Summary
この方法は、P17フェレットにおける炎症感作性低酸素虚血性および高酸素性脳損傷を記述し、多くの後期乳児で経験した長期炎症と酸化脳損傷との間の複雑な相互作用をモデル化する。
Abstract
周産期感染および低酸素虚血(HI)の臨床的に関連するモデルの継続的な必要性があり、これは、未熟児の神経学的後遺症を有する乳児の治療的介入を試験する。フェレットは、リセンスケファルク生まれで、出生後にギレンセファリック脳を発症するので、早産の人間の脳をモデル化するための理想的な候補です。出生時、フェレット脳の発達は13週のヒト胎児に似ており、出生後の日(P)17キットは32~36週の妊娠で乳児と同等であると考えられる。我々は、リポ多糖投与の後に両側性脳虚血、低酸素症、および高酸素症が続くP17フェレットにおける傷害モデルを記述する。これは、脳損傷を発症する新生児の数で経験した長期炎症、虚血、低酸素症、および酸化ストレスの複雑な相互作用をシミュレートする。負傷した動物は、複数の皮質ジャイリおよび関連するスルシの狭窄を含む脳の形態学的変化を伴う、重症傷害重症度の範囲を示す。負傷した動物はまた、反射の発達が遅く、自動キャットウォークでの移動速度が遅く、より可変的な速度を示し、オープンフィールドでの探査を減少させた。このモデルは、炎症およびHIに関連する新生児脳症を有する乳児の病理療法を試験し、皮質発達に影響を与える傷害のメカニズムを研究し、回復力を提供する経路を調査するプラットフォームを提供するプラットフォームを提供する。影響を受けない動物。
Introduction
乳児の治療介入をテストできる未熟児および周産期低酸素虚血の病態生理学を反映する大型動物モデルの必要性が続いている。2017年には、米国で生まれた382,726人の乳児の9.93%が早産で、そのうち84%が妊娠1の32~36週の間に生まれました。早期産児では、感染や炎症への周産期暴露が一般的であり、ウイルスまたは細菌病原体による母親の免疫活性化が早産を開始できる。出生後、早産児は早期または遅発性敗血症のリスクが高い。早産児はまた、未熟な心呼吸器系、子宮内で経験した人に比べて大気中の酸素張力の上昇、およびイアトロゲン暴露のために、低酸素症、低血圧、および高酸素症の期間を頻繁に経験する。さらに、早産児では、抗酸化防御は未熟な3であり、プロアポトーシス因子は自然にアップレギュレートされる4.酸化ストレスと細胞死は、免疫系と神経炎症の活性化につながります.これらの複合因子は、脳の発達および生理学的脆弱性に寄与すると考され、早産児5、6、7における発達不良に関連する脳症を生じるまたは悪化させる。
フェレット脳が人間の脳と共有する物理的および発達的な類似点のために、フェレットは脳損傷をモデル化する魅力的な種である8,9,10,11,12.フェレットはまた、早産下脳症が生まれ、出生後にギレンセファリック脳を発達させるため、早産の人間の脳をモデル化するのに理想的な候補であり、早産で生まれた乳児を模倣する侮辱に発達中の脳を露出させる窓を提供する。出生時、フェレット脳の発達は13週のヒト胎児に似ており、出生後の日(P)17キットは妊娠13週の32〜36週で乳児と同等であると考えられる。
私たちのグループは最近、低酸素症および高酸素症12へのその後の暴露と大腸菌リポ多糖(LPS)と炎症性感作(LPS)を組み合わせることにより、P10フェレットにおける非常に早産(<28週)脳損傷のモデルを発表した。次のプロトコルでは、LPS感作が二国間脳虚血、低酸素症、および高酸素症が続くP17フェレットの後期早期モデルについて説明します。これは、動物のサブセットでより重度の傷害をもたらし、より密接に長引く炎症、虚血、低酸素症、および脳損傷を発症する多くの早産児で経験した酸化ストレスの複雑な相互作用をモデル化する。
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Protocol
手順は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われ、ワシントン大学機関動物ケアと使用委員会によって承認されたプロトコルの一部として行われました。
1. 準備とLPS管理
