Summary
Her presenterer vi en protokoll for minimalt invasiv kirurgisk lesioning av musklene iboende til fôring apparatet av marine mollusk Aplysia californica å forstå rollene til disse musklene under fôring atferd.
Abstract
Aplysia californica er et modell system for å studere den nevrale kontroll av læring og atferd. Dette dyret har en semi-åpen sirkulasjons-system, noe som gjør det mulig å få tilgang til mange av sine interne strukturer uten å forårsake noen betydelig skade. Mange manipulasjoner kan enkelt utføres både i vivo og in vitro, noe som gjør det til en svært medgjørlig modell for analyse av atferd og nevrale kretser. For bedre å forstå funksjonene til musklene i fôring grasper, har vi utviklet en teknikk for lesioning dem uten å åpne den viktigste kroppen hulrom av dyret eller skade de ytre lag av fôring organ (dvs. den bukkal massen). I denne teknikken, er grasper delvis vrenges ut, slik at direkte tilgang til muskulaturen. Denne fremgangsmåten gjør at dyrene kan komme seg raskt og pålitelig. Denne har fremstilt den mulig å leksjonen det i7 muskelen og sub-radular fibre, tillater oss å viser det begge to muskelen viktig levere å åpningen inne vivo.
Introduction
Fôring system av Aplysia californica har en lang historie med bruk som et modell system for å forstå læring og minne1, motivert atferd2,3, og samspillet mellom atferd, biomekanikk og nevrale kontroll under fôring4. Den har lett tilgjengelige nevrale kretser, med et relativt lite antall store, identifiserbare neurons. Dyret har en semi-åpen sirkulasjons-system, noe som gjør det mulig å få tilgang til mange av sine interne strukturer uten å forårsake betydelig skade. Det er også robust for mange manipulasjoner både i vivo og in vitro, noe som gjør det til en svært medgjørlig modell for analyse av atferd og nevrale kretser.
For å forstå nevrale mønstre som gir opphav til fôring atferd, er det viktig å beskrive den underliggende mekanikken i den myke strukturen som utgjør fôring organ, den bukkal massen4. Mens det har vært arbeid gjort for å karakterisere de ytre musklene som utgjør bukkal masse5,6, den indre musklene i den underliggende strukturen innenfor bukkal massen som styrer overflaten av grasper, den odontophore, har vært i stor grad utilgjengelige for in vivo-eksperimentering. Selv om det har vært in vitro studier på funksjonene til noen av disse musklene7,8, mangel på direkte tilgang til disse musklene har gjort det vanskelig å studere deres rolle i intakt, oppfører dyr.
De fleste teknikker for implantat teknikk eller lesjoner i Aplysia eller liknende skjellene arter krever at kropps veggen åpnes9,10,11,12. Åpne kroppen veggen forårsaker epitel skader, og snittet må være forsvarlig forseglet for å hindre hemolymph rømme. Enda mer alvorlige vanskeligheter stilles når du forsøker å nå de indre musklene i grasper av Aplysia (musklene underliggende radular overflaten eller innenfor odontophore): å ha gått inn gjennom de viktigste kroppen hulrom, må man da gå gjennom noen del av muskel veggen av bukkal massen for å få tilgang til de innvendige strukturene (figur 1a). Denne akkumulerte skaden og vanskeligheten av tilgang har gjort tilnærmingen gjennom konvensjonelle betyr problematisk fordi dyrene ikke gjenopprette godt fra disse operasjonene (av dyr med full eversions, bare 17% tilbake noen fôring evne, N = 12. Rundt 85% av ikke-vrenges ut dyr gjenvunnet evnen til å mate, N = 84).
Den i7 muskelen, som har vært karakterisert som en radular opener8, er dypt inne i odontophore selv, ytterligere kompliserer tilgang. Den strekker seg mellom bunnen av radular stilken (figur 1C) og undersiden av radular overflate, gjennom en lumen i Odontophore (figur 1C). På tre sider av i7 musklene er veggene i muskelen, og den fjerde veggen består av radular stengel. Ved anvendelsen av en biomekaniske studie ville betydelig svekkelse av noen av disse strukturene kompromittere normal funksjon av fôrings apparatet. Vi utviklet en ny tilnærming for å jobbe odontophore ut gjennom kjever, og gjennomføre kirurgi gjennom et snitt til den tynne, cartilaginous radular overflate, som gjorde det mulig å lesjon i7 muskelen, samt nylig beskrevet fine muskelfibre som løpe like under radular overflate, som vi refererer til som sub-radular fibre (figur 1C).
Figur 1: anatomisk oversikt. (A) plassering av bukkal massen innen Aplysia. (B) ekstern anatomi av odontophore. Overflaten av Forgjellesnegler og radular SAC er gul; musklene komponere odontophore er vist i rødt, basert på deres faktiske farger. (C) sagittal delen av odontophore, viser plasseringen av sub-radular fibre (buet rosa linje) og i7 muskel (rett rosa linje). Tverrsnitt av i6 muskelen er vist i mørk rød. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Aplysia er virvelløse dyr og dermed ikke utsettes for IAUC godkjenning. Å minimere ubehag å dyrene, sikre det de er fullt ut anesthetized tidligere anvender det inngrep teknikker beskrevet neden.
1. valg av dyr og bedøvelsen
- Velg et aktivt dyr ved å tilby det tang og bekrefter at bite intervaller er ikke større enn mellom 3 og 5 s.
-
Bedøve dyret med 0,333 molar magnesium klorid (se tabell 1) ved å injisere nær hodet med en 18 G nål på en 60 mL sprøyte slik at den høyeste konsentrasjonen av bedøvelse vil være rundt bukkal massen.
- Pass på å trenge inn i både det ytre epitel og det indre vevet laget med nålen. Sørg for at injeksjonen er omtrent under rhinophore, halvveis mellom rhinophore og foten, og nålen skal gå inn skrått, peker i retning av kjeven.
- Etter 10 min, forsiktig forsøke å sette inn en nål i Gill og rhinophore, verifisere at disse ikke trekke, for å sikre tilstrekkelig bedøvelsen.
- Sørg for at leppene og kjeven på sneglen er avslappet, slik at odontophore kan utsettes.
Merk: Rynker på leppene til figur 2a indikerer at dyrets lepper og kjeve ikke er tilstrekkelig avslappet for at den kirurgiske prosedyren skal utføres uten skade. Den glatte, avslappede leppene til figur 2b indikerer at kjeven er helt avslappet.
Figur 2: spenning og avslapping i anesthetized Aplysia munner. (A) Aplysia viser en høy grad av muskelspenninger rundt leppene. Dette samsvarer med kjeve spenning og contraindicates fortsetter med kirurgi. (B) Aplysia med avslappede lepper som viser innsiden av kjeven (lys grå). Fargene igjen tilsvarer de som er observert i dyret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Hvis et dyr lepper ikke er avslappet, injisere ytterligere 30 mL magnesium klorid og vente ytterligere 5 min. Hvis dette ikke resulterer i leppe avslapping, returner dem til en isolert beholder med god vannføring for å tillate dem å gjenopprette (se trinn 4) og fortsette med et annet dyr.
2. utsette Radular overflate
- Plasser Slug slik at hodet henger nedover, slik at bukkal massen til å bosette seg mot kjeven.
- Påfør trykk med tommelen og pekefingeren for å presse den bukkal massen mot kjeven, holde bukkal massen på plass.
- Roter kjeven slik at de er synlige. Samtidig, opprettholde trykket på bukkal massen slik at stavnen av bukkal massen er synlig gjennom kjeven. (Figur 3).
