Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

Kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI) bruker flyt flowcytometri for følsom påvisning av forskjeller i overflod av målrettede protein-protein interaksjoner mellom to prøver. QMI kan utføres ved hjelp av en liten mengde biomaterialet, krever ikke genetisk konstruerte koder, og kan tilpasses for alle tidligere definerte protein interaksjon nettverk.

Abstract

Dynamisk protein-protein interaksjoner kontroll cellulære atferd, fra motilitet til DNA replikering til signal Transduction. Det er imidlertid teknisk vanskelig å overvåke dynamisk samhandling mellom flere proteiner i et protein interaksjons nettverk. Her presenterer vi en protokoll for kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI), som tillater kvantitativ vurdering av fold endringer i protein interaksjoner basert på relative fluorescens målinger av proteiner i delte komplekser oppdaget av Exposed Overflate epitopes (Fiskene). I QMI, protein komplekser fra celle lysater er immunoprecipitated på mikrosfærer, og deretter analysert med en merket antistoff for et annet protein for å kvantifisere overflod av fiskene. Immunutfelling antistoffer blir bøyd til forskjellige MagBead Spectral regioner, som tillater en strømnings flowcytometer å differensiere flere parallelle immunoprecipitations og samtidig kvantifisere mengden av sonde antistoff knyttet til hver. QMI krever ikke genetisk merking og kan utføres ved hjelp av minimale biomaterialet sammenlignet med andre immunutfelling metoder. QMI kan tilpasses for enhver definert gruppe av samspill proteiner, og har hittil blitt brukt til å karakterisere signalering nettverk i T-celler og neuronal glutamat synapser. Resultatene har ført til ny hypotese generasjon med potensielle diagnostiske og terapeutiske programmer. Denne protokollen inneholder instruksjoner for å utføre QMI, fra det første antistoff panel valget gjennom å kjøre analyser og analysere data. Den første monteringen av en QMI analysen innebærer screening antistoffer for å generere et panel, og empirisk bestemme en passende lyseringsbuffer. Den påfølgende reagens forberedelsen inkluderer covalently kopling immunutfelling antistoffer mot MagBeads, og biotinylating sonde antistoffer slik at de kan merkes med en streptavidin fluoroforen. For å kjøre analysen, er lysat blandet med MagBeads over natten, og deretter perler er delt og inkubert med forskjellige sonde antistoffer, og deretter en fluoroforen etikett, og leses av flyt flowcytometri. To statistiske tester er utført for å identifisere Fiskene som avviker betydelig mellom eksperimentelle forhold, og resultatene er visualisere ved hjelp av heatmaps eller node-Edge diagrammer.

Introduction

Dynamisk protein-protein interaksjoner utgjør den molekylære signalering kaskader og aktive strukturer som er funksjonell basis for de fleste cellulære fysiologi1. Disse prosessene er ofte avbildet som lineær signalering trasé som veksler mellom Steady stater basert på enkelt innganger, men eksperimentelle og modellering data tydelig viser at de fungerer som integrerte nettverk2,3, 4. i tilfelle av G proteiner, ulike reseptorer har ofte muligheten til å aktivere samme G protein, og en enkelt reseptor kan også aktivere mer enn én type G protein5,6. For at relativt lite antall G protein klasser spesielt modulere et stort utvalg av cellulære funksjoner som Synaptic overføring, hormon regulering, og celle migrasjon, må cellene både integrere og differensiere disse signalene4 , 5. bevis har vist at dette signalet spesifisitet, for G proteiner så vel som andre, er først og fremst avledet på grunnlag av finjusterte protein-protein interaksjoner og deres timelige dynamikk1,3, 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. fordi signalering nettverk består av dynamiske protein komplekser med flere innganger, utganger, og feedback looper, en enkelt forstyrrelsene har mulighet til å endre den samlede homøostatisk balansen i en celle fysiologi4 ,7. Det er nå allment enighet om at signalering bør undersøkes fra et nettverk perspektiv for å bedre forstå hvordan integreringen av flere innganger kontroller diskret cellulære funksjoner i helse og sykdom7,8, 9,10,11,12,13. I lys av dette, ble kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI) utviklet for å samle middels gjennomstrømning, kvantitative data om fold endringer i dynamiske protein interaksjon nettverk.

QMI er et antistoff-basert analyse der cellen lysat er inkubert med et panel av immunutfelling antistoffer som er covalently koplet til magnetiske perler som inneholder distinkte prosenter av fluorescerende fargestoffer. Etter å ha spesifikke antistoffer koplet til distinkte magnetiske bead klasser tillater samtidig co-immunutfelling av flere mål proteiner fra samme lysat. Etter immunutfelling (IP) er magnetiske perler inkubert med et sekund, fluoroforen sonde antistoff (eller biotinylated antistoff i forbindelse med fluoroforen-bøyd streptavidin). Co-foreninger mellom proteiner gjenkjent av hvert IP antistoff-sonde antistoff par, eller Fiskene (proteiner i delte komplekser oppdages av utsatte overflate epitopes), blir deretter oppdaget av Flow flowcytometri og kan kvantitativt sammenlignet mellom ulike eksempel vilkår14. Illustrasjoner i figur 1 viser trinnene involvert i å kjøre en QMI-analysen, inkludert et diagram av magnetiske perler med immunoprecipitated protein komplekser merket av fluorescensmerkete bøyd sonde antistoffer (figur 1C).

Følsomheten til QMI avhenger av protein konsentrasjonen av lysat i forhold til antall magnetiske perler som brukes til immunutfelling, og oppnå en oppløsning for å oppdage 10% fold endringer krever bare en liten mengde Start materiale i forhold til andre co-IP metoder14,15. For eksempel er mengden av Start materiale som brukes i QMI lik som kreves for en sandwich enzym-koblet Immunosorbentanalyse-analysen (ELISA), men flere interaksjoner er oppdaget i en enkelt QMI-analysen. QMI analyser med 20 IPs og 20 sonde mål har blitt utført med 1-5 x 105 primær T-celler isolert fra en 4 mm hud biopsi, P2 synaptosomal preparater fra en 3 mm koronale del av musen prefrontal cortex, eller 3 x 106 kultivert mus primære kortikale neurons14,16,17. Denne følsomheten gjør QMI nyttig for analyse av celler eller vev med begrenset tilgjengelighet, for eksempel kliniske prøver.

