Summary
Här presenterar vi ett protokoll för minimalinvasiv kirurgisk lesioning av muskler inneboende till utfodring apparaten av den marina mollusk Aplysia californica att förstå rollerna för dessa muskler under utfodring beteende.
Abstract
Aplysia californica är ett modellsystem för att studera den neurala kontrollen av inlärning och beteende. Detta djur har en semi-öppna cirkulationssystemet, vilket gör det möjligt att komma åt många av dess interna strukturer utan att orsaka några betydande skador. Många manipulationer kan enkelt utföras både in vivo och in vitro, vilket gör det till en mycket tractable modell för analys av beteende och neurala kretsar. För att bättre förstå funktionerna i musklerna inom utfodring grasper, har vi utvecklat en teknik för att lesioning dem utan att öppna kroppens huvud hålighet av djuret eller skadar de yttre lagren av utfodring organ (dvs, den buckala massan). I denna teknik är grasper delvis everted, vilket ger direkttillgång till muskulaturen. Detta förfarande tillåter djur att återhämta sig snabbt och tillförlitligt. Detta har gjort det möjligt att lesion i7 musklerna och sub-radular fibrer, så att vi kan visa att båda musklerna avsevärt bidra till öppnandet in vivo.
Introduction
Utfodringssystemet av aplysia californica har en lång historia av användning som modellsystem för att förstå inlärning och minne1, motiverade beteenden2,3, och samspelet mellan beteende, biomekanik och neurala kontroll under utfodring4. Den har mycket tillgängliga neurala kretsar, med ett relativt litet antal stora, identifierbara nervceller. Djuret har ett semi-öppet cirkulationssystem, vilket gör det möjligt att komma åt många av dess interna strukturer utan att orsaka betydande skador. Det är också robust för många manipulationer både in vivo och in vitro, vilket gör det en mycket tractable modell för analys av beteende och neurala kretsar.
För att förstå de neurala mönster som ger upphov till utfodring beteenden, är det viktigt att beskriva den bakomliggande mekaniken i den mjuka strukturen som utgör utfodring orgel, den buckala massan4. Även om det har gjorts arbete för att karakterisera de yttre musklerna som utgör den buckala massan5,6, de inre musklerna i den underliggande strukturen i buckala massan som styr ytan av grasper, den odontophore, har till stor del otillgängliga för in vivo experiment. Även om det har förekommit in vitro-studier på funktionerna hos några av dessa muskler7,8, bristen på direkttillgång till dessa muskler har gjort det svårt att studera deras roll i intakt, beter sig djur.
De flesta tekniker för elektrod implantation eller lesioner i aplysia eller liknande blötdjur arter kräver att kroppen väggen öppnas9,10,11,12. Öppna kroppen väggen orsakar epitelial skada, och snittet måste vara säkert förseglade för att förhindra hemolymfa flykt. Ännu allvarligare svårigheter ställs när man försöker nå de inre musklerna i grasper av Aplysia (muskler som ligger bakom den radulär ytan eller inom odontophore): efter att ha gått igenom de viktigaste kroppens hålighet, måste man sedan gå igenom några del av muskelväggen i buckala massan för att få tillgång till de inre strukturerna (figur 1a). Denna ackumulerade skada och svårighet att få tillgång har gjort tillvägagångssättet genom konventionella medel problematiska eftersom djuren inte återhämta sig väl från dessa operationer (av djur med full eversions, endast 17% återfick någon utfodring förmåga, N = 12. Omkring 85% av icke-everted djur återfick förmågan att föda, N = 84).
I7 muskeln, som har karakteriserats som en radular öppnare8, är djupt inne i odontophore själv, ytterligare komplierar tillgång. Den sträcker sig mellan basen av radularis stjälk (figur 1c) och undersidan av radular ytan, genom en lumen i odontophore (figur 1c). På tre sidor av i7 musklerna är väggar av muskler, och den fjärde väggen består av radular stjälken. Vid tillämpning av en biomekanisk studie skulle en större försämring av någon av dessa strukturer äventyra matnings apparatens normala funktion. Vi utvecklade en ny metod för att arbeta i odontophore ut genom käkarna, och genomföra operationen genom ett snitt till den tunna, brosk radular yta, som gjorde det möjligt att lesion i7 muskeln, liksom nyligen beskrivna fina muskelfibrer som kör precis under radular ytan, som vi kallar sub-radulär fibrer (figur 1c).
