet dezelfde hoogte zijn als de maximale lijn die op de hoogtemeter wordt weergegeven. Over het aandraaien van de kegel moer kan schade aan het podium en de adapter veroorzaken. Gebruik alleen voldoende kracht om de monsters te beveiligen. - Een afbeelding van een navigatie camera aanschaffen. Draai de arm van de navigatie camera voorzichtig open totdat deze stopt. De Microscoop fase wordt automatisch naar een positie onder de camera verplaatst. Bekijk de Live-afbeelding die wordt weergegeven in kwadrant 3 van de gebruikersinterface (UI) van de Microscoop.
- Zodra het helderheidsniveau automatisch op een passend niveau is aangepast, verkrijgt u de afbeelding door op de knop omlaag op de camera beugel te drukken. Zorg ervoor dat u wacht tot de volledige beeld verwerving is voltooid, wat wordt aangegeven door een pauze symbool in kwadrant 3 en de belichting van de camera wordt uitgeschakeld. Dit duurt ongeveer 10 s. Draai de camera arm terug naar de gesloten positie. Het podium keert terug naar de oorspronkelijke positie.
- Sluit de deur van de Microscoop kamer zorgvuldig. Bekijk het CCD-camerabeeld in kwadrant 4 terwijl u de deur sluit. Zorg ervoor dat de monsters en het podium op een veilige afstand van een kritische component in de Microscoop kamer liggen.
- Selecteer de pijl-omlaag naast de pomp knop op het tabblad Beam Control. Selecteer de pomp met de knop voor het schoonmaken van het monster in de ui-software om de kamer vacuümpomp te starten en ingebouwd in de plasma reiniger. Zorg ervoor dat de deur wordt verzegeld door zachtjes op het gezicht van de deur te duwen terwijl de pomp loopt. Wacht ongeveer 8 minuten voor de pomp tijd en de plasma reinigingscyclus voor de Microscoop kamer moet worden voltooid.
Opmerking: een vacuümafdichting kan worden bevestigd door zachtjes op de deur van de kamer te trekken, die gesloten moet blijven als het systeem onder vacuüm is. - Zodra het pictogram in de rechterbenedenhoek van de UI groen wordt, drukt u op de Wake-up knop in het Beam Control-tabblad, dat de elektron-en ionen stralen inschakelt. Selecteer kwadrant 1 en stel het straal signaal in op elektronenstraal (indien niet al ingesteld), stel kwadrant 2 in op Ion Beam (indien niet al ingesteld).
- Stel SEM spanning aan 5 kV, stel SEM Beam huidige 0,20 nA, stel SEM detector naar ETD, detector modus instellen op secundair elektron. Stel FIB-spanning in op 30 kV, stel FIB-straalstroom in op 24 pA, stel FIB-detector in op IJSDETECTOR, stel de detector modus in op het secundaire elektron.
- Dubbelklik op de silicium sonde in de afbeelding van de navigatie camera, kwadrant 3 om het podium naar de geschatte locatie van de sonde te verplaatsen. Klik op kwadrant 1 om het te selecteren als het actieve Kwadrant en druk op de pauze knop om SEM-scans te starten. Stel de tijd van de scan Dwell in op 300 NS en Schakel Scan interliniëring, lijn integratieen frame gemiddeldenuit. Stel scan rotatie in op 0 in het tabblad Beam Control en klik met de rechtermuisknop op de Beam Shift 2D-regelaar en selecteer nul.
- Stel de vergroting in op de minimumwaarde door de vergrotings knop linksom te draaien in het deelvenster MUI. Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan met de knoppen op het deelvenster MUI of het werkbalk pictogram automatische contrast helderheid .
- Verplaats het werkgebied door te dubbelklikken met de muis op een functie om deze te centreren of door het muiswiel te drukken en de muismodus van de joystick te activeren. Verplaats de gewenste silicium sonde om in het midden van het SEM-beeld te worden Gedessineerd.
- Zoek een rand of andere functies zoals een stofdeeltje of kras. Verhoog de vergroting tot 2.000 x door de vergrotings knop rechtsom te draaien. Pas de focus van de SEM aan door de grove en fijne focus knoppen op de MUI te draaien totdat de afbeelding scherp is. Zodra de afbeelding scherp is, selecteert u de koppeling sample Z naar werkafstand knop in de werkbalk.
- Bevestig dat de bewerking is voltooid door te kijken naar de Z-as coördinaat op het tabblad navigatie. De waarde moet ongeveer 11 mm zijn. type in 4,0 mm in de Z-as positie en duw de Ga naar knop met de muis of druk op de Enter-toets op het toetsenbord en het podium zal bewegen naar 4 mm werkafstand.
- Verplaats het werkgebied in X en Y om de schouder van de silicium sonde te lokaliseren. Positioneer het zo dicht mogelijk bij het midden van de SEM. Verander de stage Tilt naar 52 ° door te typen in "52" in de T-coördinaat en op ENTER te drukken. Kijk of de schouder van de sonde omhoog of omlaag in de afbeelding lijkt te bewegen. Gebruik de schuifregelaar stage Z om de schouder van de sonde terug te brengen naar het midden van het SEM-beeld. Pas de Z-positie aan, verplaats de X-, Y-, T-of R-as niet.
- Voer de ingebouwde "XT align-functie" commando uit in het vervolgkeuzemenu stage. Gebruik de muis om te klikken op twee punten evenwijdig aan de rand van de sonde. Zorg ervoor dat het horizontale keuzerondje is geselecteerd in het pop-upvenster en klik op Voltooien. De fase wordt gedraaid om de sonde uit te lijnen met de X-as van het werkgebied. Pas het werkgebied in X, Y met de muis om de onderste schouder van de sonde in het midden van de SEM-afbeelding opnieuw te plaatsen.
Opmerking: het eerste punt moet naar de greep van de sonde gaan en het tweede punt moet naar het punt van de sonde gaan. - Selecteer de FIB in kwadrant 2 en zorg ervoor dat de straalstroom nog steeds 24 pA is. Stel de vergroting in op 5, 000x en de dwelltijd tot 100 ns. Typ CTRL-F op het toetsenbord om de FIB-focus in te stellen op 13,0 mm. In het tabblad Beam Control, klik met de rechtermuisknop in de stigmator 2D-regelaar en selecteer nul en klik ook met de rechtermuisknop in de Beam Shift 2D-regelaar en selecteer nul. Stel de scan rotatie in op 0 ° en druk op de knop Autocontrast helderheid op de werkbalk.
