该方法描述了在P17雪貂中建立炎症敏感的缺氧缺血性及高氧性脑损伤，以模拟多种晚期早产儿所经历的持续性炎症与氧化性脑损伤之间的复杂相互作用。
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摘要
摘要
目前仍需要建立具有临床相关性的围产期感染和缺氧缺血（HI）模型，以测试针对早产所致神经系统后遗症婴儿的治疗干预措施。雪貂是模拟早产儿人脑的理想候选动物，因为它们出生时为平滑脑，出生后则发育为具有脑回的脑结构。雪貂出生时的脑发育水平相当于人类13周的胎儿，而出生后第17天（P17）的幼崽则被认为相当于妊娠32至36周的婴儿。本文描述了一种P17雪貂的脑损伤模型，先给予脂多糖（lipopolysaccharide）处理，随后诱导双侧脑缺血、缺氧和高氧暴露。该模型模拟了多种发生脑损伤的新生儿所经历的长期炎症、缺血、缺氧和氧化应激之间的复杂相互作用。受损动物表现出不同程度的宏观损伤严重性，脑部出现多种形态学改变，包括多个大脑皮层脑回及其相应脑沟的变窄。受损动物还表现出反射发育迟缓、在自动化步道测试中行走速度更慢且变异性更大，以及在开放旷场实验中探索行为减少。该模型为测试针对与炎症和缺氧缺血相关的新生儿脑病婴儿的潜在疗法、研究影响皮层发育的损伤机制，以及探索未受损动物中具有保护作用的通路提供了平台。
引言
目前仍需要能够反映早产和围产期缺氧-缺血病理生理学的大动物模型，以用于测试针对婴儿的治疗干预措施。2017年，在美国出生的382,726名婴儿中，有9.93%为早产儿，其中84%的早产儿出生孕周在32至36周之间1。在早产儿中，围产期暴露于感染或炎症的情况较为常见，母体因病毒或细菌病原体引发的免疫激活可诱发早产。出生后，早产儿发生早发性或晚发性败血症的风险较高2。此外，由于早产儿心肺系统发育不成熟、出生后环境氧张力相对于宫内显著升高以及医源性因素暴露，他们还常经历缺氧、低血压和高氧血症。同时，早产儿的抗氧化防御系统尚未发育成熟3，促凋亡因子则自然上调4。氧化应激和细胞死亡可导致免疫系统激活及神经炎症。这些因素共同作用，被认为会导致大脑在发育和生理上的易损性，进而引发或加重与早产儿不良发育结局相关的脑病5,6,7。
由于雪貂大脑在结构和发育方面与人类大脑具有相似性，因此雪貂是模拟脑损伤的理想物种8,9....
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方案
实验操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的规定，并作为华盛顿大学机构动物护理与使用委员会批准方案的一部分进行。
1. 准备与LPS给药
注意：有关实验步骤的时间线，请参见图1。
- 开始操作前，密封、灭菌并高压灭菌所有外科器械和手术巾。在无菌小瓶中准备术前用药。计算所需的流速，以便在8–10分钟内用实验气体完全置换缺氧/高氧舱内的空气。
- 将脂多糖（来自E. coli 055:B5的LPS）用无菌生理盐水配制成1 mg/mL的浓度。将P17雪貂幼崽从母貂中取出，称重并编号。根据窝别和性别将动物随机分配至对照组或损伤组（或治疗组）。
- 使用300 µL胰岛素注射器，向损伤组幼崽腹腔注射3 mg/kg的LPS，对照组动物则注射等体积的无菌生理盐水载体（3 µL/g）。
- 将动物置于水浴中的密闭舱内，水浴温度维持在37–40 °C，以确保在整个手术过程中动物直肠温度保持在36–37 °C的目标范围内。
2. 麻醉
- 在操作过程中，持续监测动物的体温、呼吸频率和心率。
- 术前30分钟，皮下注射布托啡诺（0.05....
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结果
在来自六窝接受损伤处理的34只动物（n = 18只雄性，n = 16只雌性）中，损伤组有8只动物（24%；n = 4只雄性，n = 4只雌性）在第二次缺氧期（n = 5）、体温管理期间（n = 2）或损伤后过夜期间（n = 1）死亡。在损伤组中，26只存活动物中有9只（35%）出现可见的大体损伤。其中5只动物（n = 5只雄性）表现为中度损伤，4只动物（n = 2只雄性，n = 2只雌性）表现为重度损伤，分别定义为大体病理学评分为2–5分和6–9分（图2A）。因此，接受损伤处理的动物出现死亡或显著大体损伤的风险为50%。随着损伤程度加重，可见颞叶和/或枕叶脑回变窄，伴随脑沟缩短、大脑纵裂增宽，以及在损伤最严重的动物中出现大范围囊性组织缺失（图2B）。在存活的损伤动物中（n = 26；n = 14只雄性，n = 12只雌性），小脑暴露面积显著增大（图3A），同时.......
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讨论
由于雪貂大脑与人类大脑在结构和发育上具有相似性，雪貂正越来越多地被用于建立成年及发育期脑损伤的动物模型8,9,10,11,12。然而，迄今为止的研究表明，雪貂大脑对初始损伤具有较强的耐受性，且具备高度可塑性，即使存在明显的病理损伤，其行为缺陷也会随时间推移而逐渐减轻10,12。本文中，我们描述了首例针对接近早产儿发育阶段的雪貂建立的炎症致敏性缺氧缺血（HI）脑损伤模型，该模型可导致显著的双侧脑损伤，并在存活个体中引发持续性的行为功能障碍。与所有临床前模型一样，本研究的目的并非精确复制早产儿在临床环境中所经历的各种暴露因素，而是整合目前认为参与早产儿脑损伤发生的关键机制因素，包括炎症、缺氧和氧化应激<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
该模型的开发由比尔和梅琳达·盖茨基金会以及美国国立卫生研究院资助（资助号：5R21NS093154-02，NICHD）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 80% 氧气 | Praxair | ||
| 9% 氧气 | Praxair | ||
| 吸水性台面防护垫 | Kimtech | 7546 | |
| 自动步道系统 | Noldus | ||
| 聚维酮碘外科洗手液 | |||
| 布比卡因 | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| 丁丙诺啡 | |||
| 游标卡尺 | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 量程 200 mm，分辨率 0.01 mm |
| 棉质纱布海绵 | Fisher Scientific | 22028556 | |
| 弯头精细止血钳 | Roboz | RS-7101 | |
| 弯头镊子 | World Precision Instruments | 501215 | |
| 弯头缝合打结止血钳 | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision 跟踪软件 | Noldus | ||
| 眼用润滑剂 | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| 雪貂（Mustela putorius furo） | Marshall Biosciences | 非近交系（无特定品系） | |
| 福尔马林 | Fisher Scientific | SF100-4 | 10%（磷酸盐缓冲液/认证） |
| 毛发修剪器 | Conair | GMT175N | |
| 胰岛素注射器 | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| 异氟烷 | Piramal | 66794-017-25 | |
| 利多卡因 | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| 氧气传感器 | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| 戊巴比妥 | |||
| 塑料舱室 | Tellfresh | 1960 | 10 L；373 x 270 x 135 mm3 |
| 生理盐水溶液，0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| 手术刀片 | Integra Miltex | 297 | |
| 手术刀柄 | World Precision Instruments | 500236 | #3，13 cm |
| 无菌缝合线 | Fine Science Tools | 18020-50 | 编织丝线，5/0 |
| 手术夹施加器 | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| 手术夹移除器 | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| 手术单 | Medline Unidrape | VET3000 | |
| 外科手套 | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| 手术夹 | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| 体温计（直肠用） | YSI | Precision 4000A | |
| 水温计 | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| 脐带绳 | Grafco | 3031 | 无菌 |
| 水浴锅 | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
参考文献
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm....
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