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Neuroscience

सूजन से संवेदनशील देर से अपरिपक्व हाइपोक्सिक-इस्कीमिक ब्रेन इंजरी का फेरेट मॉडल

Published: November 19, 2019 doi: 10.3791/60131
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatology, Department of Pediatrics, University of Washington, 2Department of Comparative Medicine, University of Washington

Summary

विधि P17 फेरेट में सूजन से संवेदनशील हाइपोक्सिक-इस्कीमिक और हाइपरऑक्सिक मस्तिष्क की चोट का वर्णन करती है ताकि कई देर से अपरिपक्व शिशुओं में अनुभवी लंबे समय तक सूजन और ऑक्सीडेटिव मस्तिष्क की चोट के बीच जटिल बातचीत को मॉडल किया जा सके।

Abstract

प्रसवकालीन संक्रमण और हाइपोक्सिया-इस्केमिया (एचआई) के चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडलों की चल रही आवश्यकता है जिसमें प्रीमैच्योरके न्यूरोलॉजिकल सीक्वेला के साथ शिशुओं के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेपों का परीक्षण किया जा सके। फेरेट्स अपरिपक्व मानव मस्तिष्क मॉडलिंग के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं, क्योंकि वे लिसेसेन्सेफेलिक पैदा होते हैं और प्रसवोत्तर दिमाग विकसित करते हैं। जन्म के समय, फेरेट मस्तिष्क विकास 13 सप्ताह के मानव भ्रूण के समान है, प्रसवोत्तर दिन (पी) 17 किट के साथ 32-36 सप्ताह के गर्भ में एक शिशु के बराबर माना जाता है । हम P17 फेरेट में एक चोट मॉडल का वर्णन करते हैं, जहां लिपोपॉलीसैक्राइड प्रशासन के बाद द्विपक्षीय सेरेब्रल इस्केमिया, हाइपोक्सिया और हाइपरऑक्सिया होते हैं। यह मस्तिष्क की चोट विकसित करने वाले कई नवजातों में अनुभवी लंबे समय तक सूजन, इस्केमिया, हाइपोक्सिया और ऑक्सीडेटिव तनाव की जटिल बातचीत का अनुकरण करता है। घायल जानवरों में कई कॉर्टिकल गायरी और संबद्ध सल्सी को कम करने सहित मस्तिष्क में रूपात्मक परिवर्तन के साथ सकल चोट की गंभीरता की एक श्रृंखला प्रदर्शित होती है। घायल जानवरों को भी धीमा पलटा विकास, धीमी और एक स्वचालित कैटवॉक में लोकोमोशन की अधिक चर गति दिखाने के लिए, और एक खुले क्षेत्र में अंवेषण में कमी आई । यह मॉडल एक मंच प्रदान करता है जिसमें सूजन और एचआई से जुड़े नवजात एन्सेफेलोपैथी वाले शिशुओं के लिए ख्यात उपचारों का परीक्षण करने के लिए, चोट के अध्ययन तंत्र जो कॉर्टिकल विकास को प्रभावित करते हैं, और उन रास्तों की जांच करते हैं जो लचीलापन प्रदान करते हैं अप्रभावित जानवर।

Introduction

बड़े पशु मॉडलों की निरंतर आवश्यकता है जो प्रीमैच्योरिटी और प्रसवकालीन हाइपोक्सिया-इस्केमिया के रोगविज्ञान को प्रतिबिंबित करते हैं जिसमें शिशुओं के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेपों का परीक्षण किया जा सकता है। 2017 में, संयुक्त राज्य अमेरिका में पैदा हुए 382,726 शिशुओं में से 9.93% अपरिपक्व पैदा हुए थे, और इनमें से 84% शिशुओं का जन्म 32 और 36 सप्ताह के गर्भ1के बीच हुआ था। समय से पहले शिशुओं में, संक्रमण या सूजन के लिए प्रसवकालीन संपर्क आम है, जहां वायरल या बैक्टीरियल रोगजनकों के कारण मातृ प्रतिरक्षा सक्रियण अपरिपक्व श्रम शुरू कर सकता है। प्रसवोत्तर, अपरिपक्व शिशुओं को जल्दी या देर से शुरू सेप्सिस2का उच्च जोखिम होता है। अपरिपक्व शिशुओं को भी अक्सर हाइपोक्सिया, हाइपोटेंशन और हाइपरऑक्सिया की अवधि का अनुभव होता है क्योंकि उनके अपरिपक्व कार्डियोरेस्पिरेटरी सिस्टम, गर्भाशय में अनुभवी लोगों के सापेक्ष वातावरण में ऑक्सीजन तनाव बढ़ा या फिर इट्रो, और आयट्रोजेनिक एक्सपोजर। इसके अतिरिक्त, अपरिपक्व शिशुओं में, एंटीऑक्सीडेंट सुरक्षा अपरिपक्व3 और समर्थक अपोप्टोटिक कारक स्वाभाविक रूप से अपरेचित4हैं । ऑक्सीडेटिव तनाव और कोशिका मृत्यु प्रतिरक्षा प्रणाली और न्यूरोसूजन की सक्रियता का कारण बनती है। इन संयुक्त कारकों को मस्तिष्क की विकासात्मक और शारीरिक भेद्यता में योगदान करने के लिए सोचा जाता है, और अपरिपक्व शिशुओं5,6,7में खराब विकासात्मक परिणामों से जुड़े एन्सेफेलोपैथी का परिणाम हैयाबढ़ा देता है।

मानव मस्तिष्क के साथ फेरेट मस्तिष्क के शेयरों की शारीरिक और विकासात्मक समानताओं के कारण, फेरेट एक आकर्षक प्रजाति है जिसमें मस्तिष्क की चोट8,9,10,11,12को मॉडल करना है। Ferrets भी अपरिपक्व मानव मस्तिष्क मॉडल के लिए आदर्श उंमीदवार हैं, के रूप में वे वंशानुगत पैदा होते है और gyrencephalic दिमाग का विकास प्रसवोत्तर, जो एक खिड़की है जिसमें विकासशील मस्तिष्क अपमान है कि अपरिपक्व पैदा शिशुओं द्वारा अनुभवी उन लोगों की नकल करने के लिए बेनकाब प्रदान करता है । जन्म के समय, फेरेट मस्तिष्क विकास 13 सप्ताह के मानव भ्रूण के समान है, जिसमें प्रसवोत्तर दिन (पी) 17 किट को गर्भ13के 32-36 सप्ताह में शिशु के बराबर माना जाता है।

हमारे समूह ने हाल ही में हाइपोक्सिया और हाइपरऑक्सिया12के बाद के एक्सपोजर के साथ एस्चेरिचिया कोलाई लिपोपॉलीसैक्राइड (एलपीएस) के साथ भड़काऊ संवेदीकरण के संयोजन से P10 फेरेट में बेहद अपरिपक्व (<28 सप्ताह के गर्भ) मस्तिष्क की चोट का एक मॉडल प्रकाशित किया है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, अब हम P17 फेरेट में एक देर से अपरिपक्व मॉडल का वर्णन करते हैं, जहां एलपीएस संवेदीकरण द्विपक्षीय मस्तिष्क इस्केमिया, हाइपोक्सिया और हाइपरऑक्सिया द्वारा पीछा किया जाता है। यह जानवरों के सबसेट में अधिक गंभीर चोट के परिणामस्वरूप होता है, और मस्तिष्क की चोट विकसित करने वाले कई अपरिपक्व शिशुओं में अनुभवी लंबे समय तक सूजन, इस्केमिया, हाइपोक्सिया और ऑक्सीडेटिव तनाव की जटिल बातचीत को अधिक बारीकी से मॉडल करता है।

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Protocol

प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए NIH गाइड के अनुसार और वाशिंगटन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा एक अनुमोदित प्रोटोकॉल के भाग के रूप में किया गया ।

1. तैयारी और एलपीएस प्रशासन

नोट: प्रक्रियाओं की एक समय रेखा के लिए चित्रा 1 को देखें।

  1. प्रक्रिया शुरू करने से पहले, सील, बंध्याकरण और सभी सर्जिकल उपकरणों और सर्जिकल पर्दे को ऑटोक्लेव करें। बाँझ शीशियों में प्री-ऑपरेटिव दवाएं तैयार करें। हाइपोक्सिया/हाइपरऑक्सिया चैंबर में हवा को 8-10 मिन में प्रायोगिक गैस से बदलने के लिए आवश्यक प्रवाह दर की गणना करें ।
  2. 1 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता पैदा करने के लिए बाँझ खारा में लिपोपोलिसाक्राइड (ई. कोलाई 055:B5 से एलपीएस) तैयार करें । उनके जिल्स से P17 फेरेट किट निकालें । वजन और उन्हें संख्या। कूड़े और सेक्स द्वारा जानवरों को नियंत्रण या घायल (या उपचार) समूहों में यादृच्छिक बनाना।
  3. एक ३०० μL इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना, चोट समूह में किट के लिए 3 मिलीग्राम/किलो एलपीएस इंट्रापेरिटोनी प्रशासन, और बाँझ खारा वाहन (3 μL/g) के बराबर मात्रा में जानवरों को नियंत्रित करने के लिए ।
  4. सर्जिकल प्रक्रियाओं में 36-37 डिग्री सेल्सियस के लक्ष्य गुदा तापमान को बनाए रखने के लिए 37-40 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान के भीतर एक कक्ष में जानवरों को रखें।

2. एनेस्थीसिया

  1. प्रक्रिया के दौरान, लगातार तापमान, श्वसन दर और जानवर की हृदय गति की निगरानी करें।
  2. शल्य प्रक्रिया से पहले बुप्रेनोरफिन (0.05 मिलीग्राम/किलो) को नीचे 30 मिनट का प्रशासन करें। 100% ऑक्सीजन के साथ संतुलित 3% आइसोफ्लोरीन के मिश्रण में संज्ञाहरण को प्रेरित करें। इंडक्शन चैंबर से किट निकालें और इसे एक लिपटी सर्जिकल वॉटर कंबल सेट पर 37 डिग्री सेल्सियस तक रखें। नाक शंकु के लिए संज्ञाहरण हस्तांतरण और आइसोफ्लोरीन स्तर को कम करने के लिए 2-3% ।

3. सर्जिकल तैयारी

  1. छोटे पशु कतरनी का उपयोग वेंट्रल गर्दन क्षेत्र पर सभी बाल हटा दें। त्वचा को निकिंग या रेजर दाने पैदा करने से बचने के लिए देखभाल के साथ आयताकार पैटर्न में दाढ़ी बनाएं। इनट्रेडरमल लिडोकेन (4 मिलीग्राम/किलो) और बुपिवाकेन (2.5 मिलीग्राम/किलो) का उपयोग करके मुंडा क्षेत्र में स्थानीय संज्ञाहरण का प्रशासन करें।
  2. बाँझ कपास झाड़ू के साथ पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल स्क्रब के वैकल्पिक आवेदन द्वारा गर्दन तैयार करें। स्क्रब को ऐसे दोहराएं कि पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल प्रत्येक लागू 3x बारी-बारी फैशन में हैं।
  3. टो-चुटकी पलटा की अनुपस्थिति के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रतिशत पर आइसोफ्लुरन का स्तर बनाए रखें। बाँझ डिस्पोजेबल कट-आउट पर्दे का उपयोग करना जो गर्दन क्षेत्र को बेनकाब करते हैं, जानवर को कपड़ा देते हैं।

4. द्विपक्षीय कैरोटिड धमनी लिगेशन

  1. स्केलपेल ब्लेड #11 एक उपयोग के साथ, गर्दन के केंद्र में 1.5 सेमी मिडलाइन चीरा बनाएं। ठीक हेमोस्टेट और घुमावदार संदंश का उपयोग करना, बाएं कैरोटिड धमनी के नीचे स्पष्ट रूप से विच्छेदन करें। संबंधित न्यूरोवैस्कुलर बंडल से दूर धमनी विच्छेदन।
  2. घुमावदार ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, धमनी के नीचे बाँझ 5-0 रेशम सीवन की एक लूप 10 सेमी लंबाई पास करें। सीवन को आधे में काट लें। सीवन की दोनों लंबाई को सुरक्षित रूप से बांधने से धमनी को लिगेट करें, जिससे समुद्री मील के बीच कम से कम 2 मिमी हो। सीवन के बीच बाईं कैरोटिड धमनी को ट्रांसेक्ट करें, तंत्रिका को बरकरार रखने का ख्याल रखते हुए।
  3. विच्छेदन को दाईं ओर दोहराएं। एक बाँझ 1/8 इंच नाल टाई के साथ सही कैरोटिड धमनी को श्रद्धापूर्वक लिगेट करें। सर्जिकल त्वचा क्लिप के साथ घाव बंद करो।
  4. हाइपोक्सिया से पहले कम से कम 30 न्यूनतम तापमान नियंत्रित पानी स्नान में जानवर को ठीक होने दें।
    नोट: यदि धमनियों को न्यूरोवैस्कुलर बंडल के बाकी हिस्सों से पूरी तरह अलग नहीं किया जाता है, तो मृत्यु दर में वृद्धि पहले या बाद में हाइपोक्सिया के दौरान देखी जा सकती है।

5. अनुक्रमिक हाइपोक्सिया, हाइपरऑक्सिया, और हाइपोक्सिया

  1. हाइपोक्सिया और हाइपरऑक्सिया के दौरान, प्रहरी पशु (एस) में हाइपोक्सिया के दौरान गुदा तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक पानी के स्नान के तापमान को बदलें।
  2. चोट समूह में जानवरों को पानी के स्नान के भीतर एक एयरटाइट कक्ष में रखें। लगातार कक्ष के भीतर ऑक्सीजन एकाग्रता की निगरानी, साथ ही कम से कम एक प्रहरी जानवर में गुदा तापमान। आर्द्र9% ऑक्सीजन (91% नाइट्रोजन) के साथ कक्ष फ्लश तो 3-5 एल/ एक बार कक्ष में ऑक्सीजन की एकाग्रता 9% तक पहुंच गई है, 30 मिन के लिए जारी है।
  3. 30 मिन के बाद, 80% आर्द्र ऑक्सीजन (20% नाइट्रोजन) के लिए गैस की आपूर्ति स्विच करें, और चैंबर को प्रवाह दर और कक्ष आकार के आधार पर लक्ष्य एकाग्रता तक पहुंचने की अनुमति दें। हाइपरऑक्सिया के 30 मिन के लिए जारी रखें। कक्ष खोलें कमरे की हवा के साथ समतुल्य करके इसे अधिक तेजी से नॉर्मोक्सिया तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए।
  4. कक्ष सील, और 9% आर्द्र ऑक्सीजन के साथ फ्लश। लगातार नेत्रहीन सभी जानवरों की निगरानी, जानवरों है कि bradypnea प्रदर्शित पर ध्यान दे रही है । एक बार कक्ष में ऑक्सीजन की एकाग्रता 9% तक पहुंच गई है, 30 मिन के लिए जारी है। यदि किसी भी जानवर में अंतर-हाइपोक्सिक मृत्यु दर (श्वसन गिरफ्तारी) 30 मिन अवधि के अंत से पहले देखी जाती है, तो हाइपोक्सिया को तुरंत समाप्त कर दें।

6. सही कैरोटिड धमनी लिगेशन के उलट

  1. सर्जिकल क्षेत्र में जानवरों को वापस करें, और 100% ऑक्सीजन के साथ संतुलित 3% आइसोफ्लोरीन के मिश्रण में संज्ञाहरण को प्रेरित करें। नाक शंकु के लिए संज्ञाहरण हस्तांतरण और आइसोफ्लोरीन स्तर को कम करने के लिए 2-3% । सर्जिकल घाव क्लिप निकालें और फिर से povidone-आयोडीन के साथ घाव क्षेत्र तैयार करते हैं। टो-चुटकी पलटा की अनुपस्थिति के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रतिशत पर आइसोफ्लोरीन के स्तर को बनाए रखें। बाँझ डिस्पोजेबल कट-आउट पर्दे का उपयोग करना जो गर्दन क्षेत्र को बेनकाब करते हैं, जानवर को कपड़ा देते हैं।
  2. घुमावदार संदंश का उपयोग करना, सही कैरोटिड धमनी से गर्भनाल टेप की पहचान और खोलना। सर्जिकल त्वचा क्लिप के साथ घाव बंद करो।

7. रिकवरी और तापमान प्रबंधन

  1. नर्सिंग और वसूली के लिए, 60 मिन के लिए अपने जिल्स के लिए सभी किट वापस. 60 मिनट के बाद, घायल जानवरों को 6 घंटे के लिए 37-40 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान के लिए वापस करें, 36-37 डिग्री सेल्सियस पर गुदा तापमान बनाए रखने के लिए आवश्यक रूप से पानी के तापमान को समायोजित करें। उनके जिल्स के लिए किट वापस ।
  2. सर्जरी के 10-14 दिन बाद सर्जिकल क्लिप निकालें (P27-P31)।

8. पलटा परीक्षण

  1. P21-P28 से दैनिक सभी पलटा परीक्षण करें, और P28-P42 से प्रति सप्ताह कम से कम 3x, जबकि एक्सपोजर (या उपचार) समूह के लिए अंधा शेष है। पलटा परीक्षण से पहले, 1 घंटे के लिए गर्मी सहायता (37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान, हीट पैड, आदि) के साथ एक कक्ष में किट रखें। प्रत्येक परीक्षण के लिए, अगले किट का परीक्षण करने से पहले किट प्रति सभी परीक्षणों को पूरा करें।
  2. नकारात्मक जियोटैक्सिस (25 डिग्री)
    1. एक फ्लैट बोर्ड (16 1/2 में x 12 in.) एक वस्तु के खिलाफ एक शोषक बेंचटॉप रक्षक में लिपटे ताकि बोर्ड मेज के साथ एक 25 डिग्री कोण रूपों । बोर्ड पर एक किट रखें और डाउनहिल का सामना करना पड़ रहा है, बोर्ड के ऊपर लगभग 75% रास्ता।
    2. सुनिश्चित करें कि किट का शरीर सीधा है और इसे जारी करने से पहले बोर्ड के खिलाफ सभी चार पंजे हैं। किट रखते ही टाइम असेसमेंट शुरू कर दें।
    3. उस समय को रिकॉर्ड करें जब किट अपने शरीर को अपनी शुरुआती स्थिति के सापेक्ष 90 डिग्री घुमाने का प्रबंधन करती है। उस समय रिकॉर्ड करें जिस पर किट अपने शरीर को 180 डिग्री तक घुमाती है और बोर्ड के शीर्ष की ओर एक पूरा कदम उठाती है। अगले परीक्षण पर जाने से पहले 25 ° झुकाव पर 3 परीक्षण करें।
  3. नकारात्मक जियोटैक्सिस (45 डिग्री)
    1. पहले वर्णित नकारात्मक जियोटैक्सिस परीक्षण के 3 परीक्षणों को फिर से करें, इस बार बोर्ड के साथ 45 डिग्री कोण पर सेट किया गया है।
  4. क्लिफ घृणा
    1. यदि वे गिरते हैं तो किट को चोट को कम करने के लिए कगार के नीचे 1 फुट के आसपास एक गद्देदार मंच रखें।
    2. लैब बेंच के किनारे पर एक किट का सामना करना पड़ रहा है, और लंबवत रखें। सुनिश्चित करें कि किट का शरीर सीधे है, इसके सामने पंजे किनारे के साथ फ्लश के साथ। किट रखे जाने के समय से समय मूल्यांकन शुरू करें। चट्टान और अन्य सहज आंदोलनों से दूर सचेत आंदोलन के बीच अंतर करने का ध्यान रखें जिनमें समन्वित चलना शामिल नहीं है।
    3. उस समय को रिकॉर्ड करें जब किट अपने शरीर को किनारे से दूर ले जाती है (किट के रूप में परिभाषित, उसके शरीर को मोड़ना, या अपने सामने के अंगों को किनारे से दूर ले जाना)। रिकॉर्ड समय किट बढ़त की विपरीत दिशा में अपना पहला कदम पूरा करता है (किनारे का सामना करना पड़ अपनी शुरुआती स्थिति से 90 डिग्री रोटेशन पिछले किसी भी दिशा या कोण के रूप में परिभाषित)।
    4. अगले परीक्षण पर जाने से पहले किट प्रति 3 क्लिफ घृणा परीक्षण करें।
  5. राइटिंग पलटा
    1. बेंच पर एक किट supine रखें, इसे जारी करने से पहले उस स्थिति में धीरे से पकड़ और एक साथ स्टॉपवॉच शुरू । समय है कि किट ही सभी चार पंजे एक साथ वजन असर पदों में बेंच के खिलाफ फ्लैट के साथ आराम करने के लिए लाता है रिकॉर्ड । उस समय को रिकॉर्ड करें जब किट किसी भी दिशा में एक पूर्ण कदम उठाती है (शरीर को कोई कताई या खींचने के साथ किसी दिए गए दिशा में प्रगति प्राप्त करने के लिए सभी चार पंजे के प्लेसमेंट के रूप में परिभाषित किया गया है)।
    2. प्रति पशु दक्षिणपंथी पलटा परीक्षण के 5 परीक्षण करें।
    3. हर किट के बाद 5 दक्षिणपंथी पलटा परीक्षण पूरा कर लिया है, जिल करने के लिए कूड़े वापस ।

9. कैटवॉक परीक्षण

  1. P42 पर, जिल से किट निकालें । परीक्षण से पहले प्लास्टिक पिंजरों में किट रखें लगभग 10 min, इसलिए वे पर्यावरण के लिए आदत कर सकते हैं। रोशनी को परीक्षण कक्ष में बंद करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि परिवेश ी प्रकाश कैटवॉक फ़ंक्शन को प्रभावित नहीं करता है।
  2. संबंधित सॉफ्टवेयर में एक नया प्रयोग बनाएं। प्रायोगिक सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि अधिकतम रन अवधि 10.00 से अधिक न हो और न्यूनतम रन अवधि 1.50 से कम न हो। अधिकतम गति भिन्नता निर्धारित करें ताकि यह 60% से अधिक न हो। प्रत्येक जानवर के लिए तीन अनुरूप रन की न्यूनतम आवश्यकता निर्धारित करें।
  3. जानवर के आकार के सापेक्ष वॉकवे की चौड़ाई को समायोजित करें ताकि यह दीवारों को छूने के बिना स्वतंत्र रूप से लोकोमोट करने में सक्षम हो, जबकि मोड़ को हतोत्साहित करने के लिए काफी संकीर्ण रह ते हैं। ऑटो डिटेक्शन का उपयोग करके डिटेक्शन सेटिंग प्रोफाइल टैब में एक नई डिटेक्शन सेटिंग जोड़ें। एक दिए गए उम्र में सभी कूड़े और जानवरों के लिए एक ही डिटेक्शन सेटिंग्स का उपयोग करें।
  4. प्रत्येक जानवर से पहले और बाद में कम लिंट पेपर ऊतक और 70% इथेनॉल के साथ वॉकवे को अच्छी तरह से साफ करें। पता लगाने और वर्गीकरण की सटीकता में सुधार करने के लिए फेरेट के पंजे को नियमित रूप से साफ करें। एक बार रास्ता और जानवर तैयार कर रहे हैं, परीक्षण अधिग्रहण शुरू करते हैं ।
  5. यदि कांच पर पैरों के निशान जमा होते हैं, या यदि जानवर मूत्र या मल पास करते हैं तो कैटवॉक को साफ करने के लिए अधिग्रहण को रोकें। अधिग्रहण बंद करो एक बार कैटवॉक सॉफ्टवेयर पूर्व निर्धारित प्रयोग सेटिंग्स के आधार पर तीन आज्ञाकारी रन पहचाना गया है ।

10. ओपन फील्ड टेस्टिंग (P42)

  1. एक गैर-असुरक्षित ऐक्रेलिक बॉक्स (55 सेमी x 55 सेमी x 40 सेमी ऊंचा) पेंट मैट-सफेद का उपयोग करें। कैमरे की स्थिति है ताकि यह सीधे बॉक्स के ऊपर केंद्रित है और सभी चार दीवारों पर कब्जा कर लिया है । पहले उपयोग से पहले और जानवरों के बीच 70% इथेनॉल के साथ परीक्षण क्षेत्र को साफ करें।
  2. प्रासंगिक सॉफ्टवेयर में, टेम्पलेट से नया चुनें और पूर्व-परिभाषित टेम्पलेट लागू करें। क्रमिक रूप से विषय प्रकारका चयन करके सेट-अप प्रक्रिया जारी रखें: अन्य; एरिना टेम्पलेट:ओपन फील्ड, स्क्वायर; जोन टेम्पलेट:केंद्र, सीमा, कोनों; ट्रैक करने के लिए विशेषताएं:केंद्र बिंदु।
  3. एरिना सेटिंग्स खोलें और कैमरा इनपुट से पृष्ठभूमि छवि को पकड़ें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि एरिना दीवारों के शीर्ष दिखाई दे रहे हैं। पैमाने पर उपकरण का उपयोग कर के क्षेत्र के आयामों को कैलिब्रेट करें।
  4. दीवार क्षेत्रों (एनडब्ल्यू, एनई, एसडब्ल्यू, एसई) और फर्श क्षेत्रों (बाएं शीर्ष, मध्य शीर्ष, दाएं शीर्ष, बाएं मध्य, केंद्र, दाएं मध्य, बाएं नीचे, मध्य नीचे, दाएं नीचे) को फिट करने के लिए रूपरेखा को फिर से आकार देकर पूर्व-परिभाषित क्षेत्र क्षेत्रों को समायोजित करें। सेट-अप को मान्य करें ताकि यह पुष्टि की जा सकी कि कोई भी जोन ओवरलैप नहीं होता है ।
  5. अधिग्रहण खिड़की खोलें और अधिग्रहण शुरू करें। फेरेट को इस तरह से उन्मुख परीक्षण क्षेत्र के केंद्र में रखें जो हर परीक्षण विषय के लिए सुसंगत है। फेरेट को 5 मिन की अवधि के लिए पूरे क्षेत्र में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति दें। परीक्षण अवधि के अंत में, प्रेस स्टॉप अधिग्रहण। अगले फेरेट के साथ प्रक्रिया दोहराएं।
    नोट: कमरे में सभी प्रयोगकर्ताओं को फेरेट द्वारा खुद को अनिरीक्षणीय होने की स्थिति बनानी चाहिए और परीक्षण अवधि के दौरान शांत रहना चाहिए।

11. फिक्सेशन-परफ्यूजन

  1. P42 पर, 5% आइसोफ्लोरीन के साथ गहराई से एनेस्थेटाइज़ किट। एक पेंटोबार्बिटल ओवरडोज (120-150 मिलीग्राम/किलो पी)। टो चुटकी और श्वसन आंदोलनों के नुकसान के लिए प्रतिक्रिया की कमी से गहरी संज्ञाहरण सुनिश्चित करें।
  2. जानवर को धुएं के हुड में स्थानांतरित करें। छाती खोलें और ठीक हेमोस्टेट का उपयोग करके उतरते महाधमनी को क्लैंप करें। सही एट्रियम काटें। एक परफ्यूजन पंप का उपयोग करना, 30 मीटर/मिन की दर से बाँझ खारा के ६० मीटर के साथ बाएं वेंट्रिकल perfuse । 30 mL/min की दर से फॉर्मेलिन (10% formaldehyde) के ६० mL के साथ Perfuse ।
  3. शव को काटना, और कैंची, संदंश, rongeurs, और एक स्पैटुला का उपयोग कर खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें । प्रत्येक मस्तिष्क के पृष्ठीय, वेंट्रल और पार्श्व पहलुओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन तस्वीरें लें। पोस्ट-फॉर्मेलिन में मस्तिष्क को कम से कम 48 घंटे के लिए ठीक करें।

12. पूर्व वीवो मस्तिष्क माप

  1. फॉर्मेलिन (चरण 11.3) से मस्तिष्क को हटा दें और अतिरिक्त तरल को अवशोषित करने के लिए एक कागज तौलिया पर रखें।
  2. इलेक्ट्रॉनिक कैलिपर का इस्तेमाल कर के दिमाग के पृष्ठीय और वेंट्रल पहलुओं पर कैलिपर के टिप्स रखकर दिमाग की ऊंचाई को मापें। घ्राण बल्ब पर कैलिपर के टिप्स और ऑक्सीपिटल पालि के सबसे पीछे की सीमा रखकर मस्तिष्क की लंबाई को मापें। कैलिपर के टिप्स को लौकिक पालि के सबसे पार्श्व भागों में रखकर मस्तिष्क की चौड़ाई को मापें। मस्तिष्क का वजन करो।
  3. देशीयन फिशर (क्रूसिएट सल्कस के लिए पूर्वकाल और पीछे), पार्श्व सल्सी, सुप्रासिलवेलियन सल्सी, कोरोनल सल्सी, छद्म सिल्वियन सल्की, एंसिनेट सल्की, क्रूसिएट सल्सी, प्रेससिल्वियन सल्की, पार्श्व जारी, सुप्रासिलवियन गायरी, सिग्मोइडी पूर्वकाल और पीछे), कोरोनल गायरी, एक्टोसिल्वियन गायरी (पूर्वकाल और पीछे), और कक्षीय गायरी। इसी सल्कस के सबसे अलग हिस्से की शुरुआत और अंत से सभी सल्सी को मापें। प्रत्येक इसी जायरस के व्यापक पहलू से सभी गायरी को मापें।
  4. देश्युदिनल फिशर के सबसे पीछे बिंदु पर कैलिपर के एक टिप रखकर और सेरिबैलम के सबसे पीछे के हिस्से में कैलिपर के अन्य सिरे को रखकर उजागर किए गए सेरिबैलम की मात्रा को मापें।
    नोट: फेरेट मस्तिष्क एटलस, जैसा कि फेरेट14के जीव विज्ञान और रोगों में पाया जाता है, का उपयोग पूर्व वीवो फेरेट मस्तिष्क माप विकसित करने के लिए किया जाता था।

13. सकल चोट स्कोरिंग

  1. चरण 11.3 में ली गई तस्वीरों का उपयोग करते हुए, सकल मस्तिष्क चोट (0-9 स्केल) का आकलन करने के लिए चरण 13.2-13.4 में स्कोरिंग मानदंड लागू करें, जबकि एक्सपोजर (या उपचार) समूहों के लिए अंधा शेष है।
  2. देशीयन दरार का आकलन करें। यदि यह सामान्य दिखाई देता है, तो 0 का स्कोर आवंटित करें। यदि इसे हल्का चौड़ा किया जाता है (लगभग 2x सामान्य चौड़ाई), लेकिन चौड़ाई में वृद्धि दरार की लंबाई के साथ अधूरी है, तो 1 का स्कोर आवंटित करें। यदि इसे मामूली रूप से चौड़ा किया जाता है (लगभग 2-3x सामान्य), तो 2 का स्कोर आवंटित करें। यदि इसे स्पष्ट रूप से चौड़ा किया जाता है, तो विचार की अधिकांश लंबाई के साथ एक दृश्यमान अंतर और 3x सामान्य चौड़ाई के साथ, 3 का स्कोर लागू करें।
  3. पार्श्व सल्की का आकलन करें। यदि वे सामान्य परिभाषा दिखाते हैं, तो पार्श्व जायरी और सुप्रासिल्वियन गायरी के पृथक्करण के साथ, 0 का स्कोर आवंटित करें। यदि सल्कस की हल्के एकतरफा या द्विपक्षीय कम परिभाषा को देखा जाता है, विशेष रूप से कौडल भाग में, ऑक्सीपिटल लोब के सापेक्ष ललाट और लौकिक पालि के न्यूनतम संकुचन के साथ, 1 का स्कोर आवंटित करें।
    1. यदि सल्सी की मामूली कम परिभाषा देखी जाती है, तो सुप्रासिलवियन गायरी के अवसाद के साथ, कोरोनल और एक्टोसिल्वियन गायरी का संकुचन, और ऑक्सीपिटल लोब के सापेक्ष ललाट और लौकिक पालि के हल्के संकुचन, 2 का स्कोर आवंटित करें। यदि एकतरफा सिस्टिक पतन देखा जाता है, तो कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध के न्यूनतम परिवर्तन के साथ, 3 का स्कोर आवंटित करें। यदि पार्श्व सल्की की खराब परिभाषा मौजूद है, तो द्विपक्षीय सिस्टिक या ऑक्सीपिटल और लौकिक पालि के गंभीर पतन के साथ, 4 का स्कोर आवंटित करें।
  4. सेरिबैलम के दृश्यमान हिस्से का आकलन करें। यदि यह सामान्य दिखाई देता है, तो (और एलटी; 75% वर्मिस और एंड एलटी; 66% गोलार्द्धों के साथ दिखाई देता है, 0 का स्कोर आवंटित करता है। यदि 75-90% वर्मिस और 66% गोलार्द्ध दिखाई देते हैं, तो 1 का स्कोर आवंटित करें। यदि अधिकांश सेरिबैलम दिखाई देता है, तो सभी वर्मिस और गोलार्द्धों के 66% को दिखाते हुए, 2 का स्कोर आवंटित करें।

14. डेटा विश्लेषण

  1. पलटा परीक्षण डेटा के लिए, विफलताओं को 61 एस का स्कोर आवंटित करने के लिए उन्हें समय के अंत में सफलताओं की तुलना में (60 एस) की अनुमति है, लेकिन सांख्यिकीय विश्लेषण में एक बदतर रैंकिंग के साथ। प्रत्येक पलटा परीक्षणमें समय के साथ प्रत्येक जानवर के लिए वक्र के नीचे एक क्षेत्र की गणना करें।
  2. कैटवॉक डेटा है कि जानवर के वजन से दबाव के पंजा आकार शामिल समायोजित करें ।
  3. औसत और इंटरक्वॉलटाइल रेंज (आईक्यूआर) का उपयोग करके डेटा का वर्णन करते हुए गैर-पैरामेट्रिक सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

34 में से (n = 18 पुरुषों, n = 16 महिलाओं) छह अपमान के संपर्क में कूड़े से जानवरों, आठ जानवरों (24%; n = 4 पुरुषों, n = 4 महिलाओं) घायल समूह में दूसरी हाइपोक्सिया अवधि के दौरान मर गया (एन = 5), तापमान प्रबंधन के दौरान (n = 2), या रात भर अपमान के बाद (n = 1) । घायल समूह में 26 में से नौ बचे (३५%) घोर चोट दिखाई दे रही थी । पांच जानवरों (n = 5 पुरुषों) मध्यम चोट थी, और चार जानवरों (n = 2 पुरुषों, n = 2 महिलाओं) गंभीर चोट थी, क्रमशः 2-5 और 6-9 के सकल विकृति स्कोर के रूप में परिभाषित(चित्रा 2ए)। अपमान के संपर्क में जानवरों इसलिए मौत या महत्वपूर्ण सकल चोट का एक ५०% जोखिम है । बढ़ती चोट के साथ, लौकिक और/या ऑक्सीपिटल पालि में gyri के संकुचन देखा जाता है, जुड़े सल्कल छोटा, देशानुशैन दरार के चौड़ीकरण, और सबसे गंभीर रूप से घायल जानवरों में सिस्टिक ऊतक हानि के क्षेत्रों के बड़े क्षेत्रों के साथ(चित्रा 2बी)। जीवित घायल जानवरों में (n = 26; n = 14 पुरुष, n = = 12 महिलाओं), सेरिबैलम का काफी अधिक एक्सपोजर देखा जाता है(चित्रा 3ए),साथ ही देशानुदाइनल दरार(चित्रा 3डी)को छोटा करना। कोरोनल और पूर्वकाल ईटोसिल्वियन गायरी(चित्रा 3बी, ई)के साथ-साथ पार्श्व और सुप्रासिलवियन सल्की(चित्रा 3सी, एफ)का छोटा होना भी महत्वपूर्ण है। मीडियन (आईक्यूआर) मस्तिष्क का वजन 8.1 ग्राम (7.9-9.7 ग्राम, एन = 6) नियंत्रण जानवरों में था, और घायल जानवरों में 7.0 ग्राम (6.5-7.7 ग्राम) (एन = 26, पी = 0.005)। नियंत्रण जानवरों में, औसत (IQR) मस्तिष्क की लंबाई 28.9 मिमी (27.8-29.6 मिमी, एन = 6) की तुलना में 27.5 मिमी (25.5-38.0 मिमी, एन = 26) घायल जानवरों में (पी = 0.007) थी। इसी तरह के पैटर्न मस्तिष्क भर में देखा जाता है, औसत चौड़ाई और ऊंचाई के साथ 5-7% घायल जानवरों में छोटे । बाईं और दाईं ओर दोनों तरफ शारीरिक संरचनाएं समान तरीके से प्रभावित होती हैं, जिसमें गोलार्द्धों के बीच कोई अंतर नहीं होता है। शारीरिक स्थानों के चित्रण के लिए चित्र ा 1बी देखें। पलटा परीक्षण अवधि (P21-P39) पर, घायल जानवरों को नकारात्मक भू-टैक्सिस कार्य(चित्र4ए),चट्टान से बचने के कार्य में किनारे से दूर घुमाने के लिए धीमी समय(चित्रा 4बी),और धीमी समय से दाएं(चित्रा 4सी)में घुमाने के लिए धीमा समय प्रदर्शित करता है। कैटवॉक में, घायल जानवरों को नियंत्रित करने के लिए एक समान औसत गति है(चित्रा 5ए),लेकिन प्रत्येक रन(चित्रा 5बी)के दौरान गति भिन्नता का एक काफी अधिक डिग्री प्रदर्शित करते हैं । सामने पंजे और हिंद पंजे (प्रिंट स्थिति) के बीच वजन समायोजित दूरी घायल जानवरों(चित्रा 5सी)में काफी अधिक है, जिसमें सामने के पंजे(चित्रा 5डी)के माध्यम से प्रति यूनिट पंजा क्षेत्र में कम दबाव डाला जाता है। खुले मैदान में, घायल जानवर कम कुल दूरी(चित्रा 6ए)को कवर करते हैं, और अधिक बार रुकते हैं(चित्र6बी)। वे क्षेत्र के केंद्र में काफी अधिक समय बिताते हैं, और कोनों में कम समय(चित्र6सी, डी)। नियंत्रण और घायल जानवरों के प्रतिनिधि गर्मी नक्शे चित्र 7ए, बीमें दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1:टाइमलाइन। P17 पर, जानवरों को द्विपक्षीय कैरोटिड धमनी लिगेशन से गुजरने से पहले 3 मिलीग्राम/किलो एलपीएस और 30 मिन प्रत्येक (कक्ष के लिए समतुल्य करने के लिए समय सहित नहीं) हाइपोक्सिया (9% ऑक्सीजन), हाइपरऑक्सिया (८०% ऑक्सीजन) और हाइपोक्सिया (9%) सही कैरोटिड धमनी लिगेशन को फिर उलट दिया जाता है। जानवरों को नॉर्मदरमिया के 6 एच के संपर्क में आता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे चोट के बाद की अवधि में घोंसले में अनायास हाइपोथर्मिक न बनें। रिफ्लेक्स परीक्षण तो P21-P28 से दैनिक किया जाता है, और P28-P42 से प्रति सप्ताह तीन बार । P42 पर, बलिदान से पहले कैटवॉक और खुले मैदान में जानवरों का परीक्षण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:प्रतिनिधि चोट वितरण और चित्रण। (ए)घायल समूह में 26 बचे (n= 14 पुरुष, एन = 12 महिलाएं) से स्कोरिंग सकल चोट, छह कूड़े के साथी नियंत्रण की तुलना में । पांच जानवरों (n = 5 पुरुषों) मध्यम चोट थी, और चार जानवरों (n = 2 पुरुषों, n = 2 महिलाओं) गंभीर चोट थी, क्रमशः 2-5 और 6-9 के सकल विकृति स्कोर के रूप में परिभाषित किया गया । ग्राफ इंटरक्वाटाइल रेंज के साथ औसत दिखाता है। (ख)नियंत्रण मस्तिष्क (बाएं पैनल, स्कोर 0), दिमाग के साथ 2, 5 के सकल चोट स्कोर में वृद्धि का चित्रण, और 9 के कुल संभावित स्कोर में से 8, बाएं से दाएं । नियंत्रण मस्तिष्क शारीरिक संरचनाओं को विशेष रूप से चोट के लिए अतिसंवेदनशील दिखाता है; 1 = देशीयमंडल दरार, 2 = पार्श्व सल्कस, 3 = सुप्रासिलवियन सल्कस, ए = कोरोनल जायरस, बी = पूर्वकाल एक्टोसिल्वियन जायरस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:प्रतिनिधि मस्तिष्क माप। नियंत्रण (एन = 6) की तुलना में, घायल जानवरों (एन = 26) प्रदर्शन काफी सेरिबैलम(ए),देशानुशैनल दरार(डी)के छोटा, कोरोनल(बी)और पूर्वकाल ectosसिल्वेरियन(ई)gyri के संकुचन के छोटे, और पार्श्व(सी)और suprasylvian(एफ)sulci के छोटा । रेखांकन इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत दिखाते हैं। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 (विलकॉक्सन-मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:प्रतिनिधि पलटा विकास। नियंत्रण (एन = 6) की तुलना में, घायल जानवर (एन = 26) नकारात्मक भूटैक्सियों(ए),क्लिफ घृणा(बी),और दक्षिणपंथी पलटा(सी)के धीमी विकास (वक्र के तहत क्षेत्र, AUC) प्रदर्शित करते हैं। रेखांकन इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत दिखाते हैं। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 (विलकॉक्सन-मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:प्रतिनिधि कैटवॉक परिणाम । नियंत्रण (एन = 6) की तुलना में, घायल जानवर (एन = 26) समान औसत गति(ए)पर चलते हैं, लेकिन चलने के दौरान गति में अधिक परिवर्तनशीलता के साथ(बी)। घायल जानवरों को भी एक लंबे समय तक औसत प्रिंट स्थिति(सी)प्रदर्शित, कम दबाव प्रति इकाई क्षेत्र(डी)लागू के साथ । रेखांकन इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत दिखाते हैं। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 (विलकॉक्सन-मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:प्रतिनिधि ओपन फील्ड व्यवहार। नियंत्रण (एन = 6) की तुलना में, घायल जानवर (एन = 26) एक छोटी कुल दूरी(ए)को कवर करते हैं, साथ ही अधिक बार रोकते हैं(बी)। घायल जानवर भी कोनों(डी)की तुलना में केंद्र(सी)में अधिक समय बिताते हैं। रेखांकन इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत दिखाते हैं। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 (विलकॉक्सन-मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र7:प्रतिनिधि ओपन फील्ड हीट मैप्स। (ए)कंट्रोल मादा,(बी)घायल महिला। घायल जानवर खुले मैदान के भीतर काफी छोटी दूरी को कवर करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

फेरेट मस्तिष्क और मानव मस्तिष्क के बीच साझा शारीरिक और विकासात्मक समानताओं के कारण, फेरेट तेजी से वयस्क और विकासात्मक मस्तिष्क चोट दोनों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । 8,9,10,11,12. हालांकि, आज तक अनुसंधान से पता चलता है कि फेरेट मस्तिष्क प्रारंभिक चोट के साथ-साथ अत्यधिक प्लास्टिक दोनों प्रतिरोधी है, व्यवहार घाटा दृश्य रोग चोट10,12की स्थापना में भी समय के साथ कम हो जाता है। यहां, हम देर से अपरिपक्व-समकक्ष फेरेट में सूजन-संवेदनशील हाइपोक्सिक-इस्कीमिक (एचआई) मस्तिष्क की चोट के पहले मॉडल का वर्णन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण द्विपक्षीय चोट और जीवित बचे लोगों में निरंतर व्यवहार घाटा होता है। किसी भी प्रीक्लिनिकल मॉडल के साथ, लक्ष्य अपरिपक्व शिशुओं द्वारा चिकित्सकीय रूप से सामना किए गए एक्सपोजर को सही ढंग से पुन: पेश करना नहीं था, बल्कि समय से पहले मस्तिष्क की चोट में शामिल होने वाले यंत्रवादी कारकों का संगम प्रदान करना था। इनमें सूजन, हाइपोक्सिया और ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस7शामिल हैं ।

हमारे फेरेट मॉडल में एलपीएस प्रशासन का एक महत्वपूर्ण पहलू हाइपोक्सिया से पहले 4 घंटे के आसपास दी गई एक उच्च खुराक है। निकट अवधि के समकक्ष कृंतक में एलपीएस एक्सपोजर के परिणामस्वरूप एक्सपोजर के बाद 4 घंटे के आसपास एक परिसंचारी भड़काऊ साइटोकिन चोटी होती है, जो हाइपोक्सिया-इस्केमिया के मस्तिष्क के संवेदीकरण से मेल खाती है, और मस्तिष्क की चोट15,16,17में महत्वपूर्ण वृद्धि होती है। भड़काऊ साइटोकिन रिलीज (पीएलएस एक्सपोजर के बाद पीक टीएनएफ-α और आईएल-6 रिलीज 2-4 एच) का एक समान समय पाठ्यक्रम अलग फेरेट परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं18में देखा जाता है। एक ही सर्जिकल सेट-अप मानते हुए, सर्जरी शुरू होने से पहले एलपीएस 30-60 मिनट का प्रशासन 12-15 द्विपक्षीय कैरोटिड धमनी लिगेशन करने और एलपीएस प्रशासन के बाद पहले हाइपोक्सिया एक्सपोजर 4 एच शुरू करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है। मॉडल विकास के दौरान, 5 मिलीग्राम/किलो ग्राम की एलपीएस खुराक का उपयोग शुरू में किया गया था, जैसा कि हमारे P10 चोट मॉडल12में वर्णित है। हालांकि, यह एलपीएस खुराक महत्वपूर्ण अंतर-हाइपोक्सिक मृत्यु दर और नेक्रॉप्सी पर फेफड़े के एडीमा से जुड़ी थी। एलपीएस की खुराक को घटाकर 3 मिलीग्राम प्रति किलो ग्राम करके मृत्यु दर और फेफड़े दोनों एडीमा को कम कर दिया गया ।

हाइपोक्सिया एक्सपोजर के दौरान, कई कारक महत्वपूर्ण सकल चोट सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होते हैं, जबकि मृत्यु दर के उच्च स्तर को भी रोकते हैं। प्रयोगशाला फेरेट्स के आउटब्रीड होने के कारण, कूड़े में हाइपोक्सिया सहिष्णुता में एक अंतर्निहित परिवर्तनशीलता है। हमारे अनुभव में, जानवरों को पार करने या एक ही हाइपोक्सिया कक्ष में विभिन्न कूड़े से जानवरों के संयोजन मुख्य रूप से सबसे अतिसंवेदनशील कूड़े से बड़े जानवरों या जानवरों की पहले की मौत में परिणाम है । यदि अधिक संवेदनशील जानवर लक्ष्य 30 मिन हाइपोक्सिया एक्सपोजर से पहले मर जाते हैं और हाइपोक्सिया को जल्दी बंद कर दिया जाता है, तो कम अतिसंवेदनशील कूड़े से छोटे जानवरों को उपइष्टतम हाइपोक्सिया एक्सपोजर प्राप्त होगा, और महत्वपूर्ण चोट को बनाए रखने की संभावना नहीं है। नतीजतन, जानवरों के प्रत्येक कूड़े को अपने अलग कक्ष के भीतर हाइपोक्सिया के संपर्क में होना चाहिए। दूसरी हाइपोक्सिया अवधि को एक पुनरावृत्ति मॉडल विकास प्रक्रिया के हिस्से के रूप में जोड़ा गया था जिसे हमने पहले12वर्णित किया है । एक एकल हाइपोक्सिया अवधि या तो मौत या कोई महत्वपूर्ण चोट के साथ अस्तित्व में हुई, लंबाई की परवाह किए बिना ।

चूंकि फेरेट्स मस्तिष्क की महत्वपूर्ण चोट दिखाए बिना तीव्र हाइपोक्सिया या द्विपक्षीय कैरोटिड धमनी लिगेशन की लंबी अवधि को बर्दाश्त करने में सक्षम हैं, हमारी वर्तमान परिकल्पना यह है कि हाइपरऑक्सिया की अवधि के परिणामस्वरूप ऊंचा चयापचय और वासोडिलैटेशन होता है जो सुविधाजनक होता है दूसरी हाइपोक्सिया अवधि के दौरान मस्तिष्क इस्केमिया। मॉडल में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, हमने P15 पर हमारी सुविधा में पहुंचे 8 फेरेट्स के पूर्व-आदेश वाले सेक्स-संतुलित कूड़े का उपयोग किया। प्रत्येक कूड़े में, 6-7 जानवरों की सर्जरी की गई और उसके बाद एक ही कक्ष के भीतर हाइपोक्सिया।

हाइपोक्सिया और सही कैरोटिड धमनी लिगेशन के उलट होने के बाद, जानवरों को लंबे समय तक चोट प्रोटोकॉल से निर्जलीकरण और हाइपोग्लाइसीमिया के जोखिम के कारण खिलाने के लिए समय की अवधि के लिए अपने जिल्स में वापस किया जाना चाहिए। यदि तापमान प्रबंधन अवधि के दौरान महत्वपूर्ण मृत्यु दर का अनुभव किया जाता है, तो जानवरों को 6 घंटे के लिए पानी के स्नान में रखे जाने से पहले अतिरिक्त द्रव पुनर्जीवन (चमड़े के खारे और/या हाथ से फार्मूला और पानी के साथ खिलाने) की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, तापमान प्रबंधन अवधि दीर्घकालिक चोट का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, क्योंकि जानवर अन्यथा घोंसले में सापेक्ष हाइपोथर्मिया से न्यूरोप्रोटेक्शन का अनुभव कर सकते हैं। हाइपोथर्मिया का यह जोखिम कम से कम आंशिक रूप से फेरेट (60-70 डिग्री एफ) के लिए आवश्यक आवास की स्थिति के कम तापमान के कारण होता है।

वर्णित व्यवहार परीक्षण काफी हद तक प्रयोगशाला के भीतर विकसित किए गए थे, पहले विकासशील फेरेट19में वर्णित पलटा परीक्षणों में कुछ आधार के साथ, वयस्क कृंतक से अनुकूलित कैटवॉक और खुले क्षेत्र परीक्षणों के साथ किशोर फेरेट्स में उपयोग किया जाएगा। अन्य समूहों ने दर्दनाक मस्तिष्क चोट10के बाद वयस्क फेरेट्स में खुले मैदान, भूलभुलैया और चाल परीक्षण के साथ-साथ वयस्क फेरेट्स20में सामाजिक संपर्क पर गर्भाशय सूजन के प्रभाव का भी वर्णन किया है। हालांकि उनके कम आंत पारगमन समय के कारण फेरेट्स में एक लंबी उपवास अवधि की सिफारिश नहीं की जाती है, लेकिन परीक्षणों से पहले किसी भी परीक्षण से पहले उन्हें 30-60 सीन के लिए एक पशु वाहक में रखना फायदेमंद है ताकि उन्हें परीक्षणों से पहले मूत्र और मल पारित करने की अनुमति दी जा सके। चूंकि फेरेट प्रकृति द्वारा एक जिज्ञासु जानवर है, यह अक्सर इन व्यवहार परीक्षणों में कृंतक के विपरीत तरीके से व्यवहार करता है। यह कैटवॉक में विशेष रूप से स्पष्ट है, जहां रोशनी और ध्वनियां, विशेष रूप से एक और फेरेट वोकलिंग ("डूकिंग") की रिकॉर्डिंग, फेरेट को आगे चलने के लिए प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में कुछ सीमाएं हैं। चूंकि इसे पी10 फेरेट12में पहले से विकसित तरीकों का उपयोग करके पुनरुक्ति रूप से विकसित किया गया था, इसलिए हम वर्तमान में देखा गया चोट की अंतिम डिग्री के लिए एलपीएस, हाइपोक्सिया, हाइपरऑक्सिया और रिपरफ्यूजन के सापेक्ष योगदान को नहीं जानते हैं। हालांकि, यह देखने लायक है कि यहां वर्णित विधि के विकास में फेरेट21में मूल वानुची मॉडल (एकतरफा कैरोटिड धमनी लिगेशन का उपयोग करना शामिल है) जिसके परिणामस्वरूप कोई महत्वपूर्ण चोट नहीं आई। इसलिए, चोट प्रोटोकॉल के कई हिस्सों के बीच बातचीत निरंतर चोट के लिए आवश्यक होने की संभावना है। इसके बावजूद जीवित जानवरों में घोर चोट में एक अलग परिवर्तनशीलता बनी हुई है, जो एक और संभावित सीमा है । हालांकि महत्वपूर्ण सकल चोट के बिना जानवरों को चोट हो सकती है जो एमआरआई या हिस्टोपैथोलॉजी12का उपयोग करके पता लगाने योग्य है, मॉडल पर भविष्य के काम में महत्वपूर्ण चोट को बनाए रखने वाले जानवरों की संख्या को बढ़ाने की कोशिश करने के लिए पुनरावृत्तियों को शामिल किया जाएगा, उदाहरण के लिए स्थायी द्विपक्षीय कैरोटिड धमनी लिगेशन का उपयोग करके। अंत में, इस मॉडल को विकासात्मक मस्तिष्क की चोट के लिए ख्यात न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचारों का परीक्षण करने के लिए अधिकतम उपयोगी होने के लिए, इसे न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों की प्रभावकारिता का आकलन करके मान्य किया जाना चाहिए जो या तो मानव नवजात शिशुओं में एचआई मस्तिष्क की चोट के उपचार के लिए स्थापित किए गए हैं, या नवजात मस्तिष्क चोट के अन्य पशु मॉडलों की एक श्रृंखला में सफल रहे हैं। इसलिए भविष्य के अध्ययन इस मॉडल में चिकित्सीय हाइपोथर्मिया और एरिथ्रोपोइटिन की प्रभावकारिता का आकलन करेंगे, जिसमें सेक्स आधारित चिकित्सीय प्रतिक्रियाएं और पूर्व वीवो एमआरआई12शामिल हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मॉडल के विकास के वित्त पोषित बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन, साथ ही एनआईएच अनुदान 5R21NS093154-02 (NICHD) द्वारा किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
80% Oxygen Praxair
9% Oxygen Praxair
Absorbent benchtop protector Kimtech 7546
Automated catwalk Noldus
Betadine surgical scrub
Bupivacaine Patterson Veterinary 07-888-9382
Buprenorphine
Calipers SRA Measurement Products ME-CAL-FP-200 200 mm range, 0.01 mm resolution
Cotton Gauze Sponge Fisher Scientific 22028556
Curved fine hemostat Roboz RS-7101
Curved forceps World Precision Instruments 501215
Curved suture-tying hemostat Roboz RS-7111
Ethovision tracking software Noldus
Eye Lubricant Rugby NDC 0536-1970-72
Ferrets (Mustela putorius furo) Marshall Biosciences Outbred (no specific strain)
Formalin Fisher Scientific SF100-4 10% (Phosphate Buffer/Certified)
Hair Clippers Conair GMT175N
Insulin Syringes BD 329461 0.3 cc 3 mm 31 G
Isoflurane Piramal 66794-017-25
Lidocaine Patterson Veterinary 07-808-8202
LPS List Biological LPS Ultrapure #423
Oxygen sensor BW Gas Alert GAXT-X-DL-2
Pentobarbital
Plastic chamber Tellfresh 1960 10 L; 373 x 270 x 135 mm3
Saline Solution, 0.9% Hospira RL-4492
Scalpel blade Integra Miltex 297
Scalpel handle World Precision Instruments 500236 #3, 13 cm
Sterile suture Fine Science Tools 18020-50 Braided Silk, 5/0
Surgical clip applicator Fine Science Tools 12020-09
Surgical clip remover Fine Science Tools 12023-00
Surgical drapes Medline Unidrape VET3000
Surgical gloves Ansell Perry Inc 5785004
Surigical clips Fine Science Tools 12022-09
Thermometer (rectal) YSI Precision 4000A
Thermometer (water) Fisher Scientific 14-648-26
Umbilical tape Grafco 3031 Sterile
Water bath Thermo Scientific TSCOL19 19 L

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References

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न्यूरोसाइंस इश्यू 153 फेरेट नवजात हाइपोक्सिया-इस्केमिया न्यूरोप्रोटेक्शन लिपोपॉलीसैक्जारिडी कैरोटिड लिगेशन हाइपरऑक्सिया
सूजन से संवेदनशील देर से अपरिपक्व हाइपोक्सिक-इस्कीमिक ब्रेन इंजरी का फेरेट मॉडल
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Wood, T., Moralejo, D., Corry, K.,… More

Wood, T., Moralejo, D., Corry, K., Fisher, C., Snyder, J. M., Acuna, V., Holden-Hunt, A., Virk, S., White, O., Law, J., Parikh, P., Juul, S. E. A Ferret Model of Inflammation-sensitized Late Preterm Hypoxic-ischemic Brain Injury. J. Vis. Exp. (153), e60131, doi:10.3791/60131 (2019).

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