Neuroscience

שיטה מינימלית פולשנית לשרירי השרירים הפנימיים של השיניים של Aplysia קליפורניה

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/60030

Catherine Kehl¹, Hillel J. Chiel^1,2,3,4

¹Department of Biology, Case Western Reserve University, ²Department of Biology, Case Western Reserve University, ³Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, ⁴Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור כירורגי מינימלית פולשנית של השרירים הפנימיים למנגנון האכלה של שבלול ימית הaplysia קליפורניה כדי להבין את התפקידים של שרירים אלה בעת האכלה התנהגות.

Abstract

מערכת מודל ללימוד השליטה העצבית בלמידה ובהתנהגות. לחיה זו מערכת של מחזור הדם פתוח למחצה, ומאפשרת גישה לרבים מהמבנים הפנימיים שלה מבלי לגרום לנזק משמעותי. מניפולציות רבות ניתן לבצע בקלות הן בvivo והן בתוך מבחנה, מה שהופך אותו מודל צייתן מאוד לניתוח של התנהגות ומעגלים עצביים. כדי להבין טוב יותר את הפונקציות של השרירים בתוך גמור האכלה, פיתחנו טכניקה עבור מתיחה אותם מבלי לפתוח את חלל הגוף העיקרי של בעל החיים או להזיק את השכבות החיצוניות של איבר האכלה (כלומר, המסה בוצ). בטכניקה זו, גמור הוא חלקית באופן חלקי, המאפשר גישה ישירה לשרירים. הליך זה מאפשר לבעלי חיים להתאושש במהירות ובאמינות. זה איפשר לנגע השרירים I7 וסיבים sub-radular, המאפשר לנו להראות כי שני השרירים לתרום באופן משמעותי את הפתיחה ב vivo.

Introduction

מערכת האכלה של ליסיה קליפורניקה יש היסטוריה ארוכה של שימוש כמערכת מודל להבנת למידה וזיכרון¹, התנהגויות מוטיבציה²^,³, ואת האינטראקציה בין התנהגות, ביומכניקה ו שליטה עצבית בזמן האכלה⁴. יש מעגלים עצביים נגישים מאוד, עם מספר קטן יחסית של נוירונים גדולים, הניתנים לזיהוי. לחיה מערכת מחזור הדם פתוחה למחצה, ומאפשרת גישה לרבים מהמבנים הפנימיים שלו מבלי לגרום לנזק משמעותי. הוא גם חזק למניפולציות רבות הן בvivo והן בתוך מבחנה, מה שהופך אותו למודל מאוד מעוקב לניתוח של התנהגות ומעגלים עצביים.

כדי להבין את הדפוסים העצביים הגורמים להתנהגויות האכלה, חשוב לתאר את המכניקה הבסיסית של המבנה הרך היוצר את איבר ההזנה, מסת הבקאל⁴. בעוד יש עבודה שנעשתה כדי לאפיין את השרירים החיצוניים המהווה את המסה בוצ⁵^,⁶, את השרירים הפנימיים של המבנה הבסיסי בתוך מסה בוצ השולט על פני השטח של גמור, הדונטופפור, היו לא נגיש במידה רבה בניסויים vivo. למרות שהיו במחקרים מחוץ לגופית על הפונקציות של חלק מהשרירים האלה⁷^,⁸, היעדר גישה ישירה לשרירים אלה הקשה ללמוד את תפקידם בבעלי חיים שלמים ומתנהגים.

רוב הטכניקות עבור השרשה אלקטרודות או נגעים aplysia או רכיכות דומה מינים דורשים כי קיר הגוף יפתחו⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². פתיחת קיר הגוף גורמת לפציעה אפיתל, ואת החתך חייב להיות אטום באופן מאובטח כדי למנוע המוליקמ להימלט. קשיים רציניים אפילו יותר הם הציבו כאשר מנסים להגיע השרירים הפנימיים של גמור של Aplysia (השרירים המשמשים את פני השטח radular או בתוך הדונטופפור): לאחר שנכנס דרך חלל הגוף הראשי, יש לעבור לאחר מכן דרך כמה חלק של הקיר השרירי של מסה בוצ כדי לקבל גישה למבנים הפנימיים (איור 1A). זו פציעה מצטברת וקושי של גישה עשה את הגישה דרך קונבנציונאלי אמצעים בעייתיים כי בעלי חיים לא להתאושש היטב מניתוחים אלה (של בעלי חיים עם בעיות מלאות, רק 17% חזר כל יכולת האכלה, N = 12. סביב 85% של בעלי חיים שאינם everted חזרו היכולת להאכיל, N = 84).

