Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

doi: 10.3791/60029 Published: August 21, 2019

Summary

Kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI) använder flödescytometri för känslig detektion av skillnader i överflödet av riktade protein-protein interaktioner mellan två prover. QMI kan utföras med en liten mängd biomaterial, kräver inte genetiskt modifierade taggar, och kan anpassas för alla tidigare definierade protein interaktion nätverk.

Abstract

Dynamic protein-protein interaktioner kontroll cellulära beteende, från motilitet till DNA-replikering för att signalera transduktion. Dock är det tekniskt svårt att övervaka dynamiska interaktioner mellan flera proteiner i ett protein interaktions nätverk. Här presenterar vi ett protokoll för kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI), som möjliggör kvantitativ bedömning av veck förändringar i proteininteraktioner baserat på relativa fluorescensmätningar av proteiner i delade komplex som upptäckts av exponerade Ytan epitoper (fiskarna). I QMI, proteinkomplex från cell celllysat är immunoprecipitated på mikrosfärer, och sedan sonderade med en märkt antikropp för ett annat protein för att kvantifiera överflödet av fiskarna. Immunoprecipitation antikroppar konjugeras till olika MagBead spektrala regioner, vilket gör att en flödescytometer att skilja flera parallella immunoprecipitations och samtidigt kvantifiera mängden sond antikropp associerad med varje. QMI kräver inte genetisk märkning och kan utföras med minimal biomaterial jämfört med andra immunoprecipitation metoder. QMI kan anpassas för en definierad grupp av samverkande proteiner, och har hittills använts för att karakterisera signal nätverk i T-celler och neuronala glutamatsynapser. Resultat har lett till nya hypotes generationen med potentiella diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. Detta protokoll innehåller instruktioner för att utföra QMI, från den initiala antikropp panel urvalet till att köra analyser och analysera data. Den första monteringen av en QMI-analys innebär screening antikroppar för att generera en panel, och empiriskt fastställa en lämplig lysis buffert. Det efterföljande reagenspreparatet omfattar kovalent koppling av immunoprecipitation-antikroppar mot MagBeads och biotinylerande sond-antikroppar så att de kan märkas med en streptavidin-konjugerad fluorofore. För att köra analysen, är lysate blandas med MagBeads över natten, och sedan pärlor är uppdelade och inkuberas med olika sond antikroppar, och sedan en fluorophore etikett, och läsas av flödescytometri. Två statistiska tester utförs för att identifiera fiskarna som skiljer sig avsevärt mellan experimentella förhållanden, och resultaten visualiseras med hjälp av heatmaps eller Node-Edge diagram.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dynamiska protein-protein interaktioner utgör molekylära signalering kaskader och rörliga strukturer som är funktionell grund för de flesta cellulära fysiologi1. Dessa processer avbildas ofta som linjära signalvägar som växlar mellan steady-state baserat på enstaka ingångar, men experimentella och modelleringsdata visar tydligt att de fungerar som integrerade nätverk2,3, 4. När det gäller G-proteiner, olika receptorer har ofta förmågan att aktivera samma G-protein, och en enda receptor kan också aktivera mer än en typ av g-protein5,6. För att det relativt lilla antalet G protein klasser att specifikt modulera ett brett spektrum av cellulära funktioner såsom synaptisk transmission, hormon reglering, och cell migration, celler måste både integrera och differentiera dessa signaler4 , 5. bevis har visat att denna signalspecificitet, för G-proteiner och andra, huvudsakligen härleds på grundval av finstämda protein-proteininteraktioner och deras temporala dynamik1,3, 4 , ,5 , 6 , 7. eftersom signalering nätverk består av dynamiska proteinkomplex med flera ingångar, utgångar, och feedbackloopar, en enda störning har möjlighet att förändra den totala homeostatiska balansen i en cells fysiologi4 ,7. Det är nu allmänt överenskommet att signalering bör undersökas ur ett nätverk perspektiv för att bättre förstå hur integrationen av flera ingångar styr diskreta cellulära funktioner i hälsa och sjukdom7,8, 9,10,11,12,13. Mot bakgrund av detta utvecklades kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI) för att samla in medelhögt dataflöde, kvantitativa data om viknings förändringar i dynamiska protein interaktions nätverk.

QMI är ett antikroppsbaserat test där celllysat inkuberas med en panel av immunoprecipitation-antikroppar som är kovalent kopplade till magnetiska pärlor som innehåller distinkta proportioner av fluorescerande färgämnen. Med specifika antikroppar kopplade till distinkta magnetiska pärlklasser möjliggör samtidig samtidig immunoprecipitation av flera målproteiner från samma lysat. Efter immunoprecipitation (IP) inkuberas magnetiska pärlor med en andra, fluorophore-konjugerad sond-antikropp (eller biotinylerad antikropp tillsammans med fluorophore-konjugerat streptavidin). Co-föreningar mellan de proteiner som erkänns av varje IP antikropp-sond antikroppar par, eller Fiskarna (proteiner i delade komplex upptäcks av exponerade ytan epitopes), sedan detekteras med flödescytometri och kan kvantitativt jämföras mellan olika exempel villkor14. Illustrationerna i figur 1 visar de steg som ingår i en QMI-analys, inklusive ett diagram över magnetiska pärlor med immunoprecipiterade proteinkomplex märkta med fluorescerande konjugerade sond antikroppar (figur 1C).

Känsligheten för QMI beror på protein koncentrationen av lysat i förhållande till antalet magnetiska pärlor som används för immunoprecipitation, och att uppnå en upplösning för att upptäcka 10% gånger förändringar kräver endast en liten mängd utgångsmaterial jämfört med andra Co-IP-metoder14,15. Till exempel är den mängd utgångsmaterial som används i QMI liknande den som krävs för en Sandwich enzymkopplad ImmunoSorbent assay (ELISA), men flera interaktioner upptäcks i en enda QMI-analys. QMI-analyser med 20 IPs och 20 sond mål har utförts med 1-5 x 105 primära T-celler isolerade från en 4 mm hudbiopsi, P2 synaptosomala preparat från en 3 mm koronala delen av mus prefrontala cortex, eller 3 x 106 odlade mus primär kortikala neuroner14,16,17. Denna känslighet gör QMI användbart för analys av celler eller vävnad med begränsad tillgänglighet, såsom kliniska prover.

