Summary
Aquí describimos un protocolo para la inducción de una lesión cerebral traumática murina a través de un impacto cortical controlado a cabeza abierta.
Abstract
Los Centros para el Control y la Prevención de Lesiones estiman que casi 2 millones de personas sufren una lesión cerebral traumática (TBI) cada año en los Estados Unidos. De hecho, el TBI es un factor que contribuye a más de un tercio de toda la mortalidad relacionada con el daño. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la fisiopatología de la TBI se entienden mal. Por lo tanto, los modelos preclínicos de TBI capaces de replicar los mecanismos de lesión pertinentes a TBI en pacientes humanos son una necesidad crítica de investigación. El modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI utiliza un dispositivo mecánico para impactar directamente la corteza expuesta. Si bien ningún modelo puede recapitular completamente los patrones de lesión dispares y la naturaleza heterogénea de TBI en pacientes humanos, CCI es capaz de inducir una amplia gama de TBI clínicamente aplicable. Además, CCI se estandariza fácilmente permitiendo a los investigadores comparar los resultados entre experimentos, así como entre grupos de investigación. El siguiente protocolo es una descripción detallada de la aplicación de un CCI grave con un dispositivo de impacto disponible comercialmente en un modelo murino de TBI.
Introduction
Los Centros para el Control y la Prevención de Lesiones estiman que aproximadamente 2 millones de estadounidenses sufren una lesión cerebral traumática (TBI) cada año1,2. De hecho, TBI contribuye a más del 30% de todas las muertes relacionadas con lesiones en los Estados Unidos con costos de atención médica cercanos a $80 mil millones anuales y casi $4 millones por persona por año sobreviviendo a un TBIsevero 3,4,5. El impacto de la TBI se pone de relieve por las importantes complicaciones neurocognitivas y neuropsiquiátricas a largo plazo sufridas por sus sobrevivientes con el inicio insidioso de deficiencias conductuales, cognitivas y motoras que se denominan Encefalopatía Traumática Crónica (TEC) 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Incluso los eventos conmocionsivas subclínicos —aquellos impactos que no resultan en síntomas clínicos— pueden conducir a una disfunción neurológica a largo plazo11,12.
Los modelos animales para el estudio de TBI se han empleado desde finales de 180013. En la década de 1980, se desarrolló un impactador neumático con el propósito de modelar TBI. Este método se conoce ahora como impacto cortical controlado (CCI)14. El control y la reproducibilidad de CCI llevaron a los investigadores a adaptar el modelo para su uso en roedores15. Nuestro laboratorio utiliza este modelo para inducir TBI a través de un impactador disponible comercialmente y un dispositivo de accionamiento electrónico16,17. Este modelo es capaz de producir una amplia gama de estados TBI clínicamente aplicables dependiendo de los parámetros biomecánicos utilizados. La evaluación histológica de los cerebros TBI después de una lesión grave inducida en nuestro laboratorio demuestra una pérdida significativa de cortical y hipocampal ipsilateral, así como edema contralateral y distorsión. Además, CCI produce un deterioro constante en la función motora y cognitiva medida por ensayos conductuales18. Las limitaciones a CCI incluyen la necesidad de craneotomía y el gasto de adquirir el impactador y el dispositivo de accionamiento.
Existen varios modelos adicionales de TBI y están bien establecidos en la literatura, incluyendo el modelo de percusión de fluido lateral, modelo de caída de peso, y lesión por explosión modelo19,20,21. Si bien cada uno de estos modelos tiene sus propias ventajas distintas, sus principales inconvenientes son lesiones mixtas, alta mortalidad y falta de estandarización, respectivamente22. Además, ninguno de estos modelos ofrece la precisión, precisión y reproducibilidad de CCI. Al ajustar la entrada de parámetros biomecánicos en el dispositivo de accionamiento, el modelo CCI permite al investigador un control preciso sobre el tamaño de la lesión, la profundidad de la lesión y la energía cinética aplicada al cerebro. Esto da a los investigadores la capacidad de aplicar todo el espectro de TBI a áreas específicas del cerebro. También permite la mayor reproducibilidad desde el experimento hasta el experimento.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones C57BL/6 fueron comprados al Laboratorio Jackson y el grupo alojado en una instalación de barrera en el Centro de Medicina Comparada de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Todos los animales fueron alojados en 12/12 h ciclo claro/oscuro con acceso gratuito a alimentos y agua.
1. Inducir la anestesia
- Anestetizar el ratón con ketamina (125 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) inyectada por vía intraperitoneal.
2. Monitoreo de signos vitales cada 15 minutos
- Controle la temperatura, la frecuencia respiratoria y el color de la piel. El ratón debe sentirse caliente al tacto. La piel debe aparecer rosa da a la piel y bien perfundida. La frecuencia respiratoria debe variar de 50 a 70 respiraciones por minuto.
3. Procedimientos prequirúrgicos
- Pesar todos los ratones el día antes de la inducción de lesiones.
- Esterilice un conjunto de instrumentos quirúrgicos mediante el autoclave para cada sujeto experimental. Esterilice el dispositivo de impacto antes de usarlo.
- Prepare una jaula de recuperación colocando una jaula limpia sobre una almohadilla de calentamiento eléctrica establecida en un ajuste "bajo" y colocada de tal manera que los ratones puedan alejarse del calor una vez ambulatorio.
- Configure el quirófano dentro de una campana de flujo laminar esterilizada.
- Coloque el marco de funcionamiento estereotaxico.
- Conecte el dispositivo de impacto al marco estereotaxico.
- Ajuste el dispositivo de accionamiento con los parámetros biomecánicos deseados para la velocidad y el tiempo de permanencia.
NOTA: En este protocolo se describe una lesión cerebral grave utilizando una punta de impacto de 3 mm de diámetro a través de una craniectomía de 5 mm de diámetro con la velocidad establecida en 2,5 m/s y un tiempo de permanencia de 0,1 s. Se puede utilizar una amplia gama de parámetros biomecánicos para inducir todo el espectro de TBI.
- Don nuevo equipo de protección personal y guantes estériles.
- Ahave el pelaje del sitio operativo con cortadoras eléctricas.
- Aplique pomada opthalmic protectora a los ojos del ratón para evitar lesiones corneales y secado.
- Coloque el ratón en el quirófano.
- Prepara la piel con un exfoliante quirúrgico a base de yodo alternado con alcohol tres veces.
4. Aplicación del impacto cortical controlado
- Incise el cuero cabelludo 1 cm en la línea media con un bisturí que expone el cráneo.
- Coloque el ratón dentro de un marco de funcionamiento estereotaxico asegurando los huesos temporales bilaterales entre las barras de oído en miniatura y bloqueando los incisivos dentro de una abrazadera incisiva creando una sujeción estable de tres puntos en la cabeza del ratón.
- Retirar el cuero cabelludo lejos del sitio operativo con un hemostat o fórceps de bloqueo para asegurarse de que el cuero cabelludo no entre en contacto con la broca durante la craneectomía.
- Identifique las suturas sagitales y coronales en el cráneo expuesto.
NOTA: Este protocolo centra la craniectomía 2 mm a la izquierda de la sutura sagital y 2 mm rostral a la sutura coronal. - Realice una craniectomía usando un taladro con una broca de trephina.
- Para realizar la craneectomía, primero active el taladro a la máxima velocidad y luego aplique la broca trephina perpendicular al cráneo en el sitio de la craneectomía.
- Aplique una presión suave y uniforme al taladro una vez que se haga contacto con el cráneo. Una ligera "dar" se sentirá una vez que el taladro penetre a través del cráneo. No penetre en la dura subyacente.
NOTA: Este protocolo utiliza una broca trephine de 5 mm para realizar la craneectomía.
- Utilice fórceps y una aguja hipodérmica de pequeño calibre para extraer la solapa ósea, exponiendo completamente la duración subyacente.
- Gire la punta del impactador en el campo operativo y baje hasta que haga contacto con la dura mater expuesta. Una vez que se realiza el contacto, el sensor de contacto del instrumento hará un tono audible para alertar al cirujano de que se ha hecho contacto. Esto marcará el punto cero desde el que se establece la profundidad de deformación.
NOTA: Este protocolo utiliza una punta de impacto de 3 mm para generar una lesión grave. Se pueden utilizar puntas tan pequeñas como 1 mm para aplicar lesiones más localizadas. - Retraiga la punta impactante y ajuste la profundidad de impacto deseada reduciendo la posición del impactador en el marco estereotaxico.
NOTA: En este protocolo describimos una lesión grave estableciendo la profundidad de deformación en 2 mm. - Aplique la lesión activando el impactador en el dispositivo de accionamiento.
- Gire el dispositivo de impacto fuera del campo y retire el animal del marco estereotaxico.
5. Cierre del sitio quirúrgico
- Controle el sangrado del cráneo y la superficie cortical lesionada con presión directa de un aplicador de punta de algodón estéril.
- Seque el cráneo con un aplicador de algodón estéril.
- Cierre el cuero cabelludo sobre la craneectomía con un adhesivo quirúrgico disponible comercialmente o sutura monofilamento.
NOTA: En este protocolo se utiliza un adhesivo quirúrgico veterinario para cerrar el cuero cabelludo. El colgajo óseo no se reemplaza y se desecha.
6. Atención y monitoreo postoperatorio
- Administrar la analgesia postoperatoria (p. ej., buprenorfina de liberación sostenida 0,1–0,5 mg/kg administrada por vía subcutánea proporcionando 72 h de analgesia sostenida).
- Coloque el animal en la posición de recuperación de decúbato lateral en una jaula limpia precalentada.
- Observe a los animales hasta que despierten y estén móviles, luego devuelva cada ratón a su jaula de origen.
- Garantizar el acceso gratuito a alimentos y agua. La ingesta normal de alimentos y agua normal mente se reanuda dentro de una a dos horas después de la lesión.
- Mida el peso corporal cada tres días a lo largo del experimento.
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Representative Results
El impactador se monta directamente en el marco estereotaxico, lo que permite una resolución de hasta 10 m para el control del punto de impacto, profundidad y penetración. Las fuerzas electromagnéticas empleadas pueden impartir velocidades de impacto que van de 1,5 a 6 m/s. Esto permite una precisión y reproducibilidad sin igual en toda la gama de TBI clínicamente relevantes. Los investigadores pueden realizar experimentos piloto cambiando los parámetros de la lesión, como el tamaño de la punta del impactador, la velocidad de impacto y la profundidad de impacto para determinar los parámetros que mejor producen el grado deseado de lesión. Este protocolo describe un TBI severo a la región parietotemporal izquierda mediante la realización de una craniectomía de 5 mm 2 mm a la izquierda de la sutura sagital y 2 mm rostral a la sutura coronal (Figura1A). Un impacto cortical controlado se entrega con una punta de impacto de 3 mm a 2,5 m/s y una profundidad de deformación de 2 mm (Figura2). La lesión consiste en hemorragia subdural, intraparenquimal y subaracnoidea (Figura3). Las pruebas neurocognitivas un mes después de esta lesión demuestran déficits persistentes en la memoria de trabajo, adquisición de habilidades y coordinación motora18. La evaluación histológica de los cerebros TBI después de una lesión grave inducida en nuestro laboratorio demuestra una pérdida significativa de cortical y hipocampal ipsilateral, así como edema contralateral y distorsión. El examen por RMN de los cerebros gravemente lesionados utilizando este modelo demuestra pérdida progresiva de tejido y reemplazo por líquido cefalorraquídeo (Figura4)23. Por último, el análisis citométrico de flujo de cerebros lesionados y falsos demuestra una marcada diferencia en la infiltración de células inflamatorias durante el curso de la lesión17,18.
Figura 1: Configuración del equipo para el modelo murino de impacto cortical controlado.
(A) El dispositivo de accionamiento se establece una velocidad de 2,5 m/s y un tiempo de permanencia de 0,1 s. (B) El impactador con una punta de impacto de 3 mm se fija al marco estereotaxico. (C) Un ratón con craniectomía de 5 mm se fija en el marco de funcionamiento estereotaxico con barras de oído y una barra incisiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: TBI grave a través de impacto cortical controlado a cabeza abierta.
(A) El cable de puesta a tierra se recorta a la región posterior del ratón y la punta de impacto se baja sobre la dura mater hasta que el sensor de contacto se alarma. Este es el punto cero. (B) La punta de impacto se retrae, se marca una profundidad de 2 mm de lesión en el marco estereotaxico y se aplica el impacto. (C) Después de aplicar el CCI, la punta de impacto se gira fuera del campo y el ratón se recupera del marco estereotaxico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Examen bruto de los cerebros de ratón después de tBI grave inducido por el impacto cortical controlado.
(A) Cerebro de un ratón ingenuo de 12 semanas. (B) Cerebro de un ratón de 12 semanas de edad 24 h después de sostener un TBI severo a través de impacto cortical controlado. (C) Cerebro de un ratón de 12 semanas de edad 7 días después de sostener un TBI severo a través de impacto cortical controlado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación histológica y de RMN de TBI grave después del impacto cortical controlado.
Hematoxilina y eosina (H&E) teñidas secciones coronales e imágenes representativas de RM coronal ponderada en T1. (A) Lesión por sham, que consiste únicamente en craneotomía. (B) EL CCI da como resultado un TBI grave con gran pérdida de volumen de corteza (Ctx) en el lugar del impacto, así como la pérdida y distorsión de la formación subyacente del hipocampo (HF) y el tálamo (TH). (C) La RMN a 1 día después de la TBI demuestra traumatismo tisular y edema sobre la corteza parietotemporal izquierda. (D–E) Las imágenes representativas de los días 7 y 14 posteriores a la lesión demuestran un aumento de las áreas de hiperatenuación que representan el reemplazo progresivo del tejido desvitalizado por líquido cefalorraquídeo. Figura ha sido adaptada de Makinde, et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay varios pasos que son críticos para aplicar una lesión confiable y consistente. En primer lugar, el ratón debe alcanzar un plano profundo de anestesia quirúrgica asegurando que no haya movimiento durante la realización de la craneectomía. Mientras que se pueden utilizar numerosos regímenes anestésicos para inducir anestesia general en roedores, los anestésicos que inducen depresión respiratoria como los anestésicos inhalatorios pueden resultar en un paro respiratorio cuando se combinan con un TBI grave. Este protocolo utiliza ketamina (125 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) inyectada por vía intraperitoneal. Esta combinación de fármacos produce un plano quirúrgico de anestesia dentro de 5 min de la administración para una duración de aproximadamente 30-45 min. Además, esta combinación de medicamentos no resulta en depresión respiratoria. El siguiente paso crítico es el rendimiento de la craneectomía. La craniectomía siempre debe realizarse con una nueva broca trephina a alta velocidad para garantizar que el calor y la vibración mínimas se transmitan al cerebro del ratón. El calor y la vibración pueden causar daños en el tejido cerebral adyacente fuera del área de CCI, lo que conduce a un tamaño y un mecanismo de lesión inconsistentes entre los sujetos y los experimentos. A continuación, el cabezal del ratón debe estar firmemente asegurado dentro del marco estereotaxico antes de la aplicación del CCI para garantizar que la profundidad y la ubicación de las lesiones sean consistentes entre las aplicaciones de lesiones. Las barras de oído en miniatura y una abrazadera incisiva son componentes esenciales para asegurar correctamente el cabezal del ratón dentro del marco estereotaxico. Por último, es fundamental utilizar un dispositivo con un sensor de contacto. El sensor indicará el punto exacto de contacto entre la punta que impacta y la dura mater expuesta. Esto permite al investigador observar el punto cero exacto desde el cual se puede ajustar la profundidad de la lesión con el marco estereotaxico asegurando un grado preciso y reproducible de lesión.
Para asegurarse de que el cuero cabelludo incisado está fuera del campo en el momento de la cci, a menudo es necesario utilizar un retractor como abrazadera o fórceps para tirar al cuero cabelludo lejos del sitio de la craneectomía. Si el cuero cabelludo vuelve a caer en el campo CCI a medida que se aplica la lesión, el tamaño y la gravedad de la lesión no serán confiables. Además, aunque es imprescindible asegurarse de que el cabezal del ratón esté inmovilizado dentro del marco estereotaxico, el investigador debe asegurarse de que la fijación no afecte a la respiración. La hipoxia en el momento de la lesión secundaria a la respiración restringida introducirá una forma secundaria de lesión haciendo que el grado, la gravedad y el mecanismo de lesión no sean confiables entre los sujetos experimentales.
Dada la capacidad de especificar con precisión múltiples parámetros biomecánicos, CCI es uno de los métodos más consistentes y confiables para inducir lesiones cerebrales traumáticas en modelos de roedores15. Sin embargo, hay una serie de limitaciones que el investigador debe tener en cuenta a la hora de elegir qué modelo de TBI es el más adecuado para responder a su pregunta científica22. CCI sufre de las mismas limitaciones que todos los modelos preclínicos de lesión cerebral en que requiere anestesia y un procedimiento quirúrgico (craniectomía) antes de la inducción de la lesión. Tanto la anestesia como la craneectomía son capaces de generar una respuesta inflamatoria y deben considerarse como potenciales confundistas durante el análisis de datos24. Además, aunque CCI produce una lesión fiable y consistente, la mayoría de tBI en pacientes humanos son difusos y se producen a través de múltiples mecanismos simultáneos25. Esto puede hacer que la traducción directa a pacientes humanos con TBI sea problemática, ya que EL CCI produce una lesión focal con diferentes grados de efectos difusos dependiendo de la gravedad de la lesión aplicada. Por último, CCI requiere la compra y el mantenimiento de varios componentes mecánicos que pueden resultar prohibitivos para algunos grupos de investigación. Sin el mantenimiento adecuado de los componentes mecánicos, puede haber una deriva sustancial en los parámetros biomecánicos reales aplicados desde el experimento hasta el experimento24.
La identificación de los controles adecuados para cada experimento es fundamental. Los ratones heridos por sham son un control importante en cada experimento. El grupo de lesiones falsas debe recibir anestesia, incisión del cuero cabelludo, colocación en el marco estereotaxico y analgesia postoperatoria. Sin embargo, el grupo de lesiones falsas no debe someterse a una craneectomía. La vibración y la transferencia de calor de la craneectomía, incluso cuando se realiza rápidamente con precisión experta, resulta en una lesión cerebral traumática leve. Aunque esta lesión es difícil de ver groseramente, se identifica fácilmente microscópicamente. Por último, los investigadores deben considerar el uso de un grupo de ratones ingenuos emparejados con la edad para descartar cualquier cambio normal que ocurra dentro del cerebro a medida que los ratones envejecen.
A pesar de las limitaciones, CCI sigue siendo el modelo más consistente y reproducible para inducir TBI en roedores. CCI es fácil de estandarizar entre sujetos y experimentos en comparación con métodos alternativos de inducir TBI y permite a los investigadores aplicar todo el espectro de TBI a regiones anatómicas definidas con precisión del cerebro. El protocolo anterior describe la aplicación de un TBI severo a la corteza parietotemporal izquierda en un ratón. Este modelo utiliza una craniectomía de 5 mm realizada con una broca trephina a alta velocidad. Una punta impactante de 3 mm se utiliza con una profundidad de lesión de 2 mm a una velocidad de 2,5 m/s y un tiempo de permanencia de 0,1 s. Cuando se aplica adecuadamente, y cuando el sujeto experimental se recupera adecuadamente, se puede obtener una tasa de supervivencia a largo plazo que se acerca al 100% permitiendo realizar estudios a corto, intermedio y a largo plazo de TBI murino.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por National Institutes of Health Grant GM117341 y The American College of Surgeons C. James Carrico Research Fellowship to S.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 5939911020 | |
| Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL | Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA | BSRLAB0.5-182012 | |
| High Speed Rotary Micromotor KiT0 | Foredom Electric Company | K.1070 | |
| Imapact one for Stereotaxix CCI | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39463920 | |
| Ketathesia Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein, Inc | 56344 | |
| Mouse Specific Stereotaxic Base | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39462980 | |
| Trephines for Micro Drill | Fine Science Tools, Inc | 18004-50 |
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