Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation
Summary
Kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI) använder flödescytometri för känslig detektion av skillnader i överflödet av riktade protein-protein interaktioner mellan två prover. QMI kan utföras med en liten mängd biomaterial, kräver inte genetiskt modifierade taggar, och kan anpassas för alla tidigare definierade protein interaktion nätverk.
Abstract
Dynamic protein-protein interaktioner kontroll cellulära beteende, från motilitet till DNA-replikering för att signalera transduktion. Dock är det tekniskt svårt att övervaka dynamiska interaktioner mellan flera proteiner i ett protein interaktions nätverk. Här presenterar vi ett protokoll för kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI), som möjliggör kvantitativ bedömning av veck förändringar i proteininteraktioner baserat på relativa fluorescensmätningar av proteiner i delade komplex som upptäckts av exponerade Ytan epitoper (fiskarna). I QMI, proteinkomplex från cell celllysat är immunoprecipitated på mikrosfärer, och sedan sonderade med en märkt antikropp för ett annat protein för att kvantifiera överflödet av fiskarna. Immunoprecipitation antikroppar konjugeras till olika MagBead spektrala regioner, vilket gör att en flödescytometer att skilja flera parallella immunoprecipitations och samtidigt kvantifiera mängden sond antikropp associerad med varje. QMI kräver inte genetisk märkning och kan utföras med minimal biomaterial jämfört med andra immunoprecipitation metoder. QMI kan anpassas för en definierad grupp av samverkande proteiner, och har hittills använts för att karakterisera signal nätverk i T-celler och neuronala glutamatsynapser. Resultat har lett till nya hypotes generationen med potentiella diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. Detta protokoll innehåller instruktioner för att utföra QMI, från den initiala antikropp panel urvalet till att köra analyser och analysera data. Den första monteringen av en QMI-analys innebär screening antikroppar för att generera en panel, och empiriskt fastställa en lämplig lysis buffert. Det efterföljande reagenspreparatet omfattar kovalent koppling av immunoprecipitation-antikroppar mot MagBeads och biotinylerande sond-antikroppar så att de kan märkas med en streptavidin-konjugerad fluorofore. För att köra analysen, är lysate blandas med MagBeads över natten, och sedan pärlor är uppdelade och inkuberas med olika sond antikroppar, och sedan en fluorophore etikett, och läsas av flödescytometri. Två statistiska tester utförs för att identifiera fiskarna som skiljer sig avsevärt mellan experimentella förhållanden, och resultaten visualiseras med hjälp av heatmaps eller Node-Edge diagram.
Introduction
Dynamiska protein-protein interaktioner utgör molekylära signalering kaskader och rörliga strukturer som är funktionell grund för de flesta cellulära fysiologi1. Dessa processer avbildas ofta som linjära signalvägar som växlar mellan steady-state baserat på enstaka ingångar, men experimentella och modelleringsdata visar tydligt att de fungerar som integrerade nätverk2,3, 4. När det gäller G-proteiner, olika receptorer har ofta förmågan att aktivera samma G-protein, och en enda receptor kan också aktivera mer än en typ av g-protein5,6. För att det relativt lilla antalet G protein klasser att specifikt modulera ett brett spektrum av cellulära funktioner såsom synaptisk transmission, hormon reglering, och cell migration, celler måste både integrera och differentiera dessa signaler4 , 5. bevis har visat att denna signalspecificitet, för G-proteiner och andra, huvudsakligen härleds på grundval av finstämda protein-proteininteraktioner och deras temporala dynamik1,3, 4 , ,5 , 6 , 7. eftersom signalering nätverk består av dynamiska proteinkomplex med flera ingångar, utgångar, och feedbackloopar, en enda störning har möjlighet att förändra den totala homeostatiska balansen i en cells fysiologi4 ,7. Det är nu allmänt överenskommet att signalering bör undersökas ur ett nätverk perspektiv för att bättre förstå hur integrationen av flera ingångar styr diskreta cellulära funktioner i hälsa och sjukdom7,8, 9,10,11,12,13. Mot bakgrund av detta utvecklades kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI) för att samla in medelhögt dataflöde, kvantitativa data om viknings förändringar i dynamiska protein interaktions nätverk.