QMI kan anpassas för alla tidigare definierade protein interaktions nätverk (förutsatt att antikroppar finns), och hittills har utvecklats för att analysera T-cellantigen-receptorn (TCR) signalosome och en delmängd av proteiner vid glutamaterga synapser i nervceller 17 , 18. i studier av T-cell receptor signalering, QMI användes först för att identifiera stimulering-inducerad förändringar i fiskarna, och sedan att skilja autoimmuna patienter från en kontrollgrupp, upptäcka endogena autoimmuna signalering, och slutligen att generera en hypotes som involverar ett obalanserat sjukdomsassocierat subnätverk av interaktioner14. På senare tid, samma QMI panelen användes för att fastställa att thymocyte urvalet bestäms av kvantitativa snarare än kvalitativa skillnader i TCR-associerad protein signalering19. I nervceller, QMI användes för att beskriva input-specifika omplaceringen av ett protein interaktion nätverk för olika typer av ingångssignaler på ett sätt som stöder nyligen framväxande modeller av synaptisk plasticitet17. Dessutom, detta Synaptic QMI panel användes för att identifiera skillnader i sju musmodeller av autism, Cluster modellerna i subgrupper baserat på deras fiskarna biosignatures, och exakt hypotes en delad molekylära underskott som tidigare okänt i en av modellerna16. En liknande metod kan användas för att skärmen för andra undergrupper som kan svara på olika läkemedelsbehandlingar, eller tilldela läkemedel till specifika responsiva undergrupper. QMI har potentiella tillämpningar inom diagnostik, patient under skrivning och läkemedelsutveckling, förutom grundläggande vetenskap.

För att sätta ihop en QMI-antikroppspanelen beskrivs inledande antikroppsscreening-och urvals protokoll i avsnitt 1 nedan. När antikropps paneler har identifierats beskrivs protokoll för konjugering av de valda antikropparna till magnetiska pärlor för IP, och för biotinylering av de valda sond antikropparna, i avsnitt 2. Protokollet för att köra QMI-analysen på cell-eller vävnads celllysat beskrivs i avsnitt 3. Slutligen, eftersom ett enda experiment kan generera ~ 5 x 105 enskilda datapunkter, instruktioner och datorkoder för att bistå vid bearbetning, analys och visualisering finns i avsnitt 4. En översikt över arbetsflödet som beskrivs i avsnitten 2-4 visas i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. analysens utformning