QMI kan tilpasses for alle tidligere definerte protein interaksjon nettverk (forutsatt at antistoffer er tilgjengelig), og hittil er utviklet for å analysere T celle antigen reseptor (TCR) signalosome og et delsett av proteiner på glutamatergic synapser i neurons 17 i , 18. i studier av T celle reseptor SIGNALERING, QMI ble først brukt til å identifisere stimulering-indusert endringer i Fiskene, og deretter å skille autoimmune pasienter fra en kontrollgruppe, oppdage endogene autoimmune signalering, og til slutt å generere en hypotese som involverer en ubalansert sykdom-assosiert subnettverket av interaksjoner14. Flere nylig, det samme QMI panelet ble brukt til å fastslå at thymocyte utvalg bestemmes av kvantitative snarere enn kvalitative forskjeller i TCR-Associated protein signalering19. I neurons, QMI ble brukt til å beskrive input-spesifikke omorganisering av et protein interaksjon nettverk for forskjellige typer inngangssignaler på en måte som støtter nylig nye modeller av Synaptic plastisitet17. I tillegg er dette Synaptic QMI panelet ble brukt til å identifisere forskjeller i syv musemodeller av autisme, klynge modellene i undergrupper basert på deres Fiskene biosignatures, og nøyaktig hypothesize en felles molekylær underskudd som tidligere var ugjenkjennelig i en av modellene16. En lignende tilnærming kan brukes til skjerm for andre undergrupper som kan reagere på ulike rusmiddel behandlinger, eller tildele medikamenter til spesifikke responsive undergrupper. QMI har potensielle applikasjoner innen diagnostikk, pasient under skriving og narkotika utvikling, i tillegg til grunnleggende vitenskap.

For å sette sammen et QMI antistoff panel, er første antistoff-screening og utvalgs protokoller beskrevet i avsnitt 1 nedenfor. Når antistoff paneler er identifisert, er protokoller for Bøyning av de utvalgte antistoffer mot magnetiske perler for IP, og for biotinylation av de valgte sonde antistoffer, beskrevet i avsnitt 2. Protokollen for å kjøre QMI-analysen på celle-eller vevs lysater er beskrevet i avsnitt 3. Til slutt, siden et enkelt eksperiment kan generere ~ 5 x 105 individuelle datapoints, instruksjoner og datamaskinkoder for å bistå i databehandling, analyse og visualisering er gitt i § 4. En oversikt over arbeidsflyten som er beskrevet i avsnittene 2-4, vises i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. analyse design

  1. Utarbeidelse av kandidat antistoff
    1. For hvert protein av interesse, Velg 3 til 5 antistoffer til skjermen. Når det er mulig, bruk monoklonale antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitopes. Inkluderer også en ikke-spesifikk kontroll antistoff.
    2. For å fjerne Tris, Utfør buffer utvekslingen ved å legge til antistoff i et 30-verdi Settings filter på kDa, spinn ned til minimums volumet, Legg til 500 μL av fosfat-bufret saltvann (PBS), og gjenta 3 ganger. For å fjerne transportør proteiner, Utfør antistoff rensing i henhold til produsentens protokoll (se tabell over materialer for spesifikk rensing anbefaling).
      Merk: Dette er gjort fordi carrier proteiner og buffere med gratis Amin grupper (som Tris) vil reagere med COOH grupper og slukke den påfølgende perle kopling og biotinylation reaksjoner. Sørg for at alle antistoffer er renset (ingen bære proteiner) og i en buffer fri for primær aminer (dvs. ingen Tris).
    3. Par hvert antistoff for å carboxylat modifisert lateks (KML) perler som beskrevet av Davis og Schrum20. For å bevare antistoff, Skaler ned perle koplings reaksjoner med opptil 1/5 (dvs. 3,6 x 106 perler med 10 μL 0,2-1 mg/ml antistoff).
    4. Beregn perle tall ved hjelp av en hemocytometer (vanligvis ~ 108/ml) og oppbevar ved 4 ° c. Perler har vært lagret i over et år og brukt med hell i QMI analyser, men holdbarhet eller utløpsdatoer har ikke blitt formelt etablert. NaN3 i B/S buffer hindrer bakteriell vekst.
    5. Biotinylate en del av hvert antistoff (se avsnitt 2,2 nedenfor). Oppbevares ved 4 ° c.
    6. Bekreft effektiv KML-kopling og nøyaktig telling ved farging 1 x 105 perler med et PE-bøyd antistoff som reaktive til arten der antistoff ble hevet og lesing på en strømnings flowcytometer.
    7. Bekreft antistoff biotinylation ved å bruke streptavidin-HRP.
    8. Når laboratoriet har generert reagenser som er kjent for å være effektive, kan du bruke disse reagensene som positive kontroller i bekreftelses reaksjoner i trinn 1.1.5 og 1.1.6.
  2. Antistoff screening av IP-FCM (immunutfelling oppdaget av Flow flowcytometri)
    1. Bestem deg for en passende screening lysat. For dette og alle andre pre-QMI screening trinn (alt inkludert i denne delen 1: analysen design), ikke bruk biosamples med begrenset tilgjengelighet. I stedet, foretrekker en sammenlignbare administrere materiale som wildtype musen tissue, cellen linjer, eller normal Human donor tissue det er ikke en begrensende ressurs.
      Merk: velge en lyseringsbuffer for denne analysen er ikke trivielt, og er diskutert i § 1,5: vaskemiddel Selection, så vel som i nest siste avsnitt av diskusjonen delen. Standard lyse Rings buffere har en base på 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM natrium fluor, 2 mM natrium orthovanadate, og protease og fosfatase hemmer cocktails. Vaskemidler som er kompatible med QMI inkluderer 1% np-40, 1% Digitonin, 0,1-1% Triton X-100, og 0,5-1% natriumdeoksykolat14,16,17,18,19,21.
    2. Beregn det totale volumet av lysat som skal brukes for hver IP, med 10 μL for hver IP-probe-kombinasjon som skal undersøkes. Hvis screening X sonde antistoffer og bruker en IgG-kontroll, vil hver IP bruke (X + 1) * (10 μL) * (1,1 for pipettering feil); X + 1 er å gjøre rede for den påkrevde IgG-sonde-kontrollen. For eksempel, i en 3x3 antistoff skjerm, hver IP bør bruke 44 ul. Husk å ta med en IgG IP-kontroll (se eksempel screening oppsett i figur 2).
    3. Beregn antall KML-perler som skal brukes. Hvis du er screening X sonde antistoffer, bruk [(X + 1) * 5 X 104 perler]. Ideelt sett vil 5 000 perler per brønn resultere i > 2000 perler per brønn blir lest av flyten flowcytometer. For eksempel, i en 3 x 3 antistoff skjerm, hver IP bør bruke 20 000 perler, som er ca 0,66 μL av forberedt KML perle lager fra trinn 1.1.3 (perler bør først kvantifisert ved hjelp av en hemocytometer for å sikre nøyaktighet).
    4. Ruge volumet av lysat fra trinn 1.2.2 med volumet av hver KML-perle for å bli vist fra trinn 1.2.3, over natten ved 4 ° c med rotasjon for å hindre at perlene blir avgjort. Vanligvis utfører incubations i den første kolonnen i en 96-brønn PCR-plate, og lue med PCR rør strimmel caps.
    5. Snurr ned KML-perler på 3 200 x g i 1 min og fjern lysat med en enkelt, rask dreining av platen over vasken. En liten hvit pellet skal være synlig på bunnen av hver brønn både før og etter å ha bla.
    6. Resuspend KML perler i et volum på FlyP buffer til lik 20 μL for hver perle-sonde pair; for X-sonde antistoffer, bruk (X + 1) * (20 μL) * (1,1 for pipettering feil), tilsvarende trinn 1.2.2. For en 3 x 3-skjerm, resuspend i 88 μL av FlyP buffer. FlyP buffer er 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Distribuer hver IP på tvers (X + 1) brønner på en 96-brønn PCR-plate, der X er antall sonde antistoffer som blir vist, ved hjelp av 20 μL/brønn. Figur 2 A viser et eksempel på screening-oppsett.
    8. Vask 2 ekstra ganger ved hjelp av 200 μL av FlyP buffer per brønn. Spinn platen som i trinn 1.2.5 og knips platen for å fjerne vaskebuffer etter hver vask. Pellets ville være ytterst liten, bortsett fra burde være synlig etter hver vask.
    9. For hvert biotinylated antistoff som skal undersøkes, beregner du det totale volumet som (Y + 1) * 1,1 * 50 μL, der Y er antall IP-antistoffer som blir vist. Fortynne antistoff til en fungerende konsentrasjon i dette volumet av FlyP buffer, vanligvis starter med 1:100 fortynning av en 0,5 mg/mL lager.
    10. Distribuer hvert utvannet antistoff ned hver kolonne på 96 brønn platen, og sikre at KML-perlene er resuspendert.
    11. Ruge ved 4 ° c i 1 time, enten med rotasjon eller pipettering ved 15 minutter intervaller for å sikre at KML-perler forblir i suspensjon.
    12. Vask 3x i 200 μL av FlyP buffer, for hver vask sentrifuge og fjern lysat som i trinn 1.2.5.
    13. Resuspend alle KML-perler i 50 μL av 1:200 Streptavidin-PE i FlyP-buffer.
    14. Ruge ved 4 ° c i mørket i 30 minutter.
    15. Vask 3x i 200 μL av FlyP buffer, for hver vask sentrifuge og fjern lysat som i trinn 1.2.5.
    16. Resuspend i 200 μL av FlyP buffer, og deretter kjøre på en Flow flowcytometer.
  3. Velge antistoffer for å inkludere i analysen
    1. Gate på størrelse ved hjelp av FSC-H vs SSC-H, og eliminere doublets ved hjelp av FSC-H vs FSC-A.
    2. Generer histogrammer av PE fluorescens intensitet og overlegg både IgG-kontroller (IgG bead-test probe, test bead-IgG sonde) på testet parene (figur 2).
    3. Se etter en perle-sonde par som gir klart signal over støy (figur 2B). I tillegg er det ikke ideelt å bruke samme antistoff for både perle og sonde. Differensial epitope anerkjennelse maksimerer sjansene for å observere interaksjoner fordi noen epitopes kan være okkludert i visse protein komplekser. Hvis det ikke finnes noen akseptable alternativer, gjentar du skjermen med flere antistoffer.
  4. Bekreftelse av antistoff spesifisitet
    1. For å sikre antistoff spesifisitet for de tiltenkte målene, bruk en lysat prøve der målet er slått ut; for eksempel en knockout mus eller en RNAi cellelinje. Alternativt, bruk lysat fra en mål-negativ cellen line i hvilket målet protein er blitt kunstig uttrykt.
    2. Utfør IP-FCM som beskrevet i trinn 1,2, og endre for å passe eksperimentet.
  5. Valg av vaskemiddel
    1. Som vaskemidler er avgjørende i co-IP eksperimenter, empirisk teste ulike varianter for å sikre at analysen har maksimal sannsynlighet for å oppdage endringer. For å starte, velger du et relativt lite panel av interaksjoner (4-8) som er kjent for å endre i en gitt tilstand og/eller er av spesiell interesse for studiet.
    2. Bruk av ikke-fluorescerende, antistoff-bøyd KML-perler laget for startskjermer, Utfør IP-FCM som beskrevet i 1,2 ved hjelp av varierte lyseringsbuffer rengjøringsmidler. Vaskemiddel skjermer kan utføres med vaskemiddel som den eneste variabelen, eller med ulike celle forhold for hver vaskemiddel. Bruk alltid IgG-kontroller for både perler og sonder, siden vaskemidler tidvis produserer uventet bakgrunn i noen kombinasjoner av IP-sonde.
    3. Basert på mikrofinansinstitusjoner fra skjermen, velger du et vaskemiddel som optimaliserer signalet for Fiskene av interesse. Det er sannsynlig at noen kompromisser må gjøres22.

