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Biochemistry

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

doi: 10.3791/60029 Published: August 21, 2019

Summary

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

Abstract

동적 단백질-단백질 상호 작용 제어 세포 행동, 운동성에서 DNA 복제 신호 변환에. 그러나, 단백질 상호 작용 네트워크에서 여러 단백질 간의 동적 상호 작용을 모니터링하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서, 우리는 노출에 의해 검출된 공유 복합체에 있는 단백질의 상대적인 형광 측정에 근거를 둔 단백질 상호 작용에 있는 배 변경의 정량적인 평가를 허용하는 정량적 멀티플렉스 면역 침전 (QMI)를 위한 프로토콜을 제시합니다 표면 에피토프 (PiSCES). QMI에서, 세포 용해물에서 단백질 복합체는 PiSCES의 풍부를 정량화하기 위하여 다른 단백질을 위한 표지된 항체로 그 때 마이크로스피어로 면역 침전되고, 그 때 조사됩니다. 면역 침전 항체는 다른 MagBead 스펙트럼 지구에 공액화되어 유동 세포계가 다중 병렬 면역 침전을 분화하고 동시에 각각과 관련된 프로브 항체의 양을 정량화할 수 있습니다. QMI는 유전 적 태깅을 필요로하지 않으며 다른 면역 침전 방법에 비해 최소한의 생체 재료를 사용하여 수행 할 수 있습니다. QMI는 상호 작용하는 단백질의 임의의 정의된 단에 적응될 수 있고, 지금까지 T 세포 및 신경 글루타메이트 시냅스에서 신호 네트워크를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 결과는 잠재적인 진단 및 치료 응용을 가진 새로운 가설 생성으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜에는 초기 항체 패널 선택부터 실행 분석 및 데이터 분석에 이르기까지 QMI를 수행하는 지침이 포함되어 있습니다. QMI 분석법의 초기 조립은 패널을 생성하는 스크리닝 항체를 포함하고, 경험적으로 적절한 라시스 완충액을 결정한다. 후속 시약 제제는 MagBeads에 면역 침전 항체를 공유결합하고, 생물항제 프로브 항체를 포함하므로 스트렙타비딘-컨쥬게이트 형광에 의해 표지될 수 있다. 분석기를 실행하기 위해, 매사염은 하룻밤 동안 MagBeads와 혼합된 다음, 구슬을 다른 프로브 항체로 분할 및 배양한 다음, 불소 라벨을, 및 유세포 분석으로 읽습니다. 두 가지 통계 테스트가 수행되어 실험 조건간에 크게 다른 PiSCES를 식별하며, 히트맵 또는 노드 에지 다이어그램을 사용하여 결과를 시각화합니다.

Introduction

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동적 단백질-단백질 상호 작용은 대부분의 세포 생리학1의 기능적 기초인 분자신호 캐스케이드 및 운동성 구조를 구성한다. 이러한 프로세스는 종종 단일 입력을 기반으로 정상 상태 사이를 전환하는 선형 신호 경로로 묘사되지만 실험 및 모델링 데이터는 통합 네트워크 2,3 . 4.G 단백질의 경우, 다른 수용체는 종종 동일한 G 단백질을 활성화할 수 있으며, 단일 수용체는또한 G 단백질 5,6의한 가지 유형 이상을 활성화시킬 수 있다. 상대적으로 적은 수의 G 단백질 클래스가 시냅스 전송, 호르몬 조절 및 세포 이동과 같은 광범위한 세포 기능을 구체적으로 조절하기 위해서는 세포가 이러한 신호를 통합하고 분화해야 합니다4 , 5. 증거는 이 신호 특이성이 G 단백질뿐만 아니라 다른 사람에 대해, 주로 미세 조정 된 단백질 - 단백질 상호 작용 및 시간 역학 1,3에기초하여 파생된다는 것을 보여주었습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7. 시그널링 네트워크는 여러 입력, 출력 및 피드백 루프가있는 동적 단백질 복합체로 구성되기 때문에 단일 섭동은 세포의 생리학4의 전반적인 적시 성 균형을 변경할 수있는 기회를 가합니다. ,7. 이제 여러 입력의 통합이 건강과 질병7,8에서개별 세포 기능을 제어하는 방법을 더 잘 이해하기 위해 네트워크 관점에서 신호를 검사해야한다는 것이 널리 동의됩니다. 9,10,11,12,13. 이에 비추어, 정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 동적 단백질 상호작용 네트워크의 배 변화에 대한 중간 처리량, 정량적 데이터를 수집하기 위해 개발되었다.

QMI는 세포 용해가 형광 염료의 뚜렷한 비율을 포함하는 자기 구슬에 공유결합되는 면역 침전 항체의 패널로 배양되는 항체 기지를 둔 분석입니다. 뚜렷한 자기 비드 클래스에 결합된 특정 항체를 갖는 것은 동일한 용해물로부터 다중 표적 단백질의 동시 동시 동시 면역 침전을 허용한다. 면역 침전 (IP)에 이어, 자기 비드는 두 번째, 형광 공형 프로브 항체 (또는 플루오로포폴화 된 스트렙타비딘과 함께 생체 면역 항체)로 배양됩니다. 각 IP 항체 프로브 항체 쌍또는 PiSCES (노출된 표면 에피토프에 의해 검출된 공유 복합체의 단백질)에 의해 인식된 단백질 간의 공동 연결은 유세포 측정에 의해 검출되고 서로 다른 사이에서 정량적으로 비교될 수 있습니다. 샘플 조건14. 1의 그림은 형광공응접체 프로브 항체에 의해 표지된 면역침전성 단백질 복합체를 가진 자기 비드의 다이어그램을 포함하여 QMI 분석을 실행하는 데 관여하는 단계를 보여 준다(도1C).

QMI의 감도는 면역 침전에 사용되는 자기 비드의 수에 비해 용해물의 단백질 농도에 따라 달라지며, 10% 배 변화를 검출하는 분해능을 달성하는 것은 다른 것에 비해 소량의 시작 물질만필요로 한다. 공동 IP 방법14,15. 예를 들어, QMI에 사용되는 시작 물질의 양은 샌드위치 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 필요한 것과 유사하지만, 단일 QMI 분석에서 여러 상호작용이 검출된다. 20개의 IP 및 20개의 프로브 표적을 사용하여 QMI 표적은 4 mm 피부 생검으로부터 분리된 1-5 x 10 5차 T 세포를 사용하여 수행되었으며, P2 시냅소탈 제제는 마우스 전두엽 피질의 3 mm 관상 동맥 부편에서, 또는 3 x 106 배양 마우스 프라이머리를 사용하여 수행되었다. 피질 뉴런14,16,17. 이 감도는 임상 견본과 같은 제한된 가용성을 가진 세포 또는 조직의 분석을 위해 QMI를 유용하게 합니다.

QMI는 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크(항체가 사용 가능)에 대해 적응할 수 있으며, 현재까지 뉴런의 글루타마테르지시냅스에서 T 세포 항원 수용체(TCR) 신호체 및 단백질의 서브세트를 분석하기 위해 개발되었습니다. 17세 , 18.T 세포 수용체 신호의 연구에서, QMI는 먼저 PiSCES에서 자극 유발 변화를 식별하기 위해 사용되었다, 다음 대조군에서 자가 면역 환자를 구별하기 위해, 내인성 자가 면역 신호를 감지하고, 마지막으로 생성하는 상호 작용의 불균형 질병 관련 하위 네트워크와 관련된 가설14. 보다 최근에는 동일한 QMI 패널이 TCR 관련 단백질 신호(19)의 질적 차이보다는 정량적차이에 의해 결정되는 흉선 선택이 결정되는 것을 결정하는데 사용되었다. 뉴런에서, QMI는 시냅스 가소성17의새롭게 떠오르는 모델을 지원하는 방식으로 뚜렷한 유형의 입력 신호에 대한 단백질 상호작용 네트워크의 입력 특이적 재배열을 설명하는 데 사용되었다. 또한, 이 시냅스 QMI 패널은 자폐증의 7개의 마우스 모델에서 차이를 식별하고, PiSCES 생체 서명을 기반으로 모델을 하위 그룹으로 클러스터화하고, 이전에는 인식되지 않았던 공유 분자 적자를 정확하게 가설하는 데 사용되었습니다. 모델 16중 하나에서 . 유사한 접근은 다른 약 처리에 반응할 수 있는 그밖 소집단을 위해 가리기 위하여 이용될 수 있었습니다, 또는 특정 반응하는 하위 단에 약을 할당하. QMI는 기초 과학 이외에 진단, 환자 서브 타이핑 및 약물 개발에 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

QMI 항체 패널을 조립하기 위해, 초기 항체 스크리닝 및 선택 프로토콜은 아래 섹션 1에 기재되어 있다. 항체 패널이 확인되면, IP를 위한 자기 비드에 선택된 항체의 컨쥬게이션을 위한 프로토콜, 그리고 선택된 프로브 항체의 생체 측질화를 위한, 섹션 2에서 기술된다. 세포 또는 조직 용해에 대한 QMI 분석을 실행하기 위한 프로토콜은 섹션 3에 기재되어 있다. 마지막으로 단일 실험에서는 ~5 x105개의 개별 데이터 포인트를 생성할 수 있기 때문에 데이터 처리, 분석 및 시각화를 지원하는 지침과 컴퓨터 코드가 섹션 4에 제공됩니다. 2-4절에 설명된 워크플로의 개요는 그림1에 나와 있습니다.

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Protocol

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1. 분석 디자인

  1. 후보 항체 제제
    1. 관심 있는 각 단백질에 대해 3-5개의 항체를 선택하여 선별합니다. 가능하면 다른 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체를 사용하십시오. 또한 하나의 비특이적 조절 항체를 포함한다.
    2. Tris를 제거하려면 항체를 30 kDa 스핀 필터에 추가하고 최소 부피로 회전하고 인산완충 식염수 (PBS)의 500 μL을 추가하고 3 번 반복하여 버퍼 교환을 수행하십시오. 담체 단백질을 제거하려면 제조업체의 프로토콜에 따라 항체 정제를 수행하십시오 (특정 정제 권장 사항에 대한 재료 표 참조).
      참고 : 이것은 무료 아민 그룹 (예 : Tris)이있는 담체 단백질 및 완충제가 COOH 그룹과 반응하고 후속 비드 커플링 및 생물 항성 반응을 담금질하기 때문에 수행됩니다. 모든 항체가 정제되어 있는지 확인 (캐리어 단백질 없음) 및 원발성 아민이없는 완충제 (즉, Tris 없음).
    3. 데이비스와 슈럼(20)에 의해 기재된 바와 같이 각 항체를카복실레이트 변형 라텍스(CML) 비드에 결합한다. 항체를 보존하기 위해 비드 커플링 반응을 최대 1/5까지 축소합니다(즉, 3.6 x 106 구슬, 0.2-1 mg/mL 항체의 10 μL).
    4. 혈세포계(일반적으로 ~10 8/mL)를사용하여 비드 숫자를 추정하고 4°C에 보관합니다. 구슬은 1 년 이상 저장되고 QMI 계산서에서 성공적으로 사용되었지만 유통 기한 또는 만료 날짜는 공식적으로 확립되지 않았습니다. B/S 완충제의 NaN3는 세균 성장을 방지합니다.
    5. 각 항체의 일부를 바이오티니레이트합니다(아래 섹션 2.2 참조). 4 °C에서 보관하십시오.
    6. 항체가 제기된 종에 반응성이 있는 PE-컨쥬게이트 항체로 1 x 105 구슬을 염색하여 효과적인 CML 비드 커플링 및 정확한 계수를 확인하고 유동 세포계에서 판독한다.
    7. 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 도트 블롯에 의한 항체 생체 이식을 확인합니다.
    8. 실험실이 효과적인 것으로 알려진 시약을 생성한 후에는 1.1.5 및 1.1.6 단계의 확인 반응에서 이러한 시약을 긍정적 인 대조군으로 사용합니다.
  2. IP-FCM에 의한 항체 스크리닝(유세포측정에 의해 검출된 면역침전)
    1. 적절한 선별 을 결정하십시오. 이 단계와 다른 모든 사전 QMI 스크리닝 단계(이 섹션 1: 분석 설계에 포함된 모든 것)의 경우 가용성이 제한된 바이오 샘플을 사용하지 마십시오. 대신, 야생형 마우스 조직, 세포주, 또는 제한자원이 아닌 정상 인간 공여자 조직과 같은 비교 가능한 대조물질을 선택한다.
      참고: 이 분석에 대한 용해 버퍼를 선택하는 것은 사소한 것이 아니며 섹션 1.5: 세제 선택 및 토론 섹션의 끝에서 두 번째 단락에서 설명합니다. 표준 용해 완충제는 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 10 mM 불소 나트륨, 2 mM 나트륨 orthovanadate, 및 프로테아제 및 인산효소 억제제 칵테일의 염기체를 가지고 있다. QMI와 호환되는 세제는 1% NP-40, 1% 디지토닌, 0.1-1% 트리톤 X-100, 0.5-1% 디옥시콜레이트14,16,17,18,19,21을포함한다.
    2. 각 IP 프로브 조합에 대해 10 μL을 사용하여 각 IP에 사용할 용해물의 총 부피를 계산합니다. X 프로브 항체를 스크리닝하고 하나의 IgG 제어를 사용하는 경우, 각 IP는 (X+1) * (10 μL) * (파이펫팅 오류의 경우 1.1)를 사용합니다. X+1은 필요한 IgG 프로브 제어를 고려하는 것입니다. 예를 들어, 3x3 항체 화면에서, 각 IP는 44 ul을 사용해야 한다. IgG IP 컨트롤을 포함해야 합니다(그림 2의예제 스크리닝 설정 참조).
    3. 사용할 CML 비드 번호를 계산합니다. X 프로브 항체를 스크리닝하는 경우 [(X+1) * 5 x 104 구슬]을 사용하십시오. 이상적으로는 유동 세포계에 의해 웰당 5,000개의 구슬이 발생합니다. 예를 들어, 3 x 3 항체 화면에서 각 IP는 1.1.3 단계에서 준비된 CML 비드 스톡의 약 0.66 μL인 20,000개의 비드를 사용해야 합니다(비드는 먼저 정확도를 보장하기 위해 혈세포계를 사용하여 정량화되어야 합니다).
    4. 1.2.2 단계에서 용해물의 부피를 각 CML 비드의 부피로부터 스크리브화하여 1.2.3단계에서, 4°C에서 밤새 회전하여 비드가 침전되는 것을 방지한다. 전형적으로, 96웰 PCR 플레이트의 첫 번째 컬럼에서 인큐베이션을 수행하고, PCR 튜브 스트립 캡을 캡한다.
    5. CML 구슬을 3,200 x g에서 1분 동안 스핀다운하고 싱크대 위로 플레이트를 빠르게 쓸어넘기면 용해물을 제거합니다. 작은 흰색 펠릿은 각 우물의 바닥에 모두 깜박임 전후에 볼 수 있어야합니다.
    6. 각 비드 프로브 쌍에 대해 20 μL과 동일한 FlyP 버퍼의 부피에 CML 비드를 다시 일시 중단; X 프로브 항체의 경우 1.2.2단계와 유사하게 사용(X+1) * (20 μL) * (파이펫팅 오류의 경우 1.1). 3 x 3 화면의 경우 88 μL의 FlyP 버퍼에서 다시 일시 중단합니다. 플라이P 버퍼는 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1 %BSA, 0.01 % NaN 3입니다.
    7. 각 IP를 96웰 PCR 플레이트의 웰(X+1)에 분산하고, 여기서 X는 20 μL/well을 사용하여 스크리핑되는 프로브 항체의 수입니다. 그림 2 A는 예제 스크리닝 설정을 보여줍니다.
    8. 웰당 200 μL의 FlyP 버퍼를 사용하여 2회 더 씻으시고 세탁하십시오. 1.2.5 단계에서와 같이 플레이트를 회전시키고 각 세척 후 세척 버퍼를 제거하기 위해 플레이트를 쓸어 넘깁니다. 펠릿은 매우 작지만 씻을 때마다 볼 수 있어야합니다.
    9. 스크리핑될 각 생체측 항체에 대해 총 부피를 (Y+1) * 1.1 * 50 μL로 계산하고, 여기서 Y는 스크리핑되는 IP 항체의 수이다. 일반적으로 0.5 mg/mL 스톡의 1:100 희석으로 시작하는 플라이P 완충제의 이 부피에서 작동 농도로 항체를 희석한다.
    10. 희석된 각 항체를 96웰 플레이트의 각 컬럼아래로 분배하고, CML 비드가 다시 중단되도록 한다.
    11. CML 비드가 현탁액에 남아 있도록 15분 간격으로 회전 또는 파이펫팅을 통해 1시간 동안 4°C에서 배양합니다.
    12. 각 세척 원심분리기에 대해 FlyP 버퍼의 200 μL에서 3x를 세척하고 1.2.5 단계에서와 같이 용해를 제거하십시오.
    13. FlyP 버퍼에서 1:200 스트렙타비딘-PE의 50 μL에서 모든 CML 비드를 다시 일시 중단합니다.
    14. 30 분 동안 어둠 속에서 4 °C에서 배양.
    15. 각 세척 원심분리기에 대해 FlyP 버퍼의 200 μL에서 3x를 세척하고 1.2.5 단계에서와 같이 용해를 제거하십시오.
    16. FlyP 버퍼의 200 μL에서 다시 일시 중단한 다음 유동 세포계에서 실행합니다.
  3. 분석에 포함 할 항체 선택
    1. FSC-H 대 SSC-H를 사용하여 크기에 게이트를 하고 FSC-H 대 FSC-A를 사용하여 더블릿을 제거합니다.
    2. PE 형광 강도의 히스토그램을 생성하고 IgG 컨트롤 (IgG 비드 테스트 프로브, 테스트 비드 - IgG 프로브)을 테스트 된 쌍에 오버레이(그림2).
    3. 노이즈에 대한 명확한 신호를 제공하는 비드 프로브 쌍을 찾습니다(그림2B). 또한, 비드 및 프로브 모두에 동일한 항체를 사용하는 것은 이상적이지 않다. 차등 에피토프 인식은 몇몇 에피토프가 특정 단백질 복합체에서 폐색될 수 있기 때문에 상호 작용을 관찰의 기회를 최대화합니다. 허용 가능한 옵션이 없는 경우 추가 항체로 화면을 반복하십시오.
  4. 항체 특이성의 확인
    1. 의도된 표적에 대한 항체 특이성을 보장하기 위해, 타겟이 녹아웃된 용해 샘플을 사용; 예를 들어, 녹아웃 마우스 또는 RNAi 세포주. 대안적으로, 표적 단백질이 인위적으로 발현된 표적 음성 세포주에서 용해염을 사용한다.
    2. 1.2단계에서 설명한 대로 IP-FCM을 수행하고 실험에 맞게 수정한다.
  5. 세제 선택
    1. 공동 IP 실험에서 세제는 매우 중요하기 때문에 실험이 변화를 감지할 가능성이 극대화되도록 다양한 변형을 경험적으로 테스트합니다. 시작하려면 주어진 조건에서 변경되거나 연구에 특히 관심이 있는 비교적 작은 상호 작용 패널(4-8)을 선택합니다.
    2. 초기 스크린을 위해 만들어진 비형광, 항체 접합CML 비드를 사용하여, 다양한 용해 완충세제 조건을 사용하여 1.2에 기재된 바와 같이 IP-FCM을 수행한다. 세제 스크린은 유일한 변수로 세제로 수행하거나 각 세제에 대해 다른 세포 조건으로 수행 할 수 있습니다. 세제는 때때로 일부 IP-프로브 조합에서 예기치 않은 배경을 생성하기 때문에 항상 구슬과 프로브 모두에 IgG 컨트롤을 사용합니다.
    3. 화면의 MPI를 기반으로 PiSCES에 대한 신호를 최적화하는 세제를 선택합니다. 일부 타협은22를만들어야 할 가능성이 높습니다.

2. 멀티플렉스 시약 준비

  1. 마그네틱 비드 커플링
    1. 자기 비드 영역 맵을 사용하여 비드 영역을 선택하여 교차 감지 위험을 최소화하는 패턴으로 사용합니다. 마그네틱 비드는 일반적으로 위와 오른쪽으로 번지므로 대각선으로 인접한 비드 영역을 피하십시오. Luminex 웹 사이트에 표시된 비드 다이어그램의 다른 모든 열의 비드는 권장됩니다 (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. 250 μL에서 PBS에서 0.1 mg/mL에서 캐리어가 없는 항체를 준비하십시오.
    3. 소용돌이 자기 구슬 광범위하게, 다음 aliquot 250 μL 호박 미세 원심 분리 튜브로 (광 표백으로부터 구슬을 보호하기 위해).
    4. 60s에 대한 자기 분리 자기 구슬과 상급을 제거합니다.
    5. MES 버퍼 250 μL(50 mM MES pH 6.0, 1 mM EDTA),와류, 60초 동안 자기적으로 분리된 후퍼내퍼를 제거합니다. MES 버퍼의 200 μL에서 자기 비드를 반복하고 다시 중단합니다.
    6. Sulfo-NHS의 일회용 튜브 2 mg에 MES 40 μL을 추가하여 50 mg/mL 스톡을 만듭니다.
    7. 자석 구슬에 갓 만든 Sulfo-NHS 25 μL을 추가하십시오. 소용돌이.
    8. MES 버퍼에 25 μL의 50 mg/mL을 새로 용해된 EDAC [1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염을 MES 버퍼에 추가합니다. 소용돌이.
    9. 방 온도, 1000 rpm에서 20 분 동안 튜브 홀딩 부착물로 소용돌이를 덮고 흔들어줍니다.
    10. 60s를 위해 자석으로 분리하고 상한체를 제거하십시오.
    11. PBS, 소용돌이, 60 s에 대해 자기적으로 분리된 500 μL로 재중단하고 상한체를 제거합니다. 반복.
    12. 단계 2.1.2에서 항체 용액의 250 μL에서 재중단. 소용돌이.
    13. 1000 rpm에서 소용돌이에 흔들어 방 온도에서 2 시간 배양.
    14. 500 μL의 PBS를 자기 구슬, 소용돌이에 넣고 60초 동안 자석으로 분리하고 상한을 제거합니다.
    15. 블로킹/저장(B/S) 버퍼 750 μL을 추가합니다(PBS pH 7.4에서 BSA1% 0.01% NaN 3). 커버 와 방 온도에서 30 분 배양, 1000 rpm.
    16. 60s를 위해 자석으로 분리하고 상한체를 제거하십시오. B/S 버퍼의 100 μL에서 다시 일시 중단합니다.
    17. 4 °C에서 보관하십시오. 구슬은 1 년 이상 저장되고 QMI 계산서에서 성공적으로 사용되었지만 유통 기한 또는 만료 날짜는 공식적으로 확립되지 않았습니다. B/S 완충제의 NaN3는 세균 성장을 방지해야 한다.
    18. 1.1.5단계에서와 같이 형광 항숙성 종 보조 및 유동 세포계에서 판독된 결합된 자기 비드의 ~0.25 μL을 염색하여 자기 비드 커플링을 검증합니다.
  2. 생생
    1. 항체가 담체 단백질이 없는 PBS에 있는지 확인합니다.
    2. 생체연화될 항체의 총 μg를 계산합니다(멀티플렉스에 사용하기 위해 권장되는 100-200 μg, 스크리닝에 권장되는 25-50 μg).
    3. 신선한 10 mM 설포-NHS-비오틴을 준비합니다(ddH2O 의 224 μL을 1 mg 무계량 튜브에 첨가하여 수행할 수 있음).
    4. 항체, 소용돌이 또는 파이펫의 25 μg 당 10 mMM sulfo-NHS-비오틴 1 μL을 위아래로 섞어 넣습니다.
    5. 1 시간 동안 실내 온도에서 배양하십시오.
    6. 1 시간 동안 4 °C에서 배양하십시오.
    7. 30 kDa 스핀 필터를 사용하여 언바운드 비오틴을 제거하고 반응을 중지하십시오. PBS 500 μL을 추가하고 최소 볼륨에 도달할 때까지 열을 회전시면 됩니다. 500 μL의 추가 PBS를 추가하고 총 3개의 버퍼 교환을 반복합니다.
    8. 분광광도계에서 1-2 μL의 흡광도를 측정하여 농도를 추정한 다음 항체 농도를 0.5 mg/mL로 가져옵니다.
    9. 4 °C에서 보관하십시오.

3. 정량 적 다중 면역 침전

  1. 플레이트 레이아웃
    참고: 이 분석은 96웰 플레이트와 2-4개의 시료 조건을 사용하여 수행할 때 가장 효과적입니다.
    1. 조건 간의 변화를 감지하기 위해 항상 동일한 플레이트에서 적절한 컨트롤(즉, 자극된 v. 자극되지 않은 세포)을 실행합니다. 각 샘플을 플레이트 전체에 수평으로 분배하고, 각 컬럼을 다른 프로브 항체에 사용한다. 각 프로브에 대한 기술 복제 집합은 첫 번째 집합 직후에 실행되어야 합니다. 예제는 그림 3을 참조하십시오.
    2. 정확한 플레이트 로딩 및 해석을 용이하게 하기 위해 플레이트 레이아웃을 신중하게 문서화합니다.
  2. 시료 제제 및 면역 강수량 (1일째)
    1. 프로테아제 및 인산염 억제제와 함께 적절한 세제에서 조직 또는 세포를 용해시키고 15 분 동안 얼음에 배양하십시오. 항상 차가운 물기를 유지하기 위해주의하십시오.
      참고: 생체 재료 및 용해 단백질 농도를 정확하게 나타내는 양은 경험적으로 결정되어야 하며, 이전에 사용된 샘플의 몇 가지 예는 소개의 세 번째 단락에 나열되어 있습니다. 일반적으로, 시료당 2 mg/mL 단백질의 200 μL의 범위에서 과거에는 20개의 IP 및 20개의 프로브 표적에 대해 성공적이었지만, 각 항체 패널 및 세포 또는 조직 유형에 대한 이상적인 입력은 경험적으로 결정되어야 한다.
    2. 멤브레인과 이물질을 제거하기 위해 16,000 x g에서 15 분 동안 4 °C에서 스핀 다운하십시오. 상급 을 유지 하십시오.
    3. BCA 분석 또는 이와 유사한 단백질 농도를 결정한 다음 샘플 간에 단백질 농도를 정상화합니다. 셀을 사용하는 경우 조건당 동일한 수의 셀로 시작하고 정규화는 선택 사항입니다.
    4. 분석에서 각 클래스의 ~ 250 자기 비드를 포함하는 마스터 마그네틱 비드 믹스를 준비합니다. 데이터 분석 후 비드 숫자를 조정하여 향후 분석에서 각 클래스의 평균 110개의 비드를 웰당 읽을 수 있도록 합니다.
      참고: 예제 계산: (새 비드 체적) = [(실행 평균) / 110] * (이전 비드 체적). 비드 볼륨은 필요에 따라 8회 실행될 때마다 이러한 방식으로 조정해야 합니다. 전형적으로, 각 자기 비드의 3-4 μL(위와 같이 제조)은 2플레이트 실험에 사용된다.
    5. 자기 분리로 FlyP 버퍼에서 자기 비드 믹스 2x를 세척한 다음 FlyP 버퍼에서 다시 일시 중단합니다. 재서스펜션의 경우 플레이트당 샘플당 10 μL을 사용하십시오. 플라이P 버퍼는 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1 %BSA, 0.01 % NaN 3입니다.
    6. 마그네틱 비드 혼합물을 철저히 소용돌이치면, 10 μL을 얼음 차가운 미세원원지 튜브(샘플당 1개의 튜브)로 넣습니다. 면역 침전을 위해 각 튜브에 동일한 양의 용해액 (정규화 된 농도)을 추가하십시오.
    7. 용해-자기 비드 혼합물을 각 플레이트가 실행되도록 하나의 튜브로 Aliquot; 예를 들어 2 플레이트 실험의 경우 용해구를 두 개의 튜브로 분할합니다. 빛을 유지하기 위해 덮여 면역 침전을 위해 하룻밤 4 °C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.
  3. 분석 을 실행 (2 일)
    1. 플레이트 #1 용 용해 자석 비드 튜브로 시작합니다. 마그네틱 비드 랙을 사용하여 자기 비드에서 용해를 제거하고 향후 분석을 위해 용해를 예약합니다. 얼음 차가운 FlyP 버퍼의 500 μL에 구슬 2 x를 씻으소서. 튜브튜브를 항상 얼음이나 4°C로 유지하십시오.
    2. 재서스펜션 볼륨을 (프로브 수) * (2 개의 기술 복제) * (웰 당 25 μL) * (파이펫팅 오류의 경우 1.1)로 재서스펜션 볼륨을 계산합니다. 얼음 차가운 FlyP 버퍼의 계산된 볼륨에서 IP를 다시 일시 중단합니다.
    3. 부드러운 파이펫팅으로 자기 구슬을 철저히 재중단한 후, 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 우물당 25 μL을 얼음 위에 분배합니다.
    4. 다른 96웰 플레이트에서, 플라이P 버퍼에서 생체 물질화된 프로브 항체를 2배 작업 농도(일반적으로 1:100 또는 1:200, 경험적으로 결정함)로 희석하여 순서가 플레이트 레이아웃의 컬럼과 일치하도록 합니다(그림 3 참조) ). 작업 농도에서 프로브 항체의 최종 부피는 웰 당 50 μL이 될 것이므로 제조 된 각 2x 항체의 부피는 (25 μL) * *(생물학적 샘플 의 수) * (2 기술적 복제) * *(파이펫팅 오차에 대한 1.1).
    5. 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 프로브 항체 희석의 25 μL을 자기 비드 함유 분석 판에 분배합니다.
    6. 수평 플레이트 셰이커를 흔들어 자기 구슬을 혼합하고 다시 일시 중단한 다음 4 °C에서 1 시간 동안 배양하고 어둠 속에서 450 rpm에서 흔들어줍니다.
    7. 4 °C에서 자기 플레이트 와셔에 FlyP 버퍼로 3x를 세척하십시오.
    8. 1:200 스트렙타비딘-PE의 50 μL에서 자기 구슬을 다시 중단하십시오.
    9. 흔들어서 구슬을 섞고 다시 일시 중단한 다음 4°C에서 30분 동안 배양하고 어둠 속에서 450rpm으로 흔들어 줍니다.
    10. 4 °C에서 자기 플레이트 와셔에 FlyP 버퍼로 3x를 세척하십시오.
    11. FlyP 버퍼의 125 μL에서 다시 일시 중단합니다.
    12. 900 rpm에서 1 분 동안 흔들어서 구슬을 완전히 다시 떨어 뜨리십시오.
    13. 냉장 유량 세포계에서 실행합니다(그림 S1의다이어그램 참조). 유세포계 소프트웨어에서 "높은 RP1 표적" 설정을 사용하고 지역당 1,000개의 비드의 정지 조건(기계가 조기에 정지하는 것을 막기 위해 개별적인 우물에 있어야 하는 수를 크게 초과)과 80 μL의 샘플 볼륨을 사용합니다.
    14. 중간 쯤에 달리기를 일시 중지하고 구슬을 다시 일시 중단하여 침전을 방지합니다.
    15. .xml 형식으로 데이터 파일을 내보냅니다.
    16. 3.3.1 단계에서 시작하여 나머지 플레이트에 대한 과정을 반복합니다.

4. 데이터 분석

참고: ANC 코드는 N = 4개의 실험에서 두 가지 조건을 비교하도록 설계되었으며 각 조건에 대해 2개의 기술 복제본이 있습니다. 예를 들어, 세포는 4개의 독립적인 시간을 자극하고, QMI는 상기와 같이 기술적 복제와 함께 제어(un자극되지 않은) 및 자극된 세포에 대해 4개의 상이한 날에 실행되고, 데이터 분석은 아래에 설명된 바와 같이 진행된다.

  1. 조정 가능한 알파 컷오프(ANC)가 있는 적응형 비파라메트릭
    1. MATLAB을 열고 활성 디렉터리를 ANC 프로그램 구성 요소와 유동 세포계에서 내보낸 .xml 파일이 포함된 폴더로 설정합니다.
    2. 실험 설계의 세부 사항을 반영하기 위해 "ANC 입력" 파일을 입력합니다. 추가 파일에 포함된 예제 파일은 예제 데이터를 실행하기 위해 미리 채워졌으며 또한 제공되었습니다.
    3. 활성 디렉터리에 .csv 파일을 작성하는 프로그램을 실행합니다. 이 파일은 제어 조건과 실험 조건 간에 0.05의 거짓 양성(알파) 수준에서, 4개의 실험 복제또는 적어도 3/4 복제에서 현저하게 다른 PiSCES를 보고합니다.
    4. 참고 'ANC 조회수'는 PiSCES로 정의되며, 4.3.1 단계에서 사용하기 위해 파일에서 3/4 °C 4/4로 표시되는 최소 3개의 실험 복제에 상당한 차이가 있습니다.
  2. 가중 상관 관계 네트워크 분석23 (CNA)
    1. "_MFI"로 끝나는 Matlab의 데이터 파일 출력의 열 제목을 붙여넣습니다. CSV"를 새 엑셀 시트의 첫 번째 행에 넣습니다. 실험 번호에 대한 열 "실험", 및 "치료", 실험 치료, 또는 분석 할 다른 변수를 추가합니다. 이 파일을 "traits.csv"로 저장합니다.
    2. R 스튜디오를 열고 작업 디렉토리를 "_MFI"가 포함된 폴더로 설정합니다. CSV"와 "특성. CSV" 파일.
    3. 주석 처리된 명령 파일및 파일에 포함된 지침에 자세히 설명된 대로 R 명령을 실행합니다. WCNA 모듈은 각 실험 적 특성과 크게 상관관계가 있는 그래픽 파일로 출력되며, 각 모듈과 각 상호 작용 IPi_ProbeJ의 상관관계는 .csv 파일로 출력됩니다.
    4. 모듈 멤버 자격(MM)과의 상호 작용으로 정의되는 'CNA 조회수'는 4.3.1단계에서 사용하기 위해 관심 있는 실험 변수와 유의한 상관관계로 확인된 모듈의 멤버십에 대해 0.7 및 p<0.05로 정의됩니다.
  3. 긍정적인 '조회수' 및 시각화
    1. ANC 출력 파일의 "3/4 °C 4/4 조회" 목록의 각 상호 작용에 대해(4.1.4 단계에서) CNA 출력 파일을 확인하여 해당 상호 작용이 "CNA 히트"인지 확인합니다(단계 4.2.6 참조). 각 ANC 적중이 CNA 적중인지 를 나타내는 새 열을 만듭니다.
    2. 4.1.3단계에서 ANC 출력 스프레드시트 "_Hits.csv"에 제공된 값을 평균화하여 각 ANC 에 대한 평균 로그2배 변경 값을 계산합니다. 값을 평균화하기 전에2배 변경값으로 변환합니다. 3/4 복제에서만 중요한 상호 작용의 경우 이상값 값을 삭제합니다.
    3. 각 ANC °C 를 한 열에 IP로 나열하고 두 번째 열의 프로브와 세 번째 열의 배 변경 값을 표시하여 스프레드시트를 만듭니다. 이 스프레드시트를 사용하여 파일을 네트워크로 가져와 Cytoscape에서 노드 에지 다이어그램을 만듭니다.

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Representative Results

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항체 스크리닝
그림 2 B는 코넥신36 단백질에 대한 스크린의 결과를 나타낸다. 대부분의 IP_probe 조합은 IgG 컨트롤에 대한 신호를 생성하지 않습니다. 단일클론 항체 1E5 및 1E5 또는 폴리클로날 항체(6200)를 가진 프로브를 가진 IP는 IgG 대조군과 비교하여 비드 분포에서 우회적인 변화를 일으킨다. 여기서, IP 1E5 및 프로브 6200poly는 IP 및 프로브와 동일한 항체를 사용하지 않기 위해 선택되었으며, 둘 다 2개의 독립적인 항체에 의해 인식되는 비특이적 단백질의 확률을 감소시키고, 이를 사용하여 공동 연관성을 검출할 확률을 증가시키기 위해 선택되었다. 다른 에피토프. IgG 컨트롤에 비해 최소 1-2로그 가 더 높은 MFI를 사용하는 IP_probe 조합을 선택하는 것이 가장 좋지만, 대안이 없는 경우 컨트롤과 일관되게 구별되는 약한 MFI를 생성하는 쌍이 사용될 수 있습니다. 그림 2 C는 1E5-6200poly 조합에 대한 특이성 검증 실험을 나타낸다. Connexin36 플라스미드로 형질감염된 293개의 세포로부터 의 용해는 IgG 대조군과 중첩된 동안 비드 분포에서 ~1.5-log 우측 시프트를 생성하였다. 한 쌍의 특이성을 확인할 때, 표적 단백질이 없는 녹아웃 동물 또는 세포주로부터 음성 대조군 용해는 IgG 대조군과 유사한 MFI를 가져야 한다.

비드 커플링
전형적인 자기 비드 커플링 품질 관리 반응은 3 과 5 사이의 밝기 지수 (예 : PE 또는 FITC)와 형광에 컨쥬게이스된 이차 항체로 염색 될 때 배경 위의 MFI 3-4 로그를 줄 것이다. 4는 새로운 마그네틱 비드의 컨쥬게이션을 대체하는 이전 배치와 비교하여 전형적인 품질 관리 반응을 나타낸다.

데이터 분석
각 실험에서 ANC는 사용자 정의 제어 및 실험 조건 사이의 각 웰(즉, 가능한 모든 IP_Probe 조합)에서 각 자기 비드 클래스의 형광 분포를 비교합니다. 콜로모그로프-슈미르노프(K-S) 통계에 따라 동일한 집단에서 구슬이 샘플링되었을 확률을 반영하는 각 조합에 p-값을 할당합니다. 그런 다음 여러 비교를 수정하고 기술적 가변성(기술 복제간의 차이)을 고려하여 가양성 비율을 생성하는 데 필요한 K-S p-값을 계산합니다. K-S 테스트 p-값이 네 가지 실험에서 계산된 컷오프 보다 낮거나 적어도 3/4 실험(3/4μm 4/4)을 식별하는 IP_probe 조합(PiSCES)이 식별됩니다. p-value 컷오프는 이러한 서로 다른 수준의 엄격성에 따라 다르기 때문에 PiSCES는 4/4에서 식별되지만 3/4는 4/4가 아니라 별도의 목록이 계산됩니다. 자세한 ANC 방정식은 (Smith et al. 2016)을 참조하십시오. 14 WCNA 분석 및 결과에 대한 세부 사항은 랭펠더 외23에 의해 철저하게 논의된다.

데이터 프레젠테이션
ANC 및 CNA23 분석은 PiSCES를 식별하기 위해 수행되며, (1) 실행의 적어도 3/4에서 실험 조건 간의 상당한 배 변화를 보여주고 (2) 실험 변수와 상관관계가 있는 CNA 모듈에 속합니다. 2개의 독립적인 통계 접근법에 의해 확인된 이 높은 신뢰도 PiSCES는 ANC에 의하여 CNA PiSCES로 불립니다. 이러한 상호 작용은 오픈 소스 소프트웨어 Cytoscape (그림5a)를 사용하여 노드 에지 다이어그램으로 시각화 될 수 있습니다 또는 보충 자료에 포함 된 R 코드 및 분석 지침을 사용하여 히트 맵으로 (그림5b) ).

Figure 1
그림 1 . 정량 적 멀티플렉스 면역 침전의 개요. (a) 이전에 스크리니드된 항체는 별도의 반응에서 서로 다른 종류의 자기 비드에 공유적으로 결합된다. (b) 하룻밤 동안, 단백질 복합체는 항체 결합 자기 비드의 혼합물을 사용하여 면역 침전된다. (c) 동면역침전성 단백질은 프로브 항체 및 형광소에 의해 표지된다. (d) 마그네틱 비드 및 표지된 단백질 복합체는 냉장 된 유세포계를 통해 공유 복합체에서 발생하는 상대적 양의 단백질을 정량화합니다. 사용자 지정 냉장에 대한 회로도는 그림 S1을 참조하십시오. (e) 유동 세포계 관리자 소프트웨어는 MagBeads를 클래스별로 분리하고 (f) 각 비드 영역에서 형광 히스토그램을 표시합니다. (g) 데이터는 .xml 파일로 내보내지고 두 개의 독립적인 통계 접근법에 의해 분석됩니다. 두 분석에서 식별된 PiSCES만 히트맵 및 노드 에지 다이어그램 시각화를 사용하여 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 . IP-FCM을 이용한 코넥신 36 항체 스크리닝. (a) IP-FCM은 코넥신 36(Cx36) CML 비드 및 프로브의 4x4 패널을 사용하여 마우스 뇌 용해물상에서 수행하였다. 리세이트는 플레이트의 별도의 행에서 각 CML 비드를 면역침전시켰다. 세차 후, 각 비드는 컬럼당 하나의 프로브 항체를 첨가할 수 있도록 그 행에 분포되었다. (b) 대부분의 항체 조합은 IgG 배경(회색, 파란색)에 신호(주황색)를 표시하지 않습니다. 6200Poly 프로브가 있는 1E5 IP는 허용 가능한 포지티브 신호를 보여줍니다. 1E5 비드/프로브 및 6200Poly 비드/프로브 쌍은 각각 허용 가능한 신호를 보여 주지만 비드 및 프로브 모두에 동일한 항체를 사용하는 것은 이상적이지 않습니다. 차등 에피토프 인식은 몇몇 에피토프가 특정 단백질 복합체에서 폐색될 수 있기 때문에 상호 작용을 관찰의 기회를 최대화합니다. 1E5 프로브가 있는 6200Poly 비드는 가장 강한 신호를 제공하고 특이성 확인을 보류중인 멀티플렉스 분석에서 사용하도록 선택되었습니다. (c) IP-FCM을 스크리닝으로부터 선택된 Cx36 항체 쌍을 이용하여 Cx36 및 비형질감염 대조군으로 형질감염된 293T 세포의 용해물 상에서 수행하였다. Cx36 형질 감염 된 세포에서 명확한 신호가 있다, 하지만 비 형질 감염 된 세포는 IgG 비드/프로브 컨트롤에서 구별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 . 예제 플레이트 레이아웃입니다. 4-컨스쳐 멀티플렉스는 96웰 플레이트에 설치됩니다. 샘플 1-4는 연속행으로 로드되고(각 생물학적 샘플은 서로 다른 색상으로 표시됨) 기술 복제본은 다음 4개의 행에서 동일한 순서로 로드됩니다. 열당 하나의 프로브가 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 . 새로운 MagBead의 컨쥬게이션을 비교하는 일반적인 품질 관리 반응은 교체되는 이전 배치와 비교됩니다. 비드는 배경 위에 MFI 2-4 로그를 제공하며 새 배치에는 이전 배치와 유사한 MFI가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5 . QMI는 배양된 피질 뉴런에서 NMDA 자극 5분 후 크기가 변하는 시냅스 PiSCES를 식별합니다. QMI 실험 비교 NMDA 자극 대. 자극 되지 않은 (ACSF 제어) 뉴런. ANC 와 CNA 분석에 의해 확인 된 PiSCES가 제시된다. (a) 오픈 소스 소프트웨어 Cytoscape를 사용하여 생성된 노드 에지 다이어그램에서, 노드는 QMI 패널에서 IP 및 프로브로서 포함되었던 항체 표적(단백질)을 나타낸다. 가장자리는 ANC를 나타내며, 가장자리의 색상과 두께는 NMDA 처리 및 제어 사이의 접지 변화의 방향과 크기를 나타냅니다. NMDA 와 제어 조건 사이에 변경되지 않은 PiSCES는 그림에 포함되지 않습니다. (b) 히트맵.2 함수를 사용하여 R에서 생성된 히트맵은 동일한 ANC를 나타낸다. ComBAT 정규화, 로그2 MFI 값은 ~ 3 로그에 걸쳐 있는 데이터를 설명하기 위해 행별로 정규화되고, 각 실험 복제에 대한 상대 MFI는 보고된 각 PiSCES의 상대적 크기와 일관성을 보여 줍니다. 이러한 수치를 재현하는 데 필요한 데이터와 코드는 추가 파일에포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary Figure 1
그림 S1: 유세포 분석 시스템의 사용자 정의 냉장 다이어그램. 유세포계의 어레이 리더는 실온에서 보관해야 하지만 분석 중에 PiSCES를 유지하기 위해 하부(마이크로플레이트 플랫폼)를 냉장 보관해야 합니다. 사용된 유세포계 및 샌드위치 준비 냉장고에 대한 모델 정보는 재료 표를 참조하십시오. (a) 샌드위치 준비 냉장고에서 상부 부착물 및 식품 저장 함물을 제거하였다. 마이크로플레이트 플랫폼은 플라스틱 식품 저장 통을 보유하기 위한 금속 지지대 위에 배치되었다. 마이크로 플레이트 플랫폼의 플라스틱 하우징을 제거하여 적합하게 만듭니다. 맞춤형 플렉시 글라스 플랫폼은 냉장고의상부 개구부를 덮기 위해 (b)에 표시된 측정값으로 제작되었습니다. 플렉시 글라스는 플렉시 글라스의 크기에 맞게 1/2 "폼 절연 컷으로 절연하고, 절연 테이프로 간격을 밀봉했다. 그런 다음 플렉시글라스를 통해 구멍을 뚫어 유세포계 분석 기부로부터 샘플 바늘이 확장될 때 마이크로플레이트 플랫폼에 접근할 수 있도록 하였다. 원래 마이크로 플레이트 플랫폼의 상단에 나사로 조인 된 검은 색 커플링 장치를 제거하고 정렬을 도왔던 플렉시 유리 위에서 마이크로 플레이트 플랫폼으로 다시 나사로 조였습니다. 플렉시글라스 커버의 도어를 통해 마이크로플레이트 캐리어가 장치 밖으로 확장될 때 사용자가 접근할 수 있습니다. 유량 세포계 소프트웨어는 플레이트 캐리어가 너무 차가웠음을 사용자에게 경고하지만 사용자는 경고를 재정의하고 냉각된 QMI 실험을 실행할 수 있습니다. (c) 조립 된 시스템의 사진. (d) 전면 오른쪽 모서리의 세부 사항 , (a)에 그려진 대로 플렉시 유리 커버와 단열재의 조립을 보여 주실 수 있습니다. (e) 구멍 위에 정렬 된 샘플 바늘의 세부 사항. (f) 단열재의 면도 된 부분의 세부 사항은 장치 아래의 공기 흐름을 허용합니다. (g) 아래의 유량 세포계 마이크로 플레이트 플랫폼을 보여주는 열린 도어의 세부 사항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplementary File
보조 파일. 이러한 수치를 재현하는 데 필요한 데이터 및 코드입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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QMI 분석법은 항체 패널 개발, 장비 및 시약에 상당한 투자가 필요하지만, 일단 분석이 확립되면 실험적으로 제어되는 단백질 상호 작용 네트워크를 관찰하는 고차원 데이터를 수집할 수 있습니다. 자극. 기술적으로 QMI는 시료 및 항체 유정 위치의 신중한 파이펫팅 및 추적이 필요합니다. 분석 판에 신중하게 라벨을 붙이는 것은 종이에 우물 위치의 상세한 템플릿을 만드는 것과 같이 유용하며, 이는 데이터 분석을 위해 저장됩니다. 유세포계 마이크로플레이트 캐리어(사용자 지정 냉장 지침의 경우 그림 S1 참조)를 포함하여 구슬과 용해액을 항상 차갑게 유지하는 것의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 단백질 상호 작용은 실온에서 빠르게 해리되며, 수정되지 않은 실온 유동 세포계를 사용하는 초기 시도는 많은 온도-불안정한 상호 작용의 식별로 끝났지만 의도된 대로 변경되지는 않습니다. 자극.

QMI는 항체 기반 분석기이므로 항체의 초기 선택이 중요합니다. 단일 클론 또는 재조합 항체는 결과의 가변성을 줄이기 위해 가능하면 사용되어야한다. 폴리클로날은 로트 대 로트 변동을 나타내지만, 짧은 에피토프에 대한 펩티드 계 폴리클로날은 시간이 지남에 따라 상대적으로 안정한 것으로 보인다. 드리프트는 항체의 큰 배치를 구입하여 최소화 될 수있다; 이것은 또한 멜론 젤과 스핀 컬럼을 사용하여 항체를 정화할 필요성을 배제하는 무담체 없는 항체의 사용자 정의 주문, 및 관련 항체 손실을 허용합니다.

또한, 신호를 검출하는 것이 사용 가능한 에피토프에 의존하기 때문에, 신호의 부족이 반드시 상호작용의 부족을 나타내는 것은 아니며, 다른 단백질 상호작용 방법론과 공통되는 한계를 나타낸다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 14 또한, 신호가 감지되면 단백질 상호 작용이 직접적(A는 B와 상호 작용) 또는 간접(A가 X 및 Y와 상호 작용한 다음 B와 상호 작용함)을 명확하게 상태를 나타내는 것은 불가능하며, 이 때문에 관찰된 상호작용은 직접 결합을 암시할 수 있는 단백질 단백질 상호 작용(PPI)이 아닌 PiSCES라고 합니다. 염두에 두어야 할 모든 항체 기반 방법의 한계는 항체의 추가가 단백질 복합체를 방해하거나 안정화시킬 수 있다는 것입니다. 서쪽 혈전이 아닌 유동 세포 측정을 사용하는 또 다른 제한은 항체 특이성을 확인하기 위한 크기 정보가 사용할 수 없다는 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, IgG 대조군은 각 항체 쌍을 스크리닝하는데 사용되며, QMI 실험을 진행하기 전에 녹아웃 또는 녹아웃 세포주 또는 동물로 특이성이 확인된다(섹션 1.4).

IgG 컨트롤은 각 IgG가 서로 다른 수준의 배경 신호를 생성하기 때문에 QMI 분석에서 사용되지 않으므로 빼기 위해 올바른 배경 값을 알 수 없습니다. 예를 들어 IP(X)_probe IgG가 MFI를 100으로 제공하고 IP IgG_probe Y가 MFI를 200으로 제공하는 경우 IP X_probe Y에서 어떤 배경 값을 빼야 합니까? 유사하게, 때때로 발견되지 않은 상호작용(예를 들어, IP X 프로브 Z)은 비특이적 IgG 상호작용보다 더 낮은 MFI를 가질 것이다. 절대 MFI 신호를 모르는 이러한 제한을 고려하기 위해 PiSCES는 임의의 배경 수준 이상으로 감지되는 것으로만 보고되지 않습니다. 대신, 주어진 자극에 대 한 응답에서 변경 하는 PiSCES만 보고 됩니다. 높은 MFI는 비특이적 노이즈로 인해 발생할 수 있지만 이 노이즈는 자극에 따라 변경되지 않습니다. 또한, 부분 (10-20%) 관찰된 조건 의존적 상호작용의 경우 는 일반적으로 제2 방법, 즉 IP-서부에 의해 확인된다. 이 확인은 RT-PCR로 고처리량 RNA 시퀀싱 결과를 확인하는 데 유사하며 QMI 결과를 신뢰도를 높이기 위한 것입니다.

QMI가 단백질의 증가된 절대 수준과 단백질의 증가된 호모 멀티머화를 구별하지 않기 때문에 QMI 결과에 영향을 미치는 발현 효과는 추가 검사 없이 배제될 수 없다. 발현에 관한 불확실성을 최소화하기 위해 단백질 발현 수준의 잠재적 변화를 최소화하는 짧은 기간의 급성 치료 조건을 사용하여 실험을 수행할 수 있습니다. 다른 방법은 만성 치료 조건 또는 1 차적인 참을성 있는 견본에 있는 발현 효력을 배제하기 위하여 필요합니다.

QMI에 적합한 용해 버퍼를 선택하는 것이 중요합니다. 세제의 너무 약한 막을 그대로 두고 복잡 하지 않은 단백질을 함께 보유 수 있습니다., 너무 강한 세제 는 단백질 복합체를 파괴할 수 있습니다. 칼슘 또는 그 킬레이레이터의 존재와 같은 추가 요인은 PiSCES에 극적으로 영향을 미칠 수 있으며 QMI 패널에 포함할 항체를 선별하기 전에 신중하게 고려해야 합니다. IP-서부 실험의 경우, 용해 조건은 일반적으로 사례별로 각 PiSCES에 최적화되지만, 단일 PiSCES를 검출하기 위한 최상의 조건은 동일한 단백질네트워크(22)에서다른 PiSCES로 변환되지 않을 수 있다. 세제 선택은 항체 후보를 스크리닝하기 위해 용해 완충제가 필요하지만 적절한 용해 완충제를 선별하기 위해 항체 패널이 필요하다는 점에서 닭고기와 계란 딜레마를 제시합니다. 완벽한 해결책은 아니지만, 특정 관심사또는 자극에 대한 응답으로 알려진 연관 또는 해리가 있는 구슬 및 프로브의 작은 패널을 선택하고 CML 비드의 다른 용해 조건하에서 동작을 테스트할 수 있습니다. 처음에 스크리닝 항체에 사용되었습니다 (단계 1.1.3). 이상적인 세제는 PiSCES의 신뢰할 수 있는 검출과 주어진 자극으로 알려진 생리적 단백질 거동(결선/해리)의 회수를 허용해야 합니다. 세제가 막을 완전히 용해시키지 않을 우려가 있는 경우, 두 개의 단백질이 막24에의해 연결된 경우에만 신호를 제공하는 음성 대조군 항체를 첨가할 수 있다. 적절한 용해 완충제가 선택되면, 키나아제와 기판 사이의 것과 같은 약한 상호작용의 변화도 안정적으로 검출될 수 있다(예를 들어 TCR-LCK)14.

뉴런과 T 세포에서 QMI를 사용한 이전 연구는 QMI 결과의 유효성에 대한 신뢰를 높이기 위해 이전 연구 결과를 신중하게 확인했으며 신호 전이 및 질병 경로에 대한 발견으로 이어진 새로운 가설을 생성했습니다. 미래에, QMI는 그밖 단백질 상호 작용 네트워크에 적응되고 유효한 현재 마이크로스피어 종류와 가진 500의 단백질까지 확장될 수 있습니다. QMI를 사용하여 다중 단백질 복합체의 네트워크가 세포 과정을 제어할 때 자극에 반응하여 어떻게 변화하는지 연구하면 건강과 질병 모두에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 QMI 분석 개발에 중요한 기여에 대한 테사 데이비스를 인정하고 자합니다, 기술 지도 및 지적 입력스미스와 슈럼 연구소의 현재와 전 회원. 이 작품은 NIMH 보조금 R01 MH113545 및 R00 MH 102244에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

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References

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멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화
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Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

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