  1. Kandidat preparat för antikroppar
    1. För varje protein av intresse, Välj 3 till 5 antikroppar mot skärmen. När det är möjligt, Använd monoklonala antikroppar som erkänner olika epitoper. Omfattar även en icke-specifik kontroll antikropp.
    2. För att ta bort Tris, utför buffertutbytet genom att lägga till antikroppen i ett 30 kDa-spinn filter, snurra ner till dess minsta volym, lägga till 500 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och upprepa 3 gånger. För att ta bort bärare proteiner, utföra antikropp rening enligt tillverkarens protokoll (se tabell över material för specifik rening rekommendation).
      Obs: Detta görs eftersom bärare proteiner och buffertar med fria Amine grupper (såsom Tris) kommer att reagera med COOH grupper och släcka den efterföljande pärla koppling och biotinylation reaktioner. Se till att alla antikroppar renas (inga bärare proteiner) och i en buffert fri från primära aminer (dvs., ingen Tris).
    3. Par varje antikropp till karboxylate modifierade latex (KML) pärlor som beskrivs av Davis och Schrum20. För att bevara antikroppen, skala ner pärlkopplingsreaktioner med upp till 1/5 (dvs 3,6 x 106 pärlor med 10 μl 0,2-1 mg/ml antikropp).
    4. Uppskatta pärltal med hjälp av en hemocytometern (typiskt ~ 108/ml) och förvara vid 4 ° c. Pärlor har lagrats i över ett år och används framgångsrikt i QMI analyser, men hållbarhetstid eller utgångsdatum har inte formellt fastställts. NaN3 i B/S-bufferten förhindrar bakterietillväxt.
    5. Biotinylate en del av varje antikropp (se avsnitt 2,2 nedan). Förvaras vid 4 ° c.
    6. Bekräfta en effektiv KML-pärlkoppling och exakt räkning genom färgning av 1 x 105 pärlor med en PE-konjugerad antikropp som reagerar på de arter där antikroppen togs upp och som läste på en flödescytometer.
    7. Bekräfta antikropps biotinylering med dot blot med streptavidin-HRP.
    8. När labbet har genererat reagenser som är kända för att vara effektiva, använda dessa reagenser som positiva kontroller i bekräftelse reaktioner i steg 1.1.5 och 1.1.6.
  2. Antikroppsscreening med IP-FCM (immunoprecipitation upptäckt av flödescytometri)
    1. Besluta om ett lämpligt screening-lysat. För detta och alla andra pre-QMI screening steg (allt som ingår i detta avsnitt 1: assay design), Använd inte biosamples med begränsad tillgänglighet. Välj i stället ett jämförbart kontrollmaterial såsom mus vävnad av vild typ, cellinjer eller normal mänsklig givar vävnad som inte är en begränsande resurs.
      Obs: välja en lysis buffert för denna analys är inte trivialt, och diskuteras i avsnitt 1,5: urval av rengöringsmedel, liksom i näst sista stycket i diskussionen avsnitt. Standard lysis buffertar har en bas av 150 mm NaCl, 50 mm tris (pH 7,4), 10 mm natriumfluorid, 2 mm natrium orthovanadate, och proteas och fosfatas hämmare cocktails. Rengöringsmedel som är kompatibla med QMI inkluderar 1% NP-40, 1% digitonin, 0,1-1% Triton X-100, och 0.5-1% deoxicholat14,16,17,18,19,21.
    2. Beräkna den totala volymen av lysat som ska användas för varje IP, med 10 μL för varje IP-sond kombination som ska screenas. Om screening X PROBE antikroppar och med en IgG-kontroll, varje IP kommer att använda (X + 1) * (10 μL) * (1,1 för pipettering fel); X + 1 är att redogöra för den erforderliga IgG-sondkontrollen. Till exempel, i en 3x3 antikropp skärm, varje IP bör använda 44 ul. Kom ihåg att ta med en IgG IP-kontroll (se exempel screening setup i figur 2).
    3. Beräkna det KML-pärlnummer som ska användas. Om du screening X PROBE antikroppar, Använd [(X + 1) * 5 X 104 pärlor]. Helst kommer 5 000 pärlor per brunn resultera i > 2000 pärlor per brunn läsas av flödescytometern. Till exempel, i en 3 x 3 antikropp skärm, varje IP bör använda 20 000 pärlor, vilket är cirka 0,66 μL av beredd KML pärla lager från steg 1.1.3 (pärlor bör först kvantifieras med hjälp av en hemocytometern för att säkerställa noggrannhet).
    4. Inkubera volymen av lysat från steg 1.2.2 med volymen för varje KML-pärla som ska screenas från steg 1.2.3, över natten vid 4 ° c med rotation för att förhindra att pärlor sedimentera. Vanligtvis utför inkuberingar i den första kolumnen i en 96-väl PCR-plattan, och mössa med PCR-rör band CAPS.
    5. Spin down KML pärlor på 3 200 x g för 1 min och avlägsna lysate av en enda, snabb snärta av plattan över diskbänken. En liten vit pellet bör vara synlig på botten av varje brunn både före och efter snärta.
    6. Omsuspendera KML-pärlor i en volym av FlyP-buffert för att motsvara 20 μL för varje pärlsond par; för X-sondantikroppar, Använd (X + 1) * (20 μL) * (1,1 för pipettering fel), liknande steg 1.2.2. För en 3 x 3 skärm, Omsuspendera cellerna under i 88 μl av FLYP buffert. FlyP buffert är 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Fördela varje IP över (X + 1) brunnar i en 96-well PCR-platta, där X är antalet sond antikroppar som screenas, med 20 μL/brunn. Figur 2 A visar ett exempel på screening inställningar.
    8. Tvätta ytterligare 2 gånger med 200 μL FlyP-buffert per brunn. Snurra plattan som i steg 1.2.5 och svep plattan för att ta bort tvättbuffert efter varje tvätt. Pellets kommer att vara extremt liten, men bör vara synlig efter varje tvätt.
    9. För varje biotinylerad antikropp som ska screenas, beräkna den totala volymen som (Y + 1) * 1,1 * 50 μL, där Y är antalet IP-antikroppar som screenas. Späd antikropp till en arbets koncentration i denna volym av FlyP buffert, vanligtvis börjar med 1:100 utspädning av en 0,5 mg/mL lager.
    10. Fördela varje utspädd antikropp ner varje kolumn i 96 väl plattan, och se till KML pärlor återsuspenderas.
    11. Inkubera vid 4 ° c i 1 h, antingen med rotation eller pipettering med 15 minuters mellanrum för att se till att KML-pärlorna förblir suspenderas.
    12. Tvätta 3x i 200 μL FlyP-buffert, för varje tvättcentrifug och ta bort lysat som i steg 1.2.5.
    13. Omsuspendera alla KML-pärlor i 50 μL av 1:200 Streptavidin-PE i FlyP-buffert.
    14. Inkubera vid 4 ° c i mörker i 30 min.
    15. Tvätta 3x i 200 μL FlyP-buffert, för varje tvättcentrifug och ta bort lysat som i steg 1.2.5.
    16. Omsuspendera i 200 μL FlyP-buffert och kör sedan på en flödescytometer.
  3. Välja antikroppar som ska ingå i analysen
    1. Gate på storlek med FSC-h vs SSC-h, och eliminera dubletter med FSC-h vs FSC-A.
    2. Generera histogramintensitet av PE-fluorescens och överlagra både IgG-kontroller (IgG-pärla-testsond, test pärla-IgG-sond) på testade par (figur 2).
    3. Leta efter en pärla-sond par som ger tydlig signal över buller (figur 2B). Dessutom är det inte idealiskt att använda samma antikropp för både pärla och sond. Differential epitop erkännande maximerar chanserna att observera interaktioner eftersom vissa epitoper kan ockluderade i vissa proteinkomplex. Om det inte finns några godtagbara alternativ, upprepa skärmen med ytterligare antikroppar.
  4. Bekräftelse av antikropps specificitet
    1. För att säkerställa antikropps specificitet för de avsedda målen, Använd ett lysate-prov där målet har utslagen. till exempel en knockout-mus eller en RNAi-celllinje. Alternativt, Använd lysate från en mål-negativ cellinjer där målproteinet har varit artificiellt uttryckt.
    2. Utför IP-FCM som beskrivs i steg 1,2, ändra för att passa experimentet.
  5. Urval av rengöringsmedel
    1. Som rengöringsmedel är kritiska i Co-IP-experiment, empiriskt testa olika variationer för att säkerställa att analysen har maximal sannolikhet för att upptäcka förändringar. För att starta, Välj en relativt liten panel av interaktioner (4-8) som är kända för att förändras i ett visst tillstånd och/eller är av särskilt intresse för din studie.
    2. Med hjälp av icke-fluorescerande, antikroppskonjugerade KML-pärlor gjorda för initiala skärmar, utför IP-FCM enligt beskrivningen i 1,2 med varierande lyseringsbuffertens villkor. Tvättmedels skärmar kan utföras med rengöringsmedel som enda variabel, eller med olika cell förhållanden för varje tvättmedel. Använd alltid IgG-kontroller för både pärlor och sonder, eftersom rengöringsmedel ibland ger oväntad bakgrund i vissa kombinationer av IP-sond.
    3. Baserat på MFI från skärmen, Välj ett rengöringsmedel som optimerar signalen för fiskarna av intresse. Det är troligt att vissa kompromisser kommer att behöva göras22.