2. klargjøring av multiplex reagens

  1. Magnetisk perle kopling
    1. Bruk det magnetiske perle områdekartet til å velge perle områder som skal brukes i et mønster som minimerer risikoen for kryss registrering. Magnetisk perle vanligvis smøre opp og til høyre, så unngå perle områder som er diagonalt tilstøtende. Perler fra annenhver kolonne av perle diagrammet som vises på Luminex nettsted er anbefalt (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Klargjør det transportør frie antistoff ved 0,1 mg/mL i PBS (som i 1.1.2) i 250 μL. Hold på isen for senere bruk.
    3. Vortex magnetiske perler mye, og deretter alikvot 250 μL i et gult mikrosentrifugen rør (for å beskytte perler fra photobleaching).
    4. Magnetisk separate magnetiske perler for 60 s og fjern supernatanten.
    5. Tilsett 250 μL av MES-buffer (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), Vortex, magnetisk separat for 60 s, og fjern supernatanten. Gjenta og resuspend magnetiske perler i 200 μL av MES-buffer.
    6. Tilsett 40 μL av MES til en 2 mg en gangs tube med Sulfo-NHS for å lage en 50 mg/mL lager.
    7. Tilsett 25 μL av ferske Sulfo-NHS til de magnetiske perlene. Vortex.
    8. Tilsett 25 μL av 50 mg/mL fersk oppløst EDAC [1-etanol-3-( -3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, også kalt EDC] i MES buffer. Vortex.
    9. Dekk og rist på en vortexer med et rør-Holding vedlegg i 20 min ved rom temp, 1000 RPM.
    10. Magnetisk separat for 60 s og fjern supernatanten.
    11. Resuspend 500 μL av PBS, Vortex, magnetisk separat for 60 s og fjern supernatanten. Gjenta.
    12. Resuspend i 250 μL av antistoff løsning fra trinn 2.1.2. Vortex.
    13. Ruge 2 h ved rom temp med risting på en vortexer på 1000 RPM.
    14. Tilsett 500 μL av PBS til magnet perlene, Vortex, magnetisk separat for 60 s, og fjern supernatanten.
    15. Tilsett 750 μL av blokkering/lagring (B/S) buffer (1% BSA i PBS pH 7,4, 0,01% NaN3). Deksel og ruge 30 min ved romtemperatur, 1000 RPM.
    16. Magnetisk separat for 60 s og fjern supernatanten. Resuspend i 100 til μL av B/S buffer.
    17. Oppbevares ved 4 ° c. Perler har vært lagret i over et år og brukt med hell i QMI analyser, men holdbarhet eller utløpsdatoer har ikke blitt formelt etablert. NaN3 i B/S buffer bør hindre bakteriell vekst.
    18. Valider magnetisk perle kopling ved farging ~ 0,25 μL av sammenkoblede magnetiske perler med en fluorescerende anti-Host arter sekundær og lesing på en flyt flowcytometer, som i trinn 1.1.5.
  2. Biotinylation
    1. Sørg for at antistoffer er i PBS uten carrier protein.
    2. Beregn totalt μg av antistoff som skal biotinylated (100-200 μg anbefales for bruk i Multiplex, 25-50 μg anbefales for screening).
    3. Forbered frisk 10 mM sulfo-NHS-biotin (kan gjøres ved å tilsette 224 μL av ddH2O til a 1 mg no-veie rør).
    4. Tilsett 1 μL 10 mM sulfo-NHS-biotin per 25 μg antistoff, Vortex eller pipette opp og ned for å blande.
    5. Ruge på rom temp for 1 t.
    6. Ruge ved 4 ° c i 1 time.
    7. Bruk et spinn filter på 30 kDa til å fjerne ubundet biotin og stoppe reaksjonen. Tilsett 500 μL av PBS og snurr kolonnen til minimums volumet er nådd. Tilsett 500 μL av ekstra PBS og gjenta for 3 totale buffer børser.
    8. Beregn konsentrasjonen ved å måle absorbansen på 1-2 μL på en spektrofotometer, og Bring deretter antistoff konsentrasjonen til 0,5 mg/mL.
    9. Oppbevares ved 4 ° c.

3. kvantitative multiplex immunutfelling

  1. Plate layout
    Merk: denne analysen fungerer best når den utføres ved hjelp av 96-brønn plater og 2-4 prøve forhold.
    1. Kjør alltid egnede kontroller (dvs. stimulert v. unstimulated celler) på samme plate for å oppdage endringer mellom forholdene. Distribuer hvert utvalg horisontalt over platen, og bruk hver kolonne for et annet sonde antistoff. Et sett med tekniske replikerer for hver sonde bør kjøres umiddelbart etter det første settet. Se Figur 3 for et eksempel.
    2. Nøye dokumentere platen layout for å lette nøyaktig plate lasting og analyse.
  2. Eksempel på tilberedning & immunutfelling (dag 1)
    1. Lyse vev eller celler i egnet vaskemiddel med protease og fosfatase hemmere og ruge på isen i 15 min. Pass på å holde lysat kaldt til enhver tid.
      Merk: den nøyaktige mengden med angivelse av biomaterialet og lysat proteinkonsentrasjon må være empirisk bestemt, og noen eksempler på tidligere brukte prøver er oppført i tredje ledd i innledningen. Generelt, i området 200 μL av 2 mg/mL protein per prøve har vært vellykket i fortiden for 20 IP og 20 sonde mål, men ideelle innganger for hvert antistoff panel og celle eller vev type må fastsettes empirisk.
    2. Spinn ned ved 4 ° c i 15 min ved 16 000 x g for å fjerne membraner og rusk; holde supernatanten som lysat.
    3. Utfør en BCA analysen eller lignende for å bestemme protein konsentrasjoner, og deretter normalisere proteinkonsentrasjon mellom prøvene. Hvis du bruker celler, begynner du med et likt antall celler per betingelse, og normalisering er valgfritt.
    4. Forbered en Master magnetisk perle blanding som inneholder ~ 250 magnetiske perler av hver klasse per brønn i analysen. Juster perle tallene etter dataanalyse, slik at i fremtidige analyser et gjennomsnitt på 110 perler av hver klasse vil bli lest per brønn.
      Merk: eksempel beregning: (nytt perle volum) = [(kjøre gjennomsnitt)/110] * (forrige perle volum). Perle volumer bør justeres på denne måten om hver 8 går eller etter behov. Vanligvis brukes 3-4 μL av hver magnetisk perle (tilberedt som ovenfor) for et 2-plate eksperiment.
    5. Vask magnet perlen bland 2x i FlyP buffer med magnetisk separasjon, og deretter resuspend i FlyP buffer. For blanding, bruk 10 μL per prøve per plate. FlyP buffer er 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Etter grundig virvlingen av den magnetiske perle blandingen, alikvot 10 μL i iskalde mikrosentrifugen rør (ett rør per prøve). Legg like store mengder lysat (med normalisert konsentrasjoner) til hvert rør for immunutfelling.
    7. Alikvot den lysat-magnetiske perle blandingen i ett rør for hver plate som kjøres; for eksempel for et 2-plate eksperiment, deler du lysat i to rør. Plasser rør på en Rotator ved 4 ° c over natten for immunutfelling, dekket for å holde ut lyset.
  3. Kjøre analysen (dag 2)
    1. Start med lysat-magnetisk perle rør for plate #1. Bruk et magnetisk perle stativ for å fjerne lysat fra de magnetiske perlene, og reserver lysat for fremtidig analyse. Vask perler 2x i 500 μL av iskald FlyP buffer. Oppbevar rør rørene alltid på is eller ved 4 ° c.
    2. Beregn blanding volum som (antall sonder) * (2 tekniske replikerer) * (25 μL per brønn) * (1,1 for pipettering feil). Resuspend IPs i beregnet volum av iskald FlyP buffer.
    3. Etter grundig blanding magnetiske perler ved milde pipettering, distribuere 25 μL per brønn over en flat bunn 96 brønn plate, på is.
    4. I en annen 96 brønn plate, fortynne biotinylated sonde antistoffer til 2x arbeids konsentrasjon (arbeids konsentrasjon er vanligvis 1:100 eller 1:200, empirisk bestemmes) i FlyP buffer slik at deres rekkefølge samsvarer med kolonnene på plate layout (se Figur 3 ). Det endelige volumet av sonde antistoffer ved arbeids konsentrasjonen vil være 50 μL per brønn, slik at volumet av hver 2x antistoff forberedt bør være (25 μL) * (antall biologiske prøver) * (2 tekniske replikerer) * (1,1 for pipettering feil).
    5. Bruk en flerkanals pipette til å fordele 25 μL av hver sonde antistoff fortynning i den magnetiske perle-inneholdende analyse plate.
    6. Rist på en horisontal plate shaker å blande og resuspend de magnetiske perlene, og deretter ruge ved 4 ° c for 1 t, risting ved 450 RPM i mørket.
    7. Vask 3x med FlyP buffer på en magnetisk plate skive ved 4 ° c.
    8. Resuspend de magnetiske perlene i 50, μL av 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Rist for å mikse og resuspend perler, og deretter ruge ved 4 ° c i 30 min, risting ved 450 RPM i mørket.
    10. Vask 3x med FlyP buffer på en magnetisk plate skive ved 4 ° c.
    11. Resuspend i 125 μL av FlyP buffer.
    12. Rist for 1 min ved 900 RPM til grundig resuspend perler.
    13. Kjør på kjøle strømnings flowcytometer (se diag i figur S1). Bruk "High RP1 target" innstillingen i flyten flowcytometer programvare, og en stoppbetingelse av 1 000 perler per region (sterkt overshooting antallet som skal være i en enkelt person godt for å hindre at maskinen fra å stoppe for tidlig) og prøvevolum på 80 μL.
    14. Pause kjøre halvveis gjennom og resuspend perlene å hindre settling.
    15. Eksporter datafiler i XML-format.
    16. Gjenta prosessen for de resterende platene, som starter på trinn 3.3.1.

4. data analyse

Merk: ANC-koden ble utformet for å sammenligne to betingelser fra N = 4 eksperimenter, hver med 2 tekniske replikerer for hver tilstand. For eksempel er celler stimulert fire uavhengige tider, QMI kjøres på fire forskjellige dager på kontroll (unstimulated) og stimulert celler, med tekniske replikerer som ovenfor, og dataanalyse provenyet som beskrevet nedenfor.

  1. Adaptiv ikke-parametrisk med justerbar Alpha Cut (ANC)
    1. Åpne MATLAB, og angi den aktive mappen til en mappe som inneholder programkomponentene for ANC og XML-filene som eksporteres fra flyt flowcytometer.
    2. Fyll ut "ANC input" filen for å gjenspeile detaljene i eksperimentell design. Eksempel filen som er inkludert i tilleggsfilen , er forhåndsutfylt for å kjøre eksempeldataene, også gitt.
    3. Kjør programmet, som vil skrive en CSV-fil i Active Directory. Filen rapporterer Fiskene som er vesentlig forskjellige, på et falskt positivt (Alpha) nivå på 0,05, mellom kontroll og eksperimentelle forhold, i alle 4 eksperimentelle replikerer, eller minst 3/4 replikerer.
    4. Merk ' ANC hits, som er definert som Fiskene med betydelige forskjeller i minst 3 eksperimentelle replikerer, representert som 3/4 ∩ 4/4 i filen, for bruk i trinn 4.3.1.
  2. Nettverksanalyse av vektet korrelasjon23 (cna)
    1. Lim inn-transponere kolonnetitlene i datafilen utgang av MATLAB som slutter på "_MFI. CSV "i den første raden i et nytt Excel-ark. Legg til kolonnene «eksperiment» for eksperiment nummer og «behandling», for eksperimentell behandling eller andre variabler som skal analyseres. Lagre denne filen som "personlighetstrekk. csv".
    2. Åpne R Studio og sette arbeidsmappen til en mappe som inneholder "_MFI. CSV "og" PERSONLIGHETSTREKK. CSV-filer.
    3. Løpe det R kommandoene idet angitt inne det bemerket kommandere arkiv og det detaljert inne veiledningene inkludert med det fil-størrelse. Den WCNA moduler signifikant korrelert med hver eksperimentelle trekk er output som en grafisk fil, og sammenhengen av hver interaksjon IPi_ProbeJ med hver modul er output som en. CSV-fil.
    4. Obs ' CNA hits, som er definert som interaksjoner med modul medlemskap (MM) > 0,7 og p < 0,05 for medlemskap i en modul som ble identifisert som signifikant korrelert med eksperimentell variabel av interesse, for bruk i trinn 4.3.1.
  3. Positiv "hits" & visualisering
    1. For hver interaksjon i "3/4 ∩ 4/4 hits"-listen i ANC utdatafilen (fra trinn 4.1.4), identifisere om at samspillet er også en "CNA hit" ved å sjekke CNA output filen (se trinn 4.2.6). Opprett en ny kolonne som angir om hvert ANC-treff også er et CNA-treff.
    2. Beregn gjennomsnittlig Logg2 fold endre verdi for hver ANC ∩ cna rammet av gjennomsnitt verdiene gitt i ANC output regneark "_Hits. csv" fra trinn 4.1.3. Konverter verdier for å logge2 fold endre før snitt. For samhandlinger som var signifikante i bare 3/4 replikerer, sletter du den avvikende verdien.
    3. Lag et regneark med hver ANC ∩ CNA hit oppført som en IP i en kolonne, en sonde i den andre kolonnen, og fold endre verdien i den tredje kolonnen. Bruk dette regnearket til å opprette et diagram for node-kant i Cytoscape ved å importere filen som et nettverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antistoff screening
Figur 2 B viser resultatene av en skjerm for proteinet Connexin36. De fleste IP_probe-kombinasjoner gir ingen signal over IgG-kontroller. IP med monoklonale antistoff 1E5 og sonde med enten 1E5 eller polyklonale antistoff 6200 produserer en høyre forskyvning i perle fordelingen sammenlignet med IgG-kontroller. Her ble IP 1E5 og sonde 6200poly valgt for å unngå å bruke samme antistoff som IP og sonde, både for å redusere sannsynligheten for at et ikke-spesifikt protein blir gjenkjent av to uavhengige antistoffer, og for å øke sjansen for å oppdage co-foreninger ved hjelp av forskjellige epitopes. Det er best å velge en IP_probe kombinasjon med minst 1-2 logge høyere MFI forhold til IgG-kontroller, men noen ganger parene produsere svakere mikrofinansinstitusjoner som er konsekvent skilles fra kontroller kan brukes hvis ingen alternativer er identifisert. Figur 2 C viser en spesifisitet validering eksperiment for 1E5-6200poly kombinasjon. Lysat fra 293 celler transfekterte med en Connexin36 plasmider produsert en ~ 1,5-log høyre SKIFT i perle fordelingen, mens untransfected celler overlappes med IgG-kontroller. Når bekrefter spesifisitet av et par, negativ kontroll lysat fra en knockout dyr eller cellelinje uten mål proteinet bør ha en MFI ligner på IgG kontrollene.

