Summary
Hier presenteren we een protocol voor minimaal invasieve chirurgische lesioning van spieren intrinsiek aan het Voer apparaat van de mariene weekdieren Aplysia californica om de rollen van deze spieren te begrijpen tijdens het voeden gedrag.
Abstract
Aplysia californica is een modelsysteem voor het bestuderen van de neurale beheersing van leren en gedrag. Dit dier heeft een semi-open bloedsomloop, waardoor het mogelijk is om toegang te krijgen tot veel van zijn interne structuren zonder aanzienlijke schade te veroorzaken. Veel manipulaties kunnen zowel in vivo als in vitro gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor het een zeer Tractable model is voor de analyse van gedrag en neurale circuits. Om beter inzicht te krijgen in de functies van de spieren binnen de voedende grasper, hebben we een techniek ontwikkeld om ze te lesioneren zonder de hoofd lichaamsholte van het dier te openen of de buitenste lagen van het voedings orgaan te beschadigen (d.w.z. de buccale massa). In deze techniek wordt de grasper gedeeltelijk binnengejaagd, waardoor directe toegang tot de spier massa mogelijk is. Met deze procedure kunnen dieren snel en betrouwbaar herstellen. Dit heeft het mogelijk gemaakt om de i7-spieren en sub-radulaire vezels te laesie, waardoor we kunnen aantonen dat beide spieren aanzienlijk bijdragen aan de opening in vivo.
Introduction
Het voersysteem van aplysia californica heeft een lange geschiedenis van gebruik als een modelsysteem voor het begrijpen van leren en geheugen1, gemotiveerd gedrag2,3, en de interactie tussen gedrag, biomechanica en neurale controle tijdens het voeden4. Het heeft zeer toegankelijke neurale circuits, met een relatief klein aantal grote, identificeerbare neuronen. Het dier heeft een semi-open bloedsomloop, waardoor het mogelijk is om toegang te krijgen tot veel van zijn interne structuren zonder aanzienlijke schade te veroorzaken. Het is ook robuust voor vele manipulaties zowel in vivo en in vitro, waardoor het een zeer Tractable model voor de analyse van gedrag en neurale circuits.
Om de neurale patronen te begrijpen die aanleiding geven tot voedingsgedrag, is het belangrijk om de onderliggende mechanica van de zachte structuur te beschrijven die het voedings orgaan vormt, de buccale Mass4. Hoewel er werk is gedaan om de buitenste spieren te karakteriseren die de buccale massa5,6vormen, zijn de binnenste spieren van de onderliggende structuur binnen de buccale massa die het oppervlak van de grasper, de odontophore, regelt, grotendeels ontoegankelijk voor in vivo experimenten. Hoewel er in vitro studies zijn geweest over de functies van sommige van deze spieren7,8, het gebrek aan directe toegang tot deze spieren heeft het moeilijk gemaakt om hun rol in intact te bestuderen, dieren te gedragen.
De meeste technieken voor het implanteren van elektroden of laesies in aplysie of soortgelijke slakken scan vereisen dat de lichaams wand wordt geopend9,10,11,12. Het openen van de lichaams wand veroorzaakt epitheel letsel, en de incisie moet veilig worden verzegeld om te voorkomen dat Hemolymfe ontsnappen. Er worden nog ernstigere moeilijkheden gesteld bij het bereiken van de binnenste spieren van de grasper van Aplysie (spieren die aan het radulaire oppervlak of binnen de odontophore liggen): na het betreden van de hoofd lichaamsholte moet men dan door een aantal gedeelte van de spier wand van de buccale massa om toegang te krijgen tot de inwendige structuren (Figuur 1a). Dit geaccumuleerde letsel en moeilijkheden van de toegang heeft de aanpak via conventionele middelen problematisch gemaakt, omdat dieren niet goed herstellen van deze operaties (van dieren met volledige eversies, slechts 17% herwonnen elke voeding vermogen, N = 12. Rond 85% van de niet-everted dieren herwonnen de mogelijkheid om te voeden, N = 84).
De i7-spier, die is gekarakteriseerd als een radulaire opener8, is diep in de odontophore zelf, verdere complicerende toegang. Het strekt zich uit tussen de basis van de radulaire stalken (figuur 1c) en de onderzijde van het radulaire oppervlak, door een lumen in de odontophore (figuur 1c). Aan drie zijden van de i7 spieren zijn muren van de spier, en de vierde wand bestaat uit de radulaire Stalk. Voor de toepassing van een biomechanische studie zou een ernstige aantasting van een van deze structuren de normale werking van het voeder apparaat in gevaar brengen. We ontwikkelden een nieuwe aanpak van het werken van de odontophore uit door de kaken, en het uitvoeren van de operatie door middel van een incisie naar het dunne, kraakbeenachtige radulaire oppervlak, dat het mogelijk maakte om de i7 spier te laesie, evenals onlangs beschreven fijne spiervezels die ren net onder het radulaire oppervlak, waarnaar we verwijzen als de sub-radulaire vezels (figuur 1c).
Figuur 1: anatomische overzicht. A) plaats van de buccale massa in aplysie. B) uitwendige anatomie van odontophore. Het oppervlak van radula en radular SAC zijn geel; spieren die de odontophore samenstellen, worden in rood weergegeven op basis van hun werkelijke kleuren. C) Sagittaal gedeelte van odontophore, met de locatie van sub-radulaire vezels (gebogen roze lijn) en i7-spier (rechte roze lijn). Dwarsdoorsnede van de i6 spier wordt weergegeven in donkerrood. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Protocol
Aplysie is ongewervelde en wordt dus niet onderworpen aan de iauc-goedkeuring. Om het ongemak voor dieren tot een minimum te beperken, moet u ervoor zorgen dat ze volledig verdoiliseerd zijn voordat de hieronder beschreven chirurgische technieken worden toegepast.
1. selectie van dieren en Anesthetisering
- Selecteer een actief dier door het zeewier aan te bieden en bevestig dat de bijt intervallen niet groter zijn dan tussen 3 en 5 sec.
-
Anesthetiseer het dier met 0,333 molaire magnesium chloride (zie tabel 1) door het injecteren in de buurt van het hoofd met een 18 G naald op een 60 mL spuit zodat de hoogste concentratie anestheticum rond de buccale massa zal zijn.
- Zorg voor het doordringen van zowel het buitenste epitheel en de binnenste weefsellaag met de naald. Zorg ervoor dat de injectie ruwweg onder de rhinophore, halverwege tussen de rhinophore en de voet, en de naald moet schuin binnenkomen, wijzend in de richting van de kaken.
- Na 10 min, zachtjes proberen om een PIN in de Gill en rhinophore invoegen, controleren of deze niet intrekken, om voldoende anesthetisering.
- Zorg ervoor dat de lippen en kaak van de slug ontspannen zijn, zodat de odontophore kan worden blootgesteld.
Opmerking: De rimpel op de lippen van Fig. 2a geeft aan dat de lippen en kaak van het dier niet voldoende ontspannen zijn om de chirurgische ingreep zonder schade te kunnen uitvoeren. De gladde, ontspannen lippen van Figuur 2b geven aan dat de kaken volledig ontspannen zijn.
Figuur 2: spanning en ontspanning in Anesthetized Aplysia monden. A) aplysie die een hoge mate van spierspanning rond de lippen vertoont. Dit correleert met kaak spanning en contraaangeeft verder te gaan met de operatie. B) aplysia met ontspannen lippen, met de binnenkant van kaken (lichtgrijs). Kleuren weer overeenkomen met die waargenomen in het dier. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Als de lippen van een dier niet ontspannen zijn, Injecteer dan 30 mL magnesium chloride en wacht nog eens 5 min. Als dit niet resulteert in lip-ontspanning, terug te keren naar een geïsoleerde container met goede waterstroom om ze te herstellen (zie stap 4) en ga verder met een ander dier.
2. blootstellen van het Radulaire oppervlak
- Plaats de slug zodanig dat het hoofd naar beneden hangt, waardoor de buccale massa zich tegen de kaken kan vestigen.
- Druk met de duim en wijsvinger om de buccale massa naar de kaken te duwen en houd de buccale massa op zijn plaats.
- Draai de kaken zodat deze zichtbaar zijn. Op hetzelfde moment, handhaven van de druk op de buccale massa, zodat de boeg van de buccale massa zichtbaar door de kaken. (Figuur 3).