2. multiplex reagens beredning

  1. Magnetisk pärla koppling
    1. Med hjälp av kartan magnetisk pärlregion väljer du pärlområden att använda i ett mönster som minimerar risken för kors detektering. Magnetisk pärla typiskt smeta upp och till höger, så undvik pärla regioner som är diagonalt intill varandra. Pärlor från alla andra kolumner i pärldiagrammet som visas på Luminex webbplats rekommenderas (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Bered den bärarfria antikroppen på 0,1 mg/mL i PBS (som i 1.1.2) i 250 μL. Håll på is för senare användning.
    3. Vortex magnetiska pärlor i stor utsträckning, och sedan alikvot 250 μl till en Amber microcentrifug röret (för att skydda pärlor från foto blekning).
    4. Magnetiskt separata magnetiska pärlor för 60 s och ta bort supernatanten.
    5. Tillsätt 250 μL MES-buffert (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), Vortex, magnetiskt separat för 60 s, och ta bort supernatanten. Upprepa och Omsuspendera magnetiska pärlor i 200 μL av MES-buffert.
    6. Tillsätt 40 μL av MES till en 2 mg Engångstub av sulfo-NHS för att göra en 50 mg/mL lager.
    7. Tillsätt 25 μL nytillverkad sulfo-NHS till de magnetiska pärlorna. Vortex.
    8. Tillsätt 25 μl 50 mg/ml nyupplöst edac [1-etyl-3-( -3-dimetylaminopropyl) karbodiimidgrupp hydroklorid, även kallad EDC] i mes-buffert. Vortex.
    9. Täck över och skaka på en vortexblandare med ett rör-hållande fäste för 20 min vid rumstemp, 1000 rpm.
    10. Magnetiskt separat för 60 s och ta bort supernatanten.
    11. Omsuspendera i 500 μL PBS, Vortex, magnetiskt separat för 60 s och ta bort supernatanten. Upprepa.
    12. Omsuspenderas i 250 μL antikropps lösning från steg 2.1.2. Vortex.
    13. Inkubera 2 h vid rumstemp med skakning på en vortexblandare vid 1000 rpm.
    14. Tillsätt 500 μL PBS till de magnetiska pärlorna, Vortex, magnetiskt separat för 60 s, och ta bort supernatanten.
    15. Tillsätt 750 μL blockering/lagring (B/S) buffert (1% BSA i PBS pH 7,4, 0,01% NaN3). Täck över och inkubera 30 min vid rumstemp, 1000 rpm.
    16. Magnetiskt separat för 60 s och ta bort supernatanten. Omsuspenderas i 100 μL B/S-buffert.
    17. Förvaras vid 4 ° c. Pärlor har lagrats i över ett år och används framgångsrikt i QMI analyser, men hållbarhetstid eller utgångsdatum har inte formellt fastställts. NaN3 i B/S buffert bör förhindra bakterietillväxt.
    18. Validera magnetisk pärla koppling genom färgning ~ 0,25 μL av kopplade magnetiska pärlor med en fluorescerande anti-värdarter sekundär och avläsning på en flödescytometer, som i steg 1.1.5.
  2. Biotinylation
    1. Se till att antikroppar är i PBS utan bärare protein.
    2. Beräkna den totala μg av antikroppar vara en (100-200 μg rekommenderas för användning i multiplex, 25-50 μg rekommenderas för screening).
    3. Förbered färsk 10 mM sulfo-NHS-biotin (kan göras genom att tillsätta 224 μL ddH2O till ett 1 mg No-väger rör).
    4. Tillsätt 1 μL av 10 mM sulfo-NHS-biotin per 25 μg antikropp, Vortex eller Pipettera upp och ner för att blanda.
    5. Inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
    6. Inkubera vid 4 ° c i 1 h.
    7. Använd ett 30 kDa spinn filter för att ta bort obunden biotin och stoppa reaktionen. Tillsätt 500 μL PBS och snurra kolumnen tills den lägsta volymen har uppnåtts. Tillsätt 500 μL extra PBS och upprepa för 3 totala buffertutbyten.
    8. Uppskatta koncentrationen genom att mäta absorbansen för 1-2 μL på en spektrofotometer och sedan föra in antikroppskoncentrationen på 0,5 mg/mL.
    9. Förvaras vid 4 ° c.