שריר I7, אשר מאופיין כפותחן radular⁸, הוא עמוק בתוך הדונפטוהור עצמו, עוד מסבך את הגישה. היא משתרעת בין הבסיס של הradular (איור 1C) והחלק התחתון של משטח הradular, דרך לומן בדונפטופור (איור 1c). על שלושה צדדים של שרירי I7 הם קירות של שריר, והקיר הרביעי מורכב radular גבעול. לצורך מחקר ביומכאני, ליקוי גדול לכל מבנה אלה עלול לפגוע בתפקוד הרגיל של מנגנון ההזנה. פיתחנו גישה הרומן של העבודה הדונטופד החוצה דרך הלסתות, ולנהל את הניתוח באמצעות חתך לפני השטח radular דק, הסחוס, שאפשרו לנגע שריר I7, כמו גם לאחרונה תיאר סיבי שריר בסדר ש לרוץ ממש מתחת לפני השטח radular, אשר אנו מתייחסים כמו סיבי sub-radular (איור 1C).

איור 1: סקירה אנטומי. (A) מיקום המסה בתוך aplysia. (ב) אנטומיה חיצונית של שפיטופור. פני השטח של רדולה ו radular sac הם צהובים; שרירי החיבור של הדונפטופור מוצגים באדום, על בסיס הצבעים הממשיים שלהם. (ג) משונן קטע של דונפטופור, המראה את המיקום של סיבים תת radular (קו ורוד מעוקל) ו I7 שריר (קו ישר ורוד). חתך החלק של השריר I6 מוצג אדום כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

Aplysia הם חסרי חוליות ולכן לא נתון לאישור IAUC. כדי למזער אי נוחות לבעלי חיים, ודא שהם מורדם לחלוטין לפני יישום טכניקות כירורגי המתוארות להלן.

1. בחירת בעלי חיים והפחתת ההרדמה

בחר בעל חיים פעיל על-ידי הצעת אותו אצות והמאשרת כי מרווחי הנשיכה אינם גדולים יותר מאשר בין 3 ו-5.
לשאת את החיה עם 0.333 מגנזיום טוחנת כלוריד (לראות את שולחן 1) על ידי הזרקת ליד הראש עם מחט של 18 גרם על מזרק 60 mL כך הריכוז הגבוה ביותר של הרדמה יהיה סביב המסה בוצ.
1. לטפל לחדור הן האפיתל החיצוני ואת שכבת הרקמה הפנימית עם המחט. ודא כי הזריקה היא בערך תחת הלוע, באמצע הדרך בין הלוע ואת הרגל, ואת המחט צריך להיכנס בכיוון ההפוך, הצבעה לכיוון הלסתות.
לאחר 10 דקות, בעדינות לנסות להכניס את הפין לתוך הזימים והריפור, מוודא כי אלה לא לסגת, כדי להבטיח מספיק ההרדמה.
ודא שהשפתיים והלסת של הסלאג רגועים, כך שניתן יהיה לחשוף את הדונפטופור.
הערה: הקמטים על השפתיים של איור 2A מעיד על כך שהשפתיים והלסת של בעל החיים אינם רגועים מספיק להליך הכירורגי שיבוצע ללא נזק. השפתיים החלקות והרגועות של איור 2B מעידות על כך שהלסתות רגועות באופן מלא.

איור 2: מתח והרפיה באפליסיה . (א) aplysia מראה רמה גבוהה של מתח שרירים סביב השפתיים. זה תואם עם מתח הלסת התווית מצביע על המשך עם הניתוח. (ב) aplysia עם שפתיים רגועות, מראה את החלק הפנימי של הלסתות (אפור בהיר). הצבעים מתאימים שוב לאלה שנצפו בבעל החיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אם שפתי בעל חיים אינם רגועים, הכנס עוד 30 מ ל של מגנזיום כלוריד והמתן עוד 5 דקות. אם זה לא גורם לרגיעה שפתיים, להחזיר אותם מכולה מבודדת עם זרימת מים טובה כדי לאפשר להם להתאושש (ראה שלב 4) ולהמשיך עם בעל חיים שונים.

2. חשיפת המשטח הRadular

מקמו את הקליע כך שהראש מסתובב כלפי מטה ומאפשר למסת המוח להתיישב מול הלסתות.
הפעילו לחץ על האגודל והאצבע כדי לדחוף את מסת הבוצ לכיוון הלסתות, והחזיקו את המסה ההמונית במקום.
לסובב את הלסתות כך שהם גלויים. באותו הזמן, לשמור על הלחץ על מסת בוצ, כך חרטום של מסה בוצ גלוי דרך הלסתות. (איור 3).

איור 3: תמיכה במסה בוצ כנגד הפנים של הלסתות. האצבעות תומכות המסה בוצ כי כבר דחף את הקצה הפנימי של הלסתות עד קצה הגלגל ניתן לראות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעדינות לעבוד את קצות המלקחיים קהה לתוך החריץ של השיניים ולהשתמש בהם כדי למנוף את פני השטח radular דרך הלסתות. אם הלסתות אינן רגועות מספיק, השתמשו בלקחיים כדי לתפוס בעדינות את קצה החריץ כדי לסייע לתהליך זה.
זהירות: הלחץ הזה מסכן. נזק גדול יותר לחיה
לאחר חשיפת פני השטח, לעבוד את הלסתות לנקות את החלק הקדמי של פני השטח radular כל הדרך סביב המתחם. זה הופך את הדונטוורידים פחות סביר לחזור (איור 4). ודא כי לא יותר ממחצית קירות השיניים חשוף.

איור 4: אבריון חלקי של השיניים. המשטח הradular נחשף במלואו, אך הצדדים של הפיטוורידים אינם חשופים, מה שהופך את זה לדבר חלקי בלבד. . ההמשך עלול לגרום נזק לחיה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: במלוא הרצינות של הדונטופפור יגרום נזק השריר העיקרי שממנו בעלי החיים הם איטיים מאוד להתאושש.

3. חתכים כירורגיים

לאחר משטח radular נחשף לגמרי, לסדר את הסלאג תחת היקף הניתוח עבור כירורגיה.
1. לחילופין, השתמשו בגומייה רחבה וביד שלישית כדי לייצב את הלסתות ואת המשטח הradular לניתוח, במיוחד בזמן הלמידה. זה, עם זאת, מוסיף זמן ונזק רקמות מוגבר להליך, מה שהופך אותו אידיאלי פחות לטווח ארוך.
מניחים את פני השטח הradular כך שהצד השולי פונה לחוקר.
לתפוס בעדינות את פני השטח radular, ליד בסיס radular, כך קיפול אופקי נוצרת בניצב הקמט האנטומי. השימוש מספריים עדינים לחתוך את הקפל הזה, עושה חתך לאורך הקמט האנטומי (איור 5).

איור 5: מיקום החתך אל פני השטח Radular. (א) Radular פני השטח, עם חתך. (ב) Radular פני השטח עם עיגולים המראים היכן גדילי השריר הדו I7 לצרף; קווים מנוקדים מציגים את מיקומם של השרירים היורדים מתחת לפני השטח הradular. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

להאריך את החתך הראשוני כדי 3-5 ס מ כדי לאפשר גישה לפנים של מסה בוצ.
כוונן את האור כך שיצביע ישירות דרך החתך.
חלק את קצות החתך כך את גבו של לומן של הדונפטופור ואת קווצות אנכי דק של שריר I7 גלויים. (איור 6)

איור 6: מיקום I7 דרך חתך פני השטח Radular. מסתכל דרך החתך, שני קווצות של I7 ניתן לראות בין המשטחים הפנימיים של I4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

להגיע דרך החתך, לתפוס את שני קווצות של I7, ולמשוך אותם למעלה דרך החתך, שם ככל שהשריר ניתן לגזור כפי שהוא מעשי (איור 7).

איור 7: משיכת השריר I7 שריר דרך החתך. שריר I7 הוא גמיש מאוד ניתן למשוך דרך החתך להסרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: עם תרגול, זה בדרך כלל יעיל יותר לאתר I7 על ידי ההרגשה מאשר על ידי ראייה.

4. טיפול שלאחר הניתוח

לאחר נגעים בוצעו, לתפוס את זרועות הקדמי, ולדחוף למטה על פני השטח radular כדי להחזיר את הסלאג אל התצורה המקורית שלו.
מניחים בעלי חיים שלאחר ניתוח בסביבה מוגנת עם זרימת מים טובה. . החמצן הוגבר מאיץ את ההחלמה ודא שבעלי החיים ערניים ומגיבים ביום שלאחר הניתוח. אם זה לא המקרה, ניתן להניח כי הם לא להתאושש.
הערה: בדרך כלל, בעלי חיים יתחילו להיזון ביום הראשון או השני אחרי הניתוח. אפילו בעלי חיים כי הם מתקשים לנשוך צריך להיות מוצעים אצות, כפי שהוא התבוננות אנקדוטיים שההחלמה של החיה משופרת על ידי ניסיונותיה לאכול.

5. עבור הנגע משנה radular סיבים

בצע את השלבים מ 1.1 עד 3.5
הכנס את קצהו של להב אזמל ישר קטן (#11 או דומה) דרך החתך עם הקצה החדה בזווית כלפי מעלה. מגרדים בעדינות את סיבי השרירים הדקים מהצד התחתון של המשטח הradular. (איור 8).

איור 8: לעבור את סיבי Subradular. הקצה של להב האזמל הוא בזווית מעלה דרך החתך אל החלק התחתון של המשטח radular, כך שהוא יכול לגרד בעדינות את סיבי sub-radular. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

. חזור לשלב 4.1

Representative Results

העבודה הקודמת הציע כי שריר I7 תרם לפתיחת גמור⁸. מחקרים אנטומיים שלנו הציע כי סיבי sub-radular עשוי גם לתרום לפתיחת גמור. כדי לבחון את ההשערות הללו, בעלי חיים המושרה לייצר נשיכות הן לפני ואחרי קבלת הליך כירורגי. בעלי חיים היו חשופים לכל הצעדים המנתחים, כולל החתך במשטח הradular, אך לא הוסרו שרירים פנימיים. בעלי חיים שנחשפו לנגע I7 היו שרירי I7 הוסרו. בעלי חיים שנחשפו לנגע תת סיבים radular היה ~ 25% של סיבי sub-radular הוסרו מיד מתחת לחתך. הנגעים שאם לא היתה השפעה משמעותית על רוחב של הפתיחה בשיא של נשיכות, ואילו הן I7 ו-sub-radular נגעים סיבים להפחית באופן משמעותי את רוחב הנשיכה (איור 9).

איור 9: תוצאות נגעים על רוחב הפתיחה במהלך הנשיכות בשיא. נתונים המוצגים הם ההבדלים בין רוחב הפתיחה המנורמל בממוצע של רדולה לפני ואחרי הליך כירורגי עבור 5 בעלי חיים בכל אחת משלוש הקבוצות (שאם הפצע, I7, או הנגע srf), כאשר כל בעל חיים משמש כשליטה משלה. ממוצעים נלקחו 5 עקיצות לפני, ו 5 עקיצות לאחר ההליך הכירורגי כדי לקבוע את ההבדל מנורמל מתכוון. רוחב הפתיחה היה המרחק ממרכז רדולה לקצה radular בשיא המתיחה, מנורמל על ידי המרחק מן המשטח הפנימי של בסיס radular אל הקצוות הצדדיים של המשטח הradular. ההבדלים מוצגים כאמצעי בתוספת או פחות סטיית התקן. לאחר הקמת הנתונים שההבדל הופץ בדרך כלל, ההסתברות כי הנגע לא היתה השפעה נקבע (כלומר, ההשערה null נבדק כי ההשפעות של ההליכים כירורגי יהיה אפס, בממוצע) על ידי החלת מזווג t-test לכל קבוצה עצמאית. הנתונים מדגים כי הנגע המזויף לא היתה השפעה משמעותית, בעוד נגע של שרירי I7 או נגע של סיבי sub-radular היה השפעה משמעותית על radular פתיחה (p < 0.031 עבור הקבוצה הנגע I7, המצוין עם כוכבית אחת , או p < 0.002 עבור קבוצת הנגעים SRF, המצוינת על-ידי כוכבית כפולה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משקל הגוף	מנה מגנזיום כלוריד
< 200 גרם	1/2 משקל גוף
200-350 גרם	1/3 משקל גוף
350-450 גרם	1/4 משקל גוף

טבלה 1: מינון מגנזיום כלוריד במשקל גוף.

Discussion

הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם הצורך להבטיח כי בעל החיים הוא מורדם לחלוטין, וכי הציון של מסת בוצ הוא רק מספיק כדי לגשת השרירים הבסיסיים. זה עשוי לדרוש קצת תרגול כדי להשלים את השלבים הללו, אבל ברגע שהם שולט, התשואה של ניתוחים היא עשויה להיות גדולה מ 85% של כל הניסויים שנעשו. הדרך החשובה ביותר לשנות ולפתור בעיות הפרוטוקול היא לבלות זמן לבצע ניתוח של מסה בוצ, כך שמיקומי השרירים הפנימיים ברורים לחלוטין לחוקר. מכיוון החתך הציע דרך פני השטח radular בהכרח גורם נזק לסיבים sub-radular הבסיסית, זה עשוי להיות מתאים לשנות את המיקום המדויק של החתך כדי למנוע אזורים ספציפיים של סיבים אלה.

מגבלה אחת של הטכניקה כירורגית היא כי ייתכן השפעות שאינן ספציפיות על תגובות האכלה, כגון חוזק של המתיחה. אחת הדרכים להתגבר על מגבלה זו היא שבעלי חיים משמשים כפקדים שלהם. בנוסף, חשוב להיות קבוצת נגעים מזויפים הנתונה לפרוטוקול הכירורגי כולו, למעט הסרת השריר הספציפי (כלומר, I7 או ה-SRFs). על ידי ביצוע הצעות אלה, חוקר תפחית את ההשפעות של השונות בין בעלי חיים יש מדד מהותי של ההשפעות הלא ספציפיות של הניתוח.

העבודה הקודמת השתמשה גישות דרך קיר הגוף כדי לנגע או להקליט מפני העצבים¹³^,¹⁴, או שרירים¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. במעבדה שלנו, יש לנו anecdotally נצפו כי חתכים בקיר הגוף מלווים לעתים קרובות על ידי אובדן משמעותי של המוליקמ ובכך של נפח הגוף. בעלי חיים דורשים לעתים קרובות מספר ימים כדי להתאושש מזה, ואם הנגע בקיר הגוף לא בזהירות משמים, בעלי חיים לא יכול להתאושש. בנוסף, בדיקה שלאחר המוות של בעלי החיים מגלה הצטלקות ניכרת סביב החתך ותגובה חיסונית חזקה (אנקדוטיים). לעומת זאת, בעלי חיים לא מראים אובדן של המוליקמ או שינוי נפח הגוף לאחר התאוששות מהפרוטוקול המתואר כאן (מבוסס על תצפיות 96 בעלי חיים).

יישומים עתידיים של הטכניקה עשויים להאריך אותה לשרירים אחרים בתוך מנגנון ההזנה של Aplysia, ולבעלי חיים אחרים. התמקדנו בהסרת השריר I7 ו-sub-radular סיבים. אלה טכניקות כירורגית כלליות גם לאפשר גישה לרוב השרירים האחרים של הדונטופפור. חלק מאלה, כגון החלק הפנימי של השריר I5, הם הטובים ביותר גישה דרך פני השטח radular. אחרים, כמו העלונים הפנימיים של I4, יכול להיות הגיע טוב יותר דרך האפיתל החיצוני של הדונטופפור. יש לנו ניסויים ראשוניים שבו החתך תחת radular שסועה של מותר באופן חלקי evertop לגשת לקרס מחודד להיות מוכנס כי יכול לשמש לנגע שריר נוסף בתוך הדונטופפור, שריר I8⁸. מכיוון שהפרוטוקול הכירורגי המתואר כאן אינו פותח את חלל הגוף הראשי, אין צורך בשום מבצע.

הפרוטוקול שתיארנו יכול להיות עניין כללי לחוקרים אחרים העובדים על מבני רקמה רכה שאחרת יהיה קשה לתמרן, למשל, מכשיר האכלה של רכיכות אחרות. באופן כללי יותר, פרוטוקול זה יכול להציע גישות אחרות כירורגי הרומן ניתוח של מבנים רכים כגון לשונות, גזעי או זרועות¹⁸.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

היינו רוצים להכיר בעבודה הקשה ששרי Niggel, סיסי לו, וג וו הכניסו לשיפור ולאימות הפרוטוקולים הללו. עבודה זו נתמכת על ידי NSF גרנט IOS 1754869.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data