Figuur 3: ondersteuning van de buccale massa tegen de binnenkant van de kaken. Vingers ondersteunen de buccale massa die tegen de binnenrand van de kaken is geduwd tot de punt van de boeg zichtbaar is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Werk voorzichtig de uiteinden van de stompe Tang in de spleet van de odontophore en gebruik ze om het radulaire oppervlak door de kaken te hetsen. Als de kaken niet voldoende ontspannen zijn, gebruik dan de tang om de rand van de spleet voorzichtig te vatten om dit proces te ondersteunen.
Let op: Deze druk riskeert meer schade aan het dier. - Zodra het oppervlak is blootgesteld, werk de kaken duidelijk van het voorste gedeelte van het radulaire oppervlak helemaal rond de omtrek. Hierdoor wordt de odontophore minder snel teruggetrokken (Figuur 4). Zorg ervoor dat niet meer dan de helft van de wanden van de odontophore wordt blootgesteld.
Figuur 4: partiële eversie van de Odontophore. Het radulaire oppervlak is volledig blootgesteld, maar de zijkanten van de odontophore zijn niet blootgelegd, waardoor dit slechts een gedeeltelijke eversion. Verdere eversie zal waarschijnlijk resulteren in schade aan het dier. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Opmerking: Een volledige eversie van de odontophore zal grote spier schade veroorzaken waarvan de dieren erg traag zijn om te herstellen.
3. chirurgische incisies
-
Zodra het radulaire oppervlak volledig is blootgesteld, regelt u de slug onder een dissectie bereik voor de operatie.
- U ook een brede rubberen band en een derde hand gebruiken om de kaken en het radulaire oppervlak voor de operatie te stabiliseren, vooral tijdens het leren. Dit, echter, voegt tijd en verhoogde weefselschade aan de procedure, waardoor het minder ideaal op de lange termijn.
- Plaats het radulaire oppervlak zodanig dat de gespleten zijde de onderzoeker gezichten.
- Pak het radulaire oppervlak voorzichtig in de buurt van de radular Base, zodat een horizontale vouw loodrecht op de anatomische plooi wordt gevormd. Gebruik een fijne schaar om door deze vouw te snijden, waardoor een incisie langs de anatomische kreuken wordt (Figuur 5).
Figuur 5: plaats van incisie op het Radulaire oppervlak. A) radculair oppervlak, met een incisie. B) radculair oppervlak met cirkels die laten zien waar de strengen van de bilaterale i7-spier hechten; gestippelde lijnen tonen de locatie van de dalende spieren onder het radulaire oppervlak. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Verleng deze initiële incisie tot 3-5 cm om toegang te geven tot het inwendige van de buccale massa.
- Pas het licht aan zodat het direct door deze incisie wijst.
- Deel de randen van de incisie zodat de achterkant van het lumen van de odontophore en de dunne verticale strengen van de i7-spier zichtbaar zijn. (Figuur 6)
Figuur 6: locatie van i7 door het Radulaire oppervlakte incisie. Kijkend door de incisie, kunnen beide strengen van i7 worden gezien tussen de binnenste oppervlakken van I4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Reik door de incisie, pak beide strengen van i7, en trek ze omhoog door de incisie, waar zo veel als de spier kan worden weggesneden als praktisch is (Figuur 7).
Afbeelding 7: de i7-spier streng door de incisie trekken. De i7-spier is zeer elastisch en kan omhoog worden getrokken door de incisie voor verwijdering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Opmerking: Met de praktijk is het meestal effectiever om i7 te lokaliseren door te voelen dan door het zicht.
4. postoperatieve zorg
- Nadat laesies zijn uitgevoerd, pak de voorste tentakels en duw omlaag op het radulaire oppervlak om de slug terug te keren naar de oorspronkelijke configuratie.
- Plaats postoperatieve dieren in een beschermde omgeving met een goede waterstroom. Verhoogde oxygenatie versnelt het herstel. Zorg ervoor dat de dieren alert en responsief zijn op de dag na de operatie. Als dit niet het geval is, kan worden aangenomen dat ze niet worden hersteld.
Opmerking: Dieren zullen meestal beginnen te voeden op de eerste of tweede dag na de operatie. Zelfs dieren die moeite hebben met bijten moeten zeewier worden aangeboden, want het is onze anekdotische waarneming dat het herstel van een dier wordt verbeterd door zijn pogingen om te eten.
5. voor Subradulaire vezel laesie
- Volg de stappen van 1,1 tot en met 3,5
- Steek de punt van een klein recht scalpel blad (#11 of iets dergelijks) door de incisie met de scherpe rand naar boven gekanteld. Schuif de fijne spiervezels voorzichtig van de onderzijde van het radulaire oppervlak. (Figuur 8).
Figuur 8: de Subradulaire vezels Lesioneren. De rand van het scalpel-blad wordt naar boven gekanteld door de incisie aan de onderzijde van het radulaire oppervlak, zodat het zachtjes de sub-radulaire vezels kan wegkrabben. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Ga terug naar stap 4,1.
Representative Results
Vorig werk had gesuggereerd dat de i7-spier droeg bij aan de opening van de grasper8. Onze eigen anatomische studies suggereerden dat de sub-radulaire vezels ook kunnen bijdragen aan de grasper opening. Om deze hypotheses te testen, werden dieren geïnduceerd om beten te genereren, zowel voor als na het ontvangen van een chirurgische ingreep. Schijn dieren werden onderworpen aan alle chirurgische stappen, waaronder de incisie in het radulaire oppervlak, maar geen inwendige spieren werden verwijderd. Dieren die aan een i7-laesie onderworpen waren, hadden beide i7-spieren verwijderd. Dieren die aan een subradulaire vezel laesie onderworpen waren, hadden ~ 25% van de sub-radulaire vezels onmiddellijk onder de incisie verwijderd. Schijn laesies hadden geen significant effect op de breedte van de opening op het hoogtepunt van bijten, terwijl de laesies van zowel i7 als sub-radulaire vezels de beet breedte significant reduceerde (Figuur 9).
Figuur 9: resultaten van laesies bij openingsbreedte tijdens piek bijten. Getoonde gegevens zijn de verschillen tussen de gemiddelde genormaliseerde openingsbreedte van de radula voor en na de chirurgische ingreep voor 5 dieren in elk van de 3 groepen (Sham, i7 laesie, of SRF laesie), waarbij elk dier als eigen controle fungeert. Gemiddelden werden genomen van 5 beten vóór, en 5 beten na de chirurgische ingreep om het gemiddelde genormaliseerde verschil te bepalen. Openingsbreedte was de afstand van het centrum van radula tot de radulaire rand bij de piek tractie, genormaliseerd door de afstand van het binnenste oppervlak van de radulaire basis tot de gespleten zijranden van het radulaire oppervlak. De verschillen worden weergegeven als de gemiddelden plus of min de standaarddeviatie. Nadat werd vastgesteld dat de verschil gegevens normaal werden verdeeld, werd de waarschijnlijkheid dat de laesie geen effect had, bepaald (d.w.z. dat de nulhypothese werd getest dat de effecten van de chirurgische ingrepen gemiddeld nul zouden zijn) door een gekoppelde t-toets aan elke onafhankelijke groep. De gegevens laten zien dat de schijn laesie geen significant effect had, terwijl een laesie van de i7-spieren of een laesie van de sub-radulaire vezels een significant effect had op radulaire opening (p < 0,031 voor de i7-laesie groep, aangegeven met een enkele asterisk , of p < 0,002 voor de groep SRF-laesie, aangeduid met een dubbel sterretje). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Lichaamsgewicht | Magnesium chloride dosis |
| < 200 g | 1/2 lichaamsgewicht |
| 200-350 g | 1/3 lichaamsgewicht |
| 350-450 g | 1/4 lichaamsgewicht |
Tabel 1: Magnesium chloride dosering door lichaamsgewicht.
Discussion
De meest kritische stappen binnen het protocol zijn de noodzaak om ervoor te zorgen dat het dier volledig verdoiliseerd is, en dat de eversie van de buccale massa net genoeg is om toegang te krijgen tot de onderliggende spieren. Het kan enige oefening nodig om deze stappen te perfectioneren, maar zodra ze worden beheerst, de opbrengst van operaties is waarschijnlijk groter dan 85% van alle experimenten gedaan. De belangrijkste manier om het protocol correct te wijzigen en op te lossen is om tijd te besteden aan het doen van dissecties van de buccale massa, zodat de locaties van de inwendige spieren volledig duidelijk zijn voor de onderzoeker. Omdat de voorgestelde incisie door het radulaire oppervlak onvermijdelijk enige schade aan de onderliggende sub-radulaire vezels veroorzaakt, kan het gepast zijn om de exacte locatie van de incisie te wijzigen om specifieke gebieden van deze vezels te vermijden.