3. kvantitativ multiplex immunoprecipitation

  1. Plattans layout
    Anmärkning: denna analys fungerar bäst när den utförs med 96-well tallrikar och 2-4 provförhållanden.
    1. Kör alltid lämpliga kontroller (dvs. stimulerade v. ostimulerade celler) på samma platta för att upptäcka förändringar mellan förhållandena. Fördela varje prov horisontellt över plattan och Använd varje kolumn för en annan sond antikropp. En uppsättning tekniska replikat för varje avsökning ska köras omedelbart efter den första uppsättningen. Se figur 3 för ett exempel.
    2. Noggrant dokumentera plattlayouten för att underlätta noggrann plåt lastning och analys.
  2. Provberedning & immunoprecipitation (dag 1)
    1. Lyse vävnad eller celler i lämpligt rengöringsmedel med proteas och fosfatashämmare och inkubera på is i 15 min. Var noga med att hålla lysate kallt hela tiden.
      Anmärkning: den exakta kvantiteten av att ange biomaterial och lysate proteinkoncentration måste bestämmas empiriskt, och några exempel på tidigare använda prover listas i tredje stycket i inledningen. I allmänhet, i intervallet 200 μL av 2 mg/mL protein per prov har varit framgångsrikt i det förflutna för 20 IP och 20 sond mål, men idealiska ingångar för varje antikropp panel och cell-eller vävnadstyp måste bestämmas empiriskt.
    2. Snurra ner vid 4 ° c i 15 min vid 16 000 x g för att ta bort membran och skräp; Håll supernatanten som lysate.
    3. Utför en BCA-analys eller liknande för att bestämma proteinkoncentrationer, och sedan normalisera protein koncentrationen mellan proverna. Om du använder celler, börja med lika många celler per villkor och normalisering är valfritt.
    4. Förbered en Master magnetisk pärla mix som innehåller ~ 250 magnetiska pärlor av varje klass per brunn i analysen. Justera pärltal efter dataanalys så att i framtiden analyser i genomsnitt 110 pärlor av varje klass kommer att läsas per brunn.
      ANMÄRKNINGAR: exempel beräkning: (ny pärlvolym) = [(Run Average)/110] * (föregående pärlvolym). Pärlvolymer bör justeras på detta sätt om varje 8 körningar eller vid behov. Typiskt, 3-4 μL av varje magnetisk pärla (beredd som ovan) används för ett 2-plattans experiment.
    5. Tvätta den magnetiska pärlblandningen 2x i FlyP buffert med magnetisk separation, och sedan Omsuspendera i FlyP buffert. För resuspension, Använd 10 μL per prov per platta. FlyP buffert är 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Efter grundligt vortexa den magnetiska pärlblandningen, alikvot 10 μl till iskalla microcentrifug rör (ett rör per prov). Tillsätt lika mängder lysat (med normaliserade koncentrationer) till varje tub för immunoprecipitation.
    7. Aliquot den lysate-magnetisk pärla blandningen i ett rör för varje platta som körs; t. ex. för ett experiment med 2 plattor, dela upp lysatet i två rör. Placera rören på en rotator vid 4 ° c över natten för immunoprecipitation, täckt för att hålla ut ljus.
  3. Köra analysen (dag 2)
    1. Börja med lysate-magnetiska pärlrör för plåt #1. Använd en magnetisk pärla rack för att ta bort lysate från de magnetiska pärlor, och reservera lysate för framtida analys. Tvätta pärlor 2x i 500 μL av iskall FlyP buffert. Håll rör rören alltid på is eller vid 4 ° c.
    2. Beräkna resuspension volym som (antal sonder) * (2 tekniska replikat) * (25 μL per brunn) * (1,1 för pipettering fel). Omsuspendera IPs i Beräknad volym av iskall FlyP buffert.
    3. Efter noggrant omåteruppning av magnetiska pärlor genom skonsam pipettering, fördela 25 μL per brunn över en flatbottnad 96 väl tallrik, på is.
    4. I en annan 96-brunn plattan, späd en sond antikroppar till 2x arbets koncentration (arbets koncentration är typiskt 1:100 eller 1:200, empiriskt bestäms) i FLYP buffert så att deras ordning matchar kolumnerna på plattan layouten (se figur 3 ). Den slutliga volymen av sond antikroppar vid den arbetande koncentrationen kommer att vara 50 μL per brunn, så volymen av varje 2x antikropp som bereds ska vara (25 μL) * (antal biologiska prover) * (2 tekniska replikat) * (1,1 för pipettering fel).
    5. Använd en flerkanalspipett för att fördela 25 μL av varje sond antikropp spädning till den magnetiska pärla som innehåller testplattan.
    6. Skaka på en horisontell platta Shaker för att blanda och Omsuspendera de magnetiska pärlorna, och sedan Inkubera vid 4 ° c i 1 h, skaka vid 450 rpm i mörkret.
    7. Tvätta 3x med FlyP buffert på en magnetisk plattbricka vid 4 ° c.
    8. Omsuspendera de magnetiska pärlorna i 50 μL av 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Skaka för att blanda och Omsuspendera pärlor, och sedan Inkubera vid 4 ° c i 30 min, skaka vid 450 rpm i mörkret.
    10. Tvätta 3x med FlyP buffert på en magnetisk plattbricka vid 4 ° c.
    11. Omsuspenderas i 125 μL FlyP-buffert.
    12. Skaka i 1 min vid 900 RPM för att grundligt Omsuspendera pärlor.
    13. Köras på kyl flödes flödescytometerns (se diagram i figur S1). Använd inställningen "hög RP1 Target" i flödet flödescytometerns programvara, och ett stoppvillkor för 1 000 pärlor per region (kraftigt överskjutning antalet som bör vara i någon enskild brunn för att förhindra att maskinen från att stoppa i förtid) och provvolym på 80 μL.
    14. Pausa körningen halvvägs igenom och Omsuspendera pärlorna för att förhindra sedimentering.
    15. Exportera datafiler i XML-format.
    16. Upprepa processen för de återstående plattorna, med början i steg 3.3.1.

4. analys av data

Anmärkning: ANC-koden har utformats för att jämföra två villkor från N = 4 experiment, var och en med 2 tekniska replikat för varje tillstånd. Till exempel stimuleras celler fyra oberoende gånger, QMI körs på fyra olika dagar på kontroll (ostimulerade) och stimulerade celler, med tekniska replikat enligt ovan, och dataanalys fortsätter enligt beskrivningen nedan.

  1. Adaptiv icke-parametrisk med justerbar alfa cutoff (ANC)
    1. Öppna MATLAB och Ställ in Active Directory till en mapp som innehåller ANC-programkomponenterna och XML-filerna som exporteras från flödescytometern.
    2. Fyll i filen "ANC input" för att återspegla detaljerna i experimentell design. Exempel filen som ingår i tilläggsfilen har fyllts i i förväg för att köra exempeldata, som också tillhandahålls.
    3. Kör programmet, som kommer att skriva en. csv-fil i Active Directory. Filen rapporterar fiskarna som är betydligt annorlunda, på en falsk positiv (alfa) nivå på 0,05, mellan kontroll och experimentella förhållanden, i alla 4 experimentella replikat, eller åtminstone 3/4 replikat.
    4. Anmärkning "ANC träffar," som definieras som fiskarna med signifikanta skillnader i minst 3 experimentella replikat, representeras som 3/4 ∩ 4/4 i filen, för användning i steg 4.3.1.
  2. Viktad korrelation nätverksanalys23 (CNA)
    1. Klistra in-transponera kolumnrubrikerna för data fils utmatningen genom att MATLAB slutar på "_ MFI. CSV "i den första raden i ett nytt Excel-blad. Lägg till kolumnerna "experiment" för experiment nummer, och "behandling", för experimentell behandling, eller andra variabler som ska analyseras. Spara filen som "traits. csv".
    2. Öppna R Studio och ange arbetskatalogen till en mapp som innehåller "_ MFI. CSV "och" egenskaper. CSV "-filer.
    3. Springa den R befallningen så antyd i den kommenterad befalla arkivera och den specificerat i instruktionerna omfattat med det arkivera. Den WCNA moduler betydligt korrelerade med varje experiment egenskap matas ut som en grafisk fil, och sambandet mellan varje interaktion IPjag_ PROBEJ med varje modul matas ut som en. csv-fil.
    4. Observera CNA träffar, som definieras som interaktioner med modulmedlemskap (MM) > 0,7 och p < 0,05 för medlemskap i en modul som identifierades som signifikant korrelerad med den experimentella variabeln av intresse, för användning i steg 4.3.1.
  3. Positiva "träffar" & visualisering
    1. För varje interaktion i "3/4 ∩ 4/4 träffar" listan i ANC utdatafilen (från steg 4.1.4), identifiera om att interaktionen är också en "CNA hit" genom att kontrollera CNA utdatafilen (se steg 4.2.6). Skapa en ny kolumn som anger om varje ANC träff är också en CNA träff.
    2. Beräkna genomsnittet log2 Fold ändra värdet för varje ANC ∩ CNA drabbats av medelvärdes värden som anges i ANC utdata kalkylblad "_ Hits. csv" från steg 4.1.3. Konvertera värden till log2 faldig förändring före medelvärdes. För interaktioner som var signifikanta i endast 3/4 replikat, ta bort värdet för avvikare.
    3. Gör ett kalkylblad med varje ANC ∩ CNA träff listad som en IP i en kolumn, en sond i den andra kolumnen, och luckan ändra värdet i den tredje kolumnen. Använd det här kalkylbladet för att skapa ett nodgränsdiagram i Cytoscape genom att importera filen som ett nätverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Screening av antikroppar
Figur 2 B visar resultatet av en skärm för proteinet Connexin36. De flesta IP_probe kombinationer ger ingen signal över IgG-kontroller. IP med den monoklonala antikroppen 1E5 och sond med antingen 1E5 eller den polyklonala antikroppen 6200 ger en högerriktad förskjutning av pärlfördelningen jämfört med IgG-kontroller. Här valdes IP 1E5 och PROBE 6200poly ut för att undvika att använda samma antikropp som IP och PROBE, både för att minska sannolikheten för att ett icke-specifikt protein erkänns av två oberoende antikroppar, och för att öka risken för att upptäcka samföreningar med hjälp av olika epitoper. Det är bäst att välja en IP_probe kombination med minst 1-2 log högre MFI jämfört med IgG-kontroller, men ibland par som producerar svagare MFI som konsekvent kan särskiljas från kontroller får användas om inga alternativ identifieras. Figur 2 C visar ett specificitet validerings experiment för kombinationen 1E5-6200poly. Lysate från 293 celler transfekterade med en Connexin36 plasmid producerade en ~ 1,5-log höger Skift i pärlspridning, medan untransfected celler överlappade med IgG kontroller. Vid bekräftande specificiteten av en para, negativ kontroll lysate från en knockout djur eller cell Lina utan måltavlan proteinet skulle har en MFI lik till IgG kontroller.

Pärlkoppling
En typisk magnetisk pärla koppling kvalitetskontroll reaktion kommer att ge en MFI 3-4 stockar ovan bakgrund när färgade med en sekundär antikropp konjugerat till en fluorophore med en ljusstyrka index mellan 3 och 5 (t. ex. PE eller FITC). Figur 4 visar en typisk kvalitetskontroll reaktion som jämför konjugering av en ny magnetisk pärla jämfört med den äldre sats som ersätts.

Data analys
I varje experiment jämför ANC fluorescensfördelningarna för varje magnetisk pärlklass i varje brunn (d.v.s. alla möjliga IP_Probe kombinationer) mellan ett användardefinierat kontroll-och försöks tillstånd. Det tilldelar ett p-värde till varje kombination som återspeglar sannolikheten att pärlorna har provtagits från identiska populationer baserat på Kolomogrov-Shmirnov (K-S) statistik. Programmet beräknar sedan K-S p-värde som krävs för att producera en falsk positiv skattesats på 0,05 genom att korrigera för flera jämförelser och redovisning för teknisk variation (skillnader mellan de tekniska replikat). IP_probe kombinationer (PiSCES) vars K-S test p-värde sjunker under den beräknade cut-off i alla fyra experiment, eller åtminstone 3/4 experiment (3/4 ∩ 4/4) identifieras. Eftersom p-värdet cut-offs varierar beroende på dessa olika nivåer av stränghet, ibland fiskarna kommer att identifieras i 4/4 men inte 3/4 ∩ 4/4, så separata listor beräknas. För detaljerade ANC ekvationer, se (Smith et al. 2016). 14 Detaljer om WCNA analys och resultat diskuteras grundligt av langfelder et al.23

Data presentation
ANC och CNA23 analyser utförs för att identifiera fiskarna att både (1) Visa signifikanta veck förändringar mellan experimentella förhållanden i minst 3/4 av körningar och (2) tillhör en CNA-modul som är korrelerad med den experimentella variabeln. Dessa högt förtroende fiskarna som identifieras av två oberoende statistiska metoder kallas ANC ∩ CNA fiskarna. Dessa interaktioner kan visualiseras som ett Node-Edge-diagram med hjälp av programvaran med öppen källkod Cytoscape (figur 5a) eller som en heatmap med hjälp av R-kod och analys instruktioner som ingår i tilläggsmaterialet (figur 5b ).