- Zoek naar een afbeelding van de sonde schouder in kwadrant 2. Gebruik het gereedschap Momentopname om een afbeelding te verkrijgen met de FIB. Bevestig de sonde schouder is in het midden van het FIB beeld, zo niet, dubbelklik op de sonde schouder om het te verplaatsen naar het midden. Verplaats het werkgebied naar links door ongeveer 10-15 keer op de pijl naar links op het toetsenbord te drukken. Neem nog een momentopname en kijk of de sonde zich nog in het midden van de FIB bevindt.
Opmerking: zo niet, dan moet de fase rotatie licht worden aangepast. Als de sonde zich boven het afbeeldings centrum bevindt, moet het werkgebied in de negatieve richting worden gedraaid. Als de sonde zich onder het midden bevindt, moet het werkgebied met de klok mee worden gedraaid. Voer een relatieve compucentric rotatie van 0,01 tot 0,2 graden, afhankelijk van welke manier nodig is om de sonde uit te lijnen. - Herhaal de stappen 2,16 tot en met 2,17 zo vaak als nodig totdat de rand van de sonde schouder perfect is uitgelijnd met de X-as van het podium, (de rand blijft in het midden van de FIB terwijl u naar links beweegt).
- Met behulp van de FIB, verplaats het podium terug naar de onderste schouder van de sonde. Sla de positie van het werkgebied op in de lijst positie door op de knop toevoegen te klikken. Verander de FIB-straalstroom naar 2,5 nA en zorg ervoor dat de vergroting van de FIB nog steeds 5000x is. Voer de functie Automatische helderheid contrast uit en stel de tijd van de FIB-Dwell in op 100 ns.
- Druk op de pauze knop om het scannen te starten. Pas de FIB focus en astigmatisme zo snel en nauwkeurig mogelijk aan, met behulp van de grove en fijne focus knoppen, en de X en Y stigmator knoppen op het MUI panel. Druk op de pauze knop om het FIB-scannen te stoppen.
3. het schrijven van een geautomatiseerd proces voor etsen
- Start de software door deze te lokaliseren in het menu Start van Windows (dat wil zeggen, Start\Programs\FEI Company\Applications\Nanobuilder). Plaats het software venster op de zijmonitor zodat de GEBRUIKERSINTERFACE niet wordt bedekt. Open het bestand voor het patroon van de siliconen probes door te klikken op bestand en vervolgens openen. Direct de Windows-browser naar de locatie van de software script (aanvullende bestand 1 -de bestandsnaam is "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime. jbj").
- Selecteer in de software het dropdown-menu van de Microscoop en selecteer fase oorsprong instellen. Selecteer in de software het dropdown-menu van de Microscoop en selecteer Kalibreer detectoren.
- Klik op de GEBRUIKERSINTERFACE van de Microscoop in Quad 1 eenmaal met de muis om Quad 1 te selecteren. Negeer de andere instructies die in het pop-upvenster worden weergegeven, zijn ze niet nodig voor dit project. Klik op OK om de kalibratie te starten. Het proces duurt ongeveer 5 min. Zorg ervoor dat de ETD-en IJSDETECTOREN kalibreren. Het is OK als andere detectoren kalibratie fouten hebben.
- Selecteer in de software het dropdown-menu van de Microscoop en kies uitvoeren om de patroon volgorde te starten. Wanneer het patroon voltooid is, sluit u de software.
Opmerking: de software neemt Quad 3 en 4 over voor de patroon-en uitlijnings functies. Het script duurt ongeveer 12 uur om uit te voeren. Wijzig, terwijl het script wordt uitgevoerd, geen parameter op de Microscoop. - Druk op "vent" in het Microscoop UI Beam Control-tabblad om de Microscoop stralen af te sluiten en de ventilatie cyclus te starten. Terwijl de kamer ontvalt, verplaats het podium naar coördinaten X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0 °, R = 0 °. Zodra de kamer is geventileerd, zet u schone nitril handschoenen en trekt u de kamer deur open.
- Draai de stelschroef op de stub-adapter los met de 1,5 mm inbussleutel. Verwijder de aluminium stub met de patroon sonde uit de kamer. Sluit de deur van de Microscoop kamer zorgvuldig. Bekijk het CCD-camerabeeld in kwadrant 4 terwijl u de deur sluit. Zorg ervoor dat de stage adapter zich op een veilige afstand van een kritieke component in de Microscoop kamer bevindt.
- Selecteer de pijl-omlaag naast de pomp knop in het tabblad straal regeling. Selecteer de pomp knop om de vacuümpomp van de kamer te starten. Zorg ervoor dat de deur wordt verzegeld door zachtjes op het gezicht van de deur te duwen terwijl de pomp loopt.
Opmerking: een vacuümafdichting kan worden bevestigd door zachtjes op de deur van de kamer te trekken, die gesloten moet blijven als het systeem onder vacuüm is. De pomp tijd zal ongeveer 5 min. Slechts één kant van de sonde kan worden geëtst tijdens een enkele run. - Als de voor-en achterzijde van de sonde etsen vereist, verwijder dan voorzichtig de geëtste strook silicium sondes na het controleren van de uiteindelijke etch en Imaging de voorzijde (als afbeeldingen nodig zijn). Los de zilveren verf op met aceton, door het aceton voorzichtig te deppen/poetsen op de zilverkleurige verf. Draai de strook voorzichtig om de achterkant, monteer, lijn en etch volgens de hierboven beschreven stappen.
4. controle van de uiteindelijke etch en beeldvorming
- Nadat het frezen is voltooid, controleert u de uniformiteit van de verschillende secties met behulp van SEM-Imaging bij een hogere vergroting.
Opmerking: beeldvorming bij de gekantelde hoek maakt een betere beoordeling van de variatie in de freesdiepte mogelijk. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de overgangsgebieden tussen de frees locaties. - Beeld de monsters opnieuw na het frezen met een optische Microscoop.
Opmerking: de periodieke gefreesde lijnen resulteren in een brekings effect dat aanleiding geeft tot verschillende kleuren als functie van de beeldvormings hoek. Als de kleur niet continu samen met de sonde die een duidelijke indicatie van de verstoring in de gefreesde lijnen is.
5. montage van een functionele silicium sonde voor FIB etsen
- Verwijder voorzichtig de functionele silicium elektrode uit de verpakking. Gebruik de tang om voorzichtig het plastic beschermende lipje op het hoofdpodium te tillen. Begin met het optillen van een hoek van het lipje van de kleverige lijm die het op zijn plaats houdt en blijf optillen totdat de volledige elektrode is verwijderd.
- Klem de elektrode voorzichtig met hemostatica om zich voor te bereiden op de montage in het stereotaxic frame. Houd de beklede tab met de Tang, voorzichtig plaats gebogen hemostatica rond de groene schacht boven de silicium schacht, met het gebogen deel van de hemostatica naar boven gericht naar de tab. Vergrendel de hemostats op zijn plaats om ervoor te zorgen dat de elektrode niet uit de hemostatica.
- Verwijder voorzichtig het plastic beschermende lipje dat de hoofdfase bedekt. Houd de elektrode met de hemostatieven ingedrukt en knip de elektrode voorzichtig in het stereotaxsche frame voor reiniging.
- Vul 3 petrischaaltjes met 95% ethanol (~ 10 mL per Petri schaaltje). Plaats de Petri schaal onder de elektrode die in het stereotaxic frame is gemonteerd voor reiniging. Verlaag de elektrode langzaam door de micro manipulator naar beneden te draaien (100 μm/s) zodat de schacht wordt ondergedompeld in de 95% ethanol.
Opmerking: Let op dat u de micromanipulator niet te snel of te diep draait, dit kan ertoe leiden dat de elektrode breekt (d.w.z., de elektrode mag de Petri schaal niet aanraken). - Laat de elektrode schacht gedurende 5 minuten in de 95% ethanol en til de elektrode langzaam uit de 95% ethanol door de micro manipulator naar boven te draaien (100 μm/s). Herhaal deze stap nog twee keer, voor een totaal van drie washes. Laat de elektrode gedurende vijf minuten drogen.
- Gebruik dezelfde techniek voor het monteren van de elektrode in het stereotaxic frame, om de elektrode uit het stereotaxic frame te verwijderen. Plaats de hemostatica voorzichtig rond de as van de elektrode. Zodra de hemostatica strak vastzitten, laat u de elektrode los van het stereotaxic frame, stuurt u de plastic beschermingtab terug die de hoofdfase bedekt en zet u de gereinigde elektrode weer in de verpakking.
6. etsen functionele silicium sonde met behulp van FIB
- Monteer de gereinigde functionele silicium elektrode op een aluminium statief. Pak de gereinigde functionele silicium elektrode voorzichtig met behulp van de Tang en verwijder het beschermende lipje uit de hoofdfase. Plaats de elektrode schacht op de aluminium stub, zodat deze niet over een rand hangt, vervolgens met behulp van een klein stukje cu of carbon geleidende tape, de hoofdfase veilig aan de aluminium stub vastmaken.
Opmerking: als alternatief kan een laag-profiel clip houder worden gebruikt om de elektrode naar beneden te houden. Let op dat u de elektrode schacht niet aanraakt. - Volg de hierboven beschreven stappen (sectie 2), plaats de elektrode op de eucentrische hoogte en zorg ervoor dat de elektrode zich op het toeval-punt van de SEM-en FIB-stralen bevindt. Lijn de schacht uit met de "X"-richting van het podium.
- Stel de FIB in op de optimale stroom voor het frezen van de vereiste nano-architectuur en zorg ervoor dat de focus en stigmatie correct worden gecorrigeerd. Maak een reekslijnen met de gewenste afstand en lengte om het gezichtsveld van de schacht te bedekken (500 μm secties). Pas de lengte van de lijn aan terwijl etsen de schacht naar de dunnere secties haalt.
Opmerking: bij het etsen van de functionele elektrode is het niet mogelijk om fiducial Marks toe te voegen om het proces te automatiseren. Daarom wordt het verplaatsen tussen de sub-secties (~ 500 μm) handmatig gedaan. - Nadat het frezen van de eerste sectie is voltooid, controleert u de frees kwaliteit voordat u doorgaat naar het volgende gedeelte. Herhaal stap 6,3 om de volgende sectie van de schacht te etsen. Lijn de gefreesde lijnen uit de vorige sectie uit naar de patronen die worden gebruikt voor de volgende sectie om grote openingen tussen runs te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FIB geëtst nano-architectuur op de oppervlakken van enkelvoudige schacht Intracorticale sondes
Met behulp van de hier beschreven methoden, intracorticale sondes werden geëtst met specifieke nano-architecturen na vastgestelde protocollen39. Afmetingen en vorm van het Nano-architectuur ontwerp zoals beschreven in deze methoden werden uitgevoerd uit eerdere in vitro resultaten die een afname van de gliale celreactiviteit afbeelden bij de kweek met het ontwerp van de nano-architectuur zoals hier beschreven37,38. De hier beschreven methoden gebruikten een gefocuste gallium ionen straal (FIB) om nanoschaal parallelle groeven te etsen in het oppervlak van niet-functionele enkelvoudige schacht siliconen micro elektrode sondes, zoals eerder beschreven39. De nanoschaal parallelle groeven werden geëtst langs de schacht van de achterkant van de sonde met behulp van een geautomatiseerd script geschreven in de software. De uiteindelijke afmetingen van de geëtste nano-architectuur waren 200 nm brede parallelle lijnen, verdeelde 300 nm uit elkaar, en had een diepte van 200 nm (Figuur 1). Het gebruik van FIB om nano-architecturen in een apparaatoppervlak te etsen, maakt het mogelijk om precieze ontwerpen in gefabriceerde apparaten op te maken.
Geëtste nano-architectuur in Intracorticale sondes effect op neuro ontsteking
In deze eerder gerapporteerde gegevens werden de intracorticale sondes met geëtste nano-architecturen gedurende twee of vier weken in de cortex van ratten geïmplanteerd (n = 4 per tijdspunt) en vergeleken met controledieren die geïmplanteerd werden met gladde sondes die geen nano-architectuur etsen bevatten (n = 4 per tijdspunt)39. Een van de mechanismen van falen belemmeren de klinische inzet van intracorticale micro elektroden is de neuroinflammatoire reactie veroorzaakt door het verstoren van de hersenen parenchym en bloed-hersen barrière9,10,11,12,15. Een volledige beschrijving van de neuroinflammatoire reactie waargenomen na intracorticale micro elektrode implantatie kan worden gevonden in de volgende beoordelingen13,14,22. Het vermogen van intracorticale micro elektroden om actie potentialen van neuronen op te nemen is afhankelijk van de afstand van de gezonde neuronale lichamen van de intracorticale micro elektrode Recording site40. Daarom evalueerde de eerder gerapporteerde studie de neuro ontsteking rond de implantatieplaats van de intracorticale sonde door histologische markers te kwantificeren voor neuronale dichtheid, gliale celactivering en genexpressie van proinflammatoire markers39. Hoogtepunten uit die studie worden hieronder gepresenteerd om de effecten te vertegenwoordigen die nano-architecturen in het sonde oppervlak hadden op neuro ontsteking.
Effecten van geëtste nano-architectuur op neuron dichtheid
Om te bepalen hoe etsen nano-architecturen in het oppervlak van de sonde de neuronale dichtheid onmiddellijk rond het implantaat effect, de neuronale kernen werden gekleurd en gekwantificeerd met behulp van eerder beschrijven immunohistochemie methoden39,41. Er waren geen significante verschillen van neuron dichtheden rond de nano-architectuur en controle sondes bij 2 weken na implantatie (Figuur 2A). Echter, er waren significant meer neuronen rond de nano-architectuur probes op 100-150 μm afstand van de implantatieplaats in vergelijking met de soepele controle implantaten (p < 0,05 VS besturingselementen) (Figuur 2B) na 4 weken na de inplanting. Er werd ook geconstateerd dat er een toegenomen trend van neuronale dichtheid rond de nano-architectuur sondes na verloop van tijd, contrasterende de verminderde trend van neuronale dichtheid rond de controle implantaten (Figuur 2). Er is een directe relatie beeltenis van een gematigd neuroinflammatoire reactie in combinatie met een hogere dichtheid van levensvatbare neuronen rond de micro-elektrode, resulteert in een toegenomen vermogen voor de micro-elektrode om kwaliteits opnames te leveren15,40,42. Daarom, bij het interpreteren van neuronale dichtheids gegevens, een hogere dichtheid van neuronen rond de implantatieplaats kan duiden op een verminderde neuroinflammatoire respons en potentieel verbeterde opnamekwaliteit en stabiliteit van intracorticale micro elektroden.
Effecten van geëtste nano-architectuur op neuroinflammatoire moleculaire markers
Histologie is voldoende voor het identificeren van de cellen rond een implantaat plaats; echter, het mist de gevoeligheid en specificiteit voor het karakteriseren van het fenotype van de omringende cellen. Vandaar dat methoden met behulp van kwantitatieve genexpressie analyse werden gebruikt om de relatieve genexpressie van neuroinflammatoire markers te kwantificeren, om het effect te begrijpen dat Nano-architectuur heeft op het fenotype van de cellen39. Verschillende neuroinflammatoire markers werden onderzocht in de eerder gerapporteerde studie. Hier zullen slechts twee worden benadrukt die specifiek zijn voor Microglia-cellen, om te bespreken hoe hun fenotype kan zijn gewijzigd. Het cluster van differentiatie 14 (CD14) is een patroon herkennings receptor op het membraan van Microglia dat bacteriën herkent en de ontstekings route signaleert na letsel/implantatie43,44,45. Stikstofoxide synthase (NOS2), is een oxidatieve stress marker uitgedrukt in Microglia/macrofagen die wordt geassocieerd met een verhoogde productie van proinflammatoire markers46,47.
In de eerder gerapporteerde gegevens waren er geen significante verschillen tussen CD14 relatieve genexpressie tussen nano-architectuur en controle implantaten bij een na-implantatie van twee of vier weken. Met name was er een significante afname (p < 0,05) van CD14 relatieve genexpressie van twee tot vier weken rond de site van de nano-architectuur implantaten, wat duidt op een mogelijke afname van de ontsteking (aangeduid met * in Figuur 3a). Ook waren er geen significante verschillen tussen de NOS2 relatieve genexpressie tussen nano-architectuur en controle implantaten op twee weken. Er was echter significant minder (p < 0,05) NOS2 relatieve genexpressie rond het Nano-architectuur implantaat in vergelijking met het controle implantaat op vier weken na de implantatie (aangeduid met # in Figuur 3B). Bovendien was er een significante toename van 2 tot 4 weken NOS2 relatieve genexpressie rond de controle implantaten (aangeduid met * in Figuur 3B), en geen verschillen waargenomen rond de nano-architectuur implantaten na verloop van tijd, wat verder wijst op een potentiële afname van de ontsteking rond de nano-architectuur implantaten. Bij het interpreteren van deze gegevens is het belangrijk om de functie van het gekwantificeerde gen te begrijpen. Bijvoorbeeld, afname van pro-inflammatoire genen duiden op een waarschijnlijke afname van de ontstekingsreactie rond de elektrode plaats, terwijl een toename van dit soort genen suggereert een waarschijnlijke toename van de ontsteking.
FIB geëtste nano-architectuur op de oppervlakken van functionele enkelvoudige schacht Microelektroden
De eerder gerapporteerde studie had veelbelovende resultaten die een lichte toename van neuron dichtheid en de mogelijke afname van Microglia inflammatoire fenotype rond de nano-architectuur sonde implantaat site. Om de vertaling van deze resultaten naar elektrode-functionaliteit te onderzoeken, werd een functionele enkele schacht silicium-micro-elektrode geëtst met hetzelfde nano-architectuur ontwerp als de niet-functionele single Shank Silicon micro-elektrode sondes, gebruikmakend van een soortgelijk FIB-etsen protocol. Het enige verschil in de methodologie voor het etsen van de gespecificeerde nano-architectuur was dat het protocol voor de functionele elektroden niet kon worden geautomatiseerd, omdat er geen extra substraat materiaal was om fiducial-markeringen te maken. Zo werd de functionele elektrode handmatig geëtst met behulp van FIB door het opnieuw uitlijnen van de straal elke 500 μm, zoals beschreven in het bovenstaande protocol. De laatste etsen waren 200 nm brede parallelle lijnen, verdeelde 300 nm uit elkaar, en had een diepte van 200 nm (Figuur 4).
Effecten van geëtste nano-architectuur in Intracorticale micro elektroden op elektrofysiologie
Succesvolle intracorticale micro elektrode opnames zijn afhankelijk van de nabijheid van de neuronen rond de implantatieplaatsen, de integriteit van het apparaat en de betrouwbare overdracht van ééneenheids activiteit uit de hersenen8,40,48,49. Elektrofysiologische opnames werden gekwantificeerd met behulp van opgenomen metrische gegevens verzameld twee keer per week gedurende acht weken. De metrische gegevens die worden gebruikt in deze studie waren, het percentage van de kanalen opnemen van afzonderlijke eenheden, maximale amplitudes van opgenomen eenheden, en signaal-ruis verhouding (SRV). De institutionele Dierenzorg-en gebruiks comités (IACUC) van het Louis Stokes Cleveland Veterans Affairs Medical Center keurden alle dier procedures goed. Sprague Dawley ratten (8-10 weken oud en met een gewicht van ~ 225 g) werden geïmplanteerd met een enkele schacht silicium micro elektrode, met de bovengenoemde nano-architectuur (n = 1) of de gladde controles (n = 6). Er werd geen statistische analyse uitgevoerd op deze gegevens, omdat er één nano-architectuur-micro-elektrode werd geïmplanteerd voor een proof-of-concept pilot-studie. Niettemin, collectieve elektrofysiologische resultaten met een verhoogd percentage van de kanalen opnemen van enkele eenheden (Figuur 5A), maximale amplituden (Figuur 5B) van geregistreerde eenheden, en SNR (Figuur 5C) van de nano-architectuur micro elektroden in vergelijking met de soepele controle micro-elektroden, zijn veelbelovend. Deze resultaten geven aan dat het etsen van nano-architectuur in het oppervlak van micro-elektroden mogelijk kan resulteren in een betere kwaliteit en een langere levensduur van elektrofysiologische opnames. Verdere evaluatie met een verhoogde steekproefomvang is nodig om deze voorlopige bevindingen te controleren.
Figuur 1: FIB geëtst nano-architectuur op de oppervlakken van enkelvoudige schacht Intracorticale sondes. SEM-beelden van de niet-functionele enkelvoudige schacht silicium sondes met FIB geëtste nano-architecturen langs de achterzijde van de schacht. A) samengestelde beelden van de gehele sonde post etsen getoond bij 120x vergroting, schaalbalk = 400 μm. De fiducial Marks, (vierkante doos met een + symbool dat er doorheen gaat), zijn geëtst langs het silicium substraat rond de sonde. Vergrote SEM-afbeeldingen van de sondepunt worden weergegeven in (B) bij een vergroting van 1, 056x (schaalbalk = 40 μm), (C) bij een vergroting van 3, 500 x (schaalbalk = 10 μm) en (D) bij een vergroting van 10.000 x, schaalbalk = 4 μm. Dit cijfer is gewijzigd van referentie39. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: effecten van geëtste nano-architectuur op neuron dichtheid. Neuronale overleving wordt gepresenteerd als een percentage van de achtergrond regio van dezelfde dieren in afstanden van 50 μm bakken uit de buurt van de implantatieplaats. A) er werden geen significante verschillen van neuronale overleving waargenomen tussen de gladde oppervlakken (controle) en de nanopatterned implantaten na implantatie gedurende 2 weken. B) er was een significant hogere neuronale overleving rond de nanopatterned implantaten op de afstand van 100-150 μm ten opzichte van gladde oppervlakken (p < 0,05) na implantatie van 4 weken. Representatieve beelden van neuronen (gekleurd groen), met de gele omtrek beeltenis van de implantatieplaats, en de "P" die de geëtste kant van de micro-elektrode, schaalbalk = 100 μm aangeeft. Dit cijfer is gewijzigd van39. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: effecten van geëtste nano-architectuur op neuroinflammatoire moleculaire markers. Weefsel werd verzameld rond 500 μm straal van de implantatieplaats voor zowel de nanopatterned en controle implantaten. Relatieve genexpressie van ontstekingsmarkers werd kwantitatief vergeleken tussen beide implantaat typen (de verschillen worden aangeduid met # op de grafiek; p < 0,05) evenals na verloop van tijd (de verschillen worden aangeduid met * op de grafiek; p < 0,05). A) de relatieve GENEXPRESSIE van CD14 daalde significant rond de nanopatterned implantaten van twee tot vier weken (*). (B) er was een significant mindere relatieve GENEXPRESSIE van NOS2 rond nanopattern implantaat vergeleken met controle op vier weken (#) en er was een significante toename van NOS2 van twee tot vier weken rond soepele controle implantaten (*). Dit cijfer is gewijzigd van referentie39. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: FIB geëtste nano-architectuur op de oppervlakken van functionele enkelvoudige schacht Microelektroden. De inzet in de rechterbovenhoek toont de micro-elektrode die in deze studie wordt gebruikt naast een dime om de grootte van de elektrode schacht te portretteren (dunne zwarte lijn). SEM-beelden van de micro elektroden schacht met FIB geëtste nano-architecturen langs de achterzijde van de schacht. De gehele schacht wordt aan de bovenkant weergegeven bij een vergroting van 600x (schaalbalk = 50 μm), terwijl de inzet het Nano oppervlak weergeeft met een vergroting van 25, 000x, schaalbalk = 1 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: effecten van geëtste nano-architectuur in Intracorticale micro elektroden op elektrofysiologie. Evaluatie van elektrofysiologische Metrics ontdekte een veelbelovende voor ronde trend van (a) percentage van kanalen die enkelvoudige eenheden opnemen, (B) maximale amplitudes van geregistreerde eenheden, en (C) signaal-ruis verhouding van de micro-elektrode geëtst met nano-architecturen in vergelijking met de gladde besturings elektroden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: elektrofysiologie opname van geïmplanteerde functionele enkelvoudige schacht Microelektroden met FIB geëtste nano-architecturen. Een van de uitdagingen van het gebruik van FIB om nano-architecturen te etsen op gefabriceerde micro elektrode-apparaten is het risico van korte-circuiting opname contacten. De x-as toont de opnametijd in seconden en de y-as toont de elektrode kanalen die neuronale actie potentialen opnemen. Elke genummerde lijn op de y-as vertegenwoordigt een ander elektrode kanaal, waarbij kanaalnummer 1 de ondiepe is en 16 de diepste. De rode vakjes schetsen de kortgesloten kanalen, terwijl de blauwe dozen een overzicht geven van kanalen met zichtbare Neuronale activiteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het fabricage protocol dat hier wordt geschetst maakt gebruik van gerichte ionen straal-lithografie om nano-architecturen effectief en reproducdig te etsen in het oppervlak van niet-functionele en functionele enkelvoudige schacht silicium microelektroden. Met gerichte ionen straal (FIB) lithografie kan de selectieve ablatie van het substraat oppervlak met behulp van een fijn gerichte Ion Beam50,51. FIB is een direct-write techniek die verschillende functies kan produceren met nanoschaal resolutie en hoge beeldverhouding50,52,53. Om de verschillende formaat functies te creëren, kan de magnitude van de ionen straalstroom worden geoptimaliseerd om de spotgrootte van de ionen straal te veranderen binnen een bereik van 3 nm tot 2 μm50,51. Enkele algemene voordelen van het gebruik van FIB tot etch-functies op oppervlakken zijn: 1) het kan worden gebruikt op een breed scala aan materialen, waaronder silicium, metalen en polymeren53,54,55,56, 2) FIB kan worden uitgevoerd op niet-vlakke oppervlakken, en 3) FIB kan worden gebruikt voor nabewerking op afzonderlijke apparaten57.
Hier werd FIB gebruikt in combinatie met een SEM-Microscoop en software die werd gebruikt om een gespecialiseerd geautomatiseerd script te schrijven voor het etsen van specifieke functies in niet-functionele enkelvoudige schacht sondes. Het script bevatte parameters vereist (2,5 nA ionen straalstroom en 30 kV spanning) om de exacte afstand te etsen die gewenst is (200 nm brede parallelle groeven, verdeeld over 300 nm uit elkaar en 20 nm diep). De afmetingen van de elektrode overschreden het gezichtsveld voor de FIB, dus het patroon werd uitgevoerd in meerdere podium posities. Om het proces te automatiseren, werden fiducial Marks geëtst in de zijkant van het silicium blad met de sondes op zijn plaats, zodat de software nauwkeurig de patroon lijnen op de sonde schacht kan lokaliseren. De fiduciaire waarden waren noodzakelijk omdat de stage-beweging een grote onzekerheid (~ 5 μm) op de locatie van het patroongebied creëerde met betrekking tot het gezichtsveld van de ionen straal. Plaatsing van de fiduciaire op het silicium blad toegestaan voor de FIB om de patroon gebieden te lokaliseren zonder direct het scannen van de straal op de sonde schacht, die mogelijk verontreinigen of beschadigen van de sonde schacht. Het volledige geautomatiseerde etsen proces voor een schacht duurde ongeveer 12 uur om te voltooien en vereiste geen operator interventie nadat het patroon werd gestart. Collectief, de voordelen van het gebruik van FIB naar etch functies in de silicium sonde schacht waren de mogelijkheid om nanometer formaat functies, automatiseren het etsen proces, en de capaciteit om te etsen op een gefabriceerde sonde. Hoewel FIB overvloedige voordelen heeft, is een van de nadelen van het gebruik van deze fabricagemethode de langzame doorvoersnelheid die uiteindelijk het potentieel beperkt voor massaproductie van apparaten met nano-architecturen in hun oppervlakte58. Als alternatief, andere fabricagemethoden gebruikt om te maken van de functie groottes en geometrieën van belang, misschien op hogere tarieven en bij massa producties, omvatten Electron Beam lithografie en nano opdruk lithografie59,60,61,62,63,64,65. Deze methoden zijn echter niet toegestaan voor het etsen van nano-architectuur-functies in gefabriceerde apparaten. Traditioneel worden deze methoden gebruikt tijdens het fabricageproces op een blad van silicium of polymeer, dat vervolgens kan worden toegepast in de downstream verwerkingsstappen om de uiteindelijke misleidt te fabriceren.
De functionele elektroden waren niet in staat om een geautomatiseerd proces te ondergaan als gevolg van het niet hebben van een omringende materiaal rond de elektrode schacht waarin fiducial Marks in de run. Daarom werden de functionele elektroden handmatig uitgelijnd en geëtst op 500 μm secties langs de schacht, met behulp van dezelfde ionenstroom en spanning als de geautomatiseerde run om te zorgen voor dezelfde functie maten. De Beam moest handmatig opnieuw worden toegewezen na het voltooien van elk 500 μm-interval en ingesteld om de volgende sectie te etsen. Het proces van handmatige herschikking van de patronen elke 500 μm kan mogelijk leiden tot beschadigde nanostructuren of structuren die niet overeenkomen met de beoogde geometrie. Dit is te wijten aan langere blootstellings tijden die de ionen straal nodig heeft voorhand matige uitlijning66. Dit was een van de problemen ondervonden met de handmatige etsen. Als gevolg van deze complicatie, twee opname contacten werden kortgesloten en waren niet in staat om neuronale actie potentialen op te nemen (Figuur 6). Figuur 6 toont een elektrofysiologisch Live opname segment van het dier geïmplanteerd met de nano-architectuur-elektrode. De blauwe dozen schetsen de kanalen die sterke actie potentialen opnemen, in vergelijking met de rode dozen die de twee dode kanalen aangeven. Vandaar, een van de uitdagingen van het gebruik van handmatige FIB etsen op post-gefabriceerde elektroden is dat er een kans dat de straal kan kortsluiting contacten en voorkomen dat ze opnemen. Deze uitdaging wordt versterkt wanneer u probeert te etsen van de voorzijde van enkele schacht silicium elektroden, waarbij de opname contacten en traceringen zijn langs de hele schacht van de elektrode. Hoewel het haalbaar is om het silicium rond de opname contacten en-sporen te etsen, is extra voorzichtigheid geboden om schade en verminderde prestaties van de opnamemogelijkheden van de elektrode te voorkomen.
Zoals eerder vermeld, kan FIB worden gebruikt op verschillende materialen om tal van functie geometrieën in het oppervlak te etsen. Het is echter belangrijk op te merken dat de parameters voor etch-geometrieën, zoals lijnen in de verschillende materialen, ingewikkeld zijn om te voorspellen. Met name voor lijnpatronen zijn de lijnbreedte en-diepte sterk afhankelijk van veel parameters, zoals de acceleratie spanning, Beam Current, dwelltijd, pixel afstand, levensduur van het diafragma en materiaaltype. Een andere parameter die het resultaat is van de optimalisatie is de totale tijd om elke lijn te frezen. Smallere en diepere lijnen kunnen worden bereikt met behulp van kleinere straal stromingen; echter, de patroon tijd voor een hele sonde schacht zou uitbreiden tot meerdere dagen, dat is niet praktisch. Dus, hoewel het haalbaar is om het hier gepresenteerde protocol te optimaliseren, zou het buitengewoon moeilijk zijn om de parameters voor onbekende materialen te beschrijven. Bij het oplossen van de parameters voor de in dit protocol beschreven silicium voelers werden talrijke test sneden in silicium gemaakt om te evalueren hoe de veranderende omstandigheden de lijndikte en-diepte beïnvloede. Zodra de geëvalueerde omstandigheden de specifieke functie grootte en de geometrie van de interesse konden etsen (200 nm brede lijnen die 200 nm diep waren), werden deze parameters gebruikt om het software script te schrijven. Het script werd gebruikt om de afstand van elke lijn te regelen, van Midden naar midden, die in dit protocol 300 nm is. Toekomstige studies met silicium substraten/apparaten die functie groottes vereisen in de honderden nanometers, kunnen de parameters beschreven in dit protocol gebruiken als uitgangspunt voor het oplossen van de voorwaarden die nodig zijn om de gewenste functie grootten te maken. Verdere optimalisatie en het oplossen van de ETS voorwaarden zal nodig zijn voor metaal en polymeer substraten/apparaten. Over het algemeen biedt het gebruik van FIB voor het etsen van nano-architecturen in materiaal oppervlakken voldoende controle en flexibiliteit in geometrieën van functies, het gebruiken van tal van compatibele materialen en verschillende oppervlakte typen, inclusief gefabriceerde apparaten. Representatieve resultaten die hierin zijn gepresenteerd, toonden de potentiële voordelen aan die werden waargenomen in onze studies naar het gebruik van FIB om nano-architecturen in het oppervlak van intracorticale micro elektroden te etsen: 1) verhoogde neuronale dichtheid en 2) vermindering van neuroinflammatoire markers rond geïmplanteerde apparaten met nano-architecturen, evenals 3) voorlopige bevindingen met een verbeterde kwaliteit van elektrofysiologische opnames Evenzo kan de werkgelegenheid en optimalisatie van het beschreven protocol etsen van nano-architectuur functies in het oppervlak van een materiaal worden gebruikt om de functionaliteit van talrijke medische apparaten te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door de Amerikaanse (Amerikaanse) afdeling veteranen zaken revalidatie Research en Development Service Awards: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) en #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). De inhoud vertegenwoordigt niet de standpunten van het Amerikaanse ministerie van veteranen zaken of de regering van de Verenigde Staten. De auteurs willen FEI co. (nu onderdeel van Thermofisher Scientific) bedanken voor de ondersteuning van het personeel en het gebruik van instrumentatie, die hielp bij het ontwikkelen van de scripts die in dit onderzoek worden gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-Channel ZIF-Clip Headstage | Tucker Davis Technologies | ZC16 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| 1-meter cable, ALL spring wrapped | Thomas Scientific | 1213F04 | Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture |
| 32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder | Tucker Davis Technologies | Z-ROD32 | The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html |
| Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30ml | Ted Pella | 16023 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat |
| Carbon Conductive Tape, Double Coated | Ted Pella | 16084-7 | The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm |
| Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 well | Sigma Aldrich | CLS3736-100EA | Any non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/ |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30 |
| Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon Labs | Fisher Scientific | 22-032-600 | Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600 |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mm | Ted Pella | 16148 | Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180 |
| Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge roll | Fisher Scientific | 01-213-101 | Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250 |
| Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating Dishes | Fisher Scientific | 02-617-149 | Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552 |
| Michigan-style silicon functional electrode | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177 | http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/ |
| Model 1772 Universal holder | KOPF | Model 1772 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Model 900-U Small Animal Stereotaxic Instrument | KOPF | Model 900-U | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/ |
| Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide Assembly | KOPF | Model 960 | Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/ |
| Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250') | Ted Pella | 807-5 | https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm |
| PELCO Vacuum Pick-Up System, 220V | Ted Pella | 520-1-220 | Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520 |
| PELCO Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062 |
| SEM FIB FEI Helios 650 Nanolab | Thermo Fisher Scientific | Helios G2 650 | This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/ |
References
- Salcman, M., Bak, M. J. A new chronic recording intracortical microelectrode. Medical and Biological Engineering. 14 (1), 42-50 (1976).
- Im, C., Seo, J. -M. A review of electrodes for the electrical brain signal recording. Biomedical Engineering Letters. 6 (3), 104-112 (2016).
- Donoghue, J. Bridging the Brain to the World: A Perspective on Neural Interface Systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
- Gilja, V., et al. Clinical translation of a high-performance neural prosthesis. Nature medicine. 21 (10), 1142-1145 (2015).
- Wolpaw, J. R., McFarland, D. J. Control of a two-dimensional movement signal by a noninvasive brain-computer interface in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17849-17854 (2004).
- Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping in a person with tetraplegia through brain-controlled muscle stimulation: a proof-of-concept demonstration. Lancet. 389 (10081), 1821-1830 (2017).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
- Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. Journal of Neural Engineering. 9 (4), 046020 (2012).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neurosciences. 6 (1), 48-67 (2015).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Michelson, N. J., et al. Multi-scale, multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
- Saxena, T., et al. The impact of chronic blood-brain barrier breach on intracortical electrode function. Biomaterials. 34 (20), 4703-4713 (2013).
- Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34, 7001-7015 (2013).
- Ravikumar, M., et al. The Roles of Blood-derived Macrophages and Resident Microglia in the Neuroinflammatory Response to Implanted Intracortical Microelectrodes. Biomaterials. 0142 (35), 8049-8064 (2014).
- Hermann, J., Capadona, J. Understanding the Role of Innate Immunity in the Response to Intracortical Microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
- Ereifej, E. S., et al. Implantation of Intracortical Microelectrodes Elicits Oxidative Stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00009 (2018).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
- Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862 (2017).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Biran, R., Martin, D., Tresco, P. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Experimental Neurology. 195 (1), 115-126 (2005).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 7 (3), 315-326 (1999).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. , (2017).
- Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11 (5), 056014 (2014).
- Wei, X., et al. Nanofabricated Ultraflexible Electrode Arrays for High-Density Intracortical Recording. Advanced Science. , 1700625 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Kim, Y., et al. Nano-Architectural Approaches for Improved Intracortical Interface Technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chemical Neurosciences. 1 (1), 36-48 (2010).
- Ding, H., Millet, L. J., Gillette, M. U., Popescu, G. Actin-driven cell dynamics probed by Fourier transform light scattering. Biomedical Optical Express. 1 (1), 260-267 (2010).
- Kotov, N. A., et al. Nanomaterials for Neural Interfaces. Advanced Materials. 21 (40), 3970-4004 (2009).
- Curtis, A. S., et al. Cells react to nanoscale order and symmetry in their surroundings. IEEE Trans Nanobioscience. 3 (1), 61-65 (2004).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5 (1), 13406 (2011).
- Ereifej, E. S., et al. Nanopatterning effects on astrocyte reactivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (6), 1743-1757 (2013).
- Ereifej, E. S., Cheng, M. M. -C., Mao, G., VandeVord, P. J. Examining the inflammatory response to nanopatterned polydimethylsiloxane using organotypic brain slice methods. Journal of Neuroscience Methods. 217 (1-2), 17-25 (2013).
- Ereifej, E. S., et al. The Neuroinflammatory Response to Nanopatterning Parallel Grooves into the Surface Structure of Intracortical Microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
- Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
- Sladek, Z., Rysanek, D. Expression of macrophage CD14 receptor in the course of experimental inflammatory responses induced by lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. Veterinarni Medicina. 53 (7), 347-357 (2008).
- Janova, H., et al. CD14 is a key organizer of microglial responses to CNS infection and injury. Glia. , (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Ulevitch, R. J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell Science. 117 (14), 2865-2867 (2004).
- Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences. 75 (6), 639-653 (2004).
- Kozai, T. D., et al. Comprehensive chronic laminar single-unit, multi-unit, and local field potential recording performance with planar single shank electrode arrays. Journal of Neurosciences Methods. 242, 15-40 (2015).
- Kozai, T. D., et al. Mechanical failure modes of chronically implanted planar silicon-based neural probes for laminar recording. Biomaterials. 37, 25-39 (2015).
- Raffa, V., Vittorio, O., Pensabene, V., Menciassi, A., Dario, P. FIB-nanostructured surfaces and investigation of bio/nonbio interactions at the nanoscale. IEEE Transactions on Nanobioscience. 7 (1), 1-10 (2008).
- Lehrer, C., Frey, L., Petersen, S., Ryssel, H. Limitations of focused ion beam nanomachining. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics and Nanometer Structures Processing, Measurement, and Phenomena. 19 (6), 2533-2538 (2001).
- Watkins, R., Rockett, P., Thoms, S., Clampitt, R., Syms, R. Focused ion beam milling. Vacuum. 36 (11-12), 961-967 (1986).
- Veerman, J., Otter, A., Kuipers, L., Van Hulst, N. High definition aperture probes for near-field optical microscopy fabricated by focused ion beam milling. Applied Physics Letters. 72 (24), 3115-3117 (1998).
- Lanyon, Y. H., Arrigan, D. W. Recessed nanoband electrodes fabricated by focused ion beam milling. Sensors and Actuators B: Chemical. 121 (1), 341-347 (2007).
- Menard, L. D., Ramsey, J. M. Fabrication of sub-5 nm nanochannels in insulating substrates using focused ion beam milling. Nano Letters. 11 (2), 512-517 (2010).
- Ziberi, B., Cornejo, M., Frost, F., Rauschenbach, B. Highly ordered nanopatterns on Ge and Si surfaces by ion beam sputtering. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (22), 224003 (2009).
- Reyntjens, S., Puers, R. A review of focused ion beam applications in microsystem technology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 11 (4), 287 (2001).
- Heyderman, L., David, C., Kläui, M., Vaz, C., Bland, J. Nanoscale ferromagnetic rings fabricated by electron-beam lithography. Journal of Applied Physics. 93 (12), 10011-10013 (2003).
- Baquedano, E., Martinez, R. V., Llorens, J. M., Postigo, P. A. Fabrication of Silicon Nanobelts and Nanopillars by Soft Lithography for Hydrophobic and Hydrophilic Photonic Surfaces. Nanomaterials. 7 (5), 109 (2017).
- Eom, H., et al. Nanotextured polymer substrate for flexible and mechanically robust metal electrodes by nanoimprint lithography. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (45), 25171-25179 (2015).
- Li, K., Morton, K., Veres, T., Cui, B. 5.11 Nanoimprint Lithography and Its Application in Tissue Engineering and Biosensing. Comprehensive Biotechnology. , 125-139 (2011).
- Dong, B., Zhong, D., Chi, L., Fuchs, H. Patterning of conducting polymers based on a random copolymer strategy: Toward the facile fabrication of nanosensors exclusively based on polymers. Advanced Materials. 17 (22), 2736-2741 (2005).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Wilkinson, C. D. The response of fibroblasts to hexagonal nanotopography fabricated by electron beam lithography. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (4), 973-979 (2008).
- Tseng, A. A., Chen, K., Chen, C. D., Ma, K. J. Electron beam lithography in nanoscale fabrication: recent development. IEEE Transactions on Electronics Packaging Manufacturing. 26 (2), 141-149 (2003).
- Yang, Y., Leong, K. W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 478-495 (2010).
- Vermeij, T., Plancher, E., Tasan, C. Preventing damage and redeposition during focused ion beam milling: The "umbrella" method. Ultramicroscopy. 186, 35-41 (2018).
