Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo para a indução de ferimento de cérebro traumático murino através de um impacto cortical controlado da abrir-cabeça.
Abstract
Os centros de controle de doenças e prevenção de lesões estimam que quase 2 milhões pessoas sustentam uma lesão cerebral traumática (TBI) todos os anos nos Estados Unidos. Na verdade, a TBI é um fator contribuinte para mais de um terço de toda a mortalidade relacionada a lesões. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à fisiopatologia da TBI são pouco compreendidos. Assim, os modelos pré-clínicos de TCE capazes de replicar os mecanismos de lesão pertinentes à TBI em pacientes humanos são uma necessidade de pesquisa crítica. O modelo controlado do impacto cortical (CCI) de TBI utiliza um dispositivo mecânico para impactar diretamente o córtice exposto. Embora nenhum modelo possa recapitular completamente os padrões de lesões diferentes e a natureza heterogênea da TBI em pacientes humanos, o CCI é capaz de induzir uma ampla gama de TBI clinicamente aplicável. Além disso, CCI é facilmente padronizado permitindo que os investigadores para comparar os resultados através de experimentos, bem como em grupos de investigação. O seguinte protocolo é uma descrição detalhada de aplicar um CCI severo com um dispositivo de impacto comercialmente disponível em um modelo murino de TBI.
Introduction
Os centros para o controle da doença e a prevenção de ferimento estimam que aproximadamente 2 milhões americanos sustentam um ferimento de cérebro traumático (TBI) cada ano1,2. Na verdade, a TBI contribui para mais de 30% de todas as mortes relacionadas a lesões nos Estados Unidos com custos de saúde chegando a $80000000000 anualmente e quase $4000000 por pessoa por ano, sobrevivendo a um TBI severo3,4,5. O impacto da TBI é destacado pelas complicações neurocognitivas e neuropsiquiátricas de longo prazo significativas sofridas por seus sobreviventes com o início insidioso de deficiências comportamentais, cognitivas e motoras denominadas encefalopatia traumática crônica (CTE) 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9 anos de , 10. mesmo eventos de concussão subclínicos — os impactos que não resultam em sintomas clínicos — podem levar à disfunção neurológica de longo prazo11,12.
Modelos animais para o estudo da TBI têm sido empregados desde o final dos anos 1800 ' s13. Na década de 1980, foi desenvolvido um pêndulo pneumático com o objetivo de modelar a TBI. Este método é referido agora como o impacto cortical controlado (CCI)14. O controle e a reprodutibilidade do CCI levaram os pesquisadores a adaptar o modelo para uso em roedores15. O nosso laboratório utiliza este modelo para induzir o TBI através de um Impactador disponível comercialmente e dispositivo de acionamento eletrônico16,17. Este modelo é capaz de produzir uma escala larga de Estados clìnica aplicáveis de TBI dependendo dos parâmetros biomecânicos usados. A avaliação histologic de cérebros de TBI depois que uma lesão severa induzida em nosso laboratório demonstra a perda cortical e hippocampal ipsilateral significativa assim como o edema e a distorção contralaterais. Adicionalmente, o CCI produz um comprometimento consistente na função motora e cognitiva, medido por ensaios comportamentais18. As limitações ao CCI incluem a necessidade para a craniotomia e a despesa de adquirir o dispositivo do impactor e de accionar.
Vários modelos adicionais de TBI existem e estão bem estabelecidos na literatura, incluindo o modelo de percussão de fluido lateral, modelo de queda de peso e modelo de lesão de jateamento19,20,21. Embora cada um desses modelos tenha suas próprias vantagens distintas, suas principais desvantagens são a lesão mista, a alta mortalidade e a falta de padronização, respectivamente22. Além disso, nenhum desses modelos oferece precisão, precisão e reprodutibilidade do CCI. Ajustando os parâmetros biomecânicos de entrada para o dispositivo de acionamento, o modelo CCI permite que o investigador controle preciso sobre o tamanho da lesão, profundidade da lesão, e energia cinética aplicada ao cérebro. Isso dá aos investigadores a capacidade de aplicar todo o espectro de TBI para áreas específicas do cérebro. Ele também permite a maior reprodutibilidade do experimento para experimentar.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Northwestern. C57BL/6 camundongos foram comprados no laboratório Jackson e grupo alojado em uma instalação de barreira no centro de medicina comparativa na Northwestern University (Chicago, IL). Todos os animais foram alojados em 12/12 h de luz/ciclo escuro com acesso gratuito à comida e água.
1. induzir anestesia
- Anestesie o camundongo com cetamina (125 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) injetado intraperitonealmente.
2. sinais vitais que monitoram cada 15 minutos
- Monitore a temperatura, a frequência respiratória e a cor da pele. O rato deve sentir-se quente ao toque. A pele deve aparecer rosa e bem perfused. A frequência respiratória deve variar 50 – 70 respirs por minuto.
3. procedimentos pré-cirúrgicos
- Pesar todos os ratos no dia anterior à indução da lesão.
- Esterilizar um conjunto de instrumentos cirúrgicos por autoclavagem para cada sujeito experimental. Esterilizar o dispositivo de impacto antes de usar.
- Prepare uma gaiola da recuperação coloc uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento elétrica ajustada ao ajuste "baixo" e posicionado em uma maneira tal que os ratos possam se afastar do calor uma vez ambulatory.
- Configurar o teatro operacional dentro de uma capa de fluxo laminar esterilizado.
- Posicione o quadro de operação estereotótaxo.
- Prenda o dispositivo impactante ao frame Stereotaxic.
- Ajuste o dispositivo de accionar com os parâmetros biomecânicos desejados para a velocidade e o tempo de permanência.
Nota: neste protocolo uma lesão cerebral grave é descrita utilizando uma ponta de impacto de 3 mm de diâmetro através de uma craniectomia de 5 mm de diâmetro com a velocidade definida em 2,5 m/s e um tempo de permanência de 0,1. Uma escala larga de parâmetros biomecânicos pode ser usada para induzir o espectro cheio de TBI.
- Don novo equipamento de proteção pessoal e luvas estéreis.
- Depilar a pele do local operatório usando cortadores elétricos.
- Aplique a pomada opthalmic protetora aos olhos do rato para impedir ferimento e a secagem córneos.
- Coloque o mouse no teatro operacional.
- Prepare a pele com uma esfoliação cirúrgica baseada em iodo alternada com álcool três vezes.
4. aplicação do impacto cortical controlado
- Incise o couro cabeludo 1 cm na linha média com um bisturi expondo o crânio.
- Posicione o mouse dentro de um quadro de operação estereotódico, fixando os ossos temporais bilaterais entre as barras de orelha em miniatura e bloqueando os incisivos dentro de uma pinça de incisão, criando uma preensão de três pontos estável na cabeça do mouse.
- Retrair o couro cabeludo para longe do local operatório com um hemostato ou pinça de travamento para garantir que o couro cabeludo não entra em contato com a broca durante a craniectomia.
- Identifique as suturas sagital e coronal no crânio exposto.
Nota: Este protocolo centra a craniectomia 2 mm à esquerda da sutura sagital e 2 mm rostral para a sutura coronal. - Realize uma craniectomia usando uma broca com uma broca de trefina.
- Para realizar a craniectomia, primeiro ative a broca na velocidade máxima e, em seguida, aplique a broca de trefina perpendicular ao crânio no local da craniectomia.
- Aplique a pressão delicada, mesmo à broca uma vez que o contato é feito com o crânio. Uma ligeira "dar" será sentida uma vez que a broca penetra através do crânio. Não penetre na dura subjacente.
Nota: Este protocolo utiliza um bocado de broca do trephine de 5 milímetros para executar o craniectomy.
- Use o fórceps e uma agulha hipodérmica do calibre pequeno para remover a aleta do osso, expondo inteiramente o Mater subjacente da dura.
- Gire a ponta do pêndulo para o campo operatório e abaixe-a até que ela faça contato com a dura-máter exposta. Uma vez que o contato é feito o sensor do contato do instrumento fará um tom audível para alertar o cirurgião que o contato estêve feito. Isso marcará o ponto zero do qual a profundidade de deformação é definida.