Perle kopling
En typisk magnetisk perle kopling kvalitetskontroll reaksjonen vil gi en MFI 3-4 logger over bakgrunnen når beiset med et sekundært antistoff som bøyes til en fluoroforen med en lysstyrke indeks mellom 3 og 5 (for eksempel PE eller FITC). Figur 4 viser en typisk kvalitetskontroll reaksjon som sammenligner Bøyning av en ny magnetisk perle sammenlignet med det eldre partiet som erstattes.

Data analyse
I hvert eksperiment sammenligner ANC de fluorescens distribusjonene for hver magnetisk perle klasse i hver brønn (dvs. alle mulige IP_Probe-kombinasjoner) mellom en brukerdefinert kontroll og eksperimentell tilstand. Den tildeler en p-verdi til hver kombinasjon som reflekterer sannsynligheten for at perlene er samplet fra identiske populasjoner basert på Kolomogrov-Shmirnov (K-S)-statistikk. Programmet beregner deretter den K-S p-verdien som kreves for å produsere en falsk positiv rate på 0,05 ved å korrigere for flere sammenligninger og regnskap for teknisk variasjon (forskjeller mellom de tekniske replikerer). IP_probe kombinasjoner (Fiskene) hvis K-S test p-verdi faller under beregnet cut-off i alle fire eksperimenter, eller minst 3/4 eksperimenter (3/4 ∩ 4/4) er identifisert. Siden p-verdi cut-offs varierer avhengig av disse ulike nivåer av stringens, tidvis Fiskene vil bli identifisert i 4/4, men ikke 3/4 ∩ 4/4, så separate lister beregnes. For detaljerte ANC-ligninger, se (Smith et al. 2016). 14 detaljer om WCNA analyse og resultater drøftes grundig av Langfelder et al.23

Data presentasjon
ANC og CNA23 analyser utføres for å identifisere Fiskene som både (1) viser betydelige fold endringer mellom eksperimentelle forhold i minst 3/4 av løyper og (2) tilhører en cna-modul som er korrelert med eksperimentell variabel. Disse høy tillit Fiskene som er identifisert av to uavhengige statistiske tilnærminger er referert til som ANC ∩ CNA fiskene. Disse samhandlingene kan vises som et diagram for node-kant ved hjelp av programvaren Cytoscape (figur 5a) eller som en heatmap ved å bruke R-koden og analyse instruksjonene som er inkludert i Tilleggsmaterialet (figur 5b ).