QMI är ett antikroppsbaserat test där celllysat inkuberas med en panel av immunoprecipitation-antikroppar som är kovalent kopplade till magnetiska pärlor som innehåller distinkta proportioner av fluorescerande färgämnen. Med specifika antikroppar kopplade till distinkta magnetiska pärlklasser möjliggör samtidig samtidig immunoprecipitation av flera målproteiner från samma lysat. Efter immunoprecipitation (IP) inkuberas magnetiska pärlor med en andra, fluorophore-konjugerad sond-antikropp (eller biotinylerad antikropp tillsammans med fluorophore-konjugerat streptavidin). Co-föreningar mellan de proteiner som erkänns av varje IP antikropp-sond antikroppar par, eller Fiskarna (proteiner i delade komplex upptäcks av exponerade ytan epitopes), sedan detekteras med flödescytometri och kan kvantitativt jämföras mellan olika exempel villkor14. Illustrationerna i figur 1 visar de steg som ingår i en QMI-analys, inklusive ett diagram över magnetiska pärlor med immunoprecipiterade proteinkomplex märkta med fluorescerande konjugerade sond antikroppar (figur 1C).
Känsligheten för QMI beror på protein koncentrationen av lysat i förhållande till antalet magnetiska pärlor som används för immunoprecipitation, och att uppnå en upplösning för att upptäcka 10% gånger förändringar kräver endast en liten mängd utgångsmaterial jämfört med andra Co-IP-metoder14,15. Till exempel är den mängd utgångsmaterial som används i QMI liknande den som krävs för en Sandwich enzymkopplad ImmunoSorbent assay (ELISA), men flera interaktioner upptäcks i en enda QMI-analys. QMI-analyser med 20 IPs och 20 sond mål har utförts med 1-5 x 105 primära T-celler isolerade från en 4 mm hudbiopsi, P2 synaptosomala preparat från en 3 mm koronala delen av mus prefrontala cortex, eller 3 x 106 odlade mus primär kortikala neuroner14,16,17. Denna känslighet gör QMI användbart för analys av celler eller vävnad med begränsad tillgänglighet, såsom kliniska prover.
QMI kan anpassas för alla tidigare definierade protein interaktions nätverk (förutsatt att antikroppar finns), och hittills har utvecklats för att analysera T-cellantigen-receptorn (TCR) signalosome och en delmängd av proteiner vid glutamaterga synapser i nervceller 17 , 18. i studier av T-cell receptor signalering, QMI användes först för att identifiera stimulering-inducerad förändringar i fiskarna, och sedan att skilja autoimmuna patienter från en kontrollgrupp, upptäcka endogena autoimmuna signalering, och slutligen att generera en hypotes som involverar ett obalanserat sjukdomsassocierat subnätverk av interaktioner14. På senare tid, samma QMI panelen användes för att fastställa att thymocyte urvalet bestäms av kvantitativa snarare än kvalitativa skillnader i TCR-associerad protein signalering19. I nervceller, QMI användes för att beskriva input-specifika omplaceringen av ett protein interaktion nätverk för olika typer av ingångssignaler på ett sätt som stöder nyligen framväxande modeller av synaptisk plasticitet17. Dessutom, detta Synaptic QMI panel användes för att identifiera skillnader i sju musmodeller av autism, Cluster modellerna i subgrupper baserat på deras fiskarna biosignatures, och exakt hypotes en delad molekylära underskott som tidigare okänt i en av modellerna16. En liknande metod kan användas för att skärmen för andra undergrupper som kan svara på olika läkemedelsbehandlingar, eller tilldela läkemedel till specifika responsiva undergrupper. QMI har potentiella tillämpningar inom diagnostik, patient under skrivning och läkemedelsutveckling, förutom grundläggande vetenskap.
För att sätta ihop en QMI-antikroppspanelen beskrivs inledande antikroppsscreening-och urvals protokoll i avsnitt 1 nedan. När antikropps paneler har identifierats beskrivs protokoll för konjugering av de valda antikropparna till magnetiska pärlor för IP, och för biotinylering av de valda sond antikropparna, i avsnitt 2. Protokollet för att köra QMI-analysen på cell-eller vävnads celllysat beskrivs i avsnitt 3. Slutligen, eftersom ett enda experiment kan generera ~ 5 x 105 enskilda datapunkter, instruktioner och datorkoder för att bistå vid bearbetning, analys och visualisering finns i avsnitt 4. En översikt över arbetsflödet som beskrivs i avsnitten 2-4 visas i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
QMI-analysen kräver betydande investeringar i utveckling av antikropp paneler, utrustning och reagenser, men när analysen är etablerad kan man samla in högdimensionella data som observerar protein interaktions nätverk när de reagerar på experimentellt kontrollerade Stimuli. Tekniskt, kräver QMI noggrann pipettering och spårning av prov och antikroppar väl platser. Noggrant märkning analysen plattorna är användbar, som gör en detaljerad mall för väl platser på papper, som sedan sparas för dataanalys. Vik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Tessa Davis för viktiga bidrag till QMI assay utveckling, och nuvarande och tidigare medlemmar i Smith och Schrum Labs för teknisk vägledning och intellektuell input. Detta arbete finansierades av NIMH-bidrag R01 MH113545 och R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
References
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
