Her præsenterer vi en protokol for minimalt invasiv kirurgisk lesioning af muskler iboende til fodring apparat af marine bløddyrs aplysia californica at forstå rollerne af disse muskler under fodring adfærd.
Aplysia californica er et model system til at studere neurale kontrol af læring og adfærd. Dette dyr har et semi-åbent kredsløbssystem, hvilket gør det muligt at få adgang til mange af sine interne strukturer uden at forårsage nogen væsentlig skade. Mange manipulationer kan let udføres både in vivo og in vitro, hvilket gør det til en meget Tractable model til analyse af adfærd og neurale kredsløb. For bedre at forstå de funktioner af muskler i fodring grasper, har vi udviklet en teknik til at lesioning dem uden at åbne hoved kroppen hulrum af dyret eller beskadige de ydre lag af fodrings organet (dvs. den buccale masse). I denne teknik er fanger udløsende delvist everted, hvilket giver direkte adgang til muskulaturen. Denne procedure giver dyrene mulighed for at komme sig hurtigt og pålideligt. Dette har gjort det muligt at læsion de i7 muskler og sub-radular fibre, så vi kan vise, at begge muskler bidrager betydeligt til åbningen in vivo.
Fodrings systemet af aplysia californica har en lang tradition for brug som et model system til forståelse af læring og hukommelse1, motiveret adfærd2,3, og samspillet mellem adfærd, biomekanik og neurale kontrol under fodring4. Det har meget tilgængelige neurale kredsløb, med et relativt lille antal store, identificerbare neuroner. Dyret har et halvåbent kredsløbssystem, hvilket gør det muligt at få adgang til mange af dets interne strukturer uden at forårsage betydelig skade. Det er også robust over for mange manipulationer både in vivo og in vitro, hvilket gør det til en meget Tractable model til analyse af adfærd og neurale kredsløb.
For at forstå de neurale mønstre, der giver anledning til fodring adfærd, er det vigtigt at beskrive den underliggende mekanik af den bløde struktur, der udgør fodrings organet, den buccale Mass4. Mens der har været arbejde gjort for at karakterisere de ydre muskler, der udgør den buccale masse5,6, de indre muskler i den underliggende struktur i den buccale masse, der styrer overfladen af grasper, den odontophore, er blevet stort set utilgængelige for in vivo forsøg. Selv om der har været in vitro-undersøgelser om funktioner af nogle af disse muskler7,8, manglen på direkte adgang til disse muskler har gjort det vanskeligt at studere deres rolle i intakt, opfører dyr.
De fleste teknikker til elektrode implantation eller læsioner i aplysia eller lignende molluskart kræver, at kropsvæg åbnes9,10,11,12. Åbning af krops væggen forårsager epitel skade, og indsnit skal være forsvarligt forseglet for at forhindre hemolymph undslippe. Der opstår endnu alvorligere vanskeligheder, når man forsøger at nå de indre muskler i den hule af Aplysia (muskler underliggende radulært overflade eller inden for odontophore): efter at have indtastet gennem de vigtigste kropshulrum, skal man derefter gå gennem nogle del af muskel væggen i den buccale masse for at få adgang til de indvendige strukturer (figur 1a). Denne akkumulerede skade og vanskeligheder med adgang har gjort tilgangen gennem konventionelle midler problematisk, fordi dyrene ikke genvinde godt fra disse operationer (af dyr med fuld eversioner, kun 17% genvundet enhver fodring evne, N = 12. Omkring 85% af ikke-everted dyr genvundet evnen til at fodre, N = 84).
Den i7 muskel, som er blevet karakteriseret som en radular opener8, er dybt inde i odontophore selv, yderligere komplicerende adgang. Den strækker sig mellemfoden af radular stilken (figur 1c) og undersiden af radularoverfladen, gennem et lumen i odontophore (figur 1c). På tre sider af de i7 muskler er vægge af muskler, og den fjerde væg består af radular stilk. Med henblik på en biomekanisk undersøgelse ville en væsentlig forringelse af nogen af disse strukturer kompromittere den normale funktion af fodrings apparatet. Vi udviklede en roman tilgang til at arbejde med odontophore ud gennem kæberne, og gennemføre operationen via et snit til den tynde, brusk radular overflade, der gjorde det muligt at læsion den i7 muskel, samt nyligt beskrevne fine muskelfibre, der Kør lige under radular overfladen, som vi refererer til som sub-radular fibre (figur 1c).