Figure 1
Figur 1 . Oversikt over kvantitativ multiplex Immunutfelling. (a) tidligere vist antistoffer er covalently koblet til ulike klasser av magnetiske perler i separate reaksjoner. (b) over natten, er protein komplekser immunoprecipitated ved hjelp av en blanding av antistoff-sammenkoblede magnetiske perler. (c) co-immunoprecipitated proteiner er merket med et sonde antistoff og en fluoroforen. (d) magnetiske perler og merket protein komplekser kjøres gjennom en nedkjølt Flow flowcytometer å kvantifisere relative mengder proteiner som forekommer i delte komplekser. Se figur S1 for skjematisk detaljer om tilpasset kjøling. (e) Flow-Flowcytometer Manager programvare skiller MagBeads etter klasse og (f) viser fluorescens histogrammer fra hvert perle område. (g) data eksporteres som. XML-filer og analyseres av to uavhengige statistiske tilnærminger. Bare Fiskene som identifiseres av begge analysene rapporteres ved hjelp av heatmap-og node-kant-visualiseringer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Connexin 36 antistoff screening ved hjelp av IP-FCM. (a) IP-FCM ble utført på musen hjernen lysat ved hjelp av en 4X4 panel av Connexin 36 (Cx36) KML perler og sonder. Lysat ble immunoprecipitated med hver KML-perle i en separat rad på tallerkenen. Etter vask ble hver perle fordelt på rad, slik at en sonde antistoff kan legges til per kolonne. (b) de fleste antistoff kombinasjoner viser ingen signal (oransje) over IgG bakgrunn (grå, blå). 1E5 IP med 6200Poly-proben viser akseptabelt positivt signal. 1E5 bead/probe og 6200Poly perle/sonde parene hvert show akseptabelt signal, men det er ikke ideelt å bruke samme antistoff for både perle og sonde. Differensial epitope anerkjennelse maksimerer sjansene for å observere interaksjoner fordi noen epitopes kan være okkludert i visse protein komplekser. Den 6200Poly perle med 1E5 sonden gir sterkest signal og ble valgt til bruk i multiplex analysen ventende spesifisitet bekreftelse. (c) IP-FCM ved hjelp av par av Cx36 antistoffer valgt fra screening ble utført på Lysat av 293T celler transfekterte med Cx36 og ikke-transfekterte kontroller. Det er klart signal fra Cx36-transfekterte celler, men de ikke-transfekterte cellene er umulig å skille fra IgG perle/sonde kontroller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Eksempel plate layout. En 4-condition multiplex er satt opp i en 96-brønn plate. Prøver 1-4 lastes inn i etterfølgende rader (hver biologiske prøve som representeres av en annen farge), og tekniske replikeres blir lastet inn i samme rekkefølge i følgende 4 rader. En sonde brukes per kolonne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . En typisk kvalitetskontroll reaksjon som sammenligner Bøyning av en ny MagBead sammenlignet med den eldre gruppen som blir erstattet. Perlen gir en MFI 2-4 logger over bakgrunnen, og den nye batch har en MFI lik som den gamle batch. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . QMI identifiserer Synaptic Fiskene som endrer i størrelsesorden følgende 5 minutter av NMDA stimulering i kultivert kortikale neurons. En QMI eksperiment sammenlignet NMDA stimulert vs unstimulated (ACSF kontroll) neurons. Fiskene som ble identifisert av både ANC og CNA analysene presenteres. (a) i en node-Edge diagram produsert ved hjelp av åpen kildekode-programvare Cytoscape, nodene indikerer antistoff mål (proteiner) som ble inkludert som IPS og SONDER i QMI panelet. Kantene representerer ANC ∩ CNA Fiskene, med farge og tykkelse på kanten som indikerer retningen og omfanget av fold-endring mellom NMDA behandling og kontroll. Fiskene som ikke endret mellom NMDA og kontroll forholdene er ikke inkludert i figuren. (b) en heatmap produsert i R med heatmap. 2-funksjonen representerer samme ANC ∩ cna fiskene. ComBAT-normalisert, Logg2 MFI verdier er normalisert etter rad å gjøre rede for data som spenner over ~ 3 logger, og den relative MFI for hver eksperimentell replikere er show for å demonstrere den relative omfanget og konsistensen av hver rapporterte fiskene. Dataene og koden som kreves for å reprodusere disse tallene, er inkludert i tilleggsfilen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Figur S1: diagrammer av tilpasset kjøling av strømnings flowcytometri systemet. Flyten flowcytometer ' s array leseren må oppbevares ved romtemperatur, men den nedre delen (mikroplate plattform) må være nedkjølt for å opprettholde Fiskene under analysen. Se tabell over materialer for modellinformasjon om Flow flowcytometer og sandwich prep kjøleskapet som brukes. (a) den øvre vedlegg og matoppbevaring binger ble fjernet fra en sandwich prep kjøleskap. Den mikroplate plattformen ble plassert på metallet støtter ment å holde plast matoppbevaring skuffer. Plasthuset til mikroplate plattformen ble fjernet for å gjøre det passe. En tilpasset plexiglass plattform ble bygget med målinger vist i (b) for å dekke den øvre åpningen av kjøleskapet. Plexiglass ble isolert med 1/2 "skum isolasjon kuttet for å matche størrelsen på plexiglass, og forseglet gapet med isolerende tape. Et hull ble deretter boret gjennom plexiglass slik at prøven nålen fra flyten flowcytometer analysen leseren å få tilgang til mikroplate plattformen når utvidet. En svart kopling enhet som opprinnelig ble skrudd inn i toppen av mikroplate plattformen ble fjernet, og skrudd tilbake i mikroplate plattformen fra over plexiglass, som hjalp i innretting. En dør i plexiglass-dekselet gir brukeren tilgang til mikroplate transportøren når den forlenges ut av enheten. Merk at flyten flowcytometer programvaren vil varsle brukeren om at plate carrier er for kaldt, men brukeren kan overstyre advarselen og kjøre avkjølt QMI eksperimenter. (c) fotografi av det sammensatte systemet. (d) detalj i front høyre hjørne, som trekkes i (a), viser montering av plexiglass deksel og isolasjon. (e) detalj av prøven nålen justert over hullene. (f) detalj av den barberte delen av isolasjon som gjør at luftstrømmen under enheten. (g) detalj av den åpne døren viser flyten flowcytometer mikroplate plattformen nedenfor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary File
Tilleggsfil. Data og kode som kreves for å reprodusere disse tallene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den QMI analysen krever betydelige investeringer i antistoff panel utvikling, utstyr og reagenser, men når analysen er etablert, kan man samle høy-dimensjonale data observere protein interaksjon nettverk som de reagerer på eksperimentelt-kontrollerte Stimuli. Teknisk sett krever QMI nøye pipettering og sporing av prøve-og antistoff brønn steder. Nøye merking analysen platene er nyttig, som gjør en detaljert mal av brønn steder på papir, som deretter lagres for dataanalyse. Viktigheten av å holde perlene og lysat kalde til enhver tid, inkludert i strømnings flowcytometer mikroplate transportør (se figur S1 for tilpassede kjøle instruksjoner) kan ikke være overdrevet. Protein interaksjoner vil raskt distansere ved romtemperatur, og tidlig forsøk på å bruke en uendret, romtemperatur flyt flowcytometer endte med identifisering av mange temperatur-labilt interaksjoner, men ikke de som er endret med den tiltenkte Stimulering.