Figur 3: hjelpemiddel bukkal Mass mot innsiden av Jaws. Fingrene støtter bukkal massen som har blitt skjøvet opp mot innsiden kanten av kjever til spissen av stavnen kan sees. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Forsiktig arbeid tipsene til den butte tang inn i kløften av odontophore og bruke dem til å spaken radular overflaten gjennom kjeven. Hvis kjeven ikke er tilstrekkelig avslappet, bruk tang til å forsiktig gripe kanten av kløften for å hjelpe denne prosessen.
Forsiktig: Dette presset gjør risikoen større skade på dyret. - Når overflaten er eksponert, arbeid kjeven klar av den fremre delen av radular overflaten hele veien rundt omkretsen. Dette gjør odontophore mindre sannsynlighet for å trekke (Figur 4). Sørg for at ikke mer enn halvparten av veggene i odontophore er eksponert.
Figur 4: delvis eversion av Odontophore. Radular overflate er fullt eksponert, men sidene av odontophore er ikke avdekket, noe som gjør dette bare en delvis eversion. Videre eversion vil sannsynligvis føre til skade på dyret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: En i sin helhet eversion av det odontophore ville anledning større muskelen skade fra hvilke dyrene er meget langsom å komme seg.
3. kirurgiske snitt
-
Når radular overflate er fullt eksponert, arrangere Slug under en disseksjon omfang for kirurgi.
- Alternativt kan du bruke et bredt gummistrikk og en tredje hånd for å stabilisere kjever og radular overflate for operasjonen, spesielt mens læring. Dette, derimot, legger tid og økt vevsskade på prosedyren, noe som gjør det mindre ideelt på lang sikt.
- Plasser den radular overflaten slik at kløften vender mot undersøkeren.
- Forsiktig tak i radular overflate, nær radular base, slik at en horisontal fold dannes vinkelrett på den anatomiske krøll. Bruk fine saks til å skjære gjennom denne fold, noe som gjør et snitt langs anatomiske krøll (figur 5).
Figur 5: plassering av snitt til Radular overflate. (A) Radular overflate, med et snitt. (B) Radular overflate med sirkler som viser hvor tilnærmingene av den bilaterale i7 muskelen fester; stiplede linjer viser plasseringen av synkende musklene under radular overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Utvid dette første snitt til 3-5 cm for å gi tilgang til det indre av bukkal massen.
- Juster lys slik at den peker direkte tilbake gjennom dette snittet.
- Del kantene av snittet slik at baksiden av lumen av odontophore og de tynne vertikale tråder av i7 muskelen er synlige. (Figur 6)
Figur 6: plassering av i7 gjennom Radular overflate snitt. Ser gjennom snittet, både tråder av i7 kan sees mellom de indre overflater av I4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Nå inn gjennom snittet, ta tak i begge tilnærmingene av i7, og dra dem opp gjennom snittet, hvor så mye som muskelen kan kuttes bort som er praktisk (figur 7).
Figur 7: trekke i7 Muscle strand gjennom snitt. Den i7 muskelen er svært elastisk og kan trekkes opp gjennom snittet for fjerning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Merk: Med praksis er det vanligvis mer effektivt å finne i7 ved å føle enn av syne.
4. postoperativ pleie
- Etter at lesjoner er utført, ta tak i de fremre tentakler, og skyv ned på radular overflaten for å returnere Slug til sin opprinnelige konfigurasjon.
- Sted stolpe-kirurg dyrene inne en beskyttet omgivelsene med fint vann flyte. Økt oksygenering hastigheter utvinningen. Sørg for at dyrene er våken og responsive på dagen etter operasjonen. Hvis dette ikke er tilfelle, kan det antas at de ikke vil komme seg.
Merk: Dyrene ville vanligvis begynne å mate på for det første eller andre dag etter kirurgi. Selv dyr som har problemer med å bite bør tilbys tang, som det er vår anekdotiske observasjon at et dyrs utvinning er forbedret ved sine forsøk på å spise.
5. for sub-radular fiber lesjon
- Følg trinnene fra 1,1 til og med 3,5
- Sett tuppen av en liten rett skalpell blad (#11 eller lignende) gjennom snittet med den skarpe kanten vinklet oppover. Forsiktig skrape fine muskelfibre fra undersiden av den radular overflaten. (Figur 8).
Figur 8: Lesioning Subradular fibre. Kanten av skalpell bladet er vinklet oppover gjennom snittet til undersiden av radular overflaten slik at den kan forsiktig skrape bort sub-radular fibre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Gå tilbake til trinn 4,1.
Representative Results
Tidligere arbeid hadde antydet at i7 muskelen bidro til åpningen av grasper8. Våre egne anatomiske studier antydet at sub-radular Fibre kan også bidra til grasper åpning. For å teste disse hypoteser, ble dyrene indusert for å generere biter både før og etter å ha mottatt en kirurgisk prosedyre. Humbug dyr ble utsatt for alle kirurgiske skritt, inkludert snittet i radular overflate, men ingen interne muskler ble fjernet. Dyr utsatt for en i7 lesjon hadde både i7 muskler fjernet. Dyr utsatt for en sub-radular fiber lesjon hadde ~ 25% av sub-radular fibre fjernet umiddelbart under snittet. Sham lesjoner hadde ingen signifikant effekt på bredden av åpningen på toppen av bitende, mens både i7 og sub-radular fibre lesjoner gjorde betydelig redusere bite bredde (figur 9).
Figur 9: resultater av lesjoner på åpning bredde under peak bite. Data som vises er forskjellene mellom gjennomsnittlig normalisert åpning bredde på Forgjellesnegler før og etter kirurgiske prosedyren for 5 dyr i hver av de 3 gruppene (humbug, i7 lesjon, eller SRF lesjon), med hvert dyr som fungerer som sin egen kontroll. Gjennomsnitt ble tatt av 5 biter før, og 5 biter etter kirurgiske prosedyren for å bestemme gjennomsnittlig normalisert forskjell. Åpning bredde var avstanden fra sentrum av Forgjellesnegler til radular kanten på toppen protraction, normalisert ved avstanden fra den indre overflaten av den radular basen til kløften kanten av radular overflaten. Forskjellene er vist som midlene pluss eller minus standardavviket. Etter å ha fastslått at forskjellen data var normalt fordelt, sannsynligheten for at lesjon hadde ingen effekt ble bestemt (dvs. null hypotesen ble testet at virkningene av kirurgiske prosedyrer vil være null, i gjennomsnitt) ved å bruke en sammenkoblet t-test til hver uavhengige gruppe. Dataene viser at humbug lesjon hadde ingen signifikant effekt, mens en lesjon av i7 muskler eller en lesjon av sub-radular fibre hadde en betydelig effekt på radular åpning (p < 0,031 for i7 lesjon gruppen, indikert med en enkelt stjerne eller p < 0,002 for gruppen SRF, angitt med en dobbel stjerne). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kroppsvekt | Magnesium klorid dose |
| < 200 g | 1/2 kroppsvekt |
| 200-350 g | 1/3 kroppsvekt |
| 350-450 g | 1/4 kroppsvekt |
Tabell 1: Magnesium klorid dosering av kroppsvekt.
Discussion
De fleste betenkelig skritt innen protokollen er behovet å sikre det det dyr er fullt ut anesthetized, og det eversion av det bukkal masse er rettferdig nok å adgang det underliggende muskelen. Det kan kreve litt øvelse å perfeksjonere disse trinnene, men når de er mestret, avkastningen fra operasjoner er sannsynlig å være større enn 85% av alle eksperimenter gjort. Den viktigste måten å riktig modifisere og feilsøke protokollen er å bruke tid på å gjøre dissections av bukkal massen slik at plasseringen av de interne musklene er helt klart for etterforsker. Fordi den foreslåtte snitt gjennom radular overflaten uunngåelig forårsaker noen skade på underliggende sub-radular fibre, kan det være hensiktsmessig å endre den nøyaktige plasseringen av snittet for å unngå bestemte regioner av disse fibrene.