Figur 1: anatomisk översikt. A) placeringen av den buckala massan i aplysia. B) odontophores yttre anatomi. Ytan av Radula och radular SAC är gula; muskler som komponerar odontophore visas i rött, baserat på deras faktiska färger. (C) sagittal avsnitt av odontophore, visar placeringen av sub-radular fibrer (böjda rosa linje) och i7 muskel (rak rosa linje). Tvärsnittet av i6 muskeln visas i mörkt rött. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Aplysia är ryggradslösa djur och utsätts därför inte för IAUC-godkännande. För att minimera obehag för djur, se till att de är helt sövda innan de kirurgiska tekniker som beskrivs nedan.
1. djurval och Anestetisering
- Välj ett aktivt djur genom att erbjuda det tång och bekräftar att bita intervall är inte större än mellan 3 och 5 s.
-
Anesthetize djuret med 0,333 molar magnesiumklorid (se tabell 1) genom att injicera nära huvudet med en 18 G nål på en 60 mL spruta så att den högsta koncentrationen av bedövningsmedel kommer att vara runt den buckala massan.
- Var noga med att penetrera både det yttre epitelet och det inre vävnads skiktet med nålen. Se till att injektionen är ungefär under rhinophore, halvvägs mellan rhinophore och foten, och nålen bör gå snett, pekar i riktning mot käkarna.
- Efter 10 min, försiktigt försöka sätta in en nål i Gill och rhinophore, kontrollera att dessa inte dra tillbaka, för att säkerställa tillräcklig anestetization.
- Se till att läppar och käke i snigel är avslappnad så att odontophore kan exponeras.
Anmärkning: Den skrynkling på läpparna av figur 2A indikerar att djurets läppar och käke inte är tillräckligt avslappnad för att det kirurgiska ingreppet ska utföras utan skador. De släta, avslappnade läpparna i figur 2b indikerar att käftarna är helt avslappnade.
Figur 2: spänningar och avslappning i anesthetized Aplysia munnar. (A) aplysia som visar en hög grad av muskelspänningar runt läpparna. Detta korrelerar med käke spänningar och kontraindikerar att fortsätta med operationen. (B) aplysia med avslappnade läppar, som visar insidan av käkarna (ljusgrå). Färgerna motsvarar igen de som observerats i djuret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Om ett djurs läppar inte är avslappnade, injicera ytterligare 30 mL magnesiumklorid och vänta ytterligare 5 min. Om detta inte resulterar i läpp avslappning, returnera dem till en isolerad behållare med bra vattenflöde för att tillåta dem att återhämta sig (se steg 4) och gå vidare med ett annat djur.
2. exponera Radularis yta
- Placera snigel så att huvudet hänger nedåt, vilket gör att buckala massan att bosätta sig mot käkarna.
- Tryck med tummen och pekfingret för att pressa buckala massan mot käkarna, hålla buckala massan på plats.
- Vrid käftarna så att de syns. Samtidigt, bibehålla trycket på buckala massan så att prow av buckala massan är synlig genom käkarna. (Figur 3).
Figur 3: stöd för den buckala massan mot insidan av käkarna. Fingrar stödja buckala massan som har skjutits upp mot insidan kanten av käkarna tills spetsen av prow kan ses. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Försiktigt arbeta spetsarna på den trubbiga Pinkett i kluven av odontophore och använda dem för att spaken den radular ytan genom käkarna. Om käftarna inte är tillräckligt avslappnade, Använd tången för att försiktigt ta tag i kanten av klyven för att hjälpa denna process.
Försiktighet: Detta tryck riskerar större skador på djuret. - När ytan är exponerad, arbeta käftarna klara av den främre delen av radular ytan hela vägen runt omkretsen. Detta gör odontophore mindre benägna att dra tillbaka (figur 4). Se till att inte mer än hälften av väggarna i odontophore exponeras.
Figur 4: partiell Eversion av Odontophore. Den radular ytan är fullt exponerad, men sidorna av odontophore inte upptäcks, vilket gör detta endast en partiell Eversion. Ytterligare Eversion kommer sannolikt att resultera i skador på djuret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Anmärkning: En fullständig Eversion av odontophore kommer att orsaka stora muskelskador som djuren är mycket långsamma att återhämta sig.
3. kirurgiska snitt
-
När den radular ytan är fullt exponerad, ordna skogssnigel under en dissektion utrymme för operationen.
- Alternativt kan du använda ett brett gummiband och en tredje hand för att stabilisera käkarna och radularis yta för operationen, särskilt under inlärning. Detta ger dock tid och ökad vävnadsskada på förfarandet, vilket gör det mindre perfekt på lång sikt.
- Placera den radular ytan så att kluven sidan står inför prövaren.
- Ta försiktigt tag i radular ytan, nära radular basen, så att en horisontell veck bildas vinkelrätt mot den anatomiska veck. Använd fin sax för att skära igenom detta veck, vilket gör ett snitt längs den anatomiska veck (figur 5).
Figur 5: placering av snitt på den Radulära ytan. (A) radulär yta, med ett snitt. (B) radulär yta med cirklar som visar var strängarna på den bilaterala i7 muskeln fäster; prickade linjer visar placeringen av fallande muskler under radular ytan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förläng denna initiala snitt till 3-5 cm för att ge tillträde till insidan av buckala massan.
- Justera ljuset så att det pekar direkt tillbaka genom detta snitt.
- Del kanterna på snittet så att baksida av lumen av odontophore och tunna vertikala strängar av i7 muskeln är synliga. (Figur 6)
Figur 6: placering av i7 genom Radular ytsnittet. Tittar genom snittet, båda strängarna av i7 kan ses mellan de inre ytorna av i4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Nå in genom snittet, greppa båda delarna av i7, och dra dem upp genom snittet, där så mycket som muskeln kan klippas bort som är praktiskt (figur 7).
Figur 7: dra i7 muskel sträng genom snittet. I7 muskeln är mycket elastisk och kan dras upp genom snittet för avlägsnande. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Anmärkning: Med praktiken är det oftast mer effektivt att lokalisera i7 genom att känna än med sikte.
4. postoperativ vård
- Efter lesioner har utförts, ta tag i främre tentakler, och tryck ner på radular ytan för att returnera snigel till dess ursprungliga konfiguration.
- Placera post-kirurgiska djur i en skyddad miljö med bra vattenflöde. Ökad syresättning påskyndar återhämtningen. Se till att djuren är alert och lyhörd på dagen efter operationen. Om så inte är fallet, kan man anta att de inte kommer att återhämta sig.
Anmärkning: Djur börjar vanligtvis att föda den första eller andra dagen efter operationen. Även djur som har problem att bita bör erbjudas tång, eftersom det är vår anekdotiska observation att ett djurs återhämtning förbättras genom sina försök att äta.
5. för sub-radular fiber lesion
- Följ stegen från 1,1 till 3,5
- Sätt spetsen på en liten rak skalpell blad (#11 eller liknande) genom snittet med vassa kanter vinklad uppåt. Försiktigt skrapa de fina muskelfibrerna från undersidan av radular ytan. (Figur 8).
Figur 8: Lesioning av Subradular fibrer. Kanten av skalpell bladet är vinklad uppåt genom snittet till undersidan av radular ytan så att den kan försiktigt skrapa bort sub-radulär fibrer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Återgå till steg 4,1.
Representative Results
Föregående arbete hade antytt att i7 muskeln bidrog till öppningen av grasper8. Våra egna anatomiska studier föreslog att sub-radular fibrer kan också bidra till grasper öppning. För att testa dessa hypoteser, var djur induceras för att generera biter både före och efter att ha fått ett kirurgiskt ingrepp. Sham djur utsattes för alla kirurgiska steg, inklusive snittet i radular ytan, men inga interna muskler avlägsnades. Djur som utsätts för en i7 lesion hade både i7 muskler bort. Djur som utsätts för en sub-radulär fiber lesion hade ~ 25% av sub-radulär fibrer avlägsnas omedelbart under snittet. Sham lesioner hade ingen signifikant effekt på bredden av öppningen på toppen av bitande, medan både i7 och sub-radular fibrer lesioner avsevärt minska bita bredd (figur 9).
Figur 9: resultat av lesioner vid öppningsbredd under topp bitning. Data som visas är skillnaderna mellan den genomsnittliga normaliserade öppnings bredden av Radula före och efter det kirurgiska ingreppet för 5 djur i var och en av de 3 grupperna (Sham, i7 lesion, eller SRF lesion), med varje djur som fungerar som sin egen kontroll. Medelvärden togs av 5 biter innan, och 5 biter efter det kirurgiska ingreppet för att bestämma medelvärdet normaliserade skillnaden. Öppnings bredden var avståndet från centrum av Radula till radular kanten vid toppen protraction, normaliserad av avståndet från den inre ytan av radular basen till Cleft-sidan kanterna på radular ytan. Skillnaderna visas som medel plus eller minus standardavvikelsen. Efter att ha konstaterat att differensdatan normalt fördelades, var sannolikheten för att lesionen inte hade någon effekt fastställd (dvs. nollhypotesen testades att effekterna av de kirurgiska ingrepp skulle vara noll, i genomsnitt) genom att tillämpa en ihopparad t-test till varje oberoende grupp. Uppgifterna visar att den simulerade lesionen inte hade någon signifikant effekt, medan en lesion av i7 musklerna eller en lesion av sub-radular fibrer hade en signifikant effekt på radular öppning (p < 0,031 för i7 lesion gruppen, anges med en enda asterisk , eller p < 0,002 för SRF lesion-gruppen, som indikeras med en dubbel asterisk). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kroppsvikt | Magnesium klo RID dos |
| < 200 g | 1/2 kroppsvikt |
| 200-350 g | 1/3 kroppsvikt |
| 350-450 g | 1/4 kroppsvikt |
Tabell 1: Magnesiumklorid dosering av kroppsvikt.