Nota: Este protocolo utiliza uma ponta de impacto de 3 milímetros para gerar uma lesão severa. As pontas tão pequenas quanto 1 milímetro podem ser usadas para aplicar ferimento mais localizado. - Retraia a ponta impactante e ajuste a profundidade de impacto desejada abaixando a posição do impactor no frame Stereotaxic.
Nota: neste protocolo nós descrevemos uma lesão severa ajustando a profundidade da deformação a 2 milímetros. - Aplique a lesão ativando o pêndulo no dispositivo de acionamento.
- Gire o dispositivo de impacto para fora do campo e retire o animal do quadro estereotódico.
5. fechamento cirúrgico do local
- Controle o sangramento do crânio e a superfície cortical ferida com pressão direta de um aplicador derrubado algodão estéril.
- Seque o crânio com um aplicador de ponta de algodão estéril.
- Feche o couro cabeludo sobre a craniectomia usando um adesivo cirúrgico comercialmente disponível ou sutura de monofilamento.
Nota: neste protocolo um adesivo cirúrgico veterinário é usado para fechar o couro cabeludo. A aba óssea não é substituída e é descartada.
6. cuidados e monitorização pós-operatórios
- Administrar analgesia pós-operatória (por exemplo, buprenorfina de liberação sustentada 0,1 – 0,5 mg/kg administrada por via subcutânea fornecendo 72 h de analgesia sustentada).
- Coloque o animal na posição de recuperação de decúbito lateral em uma gaiola pré-aquecida limpa.
- Observe os animais até acordar e móvel, em seguida, devolver cada mouse para a sua gaiola de casa.
- Garanta o acesso gratuito à comida e à água. Ingestão normal de alimentos e água normalmente retomar dentro de uma a duas horas após a lesão.
- Medir o peso corporal a cada três dias durante todo o experimento.
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Representative Results
O pêndulo monta diretamente no quadro estereotódico, permitindo até 10 μm de resolução para o controle do ponto de impacto, profundidade e penetração. As forças eletromagnéticas empregadas podem transmitir velocidades de impacto variando de 1,5 – 6 m/s. Isto permite a precisão incomparável e a reprodutibilidade sobre a escala inteira do TBI clìnica relevante. Os investigadores podem executar experimentos piloto mudando os parâmetros de lesão, como o tamanho da ponta do pêndulo, a velocidade de impacto e a profundidade de impacto para determinar os parâmetros que melhor produzem o grau desejado de lesão. Este protocolo descreve um TBI severo à região parietotemporal esquerda executando uma craniectomia de 5 milímetros 2 milímetros esquerdo da sutura sagital e 2 milímetros rostral à sutura coronal (Figura 1a). Um impacto cortical controlado é fornecido com uma ponta de impacto de 3 milímetros em 2,5 m/s e uma profundidade da deformação de 2 milímetros (Figura 2). A lesão consiste em hemorragia subdural, intraparênquima e subaracnóidea (Figura 3). O teste Neurocognitivo um mês após este ferimento demonstra deficits persistentes na memória de trabalho, na aquisição da habilidade, e na coordenação motora18. A avaliação histologic de cérebros de TBI depois que uma lesão severa induzida em nosso laboratório demonstra a perda cortical e hippocampal ipsilateral significativa assim como o edema e a distorção contralaterais. A examinação de MRI de cérebros severamente feridos usando este modelo demonstra a perda e a recolocação progressivas do tecido pelo líquido cerebrospinal (Figura 4)23. Por fim, a análise citométrica de fluxo de cérebros lesionados e Sham demonstra uma diferença acentuada na infiltração de células inflamatórias ao longo do curso da lesão17,18.
Figura 1: configuração do equipamento para o modelo murino de impacto cortical controlado.
(A) o dispositivo de acionamento é ajustado uma velocidade de 2,5 m/s e um tempo de permanência de 0,1. (B) o impactor com uma ponta de impacto de 3 milímetros é fixado ao frame Stereotaxic. (C) um rato com a craniectomia de 5 milímetros é fixado no frame de funcionamento Stereotaxic com barras da orelha e uma barra do incisivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: TCE grave através de impacto cortical controlado de cabeça aberta.