注:手順のタイムラインについては、図 1を参照してください。
- 処置を最初に、シール、殺菌およびオートクレーブすべての外科器具および外科ドレープ。滅菌バイアルで手術前の薬を準備します。低酸素/超オキシアチャンバー内の空気を8~10分で実験ガスに置き換えるために必要な流量を計算します。
- 無菌生理食塩水中にリポ多糖(大腸菌055:B5からのLPS)を調製し、濃度1mg/mLを生成する。ジルからP17フェレットキットを取り外します。それらを計量し、番号を付ける。コントロールまたは負傷(または治療)グループにごみやセックスによって動物をランダム化します。
- 300 μLインスリン注射器を使用して、LPSの3mg/kgを傷害群のキットに静脈内投与し、動物を制御するために滅菌生理食塩水車(3μL/g)の同等量を投与する。
- 手術を通して36~37°Cの目標直腸温度を維持するために、37~40°Cの水浴内の室内に動物を入れます。
2. 麻酔
- 処置の間、動物の温度、呼吸数および心拍数を絶えず監視する。
- 外科手術の30分前にブプレノルフィン(0.05 mg/kg)を皮下投与する。100%酸素とバランスの取れた3%のイソフルランの混合物で麻酔を誘発する。誘導室からキットを取り出し、37°Cに設定したドレープ手術用水毛布の上にサピングを置きます。鼻コーンに麻酔を移し、アイソフルランレベルを2~3%に下げる。
3. 外科的準備
- 小さな動物のバリカンを使用して、腹頸部領域上のすべての毛を除去します。皮膚をニックしたり、カミソリの発疹を発生させないように注意して、長方形のパターンで剃ります。皮内リドカイン (4 mg/kg) とブピバカイン (2.5 mg/kg) を使用して、剃った領域に局所麻酔を投与します。.
- 無菌綿棒でポビドロンヨウ素と70%エタノールスクラブのアプリケーションを交互に使用することにより、首を準備します。ポビドネ-ヨウ素と70%エタノールがそれぞれ交互に3倍に塗布されるようにスクラブを繰り返します。
- つま先ピンチ反射の欠如を介して麻酔の深さを確認します。麻酔の外科平面に必要な最小パーセンテージでアイソフルランのレベルを維持する。首の領域を露出させる無菌の使い捨てカットアウトドレープを使用して、動物をドレープ。
4. 両側頸動脈合合体
- メスのブレードを使用 #11して、首の中央に1.5cmの中線切開を行います。微細な止血と湾曲した鉗子を使用して、左頸動脈にぶっきらぼうに解剖する。関連する神経血管束から動脈を解剖する。
- 湾曲した微細鉗子のペアを使用して、動脈の下に無菌5-0シルク縫合糸のループ10センチの長さを渡します。縫合糸を半分に切ります。縫合糸の両方の長さをしっかりと結び、結び目の間に少なくとも2ミリメートルを残すことによって動脈をリゲートします。縫合糸の間に左頸動脈を移し、神経をそのまま残すように注意する。
- 右側の解剖を繰り返します。可逆的に単一の無菌1/8インチの臍のネクタイで右頸動脈をリゲートする。外科的なスキンクリップで傷を閉じます。
- 低酸素症の前に少なくとも30分間、温度調節された水浴で動物が回復することを許可します。
注:動脈が神経血管束の残りの部分から完全に単離されていない場合、死亡率の増加は低酸素症の前または後に見られることがある。
5. 逐次性低酸素症、高酸素症、低酸素症
- 低酸素症および高酸素症の間に、センチネル動物の37°Cの低酸素の間に直腸温度を維持するために必要に応じて水浴温度を変える。
- 水浴内の気密室に傷害群に動物を入れます。チャンバー内の酸素濃度、ならびに少なくとも1つのセンチネル動物における直腸温度を連続的に監視する。加湿した9%の酸素(91%窒素)でチャンバーを洗い流し、チャンバーのサイズに応じて3~5 L/分の流量を維持します。チャンバー内の酸素濃度が9%に達したら、30分間続けます。
- 30分後、ガス供給を80%加湿酸素(20%窒素)に切り替え、流量とチャンバーサイズに基づいて目標濃度に到達できるようにします。高酸素症の30分間続けます。部屋の空気と平衡化することにより、より迅速にノルモクシアに到達できるようにチャンバーを開きます。