Discussion
De mest kritiska stegen i protokollet är behovet av att se till att djuret är helt sövda, och att Eversion av buckala massan är precis tillräckligt för att få tillgång till de underliggande musklerna. Det kan kräva lite övning för att perfekt dessa steg, men när de behärskar, avkastningen från operationer kommer sannolikt att vara större än 85% av alla experiment gjort. Det viktigaste sättet att korrekt ändra och felsöka protokollet är att tillbringa tid att göra dissektioner av buckala massan så att de platser för de inre musklerna är helt klart för prövaren. Eftersom den föreslagna snittet genom radular ytan oundvikligen orsakar vissa skador på den underliggande sub-radulär fibrer, det kan vara lämpligt att ändra den exakta placeringen av snittet för att undvika specifika regioner av dessa fibrer.
En begränsning av den kirurgiska tekniken är att det kan ha icke-specifika effekter på utfodring svar, såsom styrkan av protraction. Ett sätt att övervinna denna begränsning är att få djuren att fungera som egna kontroller. Dessutom är det viktigt att ha en bluff lesion grupp som utsätts för hela kirurgiska protokollet med undantag för avlägsnande av den specifika muskeln (dvs i7 eller SRFs). Genom att följa dessa förslag, en utredare kommer att minska effekterna av variationer mellan djur och har ett inneboende mått på de icke-specifika effekterna av kirurgi.
Tidigare arbete har använt metoder genom kroppen väggen till lesion eller spela in antingen från nerver13,14, eller muskler15,16,17. I vårt laboratorium, vi har anekdotiskt observerade att kroppen vägg snitt är ofta åtföljs av en betydande förlust av hemolymfa och därmed av kroppsvolym. Djur kräver ofta flera dagar att återhämta sig från detta, och om kroppen väggen lesion inte är noggrant sutured, djur får inte återhämta. Dessutom, post-mortem undersökning av djuren avslöjar betydande ärrbildning runt snittet och ett starkt immunsvar (anekdotiska observationer). Däremot, djur visar ingen förlust av hemolymfa eller förändring i kroppsvolym efter återhämtning från det protokoll som beskrivs här (baserat på observationer i 96 djur).
Framtida tillämpningar av tekniken kan förlänga den till andra muskler inom utfodringsapparaten av Aplysia, och till andra djur. Vi har fokuserat på avlägsnande av i7 muskeln och sub-radular fibrer. Dessa samma allmänna kirurgiska tekniker ger också tillgång till de flesta av de andra musklerna i odontophore. Några av dessa, såsom den inre delen av i5 muskeln, är bäst nås genom radular ytan. Andra, liksom de inre broschyrer av I4, kan bättre nås genom utsidan epitel av odontophore. Vi har gjort preliminära prövningar där ett snitt under radular kluven av den delvis vrängs odontophore får tillgång till en vass krok som skall införas som sedan kan användas för att lesion en annan muskel inom odontophore, muskel i88. Eftersom det kirurgiska protokollet som beskrivs här inte öppnar huvud kroppens hålighet, ingen suturering krävs.
Det protokoll som vi har beskrivit kan vara av allmänt intresse för andra utredare som arbetar med mjukvävnads strukturer som annars skulle vara svåra att manipulera, t. ex. Mer allmänt, detta protokoll kan föreslå andra nya kirurgiska metoder för analys av mjuka strukturer såsom tungor, stammar eller tentakler18.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna det hårda arbete som Sherry Niggel, Sisi Lu, och Joey Wu sätta på att förbättra och validera dessa protokoll. Detta arbete stöddes av NSF Grant IOS 1754869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
| Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Webcam | Logitech | c920 | for recording data |
References
- Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia. Science. 167, 1740-1742 (1970).
- Kupfermann, I. Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation. Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).
- Susswein, A. J., Chiel, H. J. Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding. Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).
- Chiel, H. J. Aplysia feeding biomechanics. Scholarpedia. 2, 4165 (2007).
- Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).
- Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents. Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).
- Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals. Journal of Visualized Experiment. (40), 1791 (2010).
- Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana. Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).
- Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning. Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis. Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).
- Kupfermann, I. Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study. Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).
- Scott, M. L., Kirk, M. D. Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california. Brain Research. 585, 272-274 (1992).
- de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail’s male organ has no physiological basis. Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).
- Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia. Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).
- Kier, W. M. The diversity of hydrostatic skeletons. Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).