Figur 1: anatomisk oversigt. A) placeringen af den buccale masse inden for aplysia. (B) udvendig anatomi af odontophore. Overfladen af Radula og radular SAC er gule; muskler komponere odontophore er vist i rødt, baseret på deres faktiske farver. (C) sagittal sektion af odontophore, viser placeringen af sub-radular fibre (buet pink linje) og i7 muskel (lige pink linje). Tværsnit af i6 musklen er vist i mørkerød. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
De mest kritiske trin i protokollen er behovet for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet, og at eversion af den buccale masse er lige nok til at få adgang til de underliggende muskler. Det kan kræve nogle praksis at perfektionere disse trin, men når de er mestrer, udbyttet fra operationer sandsynligvis vil være større end 85% af alle eksperimenter udført. Den vigtigste måde at korrekt modificere og fejlfinding protokollen er at bruge tid på at gøre dissektioner af den buccale masse, således at placeringen af de interne muskler er helt klar til investigator. Fordi den foreslåede indsnit gennem radular overfladen uundgåeligt forårsager nogle skader på de underliggende sub-radular fibre, det kan være hensigtsmæssigt at ændre den nøjagtige placering af snittet for at undgå specifikke regioner af disse fibre.
En begrænsning af den kirurgiske teknik er, at det kan have ikke-specifikke virkninger på fodring svar, såsom styrken af protraktion. En måde at overvinde denne begrænsning er at have dyr til at fungere som deres egen kontrol. Derudover er det afgørende at have en Sham-læsions gruppe, som er underkastet hele den kirurgiske protokol med undtagelse af fjernelse af den specifikke muskel (dvs. i7 eller SRFs). Ved at følge disse forslag vil en investigator reducere virkningerne af variabilitet mellem dyr og have et iboende mål for de ikke-specifikke virkninger af kirurgi.
Tidligere arbejde har brugt tilgange gennem kroppen væggen til læsion eller optage enten fra nerver13,14, eller muskler15,16,17. I vores laboratorium, har vi anekdomæssigt observeret, at kropsvæg indsnit er ofte ledsaget af et betydeligt tab af hemolymph og dermed af kroppens volumen. Dyr ofte kræver flere dage til at inddrive fra dette, og hvis kroppen væg læsion ikke er omhyggeligt sutureret, dyr kan ikke komme sig. Desuden afslører post mortem undersøgelse af dyrene en betydelig ardannelse omkring snittet og et stærkt immunrespons (anekdotiske observationer). I modsætning hertil viser dyr ingen tab af hemolymph eller ændring i krops volumen efter nyttiggørelse fra den protokol, der er beskrevet her (baseret på observationer i 96 dyr).
Fremtidige anvendelser af teknikken kan udvide det til andre muskler i fodrings apparatet af Aplysia, og til andre dyr. Vi har fokuseret på fjernelsen af de i7 muskler og sub-radular fibre. Disse samme generelle kirurgiske teknikker giver også adgang til de fleste af de andre muskler i odontophore. Nogle af disse, såsom den interne del af i5 muskel, er bedst tilgængelige gennem radular overflade. Andre, ligesom de indre foldere af i4, kan bedre nås gennem den udvendige epitel af odontophore. Vi har gjort indledende forsøg, hvor et snit under radular kløft af den delvist krænget odontophore tillod adgang til en skærpet krog, der skal indsættes, som derefter kunne bruges til at læsion en anden muskel i odontophore, muskel i88. Da den kirurgiske protokol, der er beskrevet her, ikke åbner hovedrummets hulrum, er det ikke nødvendigt at suturere.
Den protokol, som vi har beskrevet, kan være af almen interesse for andre efterforskere, der arbejder på bløddels strukturer, som ellers ville være svære at manipulere, f. eks. Mere generelt kan denne protokol foreslå andre nye kirurgiske tilgange til analyse af bløde strukturer som tunger, kufferter eller tentakler18.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende det hårde arbejde, som Sherry Niggel, SiSi Lu og Joey Wu har lagt i at forbedre og validere disse protokoller. Dette arbejde blev støttet af NSF Grant IOS 1754869.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |