Summary
El método describe la lesión cerebral hipoxic-isquémica e hiperoxica con sensibilidad a la inflamación-sensificada e hiperoxica en el hurón P17 para modelar la interacción compleja entre la inflamación prolongada y la lesión cerebral oxidativa experimentada en una serie de bebés prematuros tardíos.
Abstract
Existe una necesidad continua de modelos clínicamente relevantes de infección perinatal e hipoxia-isquemia (HI) en los que probar intervenciones terapéuticas para lactantes con la secuencia neurológica de prematuridad. Los hurones son candidatos ideales para modelar el cerebro humano prematuro, ya que nacen lissencéfalos y desarrollan cerebros gyrencéfalos postnatalmente. Al nacer, el desarrollo cerebral del hurón es similar a un feto humano de 13 semanas, con 17 kits del día postnatal (P) considerados equivalentes a un bebé a las 32-36 semanas de gestación. Describimos un modelo de lesión en el hurón P17, donde la administración de lipopolisacáridos es seguida por isquemia cerebral bilateral, hipoxia e hiperoxia. Esto simula la interacción compleja de inflamación prolongada, isquemia, hipoxia, y estrés oxidativo experimentado en un número de neonatos que desarrollan lesión cerebral. Los animales lesionados muestran una serie de gravedad grave de lesiones, con cambios morfológicos en el cerebro incluyendo el estrechamiento de múltiples gyri corticales y sulci asociados. Los animales lesionados también muestran un desarrollo reflejo lento, una velocidad de locomoción más lenta y variable en una pasarela automatizada, y una disminución de la exploración en un campo abierto. Este modelo proporciona una plataforma en la que probar terapias putativas para lactantes con encefalopatía neonatal asociada con inflamación e HI, estudiar mecanismos de lesión que afectan el desarrollo cortical e investigar vías que proporcionan resiliencia en animales no afectados.
Introduction
Existe una necesidad constante de modelos animales grandes que reflejen la fisiopatología de la prematuridad y la hipoxia-isquemia perinatal en las que se puedan probar intervenciones terapéuticas para lactantes. En 2017, el 9,93% de los 382.726 bebés nacidos en los Estados Unidos nacieron prematuros, y el 84% de estos bebés nacieron entre 32 y 36 semanas de gestación1. En los bebés prematuros, la exposición perinatal a la infección o inflamación es común, donde la activación inmune materna debido a patógenos virales o bacterianos puede iniciar el trabajo de parto prematuro. Postnatalmente, los bebés prematuros corren un alto riesgo de padecer sepsis2de inicio temprano o tarde. Los bebés prematuros también experimentan con frecuencia períodos de hipoxia, hipotensión e hiperoxia debido a su sistema cardiorrespiratorio inmaduro, elevada tensión de oxígeno en la atmósfera en relación con las experimentadas en el útero, y exposiciones iatrogénicas. Además, en los bebés prematuros, las defensas antioxidantes son inmaduras3 y los factores pro-apoptóticos son naturalmente regulados4. El estrés oxidativo y la muerte celular conducen a la activación del sistema inmunológico y la neuroinflamación. Se cree que estos factores combinados contribuyen a la vulnerabilidad del cerebro en el desarrollo y fisiológica, y dan lugar o exacerban la encefalopatía asociada con resultados de desarrollo deficientes en los bebés prematuros5,6,7.
Debido a las similitudes físicas y de desarrollo que el cerebro hurón comparte con el cerebro humano, el hurón es una especie atractiva en la que modelar lesión cerebral8,9,10,11,12. Los hurones también son candidatos ideales para modelar el cerebro humano prematuro, ya que nacen lissencéfalos y desarrollan cerebros gyrencéfalos postnatalmente, lo que proporciona una ventana en la que exponer el cerebro en desarrollo a insultos que imitan a los experimentados por los bebés nacidos prematuros. Al nacer, el desarrollo cerebral del hurón es similar a un feto humano de 13 semanas, con 17 kits del día postnatal (P) considerados equivalentes a un bebé a las 32–36 semanas de gestación13.
Nuestro grupo ha publicado recientemente un modelo de lesión cerebral extremadamente prematura (<28 semanas) en el hurón P10 combinando sensibilización inflamatoria con Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) con posterior exposición a la hipoxia y la hiperoxia12. En el siguiente protocolo, ahora describimos un modelo prematuro tardío en el hurón P17, donde la sensibilización lpS es seguida por isquemia cerebral bilateral, hipoxia e hiperoxia. Esto resulta en lesiones más graves en un subconjunto de animales, y más de cerca modela la interacción compleja de inflamación prolongada, isquemia, hipoxia, y estrés oxidativo experimentado en un número de bebés prematuros que desarrollan lesión cerebral.
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Protocol
Los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y como parte de un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.
1. Preparación y Administración de LPS
NOTA: Refiera a la figura 1 para una línea de tiempo de los procedimientos.
- Antes de iniciar el procedimiento, sellar, esterilizar y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y cortinas quirúrgicas. Preparar medicamentos preoperatorios en viales estériles. Calcule el caudal necesario para reemplazar el aire en la cámara de hipoxia/hiperoxia con el gas experimental en 8-10 min.
- Preparar el lipopolisacárido (LPS de E. coli 055:B5) en solución salina estéril para producir una concentración de 1 mg/ml. Retire los kits de hurón P17 de sus jills. Pesar y numerarlos. Aleatorizar animales por basura y sexo a los grupos de control o lesionados (o tratamiento).
- Utilizando una jeringa de insulina de 300 l, administre 3 mg/kg de LPS por vía intraperitoneal a kits del grupo de lesiones, y un volumen equivalente de vehículo salino estéril (3 l/g) para controlar a los animales.
- Colocar animales en una cámara dentro de un baño de agua a 37-40 oC para mantener una temperatura rectal objetivo de 36-37 oC durante los procedimientos quirúrgicos.
2. Anestesia
- Durante el procedimiento, controle continuamente la temperatura, la frecuencia de respiración y la frecuencia cardíaca del animal.
- Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea 30 min antes del procedimiento quirúrgico. Inducir la anestesia en una mezcla de 3% de isoflurano equilibrado con 100% de oxígeno. Retire el kit de la cámara de inducción y colóquelo de forma supina en una manta de agua quirúrgica cubierta a 37 oC. Transfiera la anestesia al cono nasal y reduzca el nivel de isoflurano a 2-3%.
3. Preparación quirúrgica
- Usando pequeños cortapapeles de animales, retire todo el cabello de la región del cuello ventral. Afeitarse en un patrón rectangular con cuidado para evitar que se ablase la piel o genere erupción cutánea. Administrar anestesia local en la zona arasda utilizando lidocaína intradérmica (4 mg/kg) y bupivacaína (2,5 mg/kg).
- Preparar el cuello mediante la aplicación alterna de povidona-yodo y 70% exfoliante de etanol con hisopos de algodón estériles. Repite el exfoliante de forma que la povidona-yodo y el 70% de etanol se apliquen 3 veces de manera alterna.
- Confirme la profundidad de la anestesia mediante la ausencia de reflejo de pellizco de los dedos de los dedos. Mantener el nivel de isoflurano en el porcentaje mínimo requerido para un plano quirúrgico de anestesia. Usando cortinas recortadas desechables estériles que exponen la región del cuello, cubran al animal.
4. Ligación Bilateral de la Arteria Carótida
- Con una hoja de bisturí de #11 de un solo uso, haga una incisión de línea media de 1,5 cm en el centro del cuello. Usando hemostats finos y fórceps curvos, disecciona sin rodeos hasta la arteria carótida izquierda. Diseccionar la arteria lejos del haz neurovascular asociado.
- Usando un par de fórceps finos curvos, pasa una longitud de 10 cm en bucle de sutura de seda estéril 5-0 debajo de la arteria. Corta la sutura por la mitad. Ligar la arteria mediante la atar de forma segura ambas longitudes de sutura, dejando al menos 2 mm entre los nudos. Transecte la arteria carótida izquierda entre las suturas, teniendo cuidado de dejar el nervio intacto.
- Repita la disección en el lado derecho. Ligar reversiblemente la arteria carótida derecha con una sola corbata umbilical estéril de 1/8 pulgadas. Cierre la herida con clips quirúrgicos de la piel.
- Deje que el animal se recupere en un baño de agua con temperatura controlada durante al menos 30 minutos antes de la hipoxia.
NOTA: Si las arterias no están completamente aisladas del resto del haz neurovascular, se puede ver un aumento de la mortalidad antes o durante la hipoxia posterior.
5. Hipoxia secuencial, hiperoxia e hipoxia
- Durante la hipoxia y la hiperoxia, altere la temperatura del baño de agua según sea necesario para mantener la temperatura rectal durante la hipoxia a 37 oC en los animales centinelas.
- Coloque a los animales en el grupo de lesiones en una cámara hermética dentro de un baño de agua. Controle continuamente la concentración de oxígeno dentro de la cámara, así como la temperatura rectal en al menos un animal centinela. Lavar la cámara con un 9% de oxígeno humidificado (91% de nitrógeno) y mantener un caudal de 3-5 L/min, dependiendo del tamaño de la cámara. Una vez que la concentración de oxígeno en la cámara ha alcanzado el 9%, continuar durante 30 minutos.
- Después de 30 minutos, cambie el suministro de gas al 80% de oxígeno humidificado (20% de nitrógeno) y permita que la cámara alcance la concentración objetivo en función del caudal y el tamaño de la cámara. Continúe durante 30 min de hiperoxia. Abra la cámara para permitir que llegue más rápidamente a normoxia equilibrando con el aire de la habitación.
- Sellar la cámara y lavar con un 9% de oxígeno humidificado. Monitoree continuamente todos los animales visualmente, tomando nota de los animales que muestran bradipnea. Una vez que la concentración de oxígeno en la cámara ha alcanzado el 9%, continuar durante 30 minutos. Si se observa mortalidad intrahipóxica (paro respiratorio) en cualquiera de los animales antes del final del período de 30 minutos, termine la hipoxia inmediatamente.
6. Reversión de la ligadura de la arteria carótida derecha
- Devolver animales a la zona quirúrgica, e inducir anestesia en una mezcla de 3% de isoflurano equilibrado con 100% de oxígeno. Transfiera la anestesia al cono nasal y reduzca el nivel de isoflurano a 2-3%. Retire los clips quirúrgicos de la herida y vuelva a preparar el área de la herida con povidona-yodo. Confirme la profundidad de la anestesia mediante la ausencia de reflejo de pellizco de los dedos de los dedos. Mantener el nivel de isoflurano en el porcentaje mínimo requerido para un plano quirúrgico de anestesia. Usando cortinas recortadas desechables estériles que exponen la región del cuello, cubran al animal.
- Con fórceps curvos, identifique y desate la cinta umbilical de la arteria carótida derecha. Cierre la herida con clips quirúrgicos de la piel.
7. Recuperación y gestión de la temperatura
- Devolver todos los kits a sus jills durante 60 minutos, para la lactancia y la recuperación. Después de 60 minutos, devolver a los animales heridos a los baños de agua a 37-40 oC durante 6 h, ajustando la temperatura del agua según sea necesario para mantener la temperatura rectal a 36-37 oC. Devolverles los kits a sus jills.
- Retire los clips quirúrgicos de 10 a 14 días después de la cirugía (P27–P31).
8. Pruebas de reflejos
- Realice todas las pruebas de reflejos diariamente a partir de P21–P28, y al menos 3 veces por semana desde P28–P42, sin dejar de estar ciego al grupo de exposición (o tratamiento). Antes de realizar pruebas de reflejos, coloque los kits en una cámara con asistencia térmica (baño de agua de 37 oC, almohadilla de calor, etc.) durante 1 h. Para cada prueba, complete todas las pruebas por kit antes de probar el siguiente kit.
- Geotaxis negativos (25o)
- Coloque una placa plana (16 1/2 pulg. x 12 pulg.) envuelta en un protector absorbente de sobremesa contra un objeto para que la placa forme un ángulo de 25o con la mesa. Coloque un kit en el tablero propenso y mirando hacia abajo, aproximadamente el 75% del camino hacia arriba del tablero.
- Asegúrese de que el cuerpo del kit esté recto y de que tenga las cuatro patas agarradas contra el tablero antes de soltarlo. Tan pronto como se coloque el kit, comience la evaluación de la hora.
- Registre el tiempo en el que el kit logra girar su cuerpo 90o en relación con su posición inicial. Registre el tiempo a la que el kit gira su cuerpo 180o y da un paso completo hacia la parte superior de la placa. Realice 3 ensayos en la inclinación de 25o antes de pasar a la siguiente prueba.
- Geotaxis negativos (45o)
- Realice 3 pruebas de la prueba de geotaxis negativa descrita anteriormente de nuevo, esta vez con la placa establecida en un ángulo de 45o.
- Aversión de Cliff
- Coloque una plataforma acolchada alrededor de 1 pie por debajo de la repisa para minimizar las lesiones en los kits si caen.
- Coloque un kit orientado y perpendicular al borde del banco de laboratorio. Asegúrese de que el cuerpo del kit esté recto, con sus patas delanteras al ras con el borde. Comience la evaluación de la hora desde el momento en que se coloca el kit. Tenga cuidado de diferenciar entre el movimiento consciente lejos del acantilado y otros movimientos espontáneos que no implican caminar coordinado.
- Registre el momento en que el kit aleja su cuerpo del borde (definido como el kit hacia arriba, girando su cuerpo o moviendo sus extremidades delanteras lejos del borde). Registre el tiempo que el kit completa su primer paso en la dirección opuesta de la arista (definida como cualquier dirección o ángulo más allá de una rotación de 90o desde su posición inicial frente al borde).
- Realice 3 pruebas de aversión a acantilados por kit antes de pasar a la siguiente prueba.
- Reflejo de derecha
- Coloque un kit supino en el banco, manteniéndolo suavemente en esa posición antes de soltarlo y al mismo tiempo iniciar el cronómetro. Registre el tiempo que el kit se detiene con las cuatro patas al mismo tiempo planas contra el banco en posiciones de soporte de peso. Registre el tiempo en el que el kit da un paso completo en cualquier dirección (definida como la colocación de las cuatro patas para lograr el progreso en una dirección dada sin girar o arrastrar el cuerpo).
- Realizar 5 pruebas de la prueba de reflejo de enderedo por animal.
- Después de que cada kit haya completado las 5 pruebas de reflejo sorteo, devuelva la camada a la jill.
9. Pruebas de pasarela
- En P42, retire los kits de la jill. Coloque los kits en jaulas de plástico aproximadamente 10 minutos antes de la prueba, para que puedan aclimatarse al medio ambiente. Apague las luces en la sala de pruebas para garantizar que la luz ambiental no afecte a la función de la pasarela.
- Cree un nuevo experimento en el software correspondiente. Ajuste los ajustes experimentales para que la duración máxima de la ejecución no supere los 10,00 s y la duración mínima de la ejecución no sea inferior a 1,50 s. Establezca la variación de velocidad máxima para que no supere el 60%. Establezca un requisito mínimo de tres corridas compatibles para cada animal.
- Ajuste la anchura de la pasarela en relación con el tamaño del animal para que pueda sobredecirlo libremente sin tocar las paredes mientras permanece lo suficientemente estrecho como para desalentar el giro. Agregue una nueva configuración de detección en la pestaña Perfiles de configuración de detección mediante detección automática. Utilice los mismos ajustes de detección para todas las camadas y animales a una edad determinada.
- Limpie a fondo la pasarela con un tejido de papel con poca pelusa y un 70% de etanol antes y después de cada animal. Limpie las patas del hurón regularmente para mejorar la precisión de la detección y clasificación. Una vez que la pasarela y el animal estén preparados, comience la adquisición del ensayo.
- Pausa la adquisición para limpiar la pasarela si se acumulan huellas en el vaso, o si los animales pasan orina o heces. Detenga la adquisición una vez que el software de pasarela haya reconocido tres ejecuciones compatibles en función de la configuración predeterminada del experimento.
10. Pruebas de campo abierto (P42)
- Utilice una caja de acrílico no porosa (55 cm x 55 cm x 40 cm de alto) pintada de blanco mate. Coloque la cámara de modo que esté centrada directamente encima de la caja y se capturen las cuatro paredes. Limpie la arena de ensayo con 70% de etanol antes del primer uso y entre animales.
- En el software correspondiente, seleccione Nuevo de plantilla y Aplicar una plantilla predefinida. Continúe el procedimiento de configuración seleccionando secuencialmente Tipo de sujeto:Otro; Plantilla de arena:Campo abierto, cuadrado; Plantilla de zona:Centro, borde, esquinas; Características a rastrear: Punto central.
- Abre Arena Settings y toma la imagen de fondo de la entrada de la cámara, asegurándote de que las paredes superiores de la arena estén visibles. Calibrar las dimensiones de la arena utilizando la herramienta de escala.
- Ajuste las zonas de arena predefinidas cambiando el tamaño de los contornos para que se ajusten a las zonas de pared (NW, NE, SW, SE) y las zonas de suelo (parte superior izquierda, parte superior media, superior derecha, centro izquierdo, centro, centro derecho, inferior izquierdo, parte inferior media, inferior derecha). Valide la configuración para confirmar que no hay zonas superpuestas.
- Abra la ventana Adquisición y pulse Iniciar adquisición. Coloque el hurón en el centro de la arena de pruebas orientado de tal manera que sea consistente para cada sujeto de prueba. Permita que el hurón se mueva libremente por toda la arena durante un período de 5 min. Al final del período de prueba, pulse Detener adquisición. Repita el procedimiento con el siguiente hurón.
NOTA: Todos los experimentadores de la sala deben posicionarse para ser inobservables por el hurón y permanecer en silencio durante el período de prueba.
11. Fijación-perfusión
- En P42, anestetiza profundamente los kits con 5% de isoflurano. Administrar una sobredosis de pentobarbital (120–150 mg/kg i.p.). Asegurar la anestesia profunda por falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del día y pérdida de los movimientos respiratorios.
- Transfiera al animal a una capucha de humo. Abra el tórax y sujete la aorta descendente usando hemostats finos. Corta la aurícula derecha. Usando una bomba de perfusión, perfundir el ventrículo izquierdo con 60 ml de solución salina estéril a una velocidad de 30 ml/min. Perfuse con 60 ml de formalina (10% formaldehído) a una velocidad de 30 ml/min.
- Decapita el cadáver y retira el cerebro del cráneo usando tijeras, fórceps, rongeurs y una espátula. Tome fotografías de alta resolución de los aspectos dorsales, ventrales y laterales de cada cerebro. Post-arreglar el cerebro en forcina durante al menos 48 h.
12. Medición cerebral Ex Vivo
- Retire el cerebro de la formalina (paso 11.3) y colóquelo sobre una toalla de papel para absorber el exceso de líquido.
- Usando una pinza electrónica, mide la altura del cerebro colocando las puntas de la pinza en los aspectos dorsales y ventrales del cerebro. Mida la longitud del cerebro colocando las puntas de la pinza en la bombilla olfativa y el borde más posterior del lóbulo occipital. Mida el ancho del cerebro colocando las puntas de la pinza en las partes más laterales de los lóbulos temporales. Pesa el cerebro.
- Medir la fisura longitudinal (anterior y posterior al sulcus cruciato), sulci lateral, suprasylvian sulci, coronal sulci, pseudosylvian sulci, ansinate sulci, cruciate sulci, presylvian sulci, gyri lateral, suprasylvian gyri, sigmoide gyri ( anterior y posterior), gyri coronal, ectosilvan gyri (anterior y posterior), y gyri orbital. Mida todos los sulci desde el principio y el final de la porción más distinta del sulcus correspondiente. Mida todos los gyri desde el aspecto más amplio de cada gyrus correspondiente.
- Mida la cantidad de cerebelo expuesta colocando una punta de la pinza en el punto más posterior de la fisura longitudinal y colocando la otra punta de la pinza en la parte más posterior del cerebelo.
NOTA: El atlas cerebral hurón, como se encuentra en Biología y Enfermedades del Hurón14,se utilizó para desarrollar las mediciones cerebrales ex vivo hurón.
13. Puntuación de lesiones brutas
- Usando las fotografías tomadas en el paso 11.3., aplique los criterios de puntuación en los pasos 13.2–13.4 para evaluar la lesión cerebral grave (escala 0-9) mientras permanece cegado a los grupos de exposición (o tratamiento).
- Evalúe la fisura longitudinal. Si parece normal, asigne una puntuación de 0. Si se ensancha ligeramente (aproximadamente 2x ancho normal), pero el aumento de ancho es incompleto a lo largo de la longitud de la fisura, asigne una puntuación de 1. Si se ensancha moderadamente (aproximadamente 2-3x normal), asigne una puntuación de 2. Si se ensancha notablemente, con un espacio visible >3x de anchura normal a lo largo de la mayor parte de la longitud de la fisura, aplique una puntuación de 3.
- Evalúe el sulci lateral. Si muestran una definición normal, con la separación del gyri lateral y el gyri suprasylvian, asigne una puntuación de 0. Si se ve una definición leve unilateral o bilateral reducida de sulcus, particularmente en la porción caudal, con un estrechamiento mínimo de los lóbulos frontales y temporales en relación con los lóbulos occipitales, asigne una puntuación de 1.
- Si se ve una definición moderadamente reducida de los sulci, con depresión del gyri suprasilvano, estrechamiento del gyri coronal y ectosilvano, y estrechamiento leve de los lóbulos frontales y temporales en relación con los lóbulos occipitales, asigne una puntuación de 2. Si se ve degeneración quística unilateral, con un cambio mínimo del hemisferio contralateral, asigne una puntuación de 3. Si hay una mala definición del sulci lateral, con degeneración quística bilateral o grave de los lóbulos occipital y temporal, asigne una puntuación de 4.
- Evaluar la parte visible del cerebelo. Si parece normal, con (<75% de los vermis y <66% de los hemisferios visibles, asigne una puntuación de 0. Si el 75–90% de los vermis y el 66% de los hemisferios son visibles, asigne una puntuación de 1. Si la mayor parte del cerebelo es visible, mostrando todos los vermis y el 66% de los hemisferios, asigne una puntuación de 2.
14. Análisis de datos
- Para los datos de pruebas de reflejos, asigne a los errores una puntuación de 61 s para permitir que se comparen con los éxitos al final de los tiempos (60 s), pero con una peor clasificación en el análisis estadístico. Calcular un área debajo de la curva para cada animal a lo largo del tiempo en cada una de las pruebas de reflejo.
- Ajuste los datos de la pasarela que implican el tamaño de la pata de la presión por el peso del animal.
- Analice los datos utilizando métodos estadísticos no paramétricos, describiendo los datos utilizando la mediana y el rango intercuartil (IQR).
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Representative Results
De 34 animales (no 18 machos, no 16 hembras) de seis camadas expuestas al insulto, ocho animales (24%; n 4 machos, no 4 hembras) en el grupo lesionado murieron durante el segundo período de hipoxia (n x 5), durante el manejo de la temperatura (n x 2), o durante la noche después del insulto (n x 1). En el grupo de lesionados, nueve de los 26 supervivientes (35%) tenía una lesión grave visible. Cinco animales (n 5 machos) tenían lesiones moderadas, y cuatro animales (n 2 machos, no 2 hembras) tenían lesiones graves, definidas como puntuaciones patopatologías brutas de 2-5 y 6-9, respectivamente(Figura 2A). Por lo tanto, los animales expuestos al insulto tienen un riesgo del 50% de muerte o lesiones graves significativas. Con el aumento de la lesión, se ve el estrechamiento del gyri en los lóbulos temporal y/o occipital, con acortamiento sulcal asociado, ensanchamiento de la fisura longitudinal y grandes áreas de pérdida de tejido quístico en los animales más gravemente heridos(Figura 2B). En los animales heridos supervivientes (n a 26; n a 14 machos, no 12 hembras), se ve una exposición significativamente mayor del cerebelo(Figura 3A),así como el acortamiento de la fisura longitudinal(Figura 3D). También hay un estrechamiento significativo del gyri de ectolavia coronal y anterior(Figura 3B,E),así como el acortamiento de los sulci laterales y suprasilvanos(Figura 3C,F). La mediana del peso cerebral (IQR) fue de 8,1 g (7,9–9,7 g, n a 6) en animales de control, y de 7,0 g (6,5-7,7 g) en animales lesionados (n a 26, p a 0,005). En los animales de control, la mediana de la longitud del cerebro (IQR) fue de 28,9 mm (27,8–29,6 mm, n a 6) en comparación con 27,5 mm (25,5–38,0 mm, n a 26) en los animales lesionados (p a 0,007). Patrones similares se ven en todo el cerebro, con ancho medio y altura 5–7% más pequeño en animales heridos. Las estructuras anatómicas tanto en el lado izquierdo como en el derecho se ven afectadas de manera similar, sin diferencia entre los hemisferios. Vea la Figura 1B para las representaciones de las ubicaciones anatómicas. Durante el período de prueba de reflejos (P21–P39), los animales heridos muestran un tiempo más lento para rotar en la tarea de geotaxis negativa(Figura 4A),tiempo más lento para girar lejos del borde en la tarea de aversión al acantilado(Figura 4B),y tiempo más lento a la derecha(Figura 4C). En la pasarela, los animales heridos tienen una velocidad media similar a los controles(Figura 5A),pero muestran un grado significativamente mayor de variación de velocidad durante cada carrera(Figura 5B). La distancia ajustada al peso entre las patas delanteras y las patas traseras (posición de impresión) es significativamente mayor en los animales heridos(Figura 5C),con menos presión ejercida por unidad de área de la pata a través de las patas delanteras(Figura 5D). En el campo abierto, los animales heridos cubren menos distancia total(Figura 6A) y se detienen con mayor frecuencia(Figura 6B). Pasan mucho más tiempo en el centro del campo, y menos tiempo en las esquinas(Figura 6C,D). En la Figura 7A,Bse muestran mapas de calor representativos de los animales de control y heridos.
Figura 1: Línea de tiempo. En P17, los animales se administran 3 mg/kg de LPS antes de someterse a la ligadura bilateral de la arteria carótida y 30 minutos cada uno (sin incluir el tiempo para que la cámara equilibre) de hipoxia (9% de oxígeno), hiperoxia (80% de oxígeno) e hipoxia (9%). La ligadura de la arteria carótida derecha se invierte. Los animales están expuestos a 6 h de normothermia para asegurarse de que no se vuelven espontáneamente hipotérmicos en el nido en el período después de la lesión. Las pruebas de reflexión se realizan diariamente desde P21–P28 y tres veces por semana desde P28–P42. En P42, los animales son probados en la pasarela y campo abierto antes del sacrificio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Distribución y representación representativas de lesiones. (A) Puntuación de lesiones brutas de 26 supervivientes (n a 14 hombres, no 12 hembras) en el grupo lesionado, en comparación con seis controles de compañero de camada. Cinco animales (5 machos) tenían lesiones moderadas, y cuatro animales (n 2 machos, no 2 hembras) tenían lesiones graves, definidas como puntuaciones patopatologías graves de 2-5 y 6-9, respectivamente. El gráfico muestra la mediana con el rango intercuartil. (B) Controlar el cerebro (panel izquierdo, puntuación 0), con cerebros que representan las crecientes puntuaciones de lesiones brutas de 2, 5 y 8 de una puntuación total posible de 9, de izquierda a derecha. El cerebro de control muestra estructuras anatómicas particularmente susceptibles a lesiones; 1 - fisura longitudinal, 2o sulcus lateral, 3o de sulcus suprasilvano, un gros coronal, b á giso ectolar anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones cerebrales representativas. En comparación con los controles (n a 6), los animales lesionados (n a 26) muestran una exposición significativamente mayor del cerebelo (A), el acortamiento de la fisura longitudinal (D), el estrechamiento de la corona (B) y la ectosilva anterior (E) gyri, y el acortamiento del lateral (C) y supralal (F) sulci. Los gráficos muestran la mediana con el rango intercuartil. *denota p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Desarrollo reflejo representativo. En comparación con los controles (n a 6), los animales lesionados (n a 26) muestran un desarrollo más lento (área bajo la curva, AUC) de geotaxis negativos (A), aversión a acantilados (B) y reflejo de derecha (C). Los gráficos muestran la mediana con el rango intercuartil. *denota p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de la pasarela. En comparación con los controles (n a 6), los animales heridos (n a 26) caminan a un ritmo medio similar(A),pero con una mayor variabilidad en la velocidad durante la marcha (B). Los animales lesionados también muestran una posición de impresión media más larga(C), con menos presión aplicada por unidad de área (D). Los gráficos muestran la mediana con el rango intercuartil. * denota p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Comportamiento representativo decampo abierto. En comparación con los controles (n a 6), los animales heridos (n a 26) cubren una distancia total menor(A),así como se detienen con mayor frecuencia (B). Los animales heridos también pasan más tiempo en el centro (C) que en las esquinas (D). Los gráficos muestran la mediana con el rango intercuartil. *denota p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Mapas representativos de calor de campo abierto. (A) control de la hembra, (B) mujer lesionada. Los animales lesionados cubren una distancia significativamente menor dentro del campo abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Debido a las similitudes físicas y de desarrollo compartidas entre el cerebro hurón y el cerebro humano, el hurón se utiliza cada vez más para modelar lesiones cerebrales adultas y del desarrollo. 8,9,10,11,12. Sin embargo, la investigación hasta la fecha sugiere que el cerebro hurón es a la vez resistente a la lesión inicial, así como altamente plástico, con déficits de comportamiento disminuyendo con el tiempo incluso en el entorno de lesión patológica visible10,12. Aquí, describimos el primer modelo de lesión cerebral hipoxic-isquémica (HI) con sensibilidad a la inflamación (HI) en el hurón equivalente a prematuros tardío, lo que resulta en lesiones bilaterales significativas y déficits de comportamiento sostenidos en sobrevivientes. Al igual que con cualquier modelo preclínico, el objetivo no era reproducir con precisión las exposiciones encontradas por los bebés prematuros clínicamente, sino proporcionar una confluencia de los factores mecánicos que se cree que están involucrados en lesiones cerebrales prematuras. Estos incluyen inflamación, hipoxia, y estrés oxidativo7.
Un aspecto crítico de la administración de LPS en nuestros modelos de hurones es una dosis alta única dada alrededor de 4 h antes de la hipoxia. La exposición a LPS en roedores equivalentes a corto plazo da como resultado un pico de citoquinas inflamatorias circulantes alrededor de 4 h después de la exposición, que corresponde con la sensibilización del cerebro a la hipoxia-isquemia, y un aumento significativo en la lesión cerebral15,16,17. Un curso de tiempo similar de liberación inflamatoria de citoquinas (pico de TNF--o y liberación de IL-6 2-4 h después de la exposición a LPS) se ve en células mononucleares de sangre periférica de hurón aislado18. Suponiendo una sola configuración quirúrgica, la administración de LPS 30-60 min antes del inicio de la cirugía permite un tiempo suficiente para realizar de 12 a 15 ligaduras bilaterales de la arteria carótida e iniciar la primera exposición a la hipoxia 4 h después de la administración de LPS. Durante el desarrollo del modelo, se utilizó inicialmente una dosis lpsiana de 5 mg/kg, como se describe en nuestro modelo de lesión P1012. Sin embargo, esta dosis de LPS se asoció con una mortalidad intrahipóxica significativa y edema pulmonar en la necropsia. Tanto la mortalidad como el edema pulmonar se redujeron disminuyendo la dosis de LPS a 3 mg/kg.
Durante la exposición a la hipoxia, una serie de factores parecen ser críticos para asegurar lesiones graves significativas y al mismo tiempo prevenir altos niveles de mortalidad. Debido a que los hurones de laboratorio están endogámicos, hay una variabilidad inherente en la tolerancia a la hipoxia a través de las camadas. En nuestra experiencia, el fomento cruzado de los animales o la combinación de animales de diferentes camadas en la misma cámara de hipoxia resulta predominantemente en la muerte temprana de animales o animales más grandes de la camada más susceptible. Si más animales susceptibles mueren antes de la exposición a la hipoxia de 30 minutos objetivo y la hipoxia se detiene a tiempo, los animales más pequeños de camadas menos susceptibles recibirán una exposición subóptima a la hipoxia, y es poco probable que sufran lesiones significativas. Como resultado, cada camada de animales debe estar expuesta a hipoxia dentro de su propia cámara separada. El segundo período de hipoxia se añadió como parte de un proceso de desarrollo de modelos iterativos que hemos descrito anteriormente12. Un solo período de hipoxia resultó en la muerte o la supervivencia sin lesiones significativas, independientemente de la duración.
Como los hurones son capaces de tolerar largos períodos de hipoxia aguda o ligadura bilateral de la arteria carótida sin mostrar una lesión cerebral significativa, nuestra hipótesis actual es que el período de hiperoxia resulta en un metabolismo elevado y vasodilatación que facilita la vasodilatación que facilita isquemia cerebral durante el segundo período de hipoxia. Para minimizar la variabilidad en el modelo, utilizamos camadas preordenadas con balance sexual de 8 hurones que llegaron a nuestras instalaciones en P15. En cada camada, 6–7 animales se sometieron a una cirugía seguida de hipoxia dentro de una sola cámara.
Después de la hipoxia y la reversión de la ligadura de la arteria carótida derecha, los animales deben ser devueltos a sus jills durante un período de tiempo para alimentarse debido al riesgo de deshidratación e hipoglucemia del protocolo de lesión prolongada. Si se experimenta una mortalidad significativa durante el período de gestión de la temperatura, los animales pueden necesitar reanimación de líquidoadicional adicional (salina subcutánea y/o alimentación manual con fórmula y agua) antes de ser colocados en los baños de agua durante 6 horas. El período de gestión de la temperatura es, sin embargo, un determinante crítico de las lesiones a largo plazo, ya que los animales pueden experimentar neuroprotección contra la hipotermia relativa en el nido. Este riesgo de hipotermia se debe al menos en parte a la baja temperatura de las condiciones de vivienda requeridas para el hurón (60-70 oF).
Las pruebas de comportamiento descritas se desarrollaron en gran medida dentro del laboratorio, con cierta base en las pruebas de reflejo descritas previamente en el hurón en desarrollo19,con pasarelas y pruebas de campo abierto adaptadas de roedores adultos para ser utilizados en hurones juveniles. Otros grupos también han descrito pruebas de campo abierto, laberinto y marcha en hurones adultos después de una lesión cerebral traumática10,así como el efecto de la inflamación en el útero en la interacción social en hurones adultos20. Aunque un largo período de ayuno no se recomienda en hurones debido a su corto tiempo de tránsito intestinal, colocarlos en un portador de animales durante 30-60 minutos antes de cualquiera de las pruebas es beneficioso para permitirles pasar orina y heces antes de las pruebas. Como el hurón es por naturaleza un animal curioso, a menudo se comporta de manera opuesta a los roedores en estas pruebas conductuales. Esto es particularmente evidente en la pasarela, donde las luces y los sonidos, particularmente las grabaciones de otro hurón vocalizando ("dooking"), se pueden utilizar para motivar al hurón a caminar hacia adelante.
El protocolo actual tiene algunas limitaciones. Como se desarrolló de forma iterativa utilizando métodos previamente desarrollados en el hurón P1012, actualmente no conocemos las contribuciones relativas de LPS, hipoxia, hiperoxia y reperfusión al grado final de lesión que se observa. Sin embargo, vale la pena señalar que el desarrollo del método descrito aquí incluyó el uso del modelo original Vannucci (ligadura unilateral de la arteria carótida seguida de un solo período de hipoxia) en el hurón21,que no resultó en ninguna lesión significativa. Por lo tanto, es probable que las interacciones entre las múltiples partes del protocolo de lesión sean necesarias para lesiones sostenidas. A pesar de esto, sigue habiendo una clara variabilidad en el daño grave en los animales supervivientes, que es otra limitación potencial. Aunque los animales sin lesiones graves significativas pueden tener lesiones que son detectables mediante resonancia magnética o histopatología12, el trabajo futuro en el modelo incluirá iteraciones para tratar de aumentar el número de animales que sufren lesiones significativas, por ejemplo mediante el uso de la ligadura bilateral permanente de la arteria carótida. Por último, con el fin de que este modelo sea útil para probar terapias neuroprotectoras putativas para lesiones cerebrales en el desarrollo, debe ser validado mediante la evaluación de la eficacia de los agentes neuroprotectores que se establecen para el tratamiento de la lesión cerebral HI en neonatos humanos, o han tenido éxito en una gama de otros modelos animales de lesión cerebral neonatal. Por lo tanto, estudios futuros evaluarán la eficacia de la hipotermia terapéutica y la eritropoyetina en este modelo, incluidas las respuestas terapéuticas basadas en el sexo y la RESONANCIA magnética ex vivo12.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El desarrollo del modelo fue financiado por bill y Melinda Gates Foundation, así como por la concesión de NIH 5R21NS093154-02 (NICHD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
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