Figure 1
Figur 1 . Översikt över kvantitativ multiplex immunoprecipitation. a) tidigare kontrollerade antikroppar är kovalent kopplade till olika klasser av magnetiska pärlor i separata reaktioner. b) över natten, proteinkomplex är immunopreciterade med hjälp av en blandning av antikropp-kopplade magnetiska pärlor. c) Co-immunopreciterade proteiner är märkta med en sond antikropp och en fluorophore. (d) magnetiska pärlor och märkta proteinkomplex drivs genom en kyld flödescytometer för att kvantifiera relativa mängder av proteiner som förekommer i gemensamma komplex. Se figur S1 för schematiska Detaljer om anpassad kylning. (e) programvaran Flow flödescytometerns Manager separerar magbeads efter klass och (f) visar fluorescenshistogram från varje pärlregion. (g) data exporteras som. XML-filer och analyseras av två oberoende statistiska metoder. Endast fiskarna som identifierats av båda analyserna rapporteras med hjälp av heatmap och Node-Edge diagram visualiseringar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Connexin 36 antikroppsscreening med IP-FCM. (a) IP-FCM utfördes på mus hjärnan lysate med en 4X4 panel av Connexin 36 (Cx36) KML pärlor och sonder. Lysate immunoprecierades med varje KML-pärla i en separat rad av plattan. Efter tvättar, var varje pärla fördelas över sin rad så att en sond antikropp kan läggas till per kolumn. (b) de flesta antikropps kombinationer visar ingen signal (orange) över IgG-bakgrund (grå, blå). Den 1E5 IP med 6200Poly sonden visar acceptabel positiv signal. Den 1E5 pärla/sond och 6200Poly pärla/sond par varje visar acceptabel signal, men det är inte idealiskt att använda samma antikropp för både pärla och sond. Differential epitop erkännande maximerar chanserna att observera interaktioner eftersom vissa epitoper kan ockluderade i vissa proteinkomplex. Den 6200Poly pärla med 1E5 sonden ger den starkaste signalen och valdes att använda i multiplex analysen avvaktan specificitet bekräftelse. (c) IP-FCM med par av Cx36 antikroppar som valts ut från screening utfördes på lysat av 293t celler som transfekterade med Cx36 och icke-transfekterade kontroller. Det finns en tydlig signal från Cx36-transfected celler, men de icke-transfected cellerna är omöjliga att skilja från IgG pärla/sond kontroller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Exempel plattans layout. En 4-Condition multiplex ställs in i en 96-brunn plattan. Exempel 1-4 läses in i efterföljande rader (varje biologiskt prov som representeras här av en annan färg) och tekniska replikat läses in i samma ordning i följande 4 rader. En sond används per kolumn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . En typisk kvalitetskontroll reaktion som jämför konjugering av en ny MagBead jämfört med den äldre sats som ersätts. Pärlan ger en MFI 2-4 stockar ovan bakgrund, och den nya partiet har en MFI som liknar den gamla partiet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . QMI identifierar Synaptic fiskarna som ändras i storleksordning efter 5 minuter av NMDA stimulering i odlade kortikala neuroner. En QMI experiment jämfört NMDA stimuleras kontra ostimulerad (ACSF kontroll) nervceller. Fiskarna som identifierades av både ANC och CNA analyser presenteras. (a) i ett Node-Edge diagram som produceras med hjälp av Open Source-programvara cytoscape, noderna indikerar antikropps mål (proteiner) som ingick som IPS och sonder i QMI panelen. Kanterna representerar ANC ∩ CNA fiskarna, med färg och tjocklek på kanten som anger riktningen och omfattningen av Fold-förändring mellan NMDA behandling och kontroll. Fiskarna som inte ändras mellan NMDA och kontrollvillkor ingår inte i figuren. b) en heatmap som produceras i R med hjälp av heatmap. 2 funktionen representerar samma ANC ∩ CNA fiskarna. ComBAT-normaliserade, log2 MFI-värden normaliseras av rad för att redogöra för data som spänner över ~ 3 loggar, och den relativa MFI för varje experimentell replikat visar att visa den relativa omfattningen och konsekvensen av varje rapporterade fiskarna. De uppgifter och den kod som krävs för att återge dessa siffror ingår i tilläggsfilen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 1
Figur S1: diagram över anpassad kylning av flödescytometrisystemet. Flödescytometerns array Reader måste förvaras i rumstemperatur, men den nedre delen (mikroplattans plattform) måste förvaras i kylskåp för att bibehålla fiskarna under analysen. Se tabellen av material för modellinformation om flödescytometer och Sandwich prep kylskåp används. (a) de övre tillbehören och livsmedels magasinering togs bort från en smörgås prep kylskåp. Den mikrotiterplattor plattformen placerades på metall stöder avsedd att hålla plast mat förvaringsfack. Plasthöljet på mikrotiterplattor-plattformen togs bort för att göra det lämpligt. En anpassad plexiglasplattform byggdes med mätningar som visas i (b) för att täcka den övre öppningen av kylskåpet. Plexiglaset isolerades med 1/2 "skum isolerings skär för att matcha storleken på plexiglaset, och förseglade gapet med isolerande tejp. Ett hål borrades sedan genom plexiglaset för att låta provet nålen från flödet flödescytometerns assay läsaren att få tillgång till mikrotiterplattor plattformen när den förlängs. En svart kopplingsanordning som ursprungligen skruvas i toppen av mikrotiterplattor plattformen togs bort, och skruvas tillbaka in i mikrotiterplattor plattformen från ovanför plexiglaset, som hjälpte i anpassningen. En dörr i Plexiglasskyddet ger användaren tillgång till mikroplattans bärare när den förlängs ut ur enheten. Observera att flödet flödescytometerns programvara kommer att varna användaren att plattan bäraren är för kallt, men användaren kan åsidosätta varningen och köra kylda QMI experiment. c) fotografi av det monterade systemet. d) detalj på det främre högra hörnet, enligt (a), som visar montering av plexiglaskåpa och isolering. e) detalj av provnålen justerad ovanför hålen. (f) detalj av den rakade delen av isoleringen som medger luftflöde under enheten. g) Detaljer om den öppna luckan som visar flödescytometerns mikroplattplattform nedan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary File
Tilläggsfil. Data och kod som krävs för att återge dessa siffror. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

QMI-analysen kräver betydande investeringar i utveckling av antikropp paneler, utrustning och reagenser, men när analysen är etablerad kan man samla in högdimensionella data som observerar protein interaktions nätverk när de reagerar på experimentellt kontrollerade Stimuli. Tekniskt, kräver QMI noggrann pipettering och spårning av prov och antikroppar väl platser. Noggrant märkning analysen plattorna är användbar, som gör en detaljerad mall för väl platser på papper, som sedan sparas för dataanalys. Vikten av att hålla pärlor och lysate kallt hela tiden, även i flödet flödescytometerns mikrotiterplattor bärare (se figur S1 för anpassade kylning instruktioner) kan inte överskattas. Protein interaktioner kommer snabbt dissociera vid rumstemperatur, och tidiga försök att använda en oförändrad, rumstemperatur flödescytometer slutade med identifieringen av många temperatur-labila interaktioner, men inte de som förändrats med den avsedda Stimulering.

QMI är en antikroppsbaserad analys, så det initiala urvalet av antikroppar är kritiskt. Monoklonala eller rekombinanta antikroppar bör användas närhelst det är möjligt för att minska variationen i resultaten. Polyclonals visar mycket variation, men peptid-baserade polyclonals till en kort epitop verkar vara relativt stabil över tiden. Drift kan minimeras genom att köpa stora partier av antikroppar; Detta möjliggör också för specialbeställningar av bärare-fria antikroppar som utesluter behovet av att rena antikroppar med hjälp av melon gel och spinn kolumner, och tillhörande antikropp förlust.

Det är också viktigt att notera att, eftersom upptäcka en signal är beroende av tillgängliga epitopes, avsaknaden av en signal inte nödvändigtvis tyder på avsaknaden av en interaktion, en begränsning som är gemensam med andra metoder protein interaktion. 14 vidare, när en signal upptäcks, är det omöjligt att otvetydigt ange vädret protein interaktionen är direkt (a interagerar med b) eller indirekt (a interagerar med X och Y, som sedan interagerar med b), varför de observerade interaktionerna är kallas fiskarna snarare än protein-proteininteraktioner (PPI), vilket kan innebära direkt bindning. En begränsning av alla antikroppsbaserade metoder som bör hållas i åtanke är att tillägg av antikroppar kan störa eller stabilisera proteinkomplex. En annan begränsning av att använda flödescytometri snarare än västerländska blotting är att storleksinformation för att bekräfta antikropps specificitet inte är tillgänglig. För att övervinna denna begränsning används IgG-kontroller vid screening av varje antikropps par, och specificitet bekräftas med Knock-out-eller Knock-in-celllinjer eller djur innan man fortsätter med QMI-experiment (avsnitt 1,4).

IgG-kontroller används inte i QMI-analysen eftersom varje IgG ger en annan nivå av bakgrunds signal, vilket gör det omöjligt att veta rätt bakgrundsvärde att subtrahera. Till exempel, om IP (X) _ PROBE IgG ger ett MFI på 100 och IP IgG_probe Y ger ett MFI på 200, vilket bakgrundsvärde bör dras från IP X_probe Y? På samma sätt, ibland oupptäckta interaktioner (t. ex., IP X PROBE Z) kommer att ha en lägre MFI än icke-specifika IgG interaktioner. För att ta hänsyn till denna begränsning av att inte veta den absoluta MFI-signalen, fiskarna rapporteras inte enbart för att upptäckas ovanför en godtycklig bakgrundsnivå. Istället, endast fiskarna som ändras som svar på en given stimulering rapporteras. Även höga MFI kan orsakas av ospecifik buller, skulle detta buller inte förväntas förändras med stimulering. Dessutom har en portion (10-20%) av tillstånd-beroende interaktioner observeras i allmänhet bekräftas av en andra metod, typiskt IP-väst. Denna bekräftelse är analogt med att bekräfta hög genomströmning RNA sekvensering resultat med RT-PCR och är tänkt att öka förtroendet QMI resultat.

Uttrycks effekter som påverkar QMI-resultat kan inte uteslutas utan ytterligare tester, eftersom QMI inte skiljer mellan förhöjda absoluta nivåer av ett protein och ökad homo-multimerisering av ett protein. För att minimera osäkerheten kring uttrycket kan experiment utföras med akuta behandlingsförhållanden med korta tidsskalor som minimerar potentiella förändringar i protein uttrycks nivåer. Andra metoder behövs för att utesluta uttrycks effekter vid kroniska behandlingsförhållanden eller primära patientprover.

Det är viktigt att välja en lämplig lyseringsbuffert för QMI. För svag av ett rengöringsmedel kan lämna membran intakt och hålla ihop proteiner som inte är i komplexa, medan alltför stark ett rengöringsmedel kan förstöra proteinkomplex. Ytterligare faktorer såsom förekomst av kalcium eller dess kelatorer kan dramatiskt påverka fiskarna och bör noga övervägas innan screening antikroppar att inkludera i en QMI panel. För IP-västerländska experiment, Lys villkor är oftast optimerade för varje fiskarna på ett fall-för-fall basis, men de bästa förutsättningarna för att upptäcka en enda fiskarna kan inte översätta till andra fiskarna i samma protein nätverk22. Tvättmedels val presenterar en kyckling-och-ägg dilemma, i att en lysis buffert behövs för att avskärma antikroppar kandidater, men en panel av antikroppar behövs för att skärmen för en lämplig lysis buffert. Även om inte en perfekt lösning, kan man välja en liten panel av pärlor och sonder som är av särskilt intresse och/eller har kända associationer eller dissociationer som svar på en stimulans, och testa deras beteende under olika Lys villkor på KML pärlor används först för screening av antikroppar (steg 1.1.3). En idealisk rengöringsmedel bör möjliggöra både tillförlitlig detektion av fiskarna och rekapitulation av kända fysiologiska protein beteende (Association/dissociation) med en given stimulans. Om det finns någon oro för att ett tvättmedel inte helt solubilize membran, en negativ kontroll antikropp kan tillsättas som bara skulle ge signal om två proteiner var sammankopplade med membran24. När lämpliga lysis buffertar väljs, kan förändringar i även svaga interaktioner-som de mellan en Kinas och substrat-tillförlitligt detekteras (t. ex. TCR-LCK)14.

Tidigare arbete med QMI i nervceller och T-celler har båda noggrant bekräftat tidigare fynd för att öka förtroendet för giltigheten av QMI resultat, och genererade nya hypoteser som ledde till upptäckter om signaltransduktion och sjukdoms vägar. I framtiden kan QMI anpassas till andra protein interaktions nätverk och utökas till 500 proteiner med nuvarande mikrosfärklasser tillgängliga. Använda QMI för att studera hur nätverk av multi-proteinkomplex förändras som svar på stimuli som de kontrollerar cellulära processer har potential att ge viktiga insikter i både hälsa och sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna Tessa Davis för viktiga bidrag till QMI assay utveckling, och nuvarande och tidigare medlemmar i Smith och Schrum Labs för teknisk vägledning och intellektuell input. Detta arbete finansierades av NIMH-bidrag R01 MH113545 och R00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14, (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12, (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361, (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19, (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273, (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88, (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26, (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2, (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6, (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41, (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9, (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007, (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9, (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146, (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23, (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4, (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7, (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187, (2), 870-878 (2011).
Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter