Summary
Metoden beskriver inflammation-sensibiliseret hypoxic-iskæmisk og hyperoxisk hjerneskade i P17 Ferret til at modellere den komplekse interaktion mellemlang varig inflammation og oxidativ hjerneskade oplevet i en række sene præmature spædbørn.
Abstract
Der er et løbende behov for klinisk relevante modeller af perinatale infektion og hypoksi-iskæmi (HI) til at teste terapeutiske interventioner for spædbørn med den neurologiske overdreven af Præmatur. Fritter er ideelle kandidater til modellering af den præterm menneskelige hjerne, da de er født lissencephalic og udvikle gyrencephalic hjerner postnatalt. Ved fødslen, er Ferret Brain Development svarer til en 13 ugers Human Foster, med postnatal-Day (P) 17 kits anses for at svare til et spædbarn på 32 – 36 ugers dræelse. Vi beskriver en skade model i P17 Ferret, hvor lipopolysaccharid administration efterfølges af bilateral cerebral iskæmi, hypoksi, og hyperoxia. Dette simulerer den komplekse interaktion af langvarig inflammation, iskæmi, hypoksi, og oxidativ stress oplevet i en række nyfødte, der udvikler hjerneskade. Tilskadekomne dyr udviser en række alvorlige alvorlighedsgrader med morfologiske ændringer i hjernen, herunder indsnævring af multipel kortikal Gyri og associeret sulci. Sårede dyr også vise bremset refleks udvikling, langsommere og mere variabel hastighed af bevægelse i en automatiseret catwalk, og nedsat udforskning i en åben mark. Denne model giver en platform til at teste formodede terapier for spædbørn med neonatal encefalopati forbundet med inflammation og HI, undersøgelse mekanismer for skade, der påvirker kortikale udvikling, og undersøge veje, der giver modstandsdygtighed i upåvirkede dyr.
Introduction
Der er et vedvarende behov for store dyremodeller, der afspejler patofysiologien af Præmatur og perinatale hypoksi-iskæmi, hvor terapeutiske indgreb for spædbørn kan testes. I 2017 blev 9,93% af de 382.726 spædbørn født i USA født på forhånd, og 84% af disse spædbørn blev født mellem 32 og 36 ugers drænings periode1. Hos præmature spædbørn er perinatal udsættelse for infektion eller inflammation almindelig, hvor maternel immun aktivering på grund af virale eller bakterielle patogener kan initiere præmature arbejdskraft. Postnatalt, præmature spædbørn er i høj risiko for tidlig eller forsinket indtræden af sepsis2. Præmature spædbørn oplever også ofte perioder med hypoksi, hypotension og Iltforgiftning på grund af deres umodne kardiorespiratoriske system, forhøjet iltspænding i atmosfæren i forhold til dem, der opleves i utero, og iatrogene eksponeringer. Desuden, i præmature spædbørn, antioxidant forsvar er umodne3 og Pro-apoptotic faktorer er naturligt upregulated4. Oxidativ stress og celledød fører til aktivering af immunsystemet og neuroinflammation. Disse kombinerede faktorer menes at bidrage til udviklingsmæssige og fysiologisk sårbarhed i hjernen, og resultere i eller forværre encefalopati forbundet med dårlige udviklingsmæssige resultater i præmature spædbørn5,6,7.
På grund af de fysiske og udviklingsmæssige ligheder, at ilden hjernen deler med den menneskelige hjerne, ilden er en attraktiv art til at modellere hjerneskade8,9,10,11,12. Fritter er også ideelle kandidater til at modellere den præmature menneskelige hjerne, da de er født lissencephalic og udvikle gyrencephalic hjerner postnatalt, som giver et vindue til at udsætte den udviklende hjerne til fornærmelser, der efterligner dem opleves af spædbørn født præterm. Ved fødslen, er Ferret Brain Development ligner en 13 ugers Human Foster, med postnatal-Day (P) 17 kits anses for at svare til et spædbarn på 32 – 36 uger af drægtighedsperioden13.
Vores gruppe har for nylig offentliggjort en model af ekstremt præterm (< 28 ugers drænings grad) hjerneskade i P10 Ferret ved at kombinere inflammatorisk sensibilisering med Escherichia coli lipopolysaccharid (LPS) med efterfølgende eksponering for hypoksi og Iltforgiftning12. I den følgende protokol beskriver vi nu en sen præterm model i P17 Ferret, hvor LPS sensibilisering efterfølges af bilateral cerebral iskæmi, hypoksi og hyperoxia. Dette resulterer i mere alvorlig skade i en delmængde af dyr, og mere tæt modeller den komplekse interaktion af langvarig inflammation, iskæmi, hypoksi, og oxidativ stress oplevet i en række præmature spædbørn, der udvikler hjerneskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer blev udført i overensstemmelse med NIH guide til pleje og brug af forsøgsdyr og som en del af en godkendt protokol ved University of Washington institutionel dyrepleje og brug udvalg.
1. klargøring og LPS administration
Bemærk: Se figur 1 for en tidslinje for procedurerne.
- Før proceduren påbegyndes, forsegler, steriliserer og autoklave alle kirurgiske instrumenter og kirurgiske gardiner. Forbered præ-operative medicin i sterile hætteglas. Beregn den strømningshastighed, der kræves for at udskifte luften i hypoxia/hyperoxia-kammeret med forsøgs gassen i 8 – 10 minutter.
- Lipopolysaccharid (LPS fra E. coli 055: B5) forberedes i sterilt saltvand for at producere en koncentration på 1 mg/ml. Fjern P17 Ferret kits fra deres Jills. Afvejes og nummerer dem. Randomize dyr med strøelse og sex til kontrol eller tilskadekomne (eller behandling) grupper.
- Ved hjælp af en 300 μL insulin sprøjte administreres 3 mg/kg LPS intraperitonealt til kits i skades gruppen og en tilsvarende mængde steril saltvands køretøj (3 μL/g) til kontrol af dyrene.
- Placer dyrene i et kammer i et vandbad ved 37 – 40 °C for at opretholde en målrektaltemperatur på 36 – 37 °C gennem de kirurgiske indgreb.
2. anæstesi
- Under proceduren, konstant overvåge temperatur, respiration sats, og puls af dyret.
- Buprenorphin (0,05 mg/kg) indgives subkutant 30 min før den kirurgiske procedure. Inducerer anæstesi i en blanding af 3% isofluran balanceret med 100% ilt. Fjern kittet fra induktions kammeret, og Placer det på et draperet kirurgisk vand tæppe, der er indstillet til 37 °C. Overfør anæstesi til næse keglen og Reducer isofluran niveauet til 2 – 3%.
3. kirurgisk forberedelse
- Ved hjælp af små dyre klippere fjerne alt hår på ventrale halsregionen. Barbering i et rektangulært mønster med omhu for at undgå at Nige huden eller generere Barber udslæt. Administration af lokalbedøvelse til det barberede område ved hjælp af intradermal lidocain (4 mg/kg) og bupivacain (2,5 mg/kg).
- Forbered halsen ved skiftevis påføring af povidon-jod og 70% ethanol scrub med sterile vatpinde. Gentag skrubbe sådan, at povidon-jod og 70% ethanol hver anvendes 3x i vekslende måde.
- Bekræft dybden af anæstesi via fravær af tå-knivspids refleks. Opretholde niveauet af isofluran med den minimumsprocentsats, der kræves for et kirurgisk plan for anæstesi. Ved hjælp af sterile engangs udskårne gardiner, der udsætter halsen regionen, drapere dyret.
4. bilateral carotis-arterie ligering
- Med en engangs #11 skalpel klinge, lav en 1,5 cm mellemlinie indsnit i midten af halsen. Ved hjælp af fine hæostatika og buede pincet, desuntly dissekere ned til venstre carotis arterie. Dissekere arterien væk fra den associerede Neuro vaskulære bundt.
- Ved hjælp af et par buede fine pincet, passere en loopes 10 cm længde af steril 5-0 silke sutur under arterien. Skær suturen i halve. Ligate arterien ved at binde begge længder af sutur sikkert, efterlader mindst 2 mm mellem knuderne. Transect den venstre carotis arterien mellem suturerne, idet man sørger for at forlade nerven intakt.
- Gentag dissektion på højre side. Den højre halspulsåre med et enkelt sterilt 1/8 tommer navle slips er reversibelt. Luk såret med kirurgiske hudklip.
- Lad dyret restituere sig i et temperaturkontrolleret vandbad i mindst 30 minutter før hypoksi.
Bemærk: Hvis arterierne ikke er fuldt isoleret fra resten af den neurovaskulære bundt, øget dødelighed kan ses før eller under senere hypoksi.
5. sekventiel hypoksi, Hyperoxia og hypoksi
- Under hypoksi og hyperoxia, ændre vandbad temperatur som nødvendigt for at opretholde rektal temperatur under hypoksi ved 37 °C i kontroldyr (r).
- Placer dyr i skades gruppen i et lufttæt kammer i et vandbad. Kontinuerligt overvåge iltkoncentrationen i kammeret, samt rektal temperatur i mindst ét kontroldyr. Skyl kammeret med befuret 9% ilt (91% kvælstof) derefter opretholde en strømningshastighed på 3 – 5 L/min, afhængigt af kammer størrelse. Når koncentrationen af ilt i kammeret har nået 9%, Fortsæt i 30 min.
- Efter 30 min, switch gas forsyning til 80% befuret ilt (20% kvælstof), og tillade kammeret at nå målet koncentration baseret på strømningshastighed og kammer størrelse. Fortsæt i 30 min af hyperoxia. Åbn kammeret, så det hurtigere kan nå normoxia ved at ækvibrere med luft i rummet.
- Forsegl kammeret, og skyl med 9% befuret ilt. Løbende overvåge alle dyr visuelt, under hensyntagen til dyr, der viser bradypnea. Når koncentrationen af ilt i kammeret har nået 9%, Fortsæt i 30 min. Hvis intra-hypoxisk dødelighed (respirationsstop) i nogen af dyrene ses inden udgangen af 30 min periode, opsige hypoksi straks.
6. tilbageførsel af højre carotis-arterie ligering
- Returner dyrene til operationsområdet, og Fremkald anæstesi i en blanding af 3% isofluran balanceret med 100% ilt. Overfør anæstesi til næse kegle og Reducer isofluran niveau til 2 – 3%. Fjern de kirurgiske sårclips, og Forbered sårområdet igen med povidon-jod. Bekræft dybden af anæstesi via fravær af tå-knivspids refleks. Opretholde niveauet af isofluran med den minimumsprocentsats, der kræves for et kirurgisk plan for anæstesi. Ved hjælp af sterile engangs udskårne gardiner, der udsætter halsen regionen, drapere dyret.
- Ved hjælp af buede pincet, identificere og løsne navle båndet fra den højre carotis arterie. Luk såret med kirurgiske hudklip.
7. nyttiggørelse og temperaturstyring
- Returner alle kits til deres sreekanth til 60 min, til sygepleje og nyttiggørelse. Efter 60 min, returnere tilskadekomne dyr til vandet bade ved 37 – 40 °C i 6 h, justere vandtemperaturen efter behov for at opretholde rektal temperatur ved 36 – 37 °C. Retursæt til deres Jills.
- Fjern kirurgiske clips 10 – 14 dage efter operationen (P27 – P31).
8. refleks prøvning
- Udfør alle refleks tests dagligt fra P21 – P28, og mindst 3x om ugen fra P28 – P42, mens de resterende blindet til eksponering (eller behandling) gruppe. Før refleks prøvning placeres kits i et kammer med varme assistance (37 °C vandbad, varmepude osv.) i 1 time. For hver test, fuldføre alle forsøg per kit før afprøvning af næste kit.
- Negative geotaxis (25 °)
- Placer en flad plade (16 1/2 i. x 12 in.) indpakket i en absorberende stationære beskytter mod et objekt, så brættet danner en 25 ° vinkel med bordet. Placer et sæt på brættet tilbøjelige og vender ned ad bakke, ca 75% af vejen op på brættet.
- Sørg for, at sættets krop er lige, og at den har alle fire poter grebet mod brættet, før den frigives. Start tids vurderingen, så snart sættet er placeret.
- Optag det tidspunkt, hvor kittet formår at rotere dets krop 90 ° i forhold til udgangspositionen. Optag det tidspunkt, hvor kittet roterer sin krop 180 ° og tager et helt skridt mod toppen af brættet. Udfør 3 forsøg ved 25 ° hældning, før du går videre til næste test.
- Negative geotaxis (45 °)
- Udfør 3 forsøg med de tidligere beskrevne negative geotaxis test igen, denne gang med brættet sat til en 45 ° vinkel.
- Cliff aversion
- Placer en polstret platform omkring 1 fod under afsatsen for at minimere skaden til kits, hvis de falder.
- Placer et kit vendende, og vinkelret på, kanten af laboratoriet bænk. Sørg for, at sættets krop er lige, og at dens forreste poter flugter med kanten. Vurderingen af starttidspunktet fra det øjeblik, hvor kittet er placeret. Vær forsigtig med at skelne mellem bevidst bevægelse væk fra klippen og andre spontane bevægelser, der ikke involverer koordineret Walking.
- Optag det tidspunkt, hvor kittet bevæger sin krop væk fra kanten (defineret som kit sikkerhedskopiere, dreje sin krop, eller flytte sine forreste lemmer væk fra kanten). Optag det tidspunkt, hvor kittet afslutter sit første trin i den modsatte retning af kanten (defineret som enhver retning eller vinkel forbi en 90 ° rotation fra udgangspositionen mod kanten).
- Udfør 3 Cliff aversion forsøg per kit, før du går videre til næste test.
- Opretterende refleks
- Placer et kit liggende på bænken, holde det forsigtigt i denne position, før frigive det og samtidig begynder stopur. Optag den tid, at sættet bringer sig selv til hvile med alle fire poter samtidig fladt mod bænken i vægtbærende positioner. Optag det tidspunkt, hvor kittet tager et fuldt skridt i enhver retning (defineret som placeringen af alle fire poter for at opnå fremskridt i en given retning uden at spinne eller trække i kroppen).
- Udfør 5 forsøg med den stabiliserede refleks test pr. dyr.
- Efter hver kit har afsluttet de 5 opretningsrefleks forsøg, returnere strøelse til Jill.
9. test af catwalk
- På P42, fjerne kits fra Jill. Placer kits i plastik bure ca. 10 min før testning, så de kan akkliere til miljøet. Sluk lysene i testrummet for at sikre, at omgivende lys ikke påvirker catwalk-funktionen.
- Opret et nyt eksperiment i den relevante software. Juster eksperimentelle indstillinger, så den maksimale varighed af kørslen ikke overskrider 10,00 s, og den minimale varighed af kørslen ikke er mindre end 1,50 s. Indstil den maksimale hastighedsvariation, så den ikke overskrider 60%. Sæt et minimumskrav for tre overensstemmende kørsler for hvert dyr.
- Juster bredden af gangbro i forhold til størrelsen af dyret, så det er i stand til frit at locomote uden at røre væggene, mens de resterende smalle nok til at modvirke drejning. Tilføj en ny registrerings indstilling under fanen Registreringsindstillinger profiler ved hjælp af automatisk registrering. Brug de samme detekterings indstillinger for alle kuld og dyr i en given alder.
- Rengør gangbroen grundigt med et papirvæv med lavt fnug og 70% ethanol før og efter hvert dyr. Rengør fritte Rens poter regelmæssigt for at forbedre nøjagtigheden af detektering og klassificering. Når gangbro og dyr er forberedt, begynde retssag erhvervelse.
- Pause erhvervelse for at rense catwalk, hvis fodspor akkumuleres på glasset, eller hvis dyrene passerer urin eller afføring. Stop erhvervelse, når catwalk-softwaren har genkendt tre kompatible kørsler baseret på de forudbestemte eksperimentindstillinger.
10. åben felttest (P42)
- Brug en ikke-porøs akryl æske (55 cm x 55 cm x 40 cm høj) malet mat-hvid. Placer kameraet, så det er centreret direkte over boksen og alle fire vægge er fanget. Rengør test arenaen med 70% ethanol før første brug og mellem dyrene.
- I den relevante software skal du vælge ny fra skabelon og anvende en foruddefineret skabelon. Fortsæt med at oprette proceduren ved sekventielt at vælge emnetype: andet; Arena skabelon: åben felt, firkant; Zone skabelon: Center, kant, hjørner; Funktioner til at spore: Center-point.
- Åbn Arena indstillinger og tag baggrundsbilledet fra kameraets indgang, og sørg for, at toppen af Arena væggene er synlige. Kalibrer dimensionerne af arenaen ved hjælp af skaleringsværktøjet.
- Juster de foruddefinerede Arena zoner ved at ændre størrelsen på konturerne, så de passer til vægzonerne (NW, NE, SW, SE) og gulv zoner (venstre top, midterste top, højre top, venstre midte, centreret, højre midte, venstre bund, midterste bund, højre bund). Valider set-up for at bekræfte, at ingen zoner overlapper hinanden.
- Åbn vinduet anskaffelse , og tryk på Start anskaffelse. Placer ilder i midten af testen Arena orienteret på en sådan måde, der er konsekvent for hver test emne. Lad ilden bevæge sig frit i hele arenaen i en periode på 5 min. I slutningen af testperioden skal du trykke på stop erhvervelse. Gentag proceduren med den næste fritte.
Bemærk: Alle eksperimenters i rummet bør positionere sig til at være uobserver bare af ilden og forblive stille i løbet af testperioden.
11. fiksering-perfusion
- På P42, dybt anæstetize kits med 5% isofluran. Administration af en pentobarbital overdosis (120 – 150 mg/kg IP). Sørg for dyb anæstesi ved manglende respons på tåen knivspids og tab af respiratoriske bevægelser.
- Overfør dyret til en stinkhætte. Åbn brystkassen og klemme den faldende aorta ved hjælp af fine hemostats. Skær det rigtige Atrium. Ved hjælp af en perfusions pumpe, perfuse den venstre ventrikel med 60 mL sterilt saltvand med en hastighed på 30 mL/min. Perfuse med 60 mL formalin (10% formaldehyd) med en hastighed på 30 mL/min.
- Decapitate slagtekroppen, og fjerne hjernen fra kraniet ved hjælp af saks, pincet, rongeurs, og en spatel. Tag billeder i høj opløsning af de dorsale, ventrale og laterale aspekter af hver hjerne. Efter fix hjernen i formalin for mindst 48 h.
12. ex vivo-hjerne måling
- Fjern hjernen fra formalin (trin 11,3), og Placer den på et papirhåndklæde for at absorbere overskydende væske.
- Ved hjælp af en elektronisk kaliber, måle højden af hjernen ved at placere spidsen af kaliber på rygnings-og ventrale aspekter af hjernen. Mål længden af hjernen ved at placere spidsen af kaliber på olfaktoriske pære og den mest posterior grænse af occipital lap. Mål bredden af hjernen ved at placere spidsen af kaliber på de mest laterale dele af de tidsmæssige lapper. Veje hjernen.
- Mål den langsgående fissur (anterior og posterior til cruciatsulcus), lateral sulci, suprasylvian sulci, koronalsektion sulci, pseudosylvian sulci, ansinate sulci, korsbånd sulci, presylvian sulci, lateral Gyri, suprasylvian Gyri, sigmoid Gyri ( forreste og posterior), koronal Gyri, ectosylvian Gyri (forreste og posterior) og orbital Gyri. Mål alle sulci fra begyndelsen og slutningen af den mest særskilte del af den tilsvarende sulcus. Mål alle Gyri fra det bredeste aspekt af hver tilsvarende gyrus.
- Måle mængden af cerebellum eksponeret ved at placere en spids af kaliber på det mest posterior punkt i den langsgående fissur og placere den anden spids af kaliber på den mest bageste del af cerebellum.
Bemærk: The Ferret Brain Atlas, som findes i biologi og sygdomme i Ferret14, blev brugt til at udvikle ex vivo Ferret hjernen målinger.
13. bedømmelse af brutto skader
- Brug fotografierne taget i trin 11,3., anvende scoring kriterier i trin 13.2 – 13.4 at vurdere grov hjerneskade (0 – 9 skala) mens resterende blindet til eksponering (eller behandling) grupper.
- Vurdere den langsgående fissure. Hvis det ser normalt ud, skal du tildele en score på 0. Hvis det er mildt udvidet (ca. 2 x normal bredde), men stigningen i bredden er ufuldstændig langs længden af fissure, tildele en score på 1. Hvis den er moderat udvidet (ca. 2 – 3x normal), skal du tildele en score på 2. Hvis det er markant udvidet, med en synlig kløft > 3x normal bredde langs det meste af længden af fissure, anvende en score på 3.
- Vurder den laterale sulci. Hvis de viser normal definition, med adskillelse af den laterale Gyri og suprasylvian Gyri, tildele en score på 0. Hvis mild ensidig eller bilateral reduceret definition af sulcus ses, især i den hale portion, med minimal indsnævring af frontal og temporale lapper i forhold til occipital lapper, tildele en score på 1.
- Hvis moderat reduceret definition af sulci ses, med depression af suprasylvian Gyri, forsnævring af koronal og ectosylvian Gyri, og mild forsnævning af frontal og temporale lapper i forhold til occipital lapper, tildele en score på 2. Hvis ensidig cystisk degeneration ses, med minimal ændring af den kontralaterale halvkugle, tildele en score på 3. Hvis dårlig definition af lateral sulci er til stede, med bilateral cystisk eller svær degeneration af occipital og temporale lapper, tildele en score på 4.
- Vurder den synlige del af cerebellum. Hvis det ser normalt ud, med (< 75% af vermis og < 66% af halvkugler synlige, tildele en score på 0. Hvis 75 – 90% af vermis og ≥ 66% af halvkugler er synlige, tildele en score på 1. Hvis det meste af cerebellum er synligt, viser alle de vermis og ≥ 66% af halvkugler, tildele en score på 2.
14. data analyse
- For refleks testdata, tildele fejl en score på 61 s at tillade dem at blive sammenlignet med succeser i slutningen af tid (60 s), men med en dårligere placering i den statistiske analyse. Beregn et areal under kurven for hvert dyr over tid i hver af refleks prøverne.
- Juster catwalk data, der involverer pote størrelse af trykket af vægten af dyret.
- Analysér data ved hjælp af ikke-parametriske statistiske metoder, der beskriver data ved hjælp af median og interkvartil interval (IQR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Af 34 (n = 18 hanner, n = 16 kvinder) dyr fra seks kuld udsat for fornærmelse, otte dyr (24%; n = 4 hanner, n = 4 hunner) i den skadede gruppe døde under den anden hypoksi periode (n = 5), under temperaturstyring (n = 2), eller natten over efter fornærmelsen (n = 1) I den skadede gruppe var ni ud af 26 overlevende (35%) havde synlige brutto skader. Fem dyr (n = 5 hanner) havde moderat skade, og fire dyr (n = 2 hanner, n = 2 hunner) havde alvorlig skade, defineret som grove patologiske scores på henholdsvis 2 – 5 og 6 – 9 (figur 2A). Dyr, der udsættes for fornærmelsen, har derfor en 50% risiko for dødsfald eller betydelig grov skade. Med stigende skade ses indsnævring af Gyri i de tidsmæssige og/eller occipital lapper, med associeret mønsteret forkortelse, udvidelse af langsgående fissure og store områder af områder med cystisk vævs tab hos de mest alvorligt tilskadekomne dyr (figur 2B). Hos overlevende tilskadekomne dyr (n = 26; n = 14 hanner, n = 12 hunner) ses signifikant større eksponering af cerebellum (figur 3A) samt afkortning af langsgående fissur (figur 3D). Der er også signifikant indsnævring af den koronale og forreste ectosylvian Gyri (figur 3B, E), samt afkortning af laterale og suprasylvian sulci (figur 3C, F). Median (IQR) hjerne vægt var 8,1 g (7,9 – 9,7 g, n = 6) i kontroldyrene, og 7,0 g (6,5-7.7 g) i tilskadekomne dyr (n = 26, p = 0,005). I kontroldyrene var den mediane (IQR) hjerne længde 28,9 mm (27,8 – 29.6 mm, n = 6) sammenlignet med 27,5 mm (25,5 – 38.0 mm, n = 26) i tilskadekomne dyr (p = 0,007). Lignende mønstre ses på tværs af hjernen, med median bredde og højde 5 – 7% mindre i tilskadekomne dyr. Anatomiske strukturer på både venstre og højre side påvirkes på en lignende måde, uden forskel mellem halvkugler. Se figur 1B for skildringer af de anatomiske steder. Over refleks testperioden (P21 – P39), sårede dyr vise langsommere tid til at rotere i den negative geotaxis opgave(figur 4A), langsommere tid til at rotere væk fra kanten i klippen aversion opgave (figur 4B), og langsommere tid til højre (figur 4C). I catwalk, har sårede dyr en lignende gennemsnitlig hastighed til kontrol (figur 5a), men viser en signifikant større grad af hastighed variation under hver kørsel (figur 5B). Den vægtjusterede afstand mellem fore poter og bagpoter (print position) er signifikant større hos tilskadekomne dyr (figur 5C), med mindre tryk udøvet pr. enhed Paw område gennem forpoterne (figur 5D). På det åbne område dækker skadede dyr mindre total afstand (figur 6A) og standser hyppigere (figur 6B). De bruger betydeligt mere tid i midten af feltet, og mindre tid i hjørnerne (figur 6C, D). Repræsentative varmekort over kontrol og tilskadekomne dyr er vist i figur 7A, B.
Figur 1: tidslinje. På P17, dyr administreres 3 mg/kg LPS før gennemgår bilateral carotis arterie ligering og 30 min hver (ikke inklusive tid til kammeret til at ækvibrere) af hypoksi (9% ilt), Iltforgiftning (80% ilt) og hypoksi (9%). Den højre carotis arterie ligering vendes derefter. Dyr udsættes for 6 timer af normothermia for at sikre, at de ikke bliver spontant hypotermiske i reden i perioden efter skaden. Refleks test udføres derefter dagligt fra P21 – P28, og tre gange om ugen fra P28 – P42. På P42 testes dyr i catwalk og åben mark før offer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ skades fordeling og skildring. a) brutto skade scoring fra 26 overlevende (n = 14 hanner, n = 12 hunner) i den skadede gruppe sammenlignet med seks kuld styringer. Fem dyr (n = 5 hanner) havde moderat skade, og fire dyr (n = 2 hanner, n = 2 hunner) havde alvorlig skade, defineret som grove patologiske scores på henholdsvis 2 – 5 og 6 – 9. Grafen viser median med interkvartil interval. (B) kontrol hjernen (venstre panel, score 0), med hjerner skildrer stigende brutto skade scoringer på 2, 5, og 8 ud af en samlet mulig score på 9, fra venstre mod højre. Kontrol hjernen viser anatomiske strukturer, som er særligt udsatte for skader; 1 = langsgående fissure, 2 = Lateral sulcus, 3 = suprasylvian sulcus, a = koronal gyrus, b = forreste ectosylvian gyrus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative hjerne målinger. Sammenlignet med kontrollerne (n = 6), tilskadekomne dyr (n = 26) udviser signifikant øget eksponering af cerebellum (A), afkortning af den langsgående fissur (D), forsnævring af koronal (B) og forreste ectosylvian (E) Gyri og forkortelse af lateral (C) og suprasylvian (F) sulci. Grafer viser median med interkvartil interval. * Angiver p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentativ refleks udvikling. Sammenlignet med kontrollerne (n = 6) viser tilskadekomne dyr (n = 26) langsommere udvikling (arealet under kurven, AUC) af negative geotaxis (A), Cliff aversion (B) og opretterende refleks (C). Grafer viser median med interkvartil interval. * Angiver p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative catwalk resultater. Sammenlignet med kontrollerne (n = 6) går tilskadekomne dyr (n = 26) i et tilsvarende gennemsnitligt tempo (a), men med en større variabilitet i hastighed under vandring (B). Tilskadekomne dyr udviser også en længere gennemsnitlig udskrivningsposition (C), og der påføres mindre tryk pr. arealenhed (D). Grafer viser median med interkvartil interval. * Angiver p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentativ åben felt adfærd. Sammenlignet med kontrollerne (n = 6) dækker tilskadekomne dyr (n = 26) en mindre total afstand (a), og de stopper hyppigere (B). Sårede dyr bruger også mere tid i midten (C) end i hjørnerne (D). Grafer viser median med interkvartil interval. * Angiver p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: repræsentative åbne felt varmekort. (a) kontrol kvinde, (B) tilskadekomne kvindelige. Tilskadekomne dyr dækker en betydeligt mindre afstand inden for det åbne område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af de fysiske og udviklingsmæssige ligheder deles mellem ilder hjernen og den menneskelige hjerne, er ilden i stigende grad bruges til at modellere både voksen og udviklingsmæssige hjerneskade. 8,9,10,11,12. Men, forskning til dato tyder på, at Ferret hjernen er både modstandsdygtig over for første skade samt højplastik, med adfærdsmæssige underskud aftagende over tid selv i fastsættelsen af synlige patologiske skade10,12. Her beskriver vi den første model af betændelse-sensibiliseret hypoxic-iskæmisk (HI) hjerneskade i den sene præterm-ækvivalent Ferret, hvilket resulterer i betydelig bilateral skade og vedvarende adfærdsmæssige underskud i overlevende. Som med enhver præklinisk model var målet ikke nøjagtigt at gengive eksponeringerne hos præmature spædbørn klinisk, men at give en sammenløbet af de mekanistiske faktorer, der menes at være involveret i for tidlig hjerneskade. Disse omfatter betændelse, hypoksi, og oxidativ stress7.
Et kritisk aspekt af LPS administration i vores Ferret modeller er en enkelt høj dosis givet omkring 4 h før hypoksi. LPS eksponering i nær-term tilsvarende gnavere resulterer i en cirkulerende inflammatorisk cytokin peak omkring 4 h efter eksponering, hvilket svarer til sensibilisering af hjernen til hypoksi-iskæmi, og en betydelig stigning i hjerneskade15,16,17. Et lignende tidsforløb med inflammatorisk cytokinfrigivelse (peak TNF-α og IL-6 Release 2 – 4 h efter LPS eksponering) ses i isolerede ilder perifert blod mononukleære celler18. Forudsat en enkelt kirurgisk set-up, administrere LPS 30 – 60 min før starten af kirurgi giver tilstrækkelig tid til at udføre 12 – 15 bilateral carotis arterie ligationer og indlede den første hypoxi eksponering 4 h efter LPS administration. Undermodel udvikling, en LPS dosis på 5 mg/kg blev oprindeligt brugt, som beskrevet i vores P10 skade model12. Men, denne LPS dosis var forbundet med signifikant intra-hypoxisk dødelighed og lungeødem på nekropsy. Både dødelighed og lungeødem blev reduceret ved at nedsætte LPS-dosen til 3 mg/kg.
Under hypoxi eksponering, en række faktorer synes at være afgørende for at sikre betydelige brutto skade samtidig også forebygge høje niveauer af dødelighed. På grund af laboratorie fritter bliver opdrættet, der er en iboende variation i hypoksi tolerance over kuld. Det er vores erfaring, at krydsning af dyr eller kombination af dyr fra forskellige kuld i samme hypoxi kammer primært resulterer i en tidligere død af større dyr eller dyr fra det mest modtagelige kuld. Hvis mere modtagelige dyr dør før målet 30 min hypoxi eksponering og hypoksi stoppes tidligt, mindre dyr fra mindre modtagelige kuld vil modtage suboptimal hypoxi eksponering, og er usandsynligt, at opretholde betydelig skade. Som følge heraf bør hvert strøelse af dyr udsættes for hypoksi i deres eget separate kammer. Den anden hypoxi periode blev tilføjet som en del af en iterativ modeludvikling proces, som vi tidligere har beskrevet12. En enkelt hypoksi periode resulterede enten i døden eller overlevelse uden væsentlig skade, uanset længde.
Som fritter er i stand til at tolerere lange perioder med akut hypoksi eller bilateral carotis arterie ligering uden at vise signifikant hjerneskade, vores nuværende hypotese er, at perioden med Iltforgiftning resulterer i forhøjet metabolisme og vasodilatation, der letter hjernen iskæmi i den anden hypoksi periode. For at minimere variabiliteten i modellen brugte vi forudbestilte sex-afbalancerede kuld af 8 fritter, der ankom til vores facilitet på P15. I hvert kuld gennemgik 6 – 7 dyr kirurgi efterfulgt af hypoksi i et enkelt kammer.
Efter hypoksi og tilbageførsel af den rigtige carotis arterie ligation, dyrene skal returneres til deres sreekanth for en periode til foder på grund af en risiko for dehydrering og hypoglykæmi fra den langvarige skade protokol. Hvis der opleves signifikant dødelighed i temperatur styrings perioden, kan dyrene have brug for yderligere væske genoplivning (subkutant saltvand og/eller hånd fodring med modermælkserstatning), før de anbringes i vandbadet i 6 timer. Temperaturstyringen er imidlertid en kritisk afgørende for langtids skade, da dyrene ellers kan opleve neuroprotection fra relativ hypotermi i reden. Denne risiko for hypotermi er i det mindste delvist på grund af den lave temperatur af de boligforhold, der kræves for fritte (60 – 70 °F).
De beskrevne adfærdsmæssige tests blev i vid udstrækning udviklet inden for laboratoriet, med nogle grundlag i refleks tests, der tidligere blev beskrevet i den udviklende Ferret19, med catwalk og åbne felt tests tilpasset fra voksne gnavere, der skal anvendes i unge fritter. Andre grupper har også beskrevet åben mark, labyrint, og gangest test i voksne fritter efter traumatisk hjerneskade10, samt effekten af in utero betændelse på social interaktion i voksne fritter20. Selvom en lang fastende periode ikke anbefales i fritter på grund af deres korte tarm transit tid, placere dem i et dyr luftfartsselskab for 30 – 60 min før nogen af testene er gavnlig for at give dem mulighed for at passere urin og afføring før testene. Da fritte er af natur et inktivt dyr, opfører det sig ofte på en modsat måde til gnavere i disse adfærdsmæssige tests. Dette er især tydeligt i catwalk, hvor lys og lyde, især optagelser af en anden ilder vocalizing ("dooking"), kan bruges til at motivere ilden til at gå fremad.
Den nuværende protokol har nogle begrænsninger. Da det blev udviklet iterativt ved hjælp af tidligere udviklede metoder i P10 Ferret12, vi ikke i øjeblikket kender de relative bidrag af LPS, hypoksi, hyperoxia, og reperfusion til den endelige grad af skade set. Det er dog værd at bemærke, at udviklingen af den metode, der er beskrevet her, omfattede anvendelse af den oprindelige Vannucci-model (ensidig carotidarterie ligering efterfulgt af en enkelt periode med hypoksi) i Ferret21, hvilket ikke resulterede i nogen væsentlig skade. Derfor vil interaktioner mellem de mange dele af skade protokollen sandsynligvis være nødvendige for vedvarende skade. På trods af dette er der stadig en tydelig variation i brutto skaden i overlevende dyr, hvilket er en anden potentiel begrænsning. Selv om dyr uden væsentlig grov skade kan have skade, der er detekterbar ved hjælp af MRI eller histopatologi12, vil fremtidigt arbejde på modellen omfatte gentagelser for at forsøge at øge antallet af dyr, der opretholder betydelig skade, for eksempel ved hjælp af permanent bilateral carotis arterie ligation. Endelig, for at denne model skal være maksimalt nyttigt at teste formodede neuroprotektive terapier for udviklingsmæssige hjerneskade, det bør valideres ved at vurdere effekten af neuroprotektive Agenter, der enten er etableret til behandling af HI hjerneskade hos menneskelige nyfødte, eller har været en succes i en række andre animalske modeller af neonatal hjerneskade. Fremtidige undersøgelser vil derfor vurdere effekten af terapeutisk hypotermi og erythropoietin i denne model, herunder kønsbaserede terapeutiske reaktioner og ex vivo MRI12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Udviklingen af modellen blev finansieret Bill og Melinda Gates Foundation, samt af NIH Grant 5R21NS093154-02 (NICHD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