Een beperking van de chirurgische techniek is dat het niet-specifieke effecten kan hebben op het voeren van reacties, zoals de sterkte van het trekken. Een manier om deze beperking te overwinnen is om dieren te laten dienen als hun eigen controles. Bovendien is het van cruciaal belang om een Sham-laesie groep te hebben die wordt onderworpen aan het gehele chirurgische protocol, behalve voor het verwijderen van de specifieke spier (d.w.z. i7 of de Srf's). Door deze suggesties te volgen, zal een onderzoeker de effecten van variabiliteit tussen dieren verminderen en een intrinsieke maatstaf van de niet-specifieke effecten van chirurgie hebben.
Eerder werk heeft benaderingen gebruikt door de lichaams wand om te laesie of opnemen van zenuwen13,14, of spieren15,16,17. In ons laboratorium, we hebben anekdotische waargenomen dat lichaams muur incisies vaak gepaard gaan met een significant verlies van Hemolymfe en dus van lichaams volume. Dieren vereisen vaak enkele dagen om te herstellen van deze, en als het lichaam wand laesie niet zorgvuldig wordt gehecht, dieren kunnen niet herstellen. Bovendien onthult een postmortemkeuring van de dieren een aanzienlijke littekenvorming rond de incisie en een sterke immuunrespons (anekdotische waarnemingen). In tegenstelling, dieren vertonen geen verlies van Hemolymfe of verandering in lichaams volume na herstel van het protocol hier beschreven (op basis van waarnemingen in 96 dieren).
Toekomstige toepassingen van de techniek kunnen deze uitbreiden naar andere spieren binnen het voeder apparaat van Aplysia en naar andere dieren. We hebben ons geconcentreerd op het verwijderen van de i7-spieren en sub-radulaire vezels. Deze zelfde algemene chirurgische technieken bieden ook toegang tot de meeste andere spieren van de odontophore. Sommige hiervan, zoals het inwendige gedeelte van de i5-spier, zijn het best toegankelijk via het radulaire oppervlak. Anderen, zoals de binnenste folders van I4, kunnen beter worden bereikt door het uitwendige epitheel van de odontophore. We hebben voorbereidende proeven gemaakt waarbij een incisie onder de radulaire spleet van de gedeeltelijk veroorzaakte odontophore toegang mogelijk maakte tot een geslepen haak die vervolgens kon worden gebruikt om een andere spier binnen de odontophore, de spier i88, te laten vallen. Omdat het chirurgische protocol dat hier wordt beschreven, de hoofd lichaamsholte niet opent, is er geen hechten vereist.
Het protocol dat we hebben beschreven, kan van algemeen belang zijn voor andere onderzoekers die werken aan weke delen structuren die anders moeilijk te manipuleren zouden zijn, bijvoorbeeld het Voer apparaat van andere weekdieren. Meer in het algemeen zou dit protocol andere nieuwe chirurgische benaderingen voor de analyse van zachte structuren zoals tongen, Trunks of tentakels18kunnen suggereren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen het harde werk erkennen dat Sherry Niggel, SiSi Lu en Joey Wu hebben gestoken in het verbeteren en valideren van deze protocollen. Dit werk werd ondersteund door NSF Grant IOS 1754869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
| Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Webcam | Logitech | c920 | for recording data |
References
- Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia. Science. 167, 1740-1742 (1970).
- Kupfermann, I. Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation. Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).
- Susswein, A. J., Chiel, H. J. Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding. Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).
- Chiel, H. J. Aplysia feeding biomechanics. Scholarpedia. 2, 4165 (2007).
- Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).
- Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents. Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).
- Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals. Journal of Visualized Experiment. (40), 1791 (2010).
- Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana. Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).
- Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning. Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis. Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).
- Kupfermann, I. Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study. Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).
- Scott, M. L., Kirk, M. D. Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california. Brain Research. 585, 272-274 (1992).
- de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail’s male organ has no physiological basis. Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).
- Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia. Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).
- Kier, W. M. The diversity of hydrostatic skeletons. Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).