- チャンバーを密封し、9%加湿酸素で洗い流します。すべての動物を視覚的に継続的に監視し、徐脈を示す動物をメモします。チャンバー内の酸素濃度が9%に達したら、30分間続けます。30分の期間の終わりまでにいずれかの動物で低酸素内死亡率(呼吸停止)が見られる場合は、直ちに低酸素症を終了する。
6. 右頸動脈ライゲーションの逆転
- 動物を手術領域に戻し、100%酸素とバランスのとれた3%のイソフルランの混合物で麻酔を誘発する。鼻コーンに麻酔を移し、アイソフルランレベルを2~3%に下げる。外科的創傷クリップを取り外し、ポビドネ・ヨウ素で創傷領域を再準備する。つま先ピンチ反射の欠如を介して麻酔の深さを確認します。麻酔の外科平面に必要な最小パーセンテージでアイソフルランのレベルを維持する。首の領域を露出させる無菌の使い捨てカットアウトドレープを使用して、動物をドレープ。
- 湾曲した鉗子を使用して、右頸動脈から臍テープを識別し、解き放つ。外科的なスキンクリップで傷を閉じます。
7. 回復と温度管理
- すべてのキットを60分間ジルに戻し、授乳と回復のために。60分後、負傷した動物を37~40°Cの水浴に6時間戻し、必要に応じて水温を調整し、直腸温度を36~37°Cに保ちます。キットをジルに戻します。
- 手術後10~14日後に手術用クリップを取り外します(P27–P31)。
8. 反射テスト
- P21-P28から毎日すべての反射検査を行い、P28-P42から週に少なくとも3倍の反射検査を行い、その間に露出(または治療)群に盲目のまま。反射試験の前に、熱補助付きのチャンバー(37°水浴、ヒートパッドなど)にキットを1時間置きます。各テストについて、次のキットをテストする前に、キットごとにすべてのトライアルを完了します。
- 負のジオタキシス (25°)
- ボードがテーブルと25°の角度を形成するように、オブジェクトに対して吸収ベンチトッププロテクタにラップされたフラットボード(16 1/2 in x 12in.)を置きます。ボードの上にキットを置き、下り坂に面しており、ボードの約75%をボードの上に置きます。
- キットの本体がまっすぐで、4本の足がすべてボードにつかまっていてから離してください。キットが配置されるとすぐに、時間評価を開始します。
- キットが開始位置を基準に90°回転する時間を記録します。キットが本体を180°回転させ、ボードの上部に向かって完全な一歩を踏み出す時間を記録します。次のテストに進む前に、25°傾斜で3回の試験を行います。
- 負のジオタキシス (45°)
- 前述のネガティブジオタキシステストの3回の試験を再度実行し、今回はボードを45°角度に設定します。
- クリフ・アバージョン
- 落下した場合のキットの傷害を最小限に抑えるために、棚の下に1フィート付近にパッド入りのプラットフォームを配置します。
- ラボ ベンチの端に向き、垂直にキットを配置します。キットの本体がまっすぐで、前面の足がエッジでフラッシュされていることを確認します。キットが配置された瞬間から時間評価を開始します。崖から離れた意識的な動きと、協調歩行を伴わない他の自発的な動きを区別するように注意してください。
- キットがエッジからボディを離れる時間を記録します(キットがバックアップ、ボディを回転、または前肢をエッジから離して移動すると定義されます)。キットがエッジの反対方向に最初のステップを完了した時間を記録します(エッジを向いた開始位置から 90°回転を超える方向または角度として定義されます)。
- 次のテストに進む前に、キットごとに3つの崖の嫌悪試験を実行します。
- 右反射
- キットのスフィンをベンチに置き、その位置にそっと保持してから離し、同時にストップウォッチを開始します。キットが重量を持つ位置のベンチに対して同時に平らに4つの足すべてで休息をもたらす時間を記録します。キットが任意の方向に完全なステップを取る時間を記録します(ボディの回転やドラッグなしで特定の方向に進行を達成するために4つの足すべてを配置として定義されます)。
- 動物1匹につき右反射試験の5回の試験を行う。
- すべてのキットが5つの右反射試験を完了した後、ジルにごみを返します。
9. キャットウォークテスト
- P42 で、ジルからキットを取り外します。テストの約10分前にプラスチックケージにキットを配置し、環境に慣れることができます。周囲光がキャットウォーク機能に影響を与えないように、テストルームのライトをオフにします。
- 関連するソフトウェアで新しい実験を作成します。最大実行時間が 10.00 s を超え、最小実行時間が 1.50 s を超えないように実験設定を調整します。動物ごとに 3 つの準拠ランの最小要件を設定します。
- 回転を妨げるほど狭いままで壁に触れることなく自由にロコモテできるように、動物の大きさに対して歩道の幅を調整します。自動検出を使用して、[検出設定プロファイル]タブに新しい検出設定を追加します。特定の年齢のすべてのごみや動物に同じ検出設定を使用します。
- 各動物の前後に低リント紙組織と70%エタノールで歩道を徹底的に清掃してください。フェレットの足を定期的に清掃し、検出と分類の精度を向上させます。歩道と動物が準備されたら、トライアル取得を開始します。
- 足跡がガラスに蓄積された場合、または動物が尿や便を通過する場合は、キャットウォークをきれいにするために取得を一時停止します。キャットウォークソフトウェアが事前に決定された実験設定に基づいて3つの準拠ランを認識したら、取得を停止します。
10. オープンフィールドテスト(P42)
- 非多孔質アクリルボックス(高さ55cm×55cm×40cm)を使用し、マットホワイトを塗装します。カメラがボックスの真上に中央に配置され、4 つの壁がすべてキャプチャされるように配置します。最初の使用前および動物間の70%エタノールで試験場をきれいにしてください。
- 関連するソフトウェアで、[テンプレートから新規作成]を選択し、[定義済みのテンプレートを適用]を選択します。[サブジェクトの種類:その他] を順番に選択して、セットアップ手順を続行します。アリーナテンプレート:オープンフィールド、正方形。ゾーンテンプレート:センター、境界線、コーナー。追跡する機能: 中心点。
- [アリーナ設定]を開き、カメラ入力から背景画像をつかみ、アリーナウォールの上部が表示されていることを確認します。スケール ツールを使用して、アリーナの寸法を調整します。
- 壁ゾーン(NW、NE、SW、SE)とフロアゾーン(左上、中央トップ、右上、左中央、中央、中央、左下、中央下、右下、右下)に合わせてアウトラインのサイズを変更して、定義済みのアリーナゾーンを調整します。セットアップを検証して、ゾーンが重複していないことを確認します。
- [取得] ウィンドウを開き、[取得の開始]をクリックします。すべての試験対象に対して一貫した方法で、テストアリーナの中心にフェレットを配置します。フェレットがアリーナ全体を5分間自由に動かします。テスト期間の終了時に、[取得の停止] を押します。次のフェレットで手順を繰り返します。
注:部屋のすべての実験者は、フェレットによって観察不能であると自分自身を位置付け、テスト期間中は静かに保つ必要があります。
11. 固定灌流
- P42では、5%のイソフルランでキットを深く麻酔します。ペントバルビタールの過剰摂取を投与する (120–150 mg/kg i.p.)つま先のピンチに対する反応の欠如と呼吸運動の喪失によって深い麻酔を確保します。
- ヒュームフードに動物を転送します。胸郭を開き、細かい止血を使用して下降大胸をクランプします。右のアトリウムを切る。灌流ポンプを使用して、30 mL/分の割合で60 mL/分の割合で滅菌生理食塩水の60 mLで左心室をパーフィンスし、60 mLのホルマリン(10%ホルムアルデヒド)の割合で30 mL/分の速度でペルフューズ。
- 死体を切り取り、はさみ、鉗子、ロンゲール、へらを使って頭蓋骨から脳を取り除きます。各脳の背面、腹部、横側の高解像度の写真を撮ります。少なくとも48時間のホルマリンで脳を後修正します。
12. Ex Vivo脳測定
- ホルマリンから脳を取り出し(ステップ11.3)、ペーパータオルの上に置いて余分な液体を吸収します。
- 電子キャリパーを使用して、脳の後ろおよび腹部の側面にキャリパーの先端を置くことによって、脳の高さを測定する。嗅球と後頭葉の最も後部境界にキャリパーの先端を置くことによって、脳の長さを測定します。側頭葉の最も横の部分にキャリパーの先端を置くことによって、脳の幅を測定します。脳の重さを量る。
- 縦裂(前十四方および後部)、横スルチ、スプラシルビアンスルチ、コロナスルチ、プソイドシルベルンスルチ、アンシン酸スルチ、クルシアテスルチ、プレシルビアンスルチ、ラテシルジャイリ、スプラシルビエンギリ、シグモイドキシ(前脛骨前部および後部)、コロナジャイリ、エクトシルビエンギリ(前部および後部)、および軌道ジャイリ。対応するスルカスの最も明確な部分の最初と最後からすべてのスルシを測定します。各対応する回の最も広い側面からすべてのジャイリを測定します。
- 長手裂の最も後部点にキャリパーの片方の先端を置き、小脳の最も後部にキャリパーのもう一方の先端を置くことによって露出する小脳の量を測定する。
注:フェレット脳アトラスは、フェレット14の生物学および疾患に見られるように、ex vivoフェレット脳測定値を開発するために使用された。
13. 重傷の得点
- ステップ11.3.で撮影した写真を使用して、ステップ13.2~13.4の採点基準を適用して、暴露(または治療)群に目がくらんだままの重度の脳損傷(0~9スケール)を評価します。
- 縦裂を評価する。正常と表示される場合は、スコア 0 を割り当てます。穏やかに広がっているが(通常幅は約2倍)、裂け目の長さに沿って幅の増加が不完全である場合は、スコア1を割り当てます。中程度に広がっている場合(約 2 ~ 3 倍正規)、スコア 2 を割り当てます。目立つように広がった場合は、裂け目の長さの大部分に沿って、表示可能なギャップ >3x 法線幅を持つ場合は、スコア 3 を適用します。
- 側面スルチを評価します。彼らは、横のジャイリとスプラシルシルビアンジャイリの分離で、通常の定義を示している場合は、0のスコアを割り当てます。軽度の一方的または両側的な溝の減少定義が見られる場合、特に後頭葉に対する前頭葉と側頭葉の狭窄を最小限に抑えて、後頭葉のスコアを1に割り当てる。
- スルシの定義が適度に減少することが見られる場合は、上シルビアン・ギリのうつ病、コロナおよびエクトシルビアン・ギリの狭窄、および後頭葉に対する前頭葉および側頭葉の軽度の狭窄を伴い、スコア2を割り当てる。片側嚢胞性変性が見られる場合は、対国間半球の変化を最小限に抑えて、スコア3を割り当てる。側側スルシの定義が不十分な場合は、後頭葉および側頭葉の両側嚢胞または重度の変性を有する、スコア4を割り当てる。
- 小脳の目に見える部分を評価します。正常に表示される場合 (頂点の 75% と半球の <66% が表示されている場合) には、スコア 0 を割り当てます。頂点の 75 ~ 90% と半球の ≥66% が表示されている場合は、スコア 1 を割り当てます。小脳の大部分が見える場合は、すべての頂点と半球の≥66%を示し、スコア2を割り当てます。
14. データ分析
- 反射テスト データの場合は、故障のスコアを 61 s に割り当てて、時間の終わりに成功 (60 s) と比較できますが、統計分析ではランキングが悪くなります。各反射テストで、時間の経過につれた各動物の曲線の下の面積を計算します。
- 動物の重量によって圧力の足のサイズを含むキャットウォークデータを調整します。
- 非パラメトリック統計法を使用してデータを分析し、中央値と四分位範囲 (IQR) を使用してデータを記述します。
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Representative Results
34匹(n=18オス、n=16雌)のうち6匹のゴミから、負傷した群の8匹の動物(24%n=4オス、n=4雌)が第2低酸素期(n=5)、温度管理中(n=2)、または侮辱後の一晩(n=1)の間に死亡した。負傷したグループでは、生存者26人中9人(35%)目に見える重傷を負った。5匹の動物(n=5オス)は中等度の傷害を有し、4匹の動物(n=2オス、n=2雌)がそれぞれ2〜5および6-9の重病理スコアとして定義される重傷を有した(図2A)。したがって、侮辱にさらされた動物は、死亡または重大な重傷の50%のリスクを有する。傷害の増加に伴い、側頭葉および/または後頭葉におけるジャイリの狭窄が見られ、関連するスルカル短縮、縦裂の拡大、および最も重傷を負った動物における嚢胞組織喪失の領域の広がりが見られる(図2B)。生き残った負傷した動物(n=26;n=14オス、n=12メス)において、小脳の有意に大きな暴露が見られる(図3A)、ならびに縦裂の短縮(図3D)。また、コロナおよび前方エクトシルビエンギリ(図3B,E)の有意な狭窄、ならびに横および上シルビアンスルシの短縮(図3C,F)も存在する。脳体重の中央値は、対照動物では8.1g(7.9~9.7g、n=6)、負傷した動物では7.0g(6.5~7.7g)であった(n=26、p=0.005)。対照動物では、負傷した動物の27.5mm(25.5~38.0mm、n=26)に対し、脳長の中央値(IQR)は28.9mm(27.8~29.6mm、n=6)であった。同様のパターンは脳全体で見られ、傷ついた動物では中央値の幅と身長が5~7%小さくなる。左側と右側の両方の解剖学的構造は、半球間の違いのない、同様の方法で影響を受けます。解剖学的位置の描写については、図 1Bを参照してください。反射検査期間中(P21-P39)、負傷した動物は負のジオタキシスタスク(図4A)で回転する時間が遅く、崖の反転タスク(図4B)でエッジから離れて回転する時間が遅く、右に時間が遅い(図4C)。キャットウォークでは、負傷した動物の平均速度はコントロールと同様です(図5A)が、各走行中の速度変動の度合いが大幅に高くなります(図5B)。前足と後足の間の重量調整距離(印刷位置)は、傷ついた動物(図5C)で有意に大きく、フォアポーを通してユニットの足面積あたりの圧力が少ない(図5D)。オープンフィールドでは、負傷した動物は全距離を少なくカバーし(図6A)、より頻繁に停止します(図6B)。フィールドの中央で時間を大幅に増やし、コーナーでの時間を減らします (図 6C,D)。コントロールおよび負傷した動物の代表的なヒートマップを図7A,Bに示す。
図1: タイムラインP17では、動物は、両側頸動脈結節を受ける前に3mg/kg LPSを投与し、低酸素(9%酸素)、高酸素症(酸素80%)および低酸素症(9%)の各30分(チャンバーが平衡化するまでの時間を含まない)を投与する。その後、右頸動脈ライゲーションが逆転する。動物は、傷害後の期間に巣の中で自発的に低体温にならないように、ノルム他血症の6時間にさらされる。反射検査は、P21-P28から毎日、そしてP28-P42から週3回行われます。P42では、動物は犠牲の前にキャットウォークとオープンフィールドでテストされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 代表的な傷害分布と描写. (A) 負傷したグループの生存者26人(n=14人の男性、n =12人の女性)からの重傷のスコアは、6つのゴミメイトコントロールと比較した。5匹の動物(n=5オス)は中等度の傷害を有し、4匹の動物(n=2オス、n=2雌)はそれぞれ2~5および6-9の重病理スコアとして定義される重傷を有した。グラフは、四分位範囲の中央値を示しています。(B)コントロール脳(左パネル、スコア0)は、脳が左から右に9の合計可能なスコアのうち2、5、および8の総傷害スコアを増加させるを描写しています。コントロール脳は、特に傷害の影響を受けやすい解剖学的構造を示す;1 = 縦方向裂け目、2 = 側面溝、3 = 双シルシルビアン溝、a = コロナギュルス、b = 前景エクトシルビエン回。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:代表的な脳測定対照(n=6)と比較して、傷ついた動物(n=26)は、小脳の曝露が有意に増加し(A)、縦裂(D)の短縮、コロナ(B)および前方エクトシルビエン(E)ギリの狭窄、および横方向(C)およびスプラシルビエン(F)スルシの短縮を示す。グラフは、四分位範囲の中央値を示します。*p< 0.05(ウィルコクソン・マン・ホイットニーU検定)を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: 代表的な反射開発コントロール(n =6)と比較して、負傷した動物(n =26)は、負のジオタキシス(A)、崖の反転(B)、および右反射(C)の発達が遅い(曲線下の領域、AUC)を表示する。グラフは、四分位範囲の中央値を示します。*p< 0.05(ウィルコクソン・マン・ホイットニーU検定)を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 代表的なキャットウォーク結果対照(n=6)と比較して、負傷した動物(n=26)は同様の平均ペース(A)で歩くが、歩行中の速度の変動が大きい(B)。負傷した動物はまた、単位面積(D)あたりの圧力が少ない、より長い平均印刷位置(C)を表示します。グラフは、四分位範囲の中央値を示します。*p < 0.05(ウィルコクソン・マン・ホイットニーU検定)を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 代表的なオープン フィールドの動作コントロール(n =6)と比較して、傷ついた動物(n =26)は、より小さな総距離(A)をカバーするだけでなく、より頻繁に停止します(B)。負傷した動物はまた、角(D)よりも中心(C)でより多くの時間を過ごす。グラフは、四分位範囲の中央値を示します。*p< 0.05(ウィルコクソン・マン・ホイットニーU検定)を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: 代表的なオープンフィールドヒートマップ。 負傷した動物は、オープンフィールド内のかなり小さな距離をカバーしています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
フェレット脳と人間の脳の間で共有される物理的および発達的な類似点のために、フェレットは、成人と発達脳損傷の両方をモデル化するためにますます使用されています。8、9、10、11、12。しかしながら、これまでの研究は、フェレット脳が初期傷害に対して耐性を有し、高プラスチック性であり、目に見える病理学的傷害10、12の設定においても、時間の経過とともに行動の欠陥が減少することを示唆している。ここでは、後期早期等価フェレットにおける炎症感作性低酸素虚血(HI)脳損傷の第1モデルを説明し、これは生存者における重大な二国間傷害および持続的な行動障害をもたらす。他の前臨床モデルと同様に、目標は、早産児が遭遇した暴露を臨床的に正確に再現するのではなく、早期脳損傷に関与すると考えられる機械的要因の合流性を提供することである。これらには、炎症、低酸素症、および酸化ストレス7が含まれる。
私たちのフェレットモデルにおけるLPS投与の重要な側面の1つは、低酸素症の前に約4時間与えられた単一の高用量である。近期同等のげっ歯類におけるLPS暴露は、低酸素虚血に対する脳の感作に対応する暴露後4時間付近の循環炎症性サイトカインピークをもたらし、脳損傷15、16、17の有意な増加をもたらす。炎症性サイトカイン放出の同様の経時経過(LPS曝露後のピークTNF-αおよびIL-6放出2〜4時間)は、単離されたフェレット末梢血単核細胞18において見られる。単一の外科的セットアップを想定して、手術開始前にLPS 30〜60分を投与すると、12〜15の両側頸動脈結節を行い、LPS投与後4時間後に最初の低酸素暴露を開始するのに十分な時間を与える。モデル開発中、P10傷害モデル12に記載されているように、5mg/kgのLPS用量が最初に使用されました。しかしながら、このLPS用量は、壊死に対する有意な低酸素内死亡率および肺水腫と関連していた。死亡率と肺水腫の両方がLPS用量を3mg/kgに減少させることによって減少した。
低酸素暴露の間、多くの要因が重大な重篤な傷害を確保する一方で、高レベルの死亡率を防ぐために重要であるように見える。実験室のフェレットが出上がっているため、ゴミの間に低酸素耐性に固有のばらつきがあります。私たちの経験では、動物を交渡したり、同じ低酸素室で異なるごみから動物を組み合わせたりすると、主に最も影響を受けやすいごみから大きな動物や動物が早く死にます。標的30分低酸素暴露と低酸素症が早期に停止する前に、より感受性の高い動物が死亡した場合、影響を受けにくいごみからの小さな動物は最適でない低酸素暴露を受け、重大な傷害を持続する可能性は低い。その結果、動物の各ごみは、独自の別々の部屋内で低酸素症にさらされるべきです。第2の低酸素症期間は、前に12を説明した反復モデル開発プロセスの一部として追加されました。単一の低酸素症期間は、長さに関係なく、有意な傷害を伴わず死亡または生存をもたらした。
フェレットは、重大な脳損傷を示すことなく、急性低酸素症または両側頸動脈結膜の長期間を許容することができるので、私たちの現在の仮説は、高酸素症の期間は、促進する高い代謝と血管拡張をもたらすということです第2低酸素期の脳虚血。モデルの変動性を最小限に抑えるために、P15の施設に到着した8フェレットの整済みのセックスバランスのごみを使用しました。各ごみでは、6〜7匹の動物が手術を受け、その後1つの部屋内で低酸素症が続いた。
低酸素症と右頸動脈結節の逆転後、動物は長期の傷害プロトコルからの脱水および低血糖のリスクのために一定期間ジルに戻す必要がある。温度管理期間中に有意な死亡率が経験された場合、動物は6時間水浴に入れる前に、追加の流体蘇生法(皮下生理食残存線および/または式および/または手で給餌)を必要とする可能性があります。しかし、動物が巣の相対的な低体温症から神経保護を経験する可能性があるため、温度管理期間は長期的な傷害の重要な決定要因である。低体温症のこのリスクは、少なくとも部分的にフェレットに必要な住宅条件の低温に起因する(60〜70°F)。
記載された行動テストは主に実験室内で開発され、以前に開発中のフェレット19で説明した反射試験のいくつかの基礎を持ち、若年フェレットで使用される成人げっ歯類から適応したキャットウォークとオープンフィールドテストを行った。他のグループはまた、外傷性脳損傷10後の成人フェレットにおけるオープンフィールド、迷路および歩行検査、ならびに成人フェレット20における社会的相互作用に対する子宮内炎症の影響について説明している。断食期間が短いため、フェレットでは断食期間が長く推奨されませんが、検査の前に尿や便を通過させるために、30~60分間動物のキャリアに入れることが有益です。フェレットは本質的に好奇心旺盛な動物であるため、これらの行動テストではげっ歯類とは逆の振る舞いをすることが多い。これは特にキャットウォークで明らかであり、ライトと音、特に別のフェレット発声の録音(「ドゥーキング」)は、フェレットが前方に歩く動機付けに使用することができます。
現在のプロトコルにはいくつかの制限があります。P10フェレット12で以前に開発された方法を用いて繰り分け開発されたもので、現在、LPS、低酸素症、過酸素症、および傷害の最終程度への再灌流の相対的な寄与は分かっていない。しかし、フェレット21に元のヴァンヌッチモデル(片側頸動脈結節とそれに続く低酸素症の単一期間)を用いて本明細書に記載された方法の開発は、重大な傷害をもたらさなかったことは注目に値する。したがって、傷害プロトコルの複数の部分間の相互作用は、持続的な傷害のために必要である可能性が高い。それにもかかわらず、生存動物の大傷害には明確な変動が残っており、これは別の潜在的な制限である。重大な重傷を負わずに重症傷害を受けた動物は、MRIまたは組織病理学12を用いて検出可能な傷害を有する可能性があるが、モデルの将来の作業には、例えば永久的な両側頸動脈結節を使用して、重大な傷害を持続する動物の数を増やそうとする反復が含まれる。最後に、このモデルが発達性脳損傷に対する局所的神経保護療法を試験するのに最大限有用でありるためには、ヒト新生児におけるHI脳損傷の治療のために確立された、または新生児脳損傷の他の動物モデルの範囲で成功している神経保護剤の有効性を評価することによって検証されるべきである。したがって、今後の研究は、性ベースの治療応答およびex vivo MRI12を含む、このモデルにおける治療用低体温およびエリスロポエチンの有効性を評価する。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
モデルの開発は、ビルとメリンダゲイツ財団だけでなく、NIH助成金5R21NS093154-02(NICHD)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