En begrensning av kirurgisk teknikk er at det kan ha ikke-spesifikke virkninger på fôring svar, slik som styrken av protraction. En måte å overvinne denne begrensningen er å ha dyr tjene som sine egne kontroller. I tillegg er det avgjørende å ha en humbug lesjon gruppe som er utsatt for hele kirurgisk protokoll med unntak av fjerning av den spesifikke muskelen (dvs. i7 eller SRFs). Ved å følge disse forslagene, vil en undersøker redusere virkningene av variasjon mellom dyr og har en iboende mål på de ikke-spesifikke virkningene av kirurgi.
Tidligere arbeid har brukt tilnærminger gjennom kroppen veggen til lesjon eller ta opp enten fra nerver13,14, eller muskler15,16,17. I vårt laboratorium har vi Anecdotally observert at kroppen vegg snitt er ofte ledsaget av et betydelig tap av hemolymph og dermed av kroppens volum. Dyr ofte forlange adskillige dager å komme til hektene igjen etter denne, og hvis kroppen mur leksjonen er ikke forsiktig sutured, dyrene kanskje ikke komme seg. I tillegg, post-obduksjon undersøkelse av dyrene avslører betydelige arrdannelse rundt snittet og en sterk immunrespons (anekdotiske observasjoner). I kontrast, dyr viser ingen tap av hemolymph eller endring i kroppen volum etter utvinning fra protokollen som er beskrevet her (basert på observasjoner i 96 dyr).
Fremtidige anvendelser av teknikken kan utvide den til andre muskler i fôring apparater av Aplysia, og til andre dyr. Vi har fokusert på fjerning av i7 muskel og sub-radular fibre. De samme generelle kirurgiske teknikker gir også tilgang til de fleste av de andre musklene i odontophore. Noen av disse, for eksempel den interne delen av i5 muskelen, er best tilgjengelig gjennom radular overflaten. Andre, som den indre brosjyrer av I4, kan være bedre nås gjennom utvendig epitel av odontophore. Vi har gjort foreløpige forsøk der et snitt under radular kløft av delvis vrenges ut odontophore tillot tilgang for en skjerpet kroken skal settes inn som kan brukes til å lesjon en annen muskel i odontophore, muskel I88. Fordi den kirurgiske protokollen som er beskrevet her ikke åpner den viktigste kroppen hulrom, ingen suturing er nødvendig.
Protokollen som vi har beskrevet kan være av allmenn interesse for andre etterforskere som arbeider på bløtvev strukturer som ellers ville være vanskelig å manipulere, f. eks, fôring apparat av andre bløtdyr. Mer generelt kan denne protokollen foreslå andre romanen kirurgiske tilnærminger til analyse av myke strukturer som tunger, kofferter eller tentakler18.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne erkjenne det harde arbeidet som Sherry Niggel, Sisi Lu, og Joey Wu satt i å forbedre og validere disse protokollene. Dette arbeidet ble støttet av NSF Grant IOS 1754869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
| Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Webcam | Logitech | c920 | for recording data |
References
- Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia. Science. 167, 1740-1742 (1970).
- Kupfermann, I. Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation. Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).
- Susswein, A. J., Chiel, H. J. Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding. Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).
- Chiel, H. J. Aplysia feeding biomechanics. Scholarpedia. 2, 4165 (2007).
- Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).
- Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents. Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).
- Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals. Journal of Visualized Experiment. (40), 1791 (2010).
- Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana. Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).
- Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning. Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis. Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).
- Kupfermann, I. Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study. Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).
- Scott, M. L., Kirk, M. D. Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california. Brain Research. 585, 272-274 (1992).
- de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail’s male organ has no physiological basis. Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).
- Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia. Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).
- Kier, W. M. The diversity of hydrostatic skeletons. Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).