QMI er en antistoff-basert analyse, så det første valget av antistoffer er kritisk. Monoklonale eller rekombinant antistoffer bør brukes når det er mulig for å redusere variasjoner i resultatene. Polyclonals viser mye-til-parti variasjon, men peptid-baserte Polyclonals til en kort epitope synes å være relativt stabilt over tid. Drift kan minimeres ved å kjøpe store grupper av antistoffer; Dette gjør det også mulig for egendefinerte-bestillinger av carrier-frie antistoffer som utelukker behovet for å rense antistoffer med melon gel og Spin kolonner, og den tilhørende antistoff tap.

Det er også viktig å merke seg at, fordi oppdager et signal er avhengig av tilgjengelige epitopes, mangelen på et signal ikke nødvendigvis indikerer mangelen på en interaksjon, en begrensning som er vanlig med andre protein interaksjon metoder. 14 videre, når et signal oppdages, er det umulig å entydig staten Vær protein interaksjon er direkte (a samhandler med b) eller indirekte (a samhandler med X og Y, som deretter samhandle med b), som er grunnen til at observert interaksjoner er referert til som Fiskene snarere enn protein-protein interaksjoner (PPI), som kan innebære direkte binding. En begrensning av alle antistoff-baserte metoder som bør holdes i bakhodet er at tilsetning av antistoffer kan forstyrre eller stabilisere protein komplekser. En annen begrensning ved bruk av Flow flowcytometri snarere enn vestlige blots er at størrelsen informasjon for å bekrefte antistoff spesifisitet er ikke tilgjengelig. For å overkomme denne begrensningen, brukes IgG-kontroller i screening av hvert antistoff par, og spesifisitet bekreftes med Knock-Out eller knock-in cellelinjer eller dyr før du fortsetter med QMI eksperimenter (seksjon 1,4).

IgG-kontroller brukes ikke i QMI analysen fordi hver IgG produserer et annet nivå av bakgrunns signal, noe som gjør det umulig å vite riktig bakgrunns verdi å subtrahere. For eksempel, hvis IP (X) _probe IgG gir en MFI av 100 og IP IgG_probe Y gir en MFI av 200, som bakgrunns verdi bør trekkes fra IP X_probe Y? På samme måte, noen ganger uoppdaget interaksjoner (f. eks IP X sonde Z) vil ha en lavere MFI enn den ikke-spesifikke IgG interaksjoner. Å gjøre rede for denne begrensningen av ikke å vite det absolutte MFI signalet, Fiskene er ikke rapportert utelukkende for å bli oppdaget over en vilkårlig bakgrunn nivå. I stedet rapporteres det bare Fiskene som forandrer som reaksjon på en gitt stimulering. Mens høye MFI kan være forårsaket av uspesifisert støy, ville denne støyen ikke forventes å endre med stimulering. I tillegg er en del (10-20%) av betingelses avhengige interaksjoner som er observert er generelt bekreftet av en annen metode, vanligvis IP-Western. Denne bekreftelsen er analog til å bekrefte resultatene av RNA-sekvensering med høy gjennomstrømming med RT-PCR og er ment å øke tilliten QMI resultater.

Uttrykk effekter som påvirker QMI resultater kan ikke utelukkes uten ytterligere tester, fordi QMI ikke skiller mellom økt absolutte nivåer av et protein og økt homo-multimerization av et protein. For å minimere usikkerhet med hensyn til uttrykk, kan eksperimenter utføres ved hjelp av akutte behandlings forhold med korte tidsrammer som minimerer potensielle endringer i protein uttrykks nivåer. Andre metoder er nødvendig for å utelukke uttrykks effekter i kroniske behandlings forhold eller primære pasientprøver.

Det er viktig å velge en passende lyseringsbuffer for QMI. For svakt av et vaskemiddel kan la membraner intakt og holde sammen proteiner som ikke er i komplekse, mens for sterkt et vaskemiddel kan ødelegge protein komplekser. Ytterligere faktorer som tilstedeværelsen av kalsium eller dens chelater kan dramatisk påvirke Fiskene og bør vurderes nøye før screening antistoffer for å inkludere i en QMI panel. For IP-vestlige eksperimenter, lyse Rings forhold er vanligvis optimalisert for hver Fiskene på et sak-til-sak grunnlag, men de beste forutsetninger for å oppdage en enkelt Fiskene kan ikke oversette til andre fiskene i samme protein nettverk22. Valg av vaskemiddel presenterer et dilemma for kylling og egg, ved at en lyseringsbuffer er nødvendig for å skjermen antistoff kandidater, men et panel av antistoffer er nødvendig for å skjermen for en passende lyseringsbuffer. Selv om det ikke er en perfekt løsning, kan man velge et lite panel av perler og sonder som er av spesiell interesse og/eller har kjente assosiasjoner eller dissociations som svar på en stimulans, og teste deres atferd under forskjellige lyse Rings forhold på KML perler i utgangspunktet brukt for screening antistoffer (trinn 1.1.3). En ideell vaskemiddel bør tillate både pålitelig påvisning av Fiskene og recapitulation av kjente fysiologiske protein atferd (forening/dissosiasjon) med en gitt stimulans. Hvis det er noen bekymring for at et vaskemiddel ikke fullt ut solubilize membraner, kan en negativ kontroll antistoff legges som bare vil gi signal Hvis to proteiner ble koblet sammen av membran24. Når passende lyse Rings buffere velges, kan endringer i selv svake interaksjoner – slik som de mellom kinase og substrat – oppdages på en pålitelig måte (for eksempel TCR-LCK)14.

Tidligere arbeid med QMI i neurons og T-celler har både nøye bekreftet tidligere funn for å øke tilliten til gyldigheten av QMI resultater, og genererte nye hypoteser som førte til funn om signal Transduction og sykdom trasé. I fremtiden kan QMI tilpasses andre protein interaksjon nettverk og utvidet opp til 500 proteiner med dagens mikrosfære klasser tilgjengelig. Bruke QMI å studere hvordan nettverk av multi-protein komplekser endring i respons på stimuli som de kontrollerer cellulære prosesser har potensial til å gi viktig innsikt i både helse og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Tessa Davis for viktige bidrag til QMI analysen utvikling, og nåværende og tidligere medlemmer av Smith og Schrum laboratorier for teknisk veiledning og intellektuelle innspill. Dette arbeidet ble finansiert av NIMH tilskudd R01 MH113545 og r00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Tags

Biokjemi IP-FCM Proteomikk protein interaksjon signalering immunutfelling QMI
Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C.,… More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter