Summary
Yöntem, p17 gelincik iltihabı duyarlı hipoksik-iskemik ve hiperoksik beyin hasarı uzun süreli inflamasyon ve oksidatif beyin hasarı geç preterm bebeklerin bir dizi deneyimli arasındaki karmaşık etkileşimi modellemek için açıklar.
Abstract
Prematüritenin nörolojik sekeli olan bebeklerde terapötik müdahalelerin test edilebilen perinatal enfeksiyon ve hipoksi-iskemi (HI) klinik olarak ilgili modellere ihtiyaç vardır. Gelincikler erken insan beynini modellemek için ideal adaylardır, çünkü lissensefalik olarak doğarlar ve doğum sonrası jirensefalik beyinler geliştirirler. Doğumda gelincik beyin gelişimi 13 haftalık insan fetüsine benzer, doğum sonrası gün (P) 17 kitleri 32-36 haftalık gebelikte bir bebeğe eşdeğer olduğu kabul edilir. Biz P17 gelincik bir yaralanma modeli tarif, lipopolisakkarit uygulaması ikili serebral iskemi takip nerede, hipoksi, ve hiperoksi. Bu uzun süreli inflamasyon karmaşık etkileşimi simüle, iskemi, hipoksi, ve oksidatif stres beyin hasarı geliştirmek neonates bir dizi deneyimli. Yaralı hayvanlar, birden fazla kortikal jirik ve ilişkili sulci daralma da dahil olmak üzere beyinde morfolojik değişiklikler ile, brüt yaralanma şiddeti bir dizi görüntüler. Yaralı hayvanlar da otomatik bir podyumda yavaş refleks gelişimi, yavaş ve daha değişken hareket hızı göstermek ve açık bir alanda keşif azalmış. Bu model, inflamasyon ve HI ile ilişkili neonatal ensefalopatisi olan bebekler için putatif tedavileri test etmek, kortikal gelişimi etkileyen yaralanma mekanizmaları çalışma ve esneklik sağlayan yolları araştırmak için bir platform sağlar etkilenmemiş hayvanlar.
Introduction
Bebekleriçin terapötik müdahalelerin test edilebildiği prematürite ve perinatal hipoksi-iskemi patofizyolojisini yansıtan büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır. 2017 yılında, ABD'de doğan 382.726 bebeğin %9.93'ü preterm, bu bebeklerin %84'ü ise 32-36 haftalık gebelik1. Prematüre bebeklerde, viral veya bakteriyel patojenlere bağlı maternal immün aktivasyonun erken doğumu başlatabildiği, enfeksiyon veya inflamasyona perinatal maruziyet yaygındır. Postnatal olarak, preterm bebekler erken veya geç başlangıçlı sepsis yüksek risk altındadır2. Preterm bebekler de sık sık hipoksi dönemleri deneyim, hipotansiyon, ve hiperoksi onların olgunlaşmamış kardiyorespiratuar sistem nedeniyle, rahim deneyimli olanlara göre atmosferde yüksek oksijen gerginliği, ve iyatrojenik maruzkalma. Ayrıca, preterm bebeklerde, antioksidan savunma olgunlaşmamış3 ve pro-apoptotic faktörler doğal olarak upregulated4. Oksidatif stres ve hücre ölümü bağışıklık sistemi ve nöroinflamasyon aktivasyonuyol açar. Bu kombine faktörler beynin gelişimsel ve fizyolojik kırılganlık katkıda bulunduğu düşünülmektedir, ve sonuç veya preterm bebeklerde kötü gelişimsel sonuçlar ile ilişkili ensefalopati şiddetlendirmek5,6,7.
Gelincik beyninin insan beyniyle paylaştığı fiziksel ve gelişimsel benzerlikler nedeniyle gelincik, beyin hasarı nın8,9, 10,11,12modelini modellediği çekici bir türdür. Gelincikler aynı zamanda preterm insan beynini modellemek için ideal adaylardır, çünkü lissensefalik olarak doğarlar ve doğum sonrası jirensefalik beyinler geliştirirler, bu da gelişmekte olan beyni erken doğan bebeklerin yaşadıklarını taklit eden hakaretlere maruz bırakmak için bir pencere sağlar. Doğumda, gelincik beyin gelişimi 13 haftalık insan fetusbenzer, doğum sonrası gün ile (P) 17 kitleri gebelik 32-36 hafta bir bebeğe eşdeğer olarak kabul13.
Grubumuz son derece erken bir model yayınladı (<28 hafta' gebelik) P10 gelincik beyin hasarı escherichia coli lipokolokarit ile inflamatuar sensitizasyon birleştirerek (LPS) hipoksi ve hiperoksia sonraki maruz kalma ile12. Aşağıdaki protokolde, LPS sensitizasyonunun bilateral serebral iskemi, hipoksi ve hiperoksia tarafından takip edildiği P17 gelinciğinde geç bir preterm modeli tanımladık. Bu hayvanların bir alt kümesinde daha ciddi yaralanma ile sonuçlanır, ve daha yakından uzun süreli inflamasyon karmaşık etkileşimmodelleri, iskemi, hipoksi, ve oksidatif stres beyin hasarı geliştirmek preterm bebeklerin bir dizi deneyimli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedürler, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak ve Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol kapsamında gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlık ve LPS İdaresi
NOT: Yordamların zaman çizelgesi için Şekil 1'e bakın.
- İşleme başlamadan önce tüm cerrahi aletleri ve cerrahi perdeleri mühürleyin, sterilize edin ve otoklavlandırın. Steril şişelerde ameliyat öncesi ilaçlar hazırlayın. Hipoksi/hiperoksi haznedeki havayı 8-10 dakika içinde deneysel gazla değiştirmek için gereken akış hızını hesaplayın.
- Lipopolisakkariti (LpS from E. coli 055:B5) steril salin içinde hazırlayın ve 1 mg/mL konsantrasyonu üretin. Onların jills P17 gelincik kitleri çıkarın. Tartın ve numaralayın. Kontrol veya yaralı (veya tedavi) gruplara çöp ve cinsiyet tarafından hayvanları randomize.
- 300 μL insülin şırınga kullanarak, yaralanma grubundaki kitlere intraperitoneal olarak 3 mg/kg LPS ve hayvanları kontrol etmek için eşdeğer hacimli steril tuzlu araç (3 μL/g) uygulayın.
- Cerrahi işlemler boyunca 36-37 °C'lik bir rektal sıcaklığı korumak için hayvanları 37-40 °C'de bir su banyosunun içine yerleştirin.
2. Anestezi
- İşlem sırasında, sürekli sıcaklık, solunum hızı ve hayvanın kalp hızı izlemek.
- Buprenorfin (0.05 mg/kg) subkutan olarak cerrahi işlemden 30 dk önce uygulayın. % 3 isofluran% 100 oksijen ile dengeli bir karışım anestezi indüklemek. Kiti indüksiyon odasından çıkarın ve 37 °C'ye ayarlanmış dökümlü cerrahi su battaniyesinin üzerine yerleştirin. Anesteziyi burun konisine aktarın ve isofluran seviyesini %2-3'e düşürün.
3. Cerrahi Hazırlık
- Küçük hayvan makaskullanarak ventral boyun bölgesinde tüm saç kaldırmak. Cilt çentik veya jilet döküntü üreten önlemek için özenle dikdörtgen bir desen tıraş. Intradermal lidokain (4 mg/kg) ve bupivacaine (2,5 mg/kg) kullanarak tıraş bölgesine lokal anestezi uygulayın.
- Povison-iyot ve steril pamuk lu bezlerin %70 etanol fırçalanması uygulaması ile boynu hazırlayın. Povison-iyot ve %70 etanolün alternatif olarak 3kat uygulandığı nı tekrarlayın.
- Ayak-çimdik refleks ilerde anestezi derinliğini onaylayın. Cerrahi anestezi düzlemi için gerekli minimum oranda isofluran seviyesini koruyun. Boyun bölgesini ortaya çıkaran steril tek kullanımlık kesik perdeler kullanarak, hayvan örtün.
4. Bilateral Karotis Arter Ligasyonu
- Tek kullanımlık #11 neşter bıçağı ile boyun merkezinde 1,5 cm'lik orta hat kesiği yapın. İnce hemostatlar ve kavisli forceps kullanarak, açık sözlü karotis arteraşağı inceltmek. Arteri ilişkili nörovasküler paketten uzaklaştırın.
- Kavisli ince forceps bir çift kullanarak, arter altında steril 5-0 ipek dikiş bir döngülü 10 cm uzunluğunda geçmek. Sütürü ikiye böl. Dikişin her iki uzunluğunu da güvenli bir şekilde bağlayarak, düğümler arasında en az 2 mm bırakarak arteri sabit olarak sabit tutun. Dikişler arasında sol karotis arter transect, sinir bozulmadan bırakmak için özen.
- Sağ taraftaki diseksiyonu tekrarlayın. Tek bir steril 1/8 inç göbek bağı ile sağ karotis arteri ters çevirin. Cerrahi deri klipsleri ile yarakapatın.
- Hipoksiden önce hayvanın sıcaklık kontrollü bir su banyosunda en az 30 dakika boyunca toparlanmasına izin verin.
NOT: Arterler tamamen nörovasküler paketin geri kalanından izole değilse, artmış mortalite önce veya daha sonra hipoksi sırasında görülebilir.
5. Sıralı Hipoksi, Hiperoksi ve Hipoksi
- Hipoksi ve hiperoksisırasında, sentinel hayvan(lar) 37 °C'de hipoksi sırasında rektal sıcaklığı korumak için gerekli olan su banyosu sıcaklığını değiştirin.
- Hayvanları bir su banyosu içinde hava geçirmez bir odaya yerleştirin. Oda içindeki oksijen konsantrasyonu ve en az bir nöbetçi hayvandaki rektal sıcaklığı sürekli olarak izler. Odayı nemlendirilmiş %9 oksijen (%91 azot) ile yıkayın ve oda büyüklüğüne bağlı olarak 3-5 L/dk akış hızı koruyun. Haznedeki oksijen konsantrasyonu %9'a ulaştığında 30 dakika devam edin.
- 30 dakika sonra gaz arzını %80 nemlendirilmiş oksijene (%20 azot) geçirin ve odanın akış hızı ve oda büyüklüğüne göre hedef konsantrasyona ulaşmasını bekleyin. 30 dakika hiperoksiye devam edin. Oda havası ile dengeleyerek normoksiye daha hızlı ulaşmasını sağlamak için odayı açın.
- Hazneyi kapatın ve %9 nemlendirilmiş oksijenle temizleyin. Bradipne gösteren hayvanları dikkate alarak tüm hayvanları sürekli olarak görsel olarak izleyin. Haznedeki oksijen konsantrasyonu %9'a ulaştığında 30 dakika devam edin. Hayvanlardan herhangi birinde intra-hipoksik mortalite (solunum durması) 30 dk.lık sürenin bitiminden önce görülürse, hipoksiyi hemen sonlandırın.
6. Sağ Karotis Arter Ligasyonuters
- Hayvanları cerrahi bölgeye geri döndürün ve %3 isofluran karışımında %100 oksijen ile dengelenmiş anesteziye neden olur. Anesteziyi burun konisine aktarın ve isofluran seviyesini %2-3'e düşürün. Cerrahi yara kliplerini çıkarın ve povison-iyot ile yara bölgesini yeniden hazırlayın. Ayak-çimdik refleks ilerde anestezi derinliğini onaylayın. Anestezi nin cerrahi düzlemi için gerekli minimum yüzdede isofluran seviyesini koruyun. Boyun bölgesini ortaya çıkaran steril tek kullanımlık kesik perdeler kullanarak, hayvan örtün.
- Kavisli forceps kullanarak, tanımlamak ve sağ karotis arterden göbek bandı çözer. Cerrahi deri klipsleri ile yarakapatın.
7. Geri Kazanım ve Sıcaklık Yönetimi
- Hemşirelik ve iyileşme için, 60 dakika boyunca onların jills için tüm kitleri dönün. 60 dk sonra yaralı hayvanları 37-40 °C'de 6 saat su banyosuna geri döndürün ve rektal sıcaklığı 36-37 °C'de tutmak için su sıcaklığını gerektiği gibi ayarlayın. Kitleri jilllerine geri ver.
- Ameliyattan 10-14 gün sonra cerrahi klipleri çıkarın (P27–P31).
8. Refleks Testi
- Tüm refleks testlerini p21-P28'den günlük olarak, P28-P42'den haftada en az 3 x yapın ve maruz kalma (veya tedavi) grubuna karşı kör kalır. Refleks testinden önce kitleri 1 saat boyunca ısı yardımı (37 °C su banyosu, ısı yastığı, vb.) içeren bir odaya yerleştirin. Her test için, bir sonraki kiti test etmeden önce kit başına tüm denemeleri tamamlayın.
- Negatif geotaksis (25°)
- Kurulun tabloyla 25° açı kurabilmesi için emici bir tezgah koruyucusuna sarılmış düz bir tahta (16 1/2 in. x 12 in.) yerleştirin. Tahtaya eğilimli ve yokuş aşağı bakan bir kit yerleştirin, tahta yukarı yol yaklaşık% 75.
- Kitin gövdesinin düz olduğundan ve dört pençesinin de onu bırakmadan önce tahtaya doğru kavradığından emin olun. Kit yerleştirilir yerleştirilmez saat değerlendirmesine başlayın.
- Kitin vücudunu başlangıç konumuna göre 90° döndürmeyi başardığı zamanı kaydedin. Kitin gövdesini 180° döndürdeği zamanı kaydedin ve tahtanın tepesine doğru tam bir adım atın. Bir sonraki teste geçmeden önce 25° eğimde 3 deneme gerçekleştirin.
- Negatif geotaksis (45°)
- Daha önce açıklanan negatif geotaxis testinin 3 denemesini tekrar gerçekleştirin, bu kez kurulu 45° açıya ayarlayın.
- Uçurum dankaçınma
- Onlar düşerse kitleri yaralanmayı en aza indirmek için çıkıntı nın yaklaşık 1 ayak etrafında yastıklı bir platform yerleştirin.
- Laboratuvar bankının kenarına bakan ve dik bir kit yerleştirin. Ön pençeleri kenarı ile floş ile kitin gövdesi düz olduğundan emin olun. Kitin yerleştirildiği andan itibaren saat değerlendirmesine başlayın. Bilinçli hareket uzak uçurumdan ve koordine yürüyüş içermeyen diğer spontan hareketleri ayırt etmek için özen.
- Kitin gövdesini kenardan uzaklaştırıp hareket ettirdiği zamanı kaydedin (kitin geri alınması, gövdesinin dönmesi veya ön uzuvlarının kenardan uzaklaştırılması olarak tanımlanır). Kitin ilk adımını kenarın ters yönünde tamamlayişini kaydedin (başlangıç konumundan kenara bakan 90° dönüşü geçmiş herhangi bir yön veya açı olarak tanımlanır).
- Bir sonraki teste geçmeden önce kit başına 3 uçurum kaçınma denemesi gerçekleştirin.
- Düzeltme refleksi
- Bir kit supine bankta yerleştirin, yavaşça bu pozisyonda tutarak bırakmadan önce ve aynı anda kronometre başlar. Kitin kendini dört pençeyle aynı anda ağırlık taşıyan pozisyonlarda tezgaha karşı düz olarak dinlendirmek için getirdiği zamanı kaydedin. Kitin herhangi bir yönde tam bir adım attığı zamanı kaydedin (vücudun dönmesi veya sürüklenmeden belirli bir yönde ilerleme kaydetmek için dört patinin de yerleştirilmesi olarak tanımlanır).
- Hayvan başına doğru refleks testi 5 denemeler gerçekleştirin.
- Her kit 5 düzeltme refleks denemeleri tamamladıktan sonra, jill için çöp dönmek.
9. Podyum Testi
- P42'de, jill'den kitleri çıkarın. Kitleri test etmeden önce yaklaşık 10 dk plastik kafeslere yerleştirin, böylece çevreye alışabilirler. Ortam ışığının podyum işlevini etkilemediğinden emin olmak için test odasındaki ışıkları kapatın.
- İlgili yazılımda yeni bir deneme oluşturun. Maksimum çalışma süresi nin 10,00's'yi ve minimum çalışma süresinin 1,50 s'den az olmaması için deneysel ayarları ayarlayın. Her hayvan için en az üç uyumlu çalıştırma gereksinimi ayarlayın.
- Yürüme yolunun genişliğini hayvanın büyüklüğüne göre ayarlayın, böylece duvarlara dokunmadan serbestçe locomote edinebilir ve tornalamayı engelleyecek kadar dar kalır. Otomatik algılamayı kullanarak Algılama ayarları profilleri sekmesine yeni bir algılama ayarı ekleyin. Belirli bir yaştaki tüm çöpler ve hayvanlar için aynı algılama ayarlarını kullanın.
- Her hayvandan önce ve sonra düşük tiftikli kağıt mendil ve %70 etanol ile geçiti iyice temizleyin. Algılama ve sınıflandırma doğruluğunu artırmak için gelincik pençelerini düzenli olarak temizleyin. Bir kez geçit ve hayvan hazırlanır, deneme edinimi başlar.
- Ayak izleri camda birikirse veya hayvanlar idrar veya dışkı geçirirse podyumu temizlemek için kazanımı duraklatın. Podyum yazılımı önceden belirlenmiş deneme ayarlarına dayalı olarak üç uyumlu çalıştırmayı tanıyınca satın almayı durdurun.
10. Açık Alan Testi (P42)
- Gözenekli olmayan akrilik bir kutu (55 cm x 55 cm x 40 cm yüksekliğinde) mat-beyaz boyalı kullanın. Kamerayı doğrudan kutunun üzerine ortalanmış ve dört duvar da yakalanıp olacak şekilde konumlandırın. Test arenasını ilk kullanımdan önce ve hayvanlar arasında %70 etanol ile temizleyin.
- İlgili yazılımda Şablondan Yeni'yi seçin ve Önceden Tanımlanmış Bir Şablon Uygula'yıseçin. Konu türü: Diğer; Arena şablonu: Açık alan, kare; Bölge şablonu: Merkez, kenarlık, köşeler; İzlenen özellikler: Merkez noktası.
- Arena Ayarları'nı açın ve kamera girişlerinden arka plan görüntüsünü alın ve arena duvarlarının üstlerinin görünür olmasını sağlar. Ölçek aracını kullanarak arenanın boyutlarını kalibre edin.
- Anahatları duvar bölgelerine (NW, NE, SW, SE) ve taban bölgelerine (sol üst, orta üst, sağ üst, sol orta, orta, sol alt, orta alt, sağ alt) uyacak şekilde yeniden boyutlandırmak üzere önceden tanımlanmış arena bölgelerini ayarlayın. Hiçbir bölge çakışma dığını doğrulamak için kurulumu doğrulayın.
- Edinme penceresini açın ve Başlat Edinme'yebasın. Gelinciği test alanının merkezine, her denek için tutarlı bir şekilde yerleştirin. Gelinciğin 5 dakika boyunca arena boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin. Test döneminin sonunda, Satın Almayı Durdur'abasın. Bir sonraki gelincik ile işlemi tekrarlayın.
NOT: Odadaki tüm deneyciler gelincik tarafından gözlemlenememelidir ve test süresi boyunca sessiz kalmalıdır.
11. Fiksasyon-perfüzyon
- P42'de % 5 isofluran eki ile kitleri derinlemesine anestezi. Pentobarbital aşırı doz (120-150 mg/kg i.p.) uygulayın. Parmak sıkışması ve solunum hareketleri kaybına yanıt eksikliği ile derin anestezi sağlamak.
- Hayvanı duman kaputuna aktarın. Toraks açın ve ince hemostatlar kullanarak alçalan aort kelepçe. Sağ atriyumu kes. Perfüzyon pompası kullanarak, sol ventrikülü 60 mL steril salin ile 30 mL/dk. Perfuse ile 60 mL formalin (%10 formaldehit) ile 30 mL/dk oranında perfüzyonlayın.
- Karkas decapitate ve makas, forceps, rongeurs ve bir spatula kullanarak kafatası ndan beyin çıkarın. Her beynin dorsal, ventral ve lateral yönlerini yüksek çözünürlüklü fotoğraflar çekin. En az 48 saat formalin de beyin düzeltmek post-fix.
12. Ex Vivo Beyin Ölçümü
- Formalin (adım 11.3) gelen beyin çıkarın ve aşırı sıvı emmek için bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.
- Elektronik kaliper kullanarak, beynin dorsal ve ventral yönlerini kaliper uçlarını yerleştirerek beynin yüksekliğini ölçmek. Koku ampul ve oksipital lob en posterior sınır kaliper uçlarını yerleştirerek beynin uzunluğu ölçün. Temporal lobların en lateral kısımlarında kaliper uçlarını yerleştirerek beynin genişliğini ölçün. Beyni tart.
- Ölçü uzunlamasına çatlak (çapraz sulkus anterior ve posterior), lateral sulci, suprasylvian sulci, koronal sulci, pseudosylvian sulci, ansinat sulci, çapraz sulci, presylvian sulci, lateral gyri, suprasylvian gyri, sigmoid gyri ( anterior ve posterior), koronal gyri, ektosylvian gyri (anterior ve posterior), ve orbital gyri. Karşılık gelen sulkus en belirgin bölümünün başından ve sonundan itibaren tüm sulci ölçün. Her karşılık gelen girus en geniş açıdan tüm gyri ölçün.
- Kaliperin bir ucunu uzunlamasına fissürün en arka noktasına yerleştirerek ve kaliperin diğer ucunu serebellumun en posterior kısmına yerleştirerek maruz kalan serebellum miktarını ölçün.
NOT: Gelincik beyin atlası, Biyoloji ve Koncik Hastalıkları bulunan14, ex vivo gelincik beyin ölçümleri geliştirmek için kullanılmıştır.
13. Brüt Yaralanma Puanlama
- 11.3.'de çekilen fotoğrafları kullanarak, brüt beyin hasarının (0-9 ölçeği) değerlendirilmesini ve maruz kalma (veya tedavi) gruplarına karşı kör kaldığını değerlendirmek için 13.2-13.4 adımlarında puanlama kriterlerini uygulayın.
- Uzunlamasına çatlakları değerlendirin. Normal görünüyorsa, 0 puan atayın. Hafif çeşni (yaklaşık 2x normal genişlik) genişlenmiş ise, ancak genişlik artışı fissür uzunluğu boyunca eksikse, 1 puan atayın. Orta derecede genişlenmişse (yaklaşık 2-3x normal), 2 puan atayın. Belirgin bir şekilde genişlenirse, görünür bir boşluk >3x normal genişlikte fissür uzunluğunun çoğu boyunca, 3 puan uygulayın.
- Lateral sulci'yi değerlendirin. Onlar normal tanımı gösterirse, lateral gyri ve suprasylvian gyri ayrılması ile, 0 puan atayın. Eğer hafif tek taraflı veya bilateral azaltılmış sulkus tanımı görülürse, özellikle kaudal kısımda, oksipital loblara göre frontal ve temporal loblarda en az daralma ile, 1 puan atayın.
- Sulci orta derecede azaltılmış tanımı görülürse, suprasylvian gyri depresyonu ile, koronal ve ektosylvian gyri daralma, ve oksipital loblara göre frontal ve temporal lobların hafif daralma, 2 puan atamak. Tek taraflı kistik dejenerasyon görülürse, kontralateral hemisferin minimal değişimi ile, 3 puan atayın. Lateral sülcinin kötü tanımı mevcutsa, oksipital ve temporal lobların bilateral kistik veya şiddetli dejenerasyonu ile 4 puan atayın.
- Beyincik görünür kısmını değerlendirmek. Normal görünüyorsa, haşaratların %75'i ve %66'sı görünür, 0 puan atar. Eğer haşaratların %75-90'ı ve %66'sı görülebiliyorsa, 1 puan atayın. Eğer beyincik lerin çoğu görünürise, hemisferlerin tüm vermisve ≥%66'sını gösterirse, 2 puan atarsınız.
14. Veri Analizi
- Refleks test verileri için, hataları 61 s puan atamak onları zaman sonunda başarıları ile karşılaştırıldığında izin vermek (60 s), ancak istatistiksel analizde daha kötü bir sıralama ile. Refleks testlerinin her birinde zaman içinde her hayvan için eğrinin altında bir alan hesaplayın.
- Hayvanın ağırlığına göre pençe basıncı nı içeren podyum verilerini ayarlayın.
- Verileri parametrik olmayan istatistiksel yöntemler kullanarak analiz ederek, ortanca ve interquartile aralığı (IQR) kullanarak verileri açıkla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
34 (n = 18 erkek, n = 16 dişi) hayvan altı çöpten hakarete maruz kalan, sekiz hayvan (%24; n = 4 erkek, n = 4 kadın) yaralı grupta ikinci hipoksi döneminde (n = 5), sıcaklık yönetimi sırasında (n = 2) veya bir gece boyunca hakaretten sonra (n = 1). Yaralı grupta, 26 kurtulandan dokuzu (%35) görünür brüt yaralanma vardı. Beş hayvan (n = 5 erkek) orta derecede yaralanmış, dört hayvan (n = 2 erkek, n = 2 dişi) sırasıyla brüt patoloji skorları olarak tanımlanan ağır yaralanmalara sahipti (Şekil 2A). Bu nedenle hakarete maruz kalan hayvanların %50 ölüm veya ciddi bir ağır yaralanma riski vardır. Artan yaralanma ile, temporal ve / veya oksipital loblarda gyri daralması görülür, ilişkili sülkal kısalma ile, uzunlamasına çatlak genişlemesi, ve en ağır yaralı hayvanlarda kistik doku kaybı alanlarının geniş alanlar(Şekil 2B). Hayatta kalan yaralı hayvanlarda (n = 26; n = 14 erkek, n = 12 dişi), serebellumun önemli ölçüde daha fazla maruz kaldığı görülür(Şekil 3A), boylamsal çatlak ların kısalması(Şekil 3D). Ayrıca koronal ve anterior ektosylvian gyri önemli daralma (Şekil 3B,E), yanı sıra lateral ve suprasylvian sulci kısaltma (Şekil 3C,F). Ortanca (IQR) beyin ağırlığı kontrol hayvanlarında 8.1 g (7.9-9.7g, n = 6) ve yaralı hayvanlarda 7.0 g (6.5-7.7 g) idi (n = 26, p = 0.005). Kontrol hayvanlarında, yaralı hayvanlarda 27,5 mm (25,5-38,0 mm, n = 26) ile karşılaştırıldığında ortalama (IQR) beyin uzunluğu 28,9 mm (27,9-29,6 mm, n = 6) idi ( p = 0,007). Benzer desenler beyin de görülür, ortanca genişlik ve yüksekliği ile 5-7% yaralı hayvanlarda daha küçük. Hem sol hem de sağ taraftaki anatomik yapılar benzer şekilde etkilenir ve hemisferler arasında fark yoktur. Anatomik konumların tasvirleri için Şekil 1B'ye bakınız. Refleks test süresi boyunca (P21–P39), yaralı hayvanlar negatif geotaxis görev döndürmek için daha yavaş zaman görüntüler (Şekil 4A), uçurum kaçınma görevinde kenardan uzağa döndürmek için daha yavaş zaman (Şekil 4B), ve sağa daha yavaş zaman (Şekil 4C). Podyumda, yaralı hayvanlar kontrollere benzer bir ortalama hıza sahiptir(Şekil 5A), ancak her çalışma sırasında önemli ölçüde daha büyük bir hız değişimi gösterirler(Şekil 5B). Ön patiler ve arka patiler arasındaki ağırlık ayarlı mesafe (baskı pozisyonu) yaralı hayvanlarda önemli ölçüde daha fazladır(Şekil 5C),ön patiler aracılığıyla birim pençe alanı başına daha az basınç uygulanan(Şekil 5D). Açık alanda, yaralı hayvanlar toplam mesafeyi daha az kaplar(Şekil 6A), ve daha sık dururlar (Şekil 6B). Alanın merkezinde önemli ölçüde daha fazla, köşelerde ise daha az zaman harcarlar (Şekil 6C,D). Kontrol ve yaralı hayvanların temsili ısı haritaları Şekil 7A,B'degösterilmiştir.
Şekil 1: Zaman çizelgesi. P17'de hayvanlara bilateral karotis arter ligasyonu ndan önce 3 mg/kg LPS ve her biri 30 dk (odanın dengelenme süresi hariç) hipoksi (%9 oksijen), hiperoksi (%80 oksijen) ve hipoksi (%9) uygulanır. Sağ karotis arter ligasyonu sonra ters. Hayvanlar, yaralanma sonrası dönemde yuvada kendiliğinden hipotermik hale geçmemeleri için 6 saat normothermiye maruz kalırlar. Refleks testi daha sonra P21-P28 günlük yapılır, ve P28-P42 haftada üç kez. P42'de hayvanlar kurban edilmeden önce podyumda ve açık alanda test edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili yaralanma dağılımı ve tasviri. (A) Yaralı grupta bulunan 26 kazazededen (n = 14 erkek, n = 12 kadın) kaynaklanan brüt yaralanma, altı çöp eşkontrolüne göre. Beş hayvan (n = 5 erkek) orta derecede, dört hayvan (n = 2 erkek, n = 2 dişi) sırasıyla 2-5 ve 6-9 brüt patoloji skorları olarak tanımlanan ağır yaralanmavardı. Grafik, interquartile aralığı ile ortanca gösterir. (B) Kontrol beyni (sol panel, skor 0), beyinler soldan sağa, 9 toplam olası puanı 2, 5 ve 8 artan brüt yaralanma puanları gösteren. Kontrol beyin özellikle yaralanma yatkın anatomik yapılar gösterir; 1 = longitudinal fissür, 2 = lateral sulkus, 3 = suprasylvian sulkus, a = koronal girus, b = anterior ektosylvian girus. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsili beyin ölçümleri. Kontrollere göre (n = 6), yaralı hayvanlar (n = 26) serebellumun(A)maruziyetinin önemli ölçüde arttığını, uzunlamasına fissür(D),koronal (B) ve ön ektosylvian (E) gyri daralması ve lateral (C) ve suprasylvian (F) sulci'nin kısaltılması dır. Grafikler, interquartile aralığı ile ortanca gösterir. *p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-testi) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili refleks gelişimi. Kontrollerle karşılaştırıldığında (n = 6), yaralı hayvanlar (n = 26) negatif geotaxis(A),uçurum aversiyon (B), ve düzeltme refleksi(C)daha yavaş gelişme (eğrinin altındaki alan, AUC) görüntüler. Grafikler, interquartile aralığı ile ortanca gösterir. *p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-testi) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temsili podyum sonuçları. Kontrollerle karşılaştırıldığında (n = 6), yaralı hayvanlar (n = 26) benzer bir ortalama hızda yürürler(A),ancak yürüme sırasında hız da daha fazla değişkenlik gösterirler(B). Yaralı hayvanlar da birim alan başına daha az basınç uygulanan daha uzun bir ortalama baskı pozisyonu(C),görüntülemek(D). Grafikler, interquartile aralığı ile ortanca gösterir. * p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-testi) ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Temsili açık alan davranışı. Kontrollere göre (n = 6), yaralı hayvanlar (n = 26) daha küçük bir toplam mesafeyi(A),daha sık dururken(B). Yaralı hayvanlar da merkezde daha fazla zaman harcamak(C) köşelerinde daha(D). Grafikler, interquartile aralığı ile ortanca gösterir. *p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-testi) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Temsili açık alan ısı haritaları. (A) kontrol kadın, (B) yaralı kadın. Yaralı hayvanlar açık alan içinde önemli ölçüde daha küçük bir mesafe yi kaplarlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelincik beyni ve insan beyni arasında paylaşılan fiziksel ve gelişimsel benzerlikler nedeniyle, gelincik giderek hem yetişkin hem de gelişimsel beyin hasarı modellemek için kullanılmaktadır. 8,9,10,11,12. Ancak, bugüne kadar yapılan araştırmalar gelincik beyninin hem ilk yaralanmaya hem de yüksek plastiklere karşı dirençli olduğunu ve davranış açıklarının görünür patolojik yaralanma ortamında bile zamanla azaldığını göstermektedir10,12. Burada, geç preterm eşdeğer gelincik iltihabı duyarlı hipoksik-iskemik (HI) beyin hasarının ilk modelini açıklıyoruz, bu da hayatta kalanlarda önemli ikili yaralanma ve sürekli davranış açıkları ile sonuçlanmaktadır. Herhangi bir preklinik modelde olduğu gibi, amaç preterm bebeklerin klinik olarak karşılaştıkları maruziyetleri doğru bir şekilde çoğaltmak değil, erken beyin hasarında rol aldığı düşünülen mekanistik faktörlerin bir araya gelmesidir. Bu inflamasyon dahil, hipoksi, ve oksidatif stres7.
Gelincik modellerimizde LPS uygulamasının kritik bir yönü hipoksiden önce 4 saat civarında verilen tek bir yüksek dozdur. Yakın dönem eşdeğer kemirgenlerde LPS maruziyeti, maruz idraden sonra 4 saat civarında dolaşan inflamatuar sitokin pik ile sonuçlanır, hangi hipoksi-iskemi beynin sensitizasyonu ile karşılık gelir, ve beyin hasarı önemli bir artış15,16,17. İnflamatuar sitokin salınımının benzer bir zaman seyri (lps maruziyetinden sonra 2-4 saat sonra pik TNF-α ve IL-6 salınımı) izole gelincik periferik kan mononükleer hücrelerinde görülür18. Tek bir cerrahi kurulum varsayarsak, cerrahi başlamadan önce LPS 30-60 dk uygulanması yeterli zaman için yeterli zaman sağlar 12-15 bilateral karotis arter ligasyonları gerçekleştirmek ve ilk hipoksi pozlama başlatmak 4 saat LPS uygulamadan sonra. Model geliştirme sırasında P10 yaralanma modeli12'deaçıklandığı gibi, başlangıçta 5 mg/kg LPS dozu kullanılmıştır. Ancak bu LPS dozu nekropsi de anlamlı intra-hipoksik mortalite ve pulmoner ödem ile ilişkiliydi. LPS dozu 3 mg/kg'a düşürülerek hem mortalite hem de pulmoner ödem azaltıldı.
Hipoksi maruziyeti sırasında, önemli brüt yaralanmayı sağlamak için bir dizi faktör kritik görünürken aynı zamanda yüksek mortalite düzeylerini de önlemektedir. Laboratuvar gelinciklerinin dışlanmadan dolayı, çöpler arasında hipoksi toleransında doğal bir değişkenlik vardır. Deneyimlerimize göre, çapraz koruyucu hayvanlar veya aynı hipoksi odasında farklı çöp hayvanları birleştirerek ağırlıklı olarak en duyarlı çöp büyük hayvan veya hayvanların önceki ölüm sonuçları. Hedef 30 dk hipoksi maruziyeti ve hipoksi erken durdurulmadan daha duyarlı hayvanlar ölürse, daha az duyarlı olan çöplerden daha küçük hayvanlara suboptimal hipoksi maruziyeti verilir ve önemli bir yaralanma yadapek olasılıkları düşüktür. Sonuç olarak, hayvanların her çöp kendi ayrı oda içinde hipoksi maruz kalmalıdır. İkinci hipoksi dönemi, daha önce12olarak tanımladığımız yinelemeli model geliştirme sürecinin bir parçası olarak eklenmiştir. Tek bir hipoksi dönemi, uzunluğu ne olursa olsun, önemli bir yaralanma olmadan ölüm ya da sağkalım ile sonuçlandı.
Gelincikler önemli beyin hasarı göstermeden akut hipoksi veya bilateral karotis arter ligasyonuuzun tolere edebiliyoruz, bizim mevcut hipotez hiperoksia dönemi yüksek metabolizma ve vazodilatasyon sonuçları olduğunu kolaylaştırır ikinci hipoksi döneminde beyin iskemi. Modeldeki değişkenliği en aza indirmek için, P15'teki tesisimize gelen 8 gelincikten önceden sipariş edilmiş seks dengeli çöpler kullandık. Her çöpte 6-7 hayvan ameliyat oldu ve ardından tek bir oda içinde hipoksi uygulandı.
Hipoksi ve sağ karotis arter ligasyonu ters sonra, hayvanlar uzun süreli yaralanma protokolü dehidratasyon ve hipoglisemi riski nedeniyle beslemek için bir süre için onların jills iade edilmelidir. Sıcaklık yönetimi döneminde önemli mortalite yaşanırsa, 6 saat boyunca su banyolarına konulmadan önce hayvanlara ek sıvı resüsitasyonu (deri altı tuzlu ve/veya formül ve su ile elle beslenme) gerekebilir. Sıcaklık yönetimi süresi, ancak, uzun süreli yaralanma kritik bir belirleyici, hayvanlar aksi takdirde yuvada göreceli hipotermi nörokoruma karşılaşabilir gibi. Bu hipotermi riski en azından kısmen gelincik için gerekli olan barınma koşullarının düşük sıcaklığından kaynaklanmaktadır (60-70 °F).
Açıklanan davranıştestleri büyük ölçüde laboratuvar içinde geliştirilmiştir, daha önce gelişmekte olan gelincik açıklanan refleks testleri bazı temelile19, podyum ve açık alan testleri yetişkin kemirgenler genç gelincikkullanılmak üzere uyarlanmış. Diğer gruplar da açık alan tarif var, labirent, travmatik beyin hasarı sonrası yetişkin gelinciklerde yürüyüş testi10, yetişkin gelinciksosyal etkileşim üzerinde rahim iltihabı etkisi20. Uzun bir oruç süresi kısa bağırsak geçiş süresi nedeniyle gelincikler tavsiye edilmez rağmen, herhangi bir test önce 30-60 dakika için bir hayvan taşıyıcı yerleştirerek onları testlerden önce idrar ve dışkı geçmek için izin vermek için yararlıdır. Gelincik doğası gereği meraklı bir hayvan olduğu için, genellikle bu davranış testlerinde kemirgenlere ters bir şekilde davranarak. Bu özellikle podyumda belirgindir, ışıklar ve sesler, özellikle başka bir gelincik vokal kayıtları ("dooking"), ileri yürümek için gelincik motive etmek için kullanılabilir.
Geçerli protokolün bazı sınırlamaları vardır. P10 gelincik12daha önce geliştirilen yöntemler kullanılarak yinelemeli olarak geliştirilmiş olduğu gibi, şu anda lps göreli katkıları bilmiyorum, hipoksi, hiperoksi, ve görülen yaralanma son derecesine reperfüzyon. Ancak, burada açıklanan yöntemin geliştirilmesi orijinal Vannucci modeli kullanılarak dahil dikkati çekiyor (tek taraflı karotis arter ligasyonu hipoksi tek bir dönem takip) gelincik21, hangi herhangi bir önemli yaralanmaya neden olmadı. Bu nedenle, yaralanma protokolünün birden fazla bölümü arasındaki etkileşimler sürekli yaralanma için gerekli olabilir. Buna rağmen, hayatta kalan hayvanlarda brüt yaralanma belirgin bir değişkenlik kalır, hangi başka bir potansiyel sınırlama. Önemli brüt yaralanma olmadan hayvanlar MRI veya histopatoloji12kullanılarak tespit edilebilir yaralanma olabilir rağmen, model üzerinde gelecekteki çalışma denemek ve önemli yaralanma sürdürmek hayvan sayısını artırmak için yinelemeler içerecektir, örneğin kalıcı bilateral karotid arter ligasyonu kullanarak. Son olarak, bu modelin gelişimsel beyin hasarı için putatif nöroprotektif tedavileri test etmek için maksimum yararlı olması için, ya insan yenidoğanlarda HI beyin hasarının tedavisi için kurulan nöroprotektif ajanların etkinliğini değerlendirerek doğrulanmalıdır, ya da yenidoğan beyin hasarı diğer hayvan modelleri bir dizi başarılı olmuştur. Gelecekteki çalışmalar bu nedenle bu modelde terapötik hipotermi ve eritropoietin etkinliğini değerlendirecektir, cinsiyete dayalı terapötik yanıtlar ve ex vivo MRI dahil12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Modelin geliştirilmesi Bill ve Melinda Gates Vakfı yanı sıra NIH hibe 5R21NS093154-02 (NICHD) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