(A) o cabo de aterramento é cortado para a região traseira do mouse e a ponta impactante é abaixada na dura-máter até que os alarmes do sensor de contato. Este é o ponto zero. (B) a ponta impactante é retraído, uma profundidade de 2 milímetros de ferimento é discado no frame Stereotaxic, e o impacto é aplicado. (C) depois que o CCI é aplicado, a ponta impactante é girada fora do campo e o rato é recuperado do frame Stereotaxic. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exame macroscópico de cérebros de camundongo após TCE grave induzido por impacto cortical controlado.
(A) cérebro de um rato de 12 semanas de idade ingênuo. (B) cérebro de um rato 12 week-old 24 h após ter sustentado um TBI severo através do impacto cortical controlado. (C) cérebro de um rato 12 week-old 7 dias após ter sustentado um TBI severo através do impacto cortical controlado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: avaliação histológica e de RM de TCE grave após impacto cortical controlado.
A hematoxilina e a eosina (H & E) corou as secções do núcleo e o Sr. coronal representativo imagens de T1. (A) lesão Sham, consistindo apenas de craniotomia. (B) CCI resulta em uma TBI grave com grande perda de volume de córtex (CTX) no local de impacto, bem como perda e distorção da formação hipocampal subjacente (HF) e tálamo (th). (C) MRI no borne-TBI de 1 dia demonstra o traumatismo e o edema do tecido sobre o córtice parietotemporal esquerdo. (D – E) As imagens representativas dos dias 7 e 14 pós-lesão demonstram aumento das áreas de hiperatenuação representando a substituição progressiva do tecido desvitalizado por líquido cefalorraquidiano. A figura foi adaptada de makinde, et al.23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem várias etapas que são críticas para a aplicação de uma lesão confiável e consistente. Primeiro, o mouse deve chegar a um plano profundo de anestesia cirúrgica, garantindo nenhum movimento durante o desempenho da craniectomia. Embora numerosos regimes anestésicos possam ser utilizados para induzir anestesia geral em roedores, os anestésicos que induzem a depressão respiratória, como anestésicos inalatórios, podem resultar em parada respiratória quando combinados com TCE grave. Este protocolo utiliza cetamina (125 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) injetado intraperitonealmente. Esta combinação de fármacos produz um plano cirúrgico de anestesia dentro de 5 min de administração por uma duração de aproximadamente 30 – 45 min. Além disso, esta combinação de drogas não resulta em depressão respiratória. O próximo passo crítico é o desempenho da craniectomia. A craniectomia deve sempre ser realizada com um pouco de broca de trefina fresca em alta velocidade para garantir que o calor mínimo e vibração são transmitidos para o cérebro do mouse. Calor e vibração podem resultar em danos ao tecido cerebral adjacente fora da área de CCI levando a um tamanho inconsistente e mecanismo de lesão entre indivíduos e experimentos. Em seguida, a cabeça do rato deve firmemente ser fixada dentro da armação Stereotaxic antes da aplicação do CCI para assegurar a profundidade e a posição da lesão é consistente entre aplicações de ferimento. As barras de orelha diminutas e uma braçadeira do incisivo são componentes essenciais em fixar corretamente a cabeça de rato dentro do frame Stereotaxic. Por fim, é fundamental utilizar um dispositivo com um sensor de contato. O sensor indicará o ponto exato de contato entre a ponta impactante e a dura-máter exposta. Isto permite que o investigador anote o ponto zero exato de que a profundidade de ferimento é pode ser ajustada com o frame Stereotaxic assegurando um grau preciso e reprodutível de ferimento.
Para assegurar-se de que o escalpe incisada esteja fora do campo na altura do CCI, é frequentemente necessário usar um retractor tal como a braçadeira ou o fórceps para puxar ao escalpe longe do local da craniectomia. Se o couro cabeludo cair de volta para o campo CCI como a lesão é aplicada, o tamanho ea gravidade da lesão não será confiável. Adicionalmente, embora seja imperativo assegurar-se de que a cabeça de rato esteja imobilizada dentro do frame Stereotaxic, o investigador deve assegurar-se de que a fixação não prejudique a respiração. A hipóxia no momento da lesão secundária à respiração restrita introduzirá uma forma secundária de lesão, tornando o grau, a severidade e o mecanismo de lesão não confiável entre os sujeitos experimentais.
Dada a capacidade de especificar com precisão múltiplos parâmetros biomecânicos, o CCI é um dos métodos mais consistentes e confiáveis para induzir lesão cerebral traumática em modelos de roedores15. No entanto, há uma série de limitações que o investigador deve estar ciente de quando escolher qual o modelo de TCE é mais adequado para responder a sua questão científica22. CCI sofre das mesmas limitações que todos os modelos pré-clínicos de lesão cerebral na medida em que requer anestesia e um procedimento cirúrgico (craniectomia) antes da indução de lesão. Tanto a anestesia quanto a craniectomia são capazes de gerar uma resposta inflamatória e devem ser consideradas como potenciais confundidores durante a análise dos dados24. Adicionalmente, embora o CCI produza um ferimento seguro e consistente, a maioria de TBI em pacientes humanos é difusa e ocorre com os mecanismos simultâneos múltiplos25. Isto pode fazer a tradução direta aos pacientes humanos do TBI problemático porque o CCI produz uma lesão focal com graus de variação de efeitos difusos dependendo da severidade da lesão aplicada. Por fim, a CCI requer a compra e manutenção de vários componentes mecânicos que podem revelar-se custo proibitivo para alguns grupos de pesquisa. Sem a manutenção apropriada dos componentes mecânicos, pode haver uma deriva substancial nos parâmetros biomecânicos reais aplicados do experimento ao experimento24.
A identificação de controles apropriados para cada experimento é crítica. Camundongos Sham-feridos são um controle importante em cada experimento. O grupo de injúria Sham deve receber anestesia, incisão no couro cabeludo, colocação no quadro estereotaxico e analgesia pós-operatória. Entretanto, o grupo Sham-ferimento não deve submeter-se a craniectomy. A vibração e a transferência de calor da craniectomia, mesmo quando executadas rapidamente com precisão especializada, resultam em uma lesão cerebral traumática leve. Embora esta lesão é difícil de ver grosseiramente, é prontamente identificado microscopicamente. Por fim, os investigadores devem considerar o uso de um grupo de camundongos ingênuos com correspondência de idade para descartar quaisquer alterações normais que ocorram dentro do cérebro como a idade dos camundongos.
Apesar das limitações, o CCI continua sendo o modelo mais consistente e reprodutível para induzir TBI em roedores. CCI é fácil de padronizar entre assuntos e experimentos em comparação com métodos alternativos de induzir TBI e permite que os investigadores apliquem todo o espectro de TBI para regiões anatômicas precisamente definidas do cérebro. O protocolo acima descreve a aplicação de um TBI severo ao córtice parietotemporal esquerdo em um rato. Este modelo utiliza um craniectomy de 5 milímetros executado com um bocado de broca do trephine na alta velocidade. Uma ponta de impacto de 3 mm é usada com uma profundidade de lesão de 2 mm a uma velocidade de 2,5 m/s e um tempo de permanência de 0,1. Quando aplicado apropriadamente, e quando o assunto experimental é recuperado corretamente, uma taxa de sobrevivência a longo prazo que aproxima 100% pode ser obtida permitindo estudos curtos, intermediários, e a longo prazo do TBI murino a ser executado.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos financeiros de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde Grant GM117341 e The American College of cirurgiões C. James Carrico Research Fellowship para S.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 5939911020 | |
| Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL | Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA | BSRLAB0.5-182012 | |
| High Speed Rotary Micromotor KiT0 | Foredom Electric Company | K.1070 | |
| Imapact one for Stereotaxix CCI | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39463920 | |
| Ketathesia Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein, Inc | 56344 | |
| Mouse Specific Stereotaxic Base | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39462980 | |
| Trephines for Micro Drill | Fine Science Tools, Inc | 18004-50 |
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