创伤性脑损伤诱导受控皮质冲击的母模型

Summary

在这里，我们描述了通过开头控制皮质撞击诱导鼠外创伤性脑损伤的协议。

Abstract

疾病控制和伤害预防中心估计，美国每年有近200万人遭受创伤性脑损伤（TBI）。事实上，TBI是造成所有与伤害有关的死亡率超过三分之一的因素。然而，TBI病理生理学的细胞和分子机制却知之甚少。因此，能够复制与人类患者TBI相关的损伤机制的TBI临床前模型是一项关键的研究需要。TBI 的受控皮质冲击 （CCI） 模型利用机械装置直接影响暴露的皮层。虽然没有一种模型能够全面概括人类患者中TBI的不同损伤模式和异质性，但CCI能够诱导广泛的临床应用TBI。此外，CCI 易于标准化，使调查人员能够跨实验和跨调查组比较结果。以下协议详细介绍了在 TBI 的鼠模型中使用市售影响装置的严重 CCI。

Introduction

美国疾病控制和预防中心估计，每年约有200万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）。事实上，TBI在美国所有与伤害有关的死亡中，超过30%的死亡率，每年医疗费用接近800亿美元，每人每年在严重的TBI^3、4、5中生存近400万美元。TBI的影响突出表现在其幸存者遭受的重大长期神经认知和神经精神并发症与行为，认知和运动损伤的阴险开始称为慢性创伤性脑病（CTE）^6,7,8,9,10.即使是亚临床脑震荡事件——那些不导致临床症状的影响——也可能导致长期神经功能障碍11、12。

研究TBI的动物模型从1800年末开始被^采用。在 20 世纪 80 年代，开发了一种用于建模 TBI 的气动冲击器。这种方法现在被称为受控皮质撞击（CCI）14。CCI的控制和可重复性使研究人员将模型调整为啮^{齿动物15。}我们的实验室使用这种模型，通过市售的冲击器和电子驱动装置16、17诱导TBI。该模型能够根据所使用的生物力学参数产生广泛的临床适用的TBI状态。在我们的实验室中引起严重损伤后，TBI大脑的由性评价显示，显著的叶边皮质和海马损失以及反向水肿和变形。此外，CCI产生一致的运动和认知功能损伤，通过行为^测定18测量。CCI 的限制包括颅切除术和获取冲击器和驱动装置的费用。

TBI的其他几种模型存在，并在文献中得到了很好的建立，包括横向流体打击模型、降重模型和爆炸伤害模型19，20，21。虽然每种型号各有其独特优势，但其主要缺点是混合损伤、高死亡率和缺乏标准化，^{分别为22。}此外，这些模型都没有提供 CCI 的精度、精度和可重复性。通过调整生物力学参数输入到驱动装置中，CCI 模型允许调查人员精确控制损伤的大小、损伤的深度以及施加到大脑的动能。这使得研究者能够将TBI的整个光谱应用于大脑的特定区域。它还允许从实验到实验的最大可重复性。

Protocol

所有程序都通过了西北大学机构动物护理和使用委员会的批准。C57BL/6小鼠是从杰克逊实验室购买的，并组在西北大学比较医学中心（伊利诺伊州芝加哥）的屏障设施中。所有动物都被安置在12/12小时的光/暗周期，免费获得食物和水。

1. 诱导麻醉

1. 用氯胺酮（125毫克/千克）和木兰素（10毫克/千克）在腹内注射给小鼠麻醉。

2. 每15分钟监测一次生命体征

1. 监测温度、呼吸速率和肤色。鼠标应该感到温暖的触摸。皮肤应该出现粉红色和充分渗透。呼吸速率应为每分钟50-70次。

3. 手术前手术

1. 在损伤诱导前一天称量所有小鼠。
2. 通过每个实验科目的高压灭菌来消毒一套手术器械。使用前对冲击装置进行消毒。
3. 通过在设置为"低"设置的电动加热垫上放置一个干净的笼子，使小鼠在流动后可以远离热量的方式，准备回收笼。
4. 在灭菌的层流罩内设置操作手术室。
   1. 定位立体操作框架。
   2. 将冲击装置连接到立体帧。
   3. 设置驱动装置，使用所需的生物力学参数来计算速度和活动时间。
      注：在本协议中，使用直径为 5 mm 的颅骨切除术，将速度设置为 2.5 m/s，并且驻点时间为 0.1 s，描述了严重的脑损伤。广泛的生物力学参数可用于诱导TBI的全部光谱。
5. 穿上新的个人防护装备和无菌手套。
6. 使用电动剪子从操作现场切毛。
7. 在小鼠眼睛上涂抹保护性眼膜膏，防止角膜损伤和干燥。
8. 将鼠标放入操作影院。
9. 用碘为基础的手术磨砂与酒精交替三次准备皮肤。

4. 受控皮质撞击的应用

1. 用手术刀露出头骨，在中线切开头皮1厘米。
2. 通过固定微型耳杆之间的双边时态骨骼，并将切口锁定在切口夹内，在鼠标头上形成稳定的三点保持，将鼠标置于立体操作框架中。
3. 用止动或锁定钳子将头皮从手术部位缩回，以确保头皮在颅切除术期间不会与钻头接触。
4. 识别暴露的颅骨上的下垂和冠状缝合。
   注：本协议将颅骨切除术2毫米左下垂缝合和2毫米玫瑰色中心至冠状缝合线。
5. 使用带颤音钻头的钻头进行颅骨切除。
   1. 要进行颅骨切除术，首先以最大速度激活钻头，然后在颅骨切除术部位应用垂直于颅骨的颅骨钻头。
   2. 一旦与头骨接触，对钻头施加轻柔、均匀的压力。一旦钻头穿透头骨，就会感觉到轻微的"给予"。不要穿透底层的杜拉。
      注：此协议使用 5 mm 颤音钻头执行颅骨切除术。
6. 使用钳子和小表皮下针去除骨皮瓣，完全暴露底层的杜拉母体。
7. 将冲击器尖端旋转到操作现场并降低，直到与裸露的 Dura 母体接触。一旦接触，仪器的接触传感器将发出声音，提醒外科医生已进行接触。这将标记设置变形深度的零点。
   注：此协议使用 3 mm 冲击尖端产生严重伤害。小至 1 mm 的尖端可用于施加更局部的伤害。
8. 通过降低立体框架上的撞击器位置，收回冲击尖端并设置所需的冲击深度。
   注：在本协议中，我们将变形深度设置为 2 mm 来描述严重伤害。
9. 通过激活驱动装置上的冲击器来施加伤害。
10. 将冲击装置旋转出场外，并将动物从立体框架中取出。

5. 手术部位关闭

1. 控制颅骨出血和受伤的皮质表面，直接压力来自无菌棉倾倾施用器。
2. 用无菌棉尖施用器干燥头骨。
3. 使用市售的手术粘合剂或单丝缝合线关闭颅骨切除术的头皮。
   注：在本协议中，使用兽医手术粘合剂关闭头皮。骨活门未更换并丢弃。

6. 术后护理和监测

1. 管理术后性肛门病（例如，持续释放丁丙诺啡0.1~0.5毫克/千克，皮下施用，提供72小时持续性痛感）。
2. 将动物置于侧侧脱热恢复位置，放在一个干净的预加热笼中。
3. 观察动物，直到醒着和移动，然后把每只老鼠送回其家笼。
4. 确保免费获得食物和水。正常食物和水摄入量通常在受伤后一至两小时内恢复。
5. 在整个实验中，每三天测量一次体重。

Representative Results

冲击器直接安装在立体框架上，分辨率高达 10 μm，用于控制冲击点、深度和穿透力。使用的电磁力可以产生1.5~6米/s的撞击速度。这使得在整个临床相关TBI范围内具有无与伦比的精度和可重复性。调查人员可以进行PILOT实验，改变损伤参数，如撞击器尖端尺寸、撞击速度和撞击深度，以确定最能产生所需伤害程度的参数。该协议描述了一个严重的TBI到左腹腔位区域，通过执行5毫米颅切除术2毫米左下垂缝合和2毫米玫瑰石到冠状缝合（图1A）。以 2.5 m/s 的速度提供 3 mm 冲击尖和 2 mm 的变形深度（图 2）。损伤包括硬膜下、内膜出血和下膜出血（图3）。神经认知测试一个月后，这种伤害显示持续缺乏工作记忆，技能获取，和运动^协调18。在我们的实验室中引起严重损伤后，TBI大脑的由性评价显示，显著的叶边皮质和海马损失以及反向水肿和变形。使用该模型对严重受伤大脑的核磁共振检查显示，脑脊液会逐渐组织丧失和置换（图4）23。最后，对受伤和假脑的流式细胞测定分析显示，在损伤17、18的过程中，炎症细胞的渗透存在显著差异。

图1：受控皮质冲击的鼠模型的设备设置。
（A）驱动装置设定速度为2.5米/s，活动时间为0.1s。 （C）带 5 mm 颅骨切除术的鼠标固定在带有耳杆和切口杆的立体操作框架中。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：通过开头控制皮质冲击产生严重TBI。
（A）接地电缆被剪切到鼠标的后部区域，撞击尖端被降低到 Dura mater 上，直到触点传感器报警。这是零点。（B）冲击尖端缩回，2毫米伤害深度被拨入立体框架，并施加冲击。（C）应用 CCI 后，冲击尖端将旋转出场，鼠标从立体帧中恢复。请点击此处查看此图的较大版本。

图3：控制皮质冲击诱发严重TBI后小鼠大脑的毛额检查。
（A）大脑来自一只12周大的幼鼠。（B）大脑从12周大的小鼠24小时后，通过受控皮质撞击维持严重的TBI。（C）通过受控皮质撞击维持严重TBI后7天，从12周大的小鼠的大脑。请点击此处查看此图的较大版本。

图4：控制皮质撞击后严重TBI的病因和MRI评价。
血氧林和欧辛（H&E）染色日冕部分和代表性日冕T1加权MR图像。（A）沙姆损伤，仅包括颅内切除术。（B） CCI 导致严重的 TBI，在撞击部位皮层（Ctx）的体积损失，以及底层海马形成 （HF） 和丘拉皮 （TH ）的损失和变形。（C） TBI后1天的MRI显示左皮质上的组织创伤和水肿。（D+E）伤后第7天和第14天的代表性图像显示，超衰减区域增加，代表逐渐用脑脊液替代脱脂组织。图已改编自马金德^等人23。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

有几个步骤对于应用可靠和一致的伤害至关重要。首先，小鼠必须到达外科麻醉的深平面，以确保在颅切除术期间没有运动。虽然许多麻醉方案可用于诱导啮齿动物的一般麻醉，但引起呼吸抑郁的麻醉剂，如吸入麻醉剂，在与严重的TBI结合时，可能导致呼吸停止。本协议使用氯胺酮（125毫克/千克）和木兰胺（10毫克/千克）注射在腹内。这种药物组合在5分钟内产生麻醉的手术平面，持续时间约为30-45分钟。此外，这种药物的组合不会导致呼吸系统抑郁症。下一个关键步骤是颅切除术的性能。颅骨切除术应始终使用高速的新鲜颤动钻头进行，以确保将最小的热量和振动传输到小鼠大脑。热和振动可能导致CCI区域外的相邻脑组织受损，导致受试者与实验之间大小和损伤机制不一致。接下来，在应用 CCI 之前，鼠标头必须牢固地固定在立体框架内，以确保伤害的深度和位置在伤害应用之间保持一致。微型耳杆和切口夹是正确固定立体框架内的鼠标头的基本部件。最后，使用带有接触传感器的设备至关重要。传感器将指示冲击尖端和暴露的杜拉母体之间的确切接触点。这使得调查员能够注意到损伤深度的精确零点，使用立体框架来设置伤害深度，以确保精确和可重现的伤害程度。

为了确保在 CCI 时，割割的头皮在场外，通常需要使用钳子或钳子等缩回器将头皮从颅切除术部位拉离头皮。如果头皮在涂抹时回落到 CCI 场，损伤的大小和严重程度将不可靠。此外，虽然必须确保鼠标头固定在立体框架中，但调查人员必须确保固定不会损害呼吸。损伤时缺氧次生至受限呼吸，将引入一种辅助损伤形式，使实验对象之间的损伤程度、严重程度和机理不可靠。

鉴于能够精确指定多个生物力学参数，CCI是啮齿动物^模型15中诱导创伤性脑损伤的最一致和可靠的方法之一。然而，在选择哪种TBI模型最适合回答他们的^{科学问题时，}调查人员应该注意一些限制。CCI 受到与所有脑损伤临床前模型相同的限制，因为它需要在引伤之前进行麻醉和外科手术（颅切除术）。麻醉和颅切除术都能够产生炎症反应，在^{数据分析24}中必须被认为是潜在的混杂因素。此外，虽然CCI产生可靠和一致的损伤，大多数TBI在人类患者是扩散和发生通过多个同时^机制25。这可能使直接翻译给人类TBI患者成问题，因为CCI产生焦点损伤，根据所应用的伤害的严重程度，产生不同程度的扩散效应。最后，CCI要求购买和维护几个机械部件，这些部件可能证明某些研究小组的成本过高。如果不对机械部件进行适当维护，从实验到^实验24的实际生物力学参数可能会有实质性漂移。

确定每个实验的适当控件至关重要。在每次实验中，受伤老鼠都是一个重要的控制。假伤组应接受麻醉，头皮切口，放置在立体性框架，和术后肛门。然而，假伤组不应该进行颅切除术。颅内切除术的振动和传热，即使以专家精度快速执行，也确实会导致轻微的创伤性脑损伤。虽然这种伤害很难看到严重，它很容易识别微观。最后，研究者应该考虑使用一组年龄匹配的幼鼠来排除随着老鼠年龄变化而大脑内发生的任何正常变化。

尽管存在限制，CCI 仍然是在啮齿动物中诱导 TBI 的最一致和可重复的模型。与诱导TBI的替代方法相比，CCI易于跨受试者和实验进行标准化，并允许研究者将TBI的整个光谱应用于精确定义的大脑解剖区域。上述协议描述了在小鼠中向左皮质表皮层应用严重的TBI。此模型使用 5 mm 颅骨切除术在高速下使用颤音钻头进行。3 mm 冲击尖端在 2.5 m/s 的速度下使用伤害深度为 2 mm，而活动时间为 0.1 s。当应用得当，当实验对象得到适当恢复时，可以获得接近100%的长期生存率，从而对鼠三甲进行短期、中期和长期研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.	5939911020
Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
High Speed Rotary Micromotor KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one for Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Mouse Specific Stereotaxic Base	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines for Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50