Summary
De methode beschrijft ontsteking-gesensibiliseerde Hypoxic-ischemische en hyperoxische hersenletsel in de P17 Ferret om de complexe interactie te modelleren tussen langdurige ontsteking en oxidatieve hersenletsel ervaren in een aantal late premature zuigelingen.
Abstract
Er is een voortdurende behoefte aan klinisch relevante modellen van perinatale infectie en hypoxie-ischemie (HI) om therapeutische interventies voor zuigelingen met de neurologische sequela van prematuriteit te testen. Fretten zijn ideaal kandidaten voor het modelleren van de premature menselijk brein, omdat ze zijn geboren lissencephalic en ontwikkelen gyrencephalic hersenen postnatally. Bij de geboorte, Ferret hersenen ontwikkeling is vergelijkbaar met een 13 week menselijke foetus, met postnatale-dag (P) 17 kits beschouwd als gelijkwaardig zijn aan een zuigeling op 32 – 36 weken ' dracht. We beschrijven een blessure model in de P17 Ferret, waar de toediening van lipopolysaccharide wordt gevolgd door bilaterale cerebrale ischemie, hypoxie en hyperoxie. Dit simuleert de complexe interactie van langdurige ontsteking, ischemie, hypoxie, en oxidatieve stress ervaren in een aantal neonaten die hersenletsel ontwikkelen. Gewonde dieren vertonen een bereik van ernst van het bruto letsel, met morfologische veranderingen in de hersenen, waaronder vernauwing van meervoudige corticale Gyri en geassocieerde sulci. Gewonde dieren tonen ook vertraagde reflex ontwikkeling, langzamer en meer variabele snelheid van motoriek in een geautomatiseerde catwalk, en verminderde verkenning in een open veld. Dit model biedt een platform voor het testen van putatieve therapieën voor zuigelingen met neonatale encefalopathie geassocieerd met ontsteking en HI, studie mechanismen van letsel die de corticale ontwikkeling beïnvloeden en onderzoeken trajecten die veerkracht bieden in niet-beïnvloedde dieren.
Introduction
Er is een voortdurende behoefte aan grote diermodellen die de pathofysiologie van prematuriteit en perinatale hypoxie-ischemie weerspiegelen, waarbij therapeutische interventies voor zuigelingen kunnen worden getest. In 2017 werd 9,93% van de in de Verenigde Staten geboren 382.726 zuigelingen geboren en 84% van deze zuigelingen werd geboren tussen 32 en 36 weken van de dracht1. Bij premature zuigelingen is perinatale blootstelling aan infectie of ontsteking gebruikelijk, waarbij maternale immuunactivering als gevolg van virale of bacteriële pathogenen premature arbeid kan initiëren. Postnataal, premature zuigelingen lopen een hoog risico op vroege of late aanvang sepsis2. Premature zuigelingen ervaren ook vaak perioden van hypoxie, hypotensie en hyperoxie als gevolg van hun onrijpe cardiorespiratoire systeem, verhoogde zuurstofspanning in de atmosfeer ten opzichte van die ervaren in utero, en iatrogene blootstellingen. Bovendien, bij premature zuigelingen, antioxidant verdediging zijn onvolgroeid3 en pro-apoptotic factoren zijn natuurlijk upregulated4. Oxidatieve stress en celdood leiden tot de activering van het immuunsysteem en de neuro ontsteking. Deze gecombineerde factoren worden verondersteld om bij te dragen aan de ontwikkeling en de fysiologische kwetsbaarheid van de hersenen, en resulteren in of verergeren de encefalopathie geassocieerd met slechte ontwikkelingsresultaten bij premature zuigelingen5,6,7.
Als gevolg van de fysieke en ontwikkelingsovereenkomsten die het fret-brein deelt met het menselijk brein, is de fret een aantrekkelijke soort om hersenletsel te modelleren8,9,10,11,12. Fretten zijn ook ideaal kandidaten om het premature menselijk brein te modelleren, omdat ze zijn geboren lissencephalic en ontwikkelen gyrencephalic hersenen postnatally, die voorziet in een venster waarin de ontwikkelende hersenen te beledigingen die nabootsen die ervaren door zuigelingen geboren premature. Bij de geboorte, Ferret hersenen ontwikkeling is vergelijkbaar met een 13 week menselijke foetus, met postnatale-dag (P) 17 kits beschouwd als gelijkwaardig zijn aan een zuigeling op 32 – 36 weken van de dracht13.
Onze groep heeft onlangs een model van zeer premature (< 28 weken dracht) hersenletsel in de P10 Ferret gepubliceerd door het combineren van inflammatoire sensibilisatie met Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) met daaropvolgende blootstelling aan hypoxie en hyperoxia12. In het volgende protocol beschrijven we nu een laat premature model in de P17 Ferret, waar LPS sensibilisatie wordt gevolgd door bilaterale cerebrale ischemie, hypoxie en hyperoxie. Dit resulteert in meer ernstige verwondingen in een subgroep van dieren, en meer nauwkeurig modellen de complexe interactie van langdurige ontsteking, ischemie, hypoxie, en oxidatieve stress ervaren in een aantal premature zuigelingen die hersenletsel ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en als onderdeel van een goedgekeurd protocol door de Universiteit van Washington institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité.
1. voorbereiding en LPS administratie
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een tijdlijn van de procedures.
- Voordat u begint met de procedure, Seal, steriliseren en autoclaaf alle chirurgische instrumenten en chirurgische gordijnen. Bereid pre-operatieve medicatie in steriele flesjes. Bereken de stroomsnelheid die nodig is om de lucht in de hypoxie/hyperoxia kamer te vervangen door het experimentele gas in 8 – 10 min.
- Bereid de lipopolysaccharide (LP'S van E. coli 055: B5) in steriele zoutoplossing om een concentratie van 1 mg/ml te produceren. Verwijder P17 Ferret kits uit hun Jills. Weeg en nummerze. Randomiseren van dieren per nest en geslacht aan de controle of geblesseerde (of behandel) groepen.
- Gebruik een 300 μL insulinespuit en dien 3 mg/kg LPS intraperitoneaal toe aan kits in de letsel groep en een equivalent volume steriel zout voertuig (3 μL/g) om de dieren te controleren.
- Plaats dieren in een kamer in een waterbad van 37 – 40 °C om een streef temperatuur van 36 – 37 °C te behouden gedurende de chirurgische ingrepen.
2. anesthesie
- Tijdens de procedure, voortdurend bewaken temperatuur, respiratie snelheid, en hartslag van het dier.
- Toediening van buprenorfine (0,05 mg/kg) subcutaan 30 min voor de chirurgische ingreep. Induceren van anesthesie in een mengsel van 3% Isofluraan gebalanceerd met 100% zuurstof. Verwijder de kit uit de inductie kamer en plaats deze op een gedrapeerde chirurgische water deken ingesteld op 37 °C. Breng anesthesie over naar de neuskegel en reduceer het Isofluraan niveau tot 2 – 3%.
3. chirurgische voorbereiding
- Gebruik kleine dieren Tondeuses om al het haar op het ventrale nekgebied te verwijderen. Scheer in een rechthoekig patroon met zorg om te voorkomen dat de huid wordt verkaand of Scheer uitslag genereert. Dien lokale anesthesie toe aan het geschoren gebied met behulp van intradermale lidocaïne (4 mg/kg) en de (2,5 mg/kg).
- Bereid de nek voor door afwisselende toepassing van Povidon-jodium en 70% ethanol scrub met steriele wattenstaafjes. Herhaal de scrub zodanig dat Povidon-jodium en 70% ethanol elk 3x op afwisselende wijze worden toegepast.
- Bevestig de diepte van de anesthesie via afwezigheid van Teen-pinch reflex. Houd het niveau van Isofluraan bij het minimumpercentage dat nodig is voor een chirurgische verdoving. Met behulp van steriele wegwerp gordijnen die het nekgebied blootstellen, draperen het dier.
4. Ligatie van de bilaterale halsslagader
- Met een eenmalig te gebruiken #11 scalpel blad, maak een 1,5 cm middenlijn incisie in het midden van de nek. Met behulp van fijne hemostatica en gebogen Tang, deuntly ontleden naar de linker halsslagader. Ontleden de slagader weg van de geassocieerde neurovasculaire bundel.
- Met behulp van een paar gebogen fijne Tang, passeren een lus 10 cm lengte van steriele 5-0 zijde hechtmiddel onder de slagader. Snijd de hechting in tweeën. Ligaat de slagader door het veilig binden van beide lengtes van hecht, waardoor ten minste 2 mm tussen de knopen. Transect de linker halsslagader tussen de hechtingen, het verzorgen van de zenuw intact te laten.
- Herhaal de dissectie aan de rechterkant. Reversibel de rechter halsslagader met een enkele steriele 1/8 inch navelstreng binden. Sluit de wond met chirurgische huid clips.
- Laat het dier gedurende ten minste 30 minuten voor hypoxie in een waterbad met temperatuurregeling herstellen.
Opmerking: Als de slagaders niet volledig geïsoleerd zijn van de rest van de neurovasculaire bundel, kan een verhoogde sterfte voor of tijdens latere hypoxie worden gezien.
5. sequentiële hypoxie, hyperoxie en hypoxie
- Tijdens hypoxie en hyperoxia, de waterbad temperatuur wijzigen indien nodig om de rectale temperatuur te behouden tijdens hypoxie bij 37 °C in het verklikker dier (en).
- Plaats dieren in de letsel groep in een luchtdichte kamer in een waterbad. Bewaak continu de zuurstofconcentratie in de kamer, evenals de rectale temperatuur in ten minste één verklikker dier. Spoel de kamer met bevoficeerd 9% zuurstof (91% stikstof) en houd vervolgens een debiet van 3 – 5 L/min, afhankelijk van de kamergrootte. Zodra de zuurstofconcentratie in de kamer 9% heeft bereikt, gaat u 30 minuten door.
- Na 30 min, Switch gastoevoer naar 80% bevoficeerde zuurstof (20% stikstof), en laat de kamer te bereiken van de doelconcentratie op basis van debiet en kamergrootte. Blijven voor 30 min van hyperoxia. Open de kamer om normoxia sneller te bereiken door te equilibreren met kamerlucht.
- Sluit de kamer af en spoel met 9% bevochten zuurstof. Bewaak voortdurend alle dieren visueel en noteer de dieren die bradypnea weergeven. Zodra de zuurstofconcentratie in de kamer 9% heeft bereikt, gaat u 30 minuten door. Als intra-hypoxische sterfte (ademhalingsstilstand) bij een van de dieren wordt gezien vóór het einde van de periode van 30 minuten, beëindig dan onmiddellijk hypoxie.
6. omkering van de Ligatie van de Rechterhalsslagader
- Terugkeer van dieren naar het chirurgische gebied, en induceren van anesthesie in een mengsel van 3% Isofluraan evenwichtig met 100% zuurstof. Breng anesthesie over naar de neuskegel en reduceer het Isofluraan niveau tot 2 – 3%. Verwijder de chirurgische wond clips en bereid het wondgebied opnieuw voor met Povidon-jodium. Bevestig de diepte van de anesthesie via afwezigheid van Teen-pinch reflex. Houd het niveau van Isofluraan bij het minimumpercentage dat nodig is voor een chirurgische verdoving. Met behulp van steriele wegwerp gordijnen die het nekgebied blootstellen, draperen het dier.
- Met behulp van gebogen Tang, identificeren en losmaken van de navelstreng tape van de juiste halsslagader. Sluit de wond met chirurgische huid clips.
7. herstel en temperatuurbeheer
- Retourneer alle kits naar hun Jills voor 60 min, voor verpleegkunde en herstel. Na 60 min, teruggewonde dieren aan de waterbaden bij 37 – 40 °C gedurende 6 uur, de watertemperatuur aanpassen om de rectale temperatuur bij 36 – 37 °C te behouden. Retour kits naar hun Jills.
- Verwijder chirurgische clips 10 – 14 dagen na de operatie (P27 – P31).
8. reflex testen
- Voer alle reflex tests dagelijks van P21 – P28, en ten minste 3x per week van P28 – P42, terwijl de resterende verblind voor blootstelling (of behandeling) groep. Plaats, voorafgaand aan reflex tests, kits in een kamer met warmte assistentie (37 °C waterbad, Heat pad, enz.) voor 1 uur. Voltooi voor elke test alle proefversies per kit voordat u de volgende kit test.
- Negatieve geotaxis (25 °)
- Plaats een vlakke plank (16 1/2 in. x 12 in.) gewikkeld in een absorberende tafel beschermer tegen een object zodat het bord een hoek van 25 ° met de tafel vormt. Plaats een kit op het bord liggend en naar beneden gericht, ongeveer 75% van de weg omhoog van het bord.
- Zorg dat de carrosserie van de Kit recht is en dat alle vier de poten tegen het bord zijn gegript voordat je hem vrijgeeft. Zodra de kit is geplaatst, start u de tijd beoordeling.
- Noteer de tijd waarop de kit erin slaagt om zijn lichaam 90 ° te roteren ten opzichte van zijn startpositie. Noteer de tijd waarop de kit zijn lichaam draait 180 ° en neemt een volledige stap naar de bovenkant van het bord. Voer 3 proeven uit op de helling van 25 ° voordat u naar de volgende test gaat.
- Negatieve geotaxis (45 °)
- Voer 3 proeven van de eerder beschreven negatieve geotaxis-test opnieuw uit, deze keer met het bord ingesteld op een hoek van 45 °.
- Cliff aversie
- Plaats een gewatteerd platform rond 1 voet onder de richel om letsel aan kits te minimaliseren als ze vallen.
- Plaats een kit gericht en loodrecht op de rand van de labbank. Zorg dat de carrosserie van de Kit recht is, met de voorste poten met de rand. Begin tijd beoordeling vanaf het moment dat de kit wordt geplaatst. Wees voorzichtig om onderscheid te maken tussen bewuste beweging weg van de klif en andere spontane bewegingen die geen gecoördineerd wandelen inhouden.
- Noteer de tijd waarop de kit zijn lichaam verplaatst van de rand (gedefinieerd als de kit back-up, draaien van de carrosserie, of het verplaatsen van de voorste ledematen weg van de rand). Noteer de tijd dat de kit zijn eerste stap voltooit in de tegenovergestelde richting van de rand (gedefinieerd als elke richting of hoek voorbij een rotatie van 90 ° vanaf de startpositie tegenover de rand).
- Voer 3 Cliff aversie-proefversies per kit uit voordat u naar de volgende test gaat.
- Rechtse reflex
- Plaats een kit rugligging op de Bank en houd deze voorzichtig in die positie voordat u deze vrijgeeft en tegelijkertijd de stopwatch start. Noteer de tijd dat de kit zichzelf tot rust brengt met de vier poten tegelijk plat tegen de Bank in gewichtdragende posities. Noteer de tijd waarop de kit een volledige stap in elke richting neemt (gedefinieerd als de plaatsing van alle vier de poten om vooruitgang te boeken in een bepaalde richting zonder te draaien of te slepen).
- Voer 5 proeven uit van de rechtse reflex test per dier.
- Nadat elke kit de 5 rechtse reflex proeven heeft voltooid, keert het nest terug naar de Jill.
9. catwalk testen
- Op P42, verwijder kits van de Jill. Plaats kits in plastic kooien ongeveer 10 minuten voor het testen, zodat ze kunnen acclimeren aan het milieu. Schakel de lampjes uit in de testruimte om ervoor te zorgen dat omgevingslicht geen invloed heeft op de catwalk-functie.
- Maak een nieuw experiment in de relevante software. Pas de experimentele instellingen aan zodat de maximale uitvoeringsduur niet meer dan 10,00 s bedraagt en de minimale uitvoeringsduur niet lager is dan 1,50 s. Stel de maximale snelheids variatie zo in dat deze niet meer dan 60% bedraagt. Stel een minimumvereiste in voor drie conforme uitvoeringen voor elk dier.
- Pas de breedte van de loopbrug aan ten opzichte van de grootte van het dier, zodat het vrij kan locomote zonder de muren aan te raken, terwijl het smal genoeg blijft om het draaien te ontmoedigen. Voeg een nieuwe detectie-instelling toe op het tabblad profielen voor detectie-instellingen met automatische detectie. Gebruik dezelfde detectie-instellingen voor alle nestjes en dieren op een bepaalde leeftijd.
- Reinig de loopbrug grondig met een laag-pluis papier weefsel en 70% ethanol voor en na elk dier. Reinig de poten van de fret regelmatig om de nauwkeurigheid van de detectie en classificatie te verbeteren. Zodra de loopbrug en het dier zijn voorbereid, beginnen trial acquisitie.
- Onderbreek acquisitie om de catwalk schoon te maken als voetafdrukken zich ophopen op het glas, of als dieren plassen of ontlasting passeren. Stop de acquisitie zodra de catwalk-software drie compatibele uitvoeringen heeft herkend op basis van de vooraf bepaalde experiment instellingen.
10. open veld testen (P42)
- Gebruik een niet-poreuze acryl doos (55 cm x 55 cm x 40 cm hoog) gelakt mat-wit. Plaats de camera zodanig dat deze direct boven het vak wordt gecentreerd en alle vier de wanden worden vastgelegd. Reinig de test arena met 70% ethanol voor het eerste gebruik en tussen dieren.
- Selecteer in de betreffende software de optie Nieuw van sjabloon en pas een vooraf gedefinieerde sjabloon toe. Doorgaan met de set-up procedure door achtereenvolgens het onderwerptypete selecteren: Overig; Arena template: open veld, vierkant; Zone sjabloon: centrum, rand, hoeken; Functies om te traceren: middelpunt.
- Open Arena-instellingen en pak de achtergrondafbeelding van de camera-ingang en zorg ervoor dat de toppen van de Arena-wanden zichtbaar zijn. Kalibreer de afmetingen van de arena met het gereedschap Schalen.
- Pas de vooraf gedefinieerde Arena zones aan door het formaat van de contouren aan te passen aan de muur zones (NW, NE, SW, SE) en vloer zones (links boven, middelste boven, rechter bovenkant, linker midden, midden, rechter midden, linker onderkant, middelste bodem, rechter onderkant). Valideer de set-up om te bevestigen dat er geen zones overlappen.
- Open het verwervings venster en druk op acquisitie starten. Plaats de fret in het midden van de test arena georiënteerd op een manier die consistent is voor elk test onderwerp. Laat de fret gedurende een periode van 5 minuten vrij door de hele Arena bewegen. Druk aan het einde van de testperiode op acquisitie stoppen. Herhaal de procedure met de volgende fret.
Opmerking: Alle onderzoekers in de kamer moeten zich positioneren om onwaarneembaar te zijn door de fret en stil te blijven tijdens de testperiode.
11. fixatie-perfusie
- Op P42, diep anesthetiseren kits met 5% isoflurane. Dien een overdosis pentobarbital toe (120 – 150 mg/kg i.p.). Zorg voor diepe anesthesie door gebrek aan reactie op Teen knijpen en verlies van respiratoire bewegingen.
- Breng het dier over naar een rook afzuigkap. Open de thorax en klem de aflopend aorta met behulp van fijne hemostatica. Snijd het juiste Atrium. Met behulp van een perfusie pomp, parfumeer de linker ventrikel met 60 mL steriele zoutoplossing met een snelheid van 30 mL/min. Parfuseren met 60 mL formaline (10% formaldehyde) met een snelheid van 30 mL/min.
- Onthooi het karkas en verwijder de hersenen van de schedel met behulp van een schaar, een tang, een Rongeurs en een spatel. Neem hoge-resolutie foto's van de rugklachten, ventrale en laterale aspecten van elke hersenen. Post-Fix de hersenen in formaline voor ten minste 48 h.
12. ex vivo hersen meting
- Verwijder de hersenen van formaline (stap 11,3) en plaats op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te absorberen.
- Met behulp van een elektronische remklauw, meet de hoogte van de hersenen door het plaatsen van de uiteinden van de remklauw op de dorsale en ventrale aspecten van de hersenen. Meet de lengte van de hersenen door het plaatsen van de uiteinden van de remklauw bij de olfactorische gloeilamp en de meest posterieure grens van de Occipitale kwab. Meet de breedte van de hersenen door het plaatsen van de uiteinden van de remklauw op de meest laterale delen van de temporale lobben. Weeg de hersenen.
- Meet de longitudinale fissuren (anterior en posterieure van de cruciaatsulcus), laterale sulci, suprasylvian sulci, coronale sulci, pseudosylvian sulci, ansinaatsulci, cruciaatsulci, presylvian sulci, laterale Gyri, suprasylvian Gyri, sigmoid Gyri ( voorste en posterior), coronale Gyri, ectosylvian Gyri (voorste en posterior), en orbitale Gyri. Meet alle sulci vanaf het begin en het einde van het meest opvallende deel van de corresponderende Sulcus. Meet alle Gyri van het breedste aspect van elke corresponderende gyrus.
- Meet de hoeveelheid cerebellum die wordt blootgesteld door een punt van de remklauw te plaatsen op het achterste punt van de longitudinale spleet en plaats de andere punt van de remklauw op het achterste deel van het cerebellum.
Opmerking: De Ferret Brain Atlas, zoals gevonden in de biologie en ziekten van de Ferret14, werd gebruikt voor de ontwikkeling van de ex vivo Ferret hersen metingen.
13. bruto schade Score
- Gebruik de Foto's gemaakt in stap 11,3., pas de scoringscriteria toe in stappen 13.2 – 13.4 om bruto hersenletsel (0 – 9 schaal) te beoordelen, terwijl het blind blijft voor blootstelling (of behandel) groepen.
- De longitudinale Fissure beoordelen. Als het normaal lijkt, wijst u een Score van 0 toe. Als het licht verbreed is (ongeveer 2x de normale breedte), maar de toename van de breedte is onvolledig langs de lengte van de Fissure, wijs een Score van 1 toe. Als het matig vergroter is (ongeveer 2 – 3x normaal), wijs dan een Score van 2 toe. Als het aanzienlijk verbreed is, met een zichtbare opening > 3x normale breedte langs het grootste deel van de lengte van de spleet, past u een Score van 3 toe.
- De laterale sulci te beoordelen. Als ze normale definitie tonen, met scheiding van de laterale Gyri en suprasylvian Gyri, wijs dan een Score van 0 toe. Als een milde unilaterale of bilaterale gereduceerde definitie van Sulcus wordt gezien, met name in het caudale gedeelte, met minimale vernauwing van frontale en temporale lobben ten opzichte van de occipitale lobben, wijst u een Score van 1 toe.
- Als matig gereduceerde definitie van de sulci wordt gezien, met depressie van de suprasylvian Gyri, vernauwing van de coronale en ectosylvian Gyri, en milde vernauwing van frontale en temporale lobben ten opzichte van occipitale lobben, wijs een Score van 2. Als unilaterale cystische degeneratie wordt gezien, met een minimale verandering van de contralaterale hemisfeer, wijs dan een Score van 3 toe. Als een slechte definitie van de laterale sulci aanwezig is, met bilaterale Cystic of ernstige degeneratie van de occipitale en temporale lobben, wijs dan een Score van 4 toe.
- Beoordeel het zichtbare gedeelte van het cerebellum. Als het normaal lijkt, met (< 75% van de cerebellaire en < 66% van de halfronden zichtbaar, wijs een Score van 0. Als 75 – 90% van de cerebellaire en ≥ 66% van de hemisferen zichtbaar zijn, wijs dan een Score van 1 toe. Als het grootste deel van het cerebellum zichtbaar is, waarbij alle cerebellaire en ≥ 66% van de hemisferen worden weergegeven, wijst u een Score van 2 toe.
14. gegevensanalyse
- Voor reflex testgegevens, toewijzen mislukkingen een Score van 61 s zodat ze kunnen worden vergeleken met successen aan het einde van de tijd (60 s), maar met een slechter ranking in de statistische analyse. Bereken een gebied onder de curve voor elk dier in de loop van de tijd in elk van de reflex tests.
- Pas de catwalk-gegevens aan met het gewicht van het dier om de druk te verkleinen.
- Analyseer gegevens met behulp van niet-parametrische statistische methoden, die gegevens beschrijven met behulp van het mediaan-en interkwartielbereik (IQR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van 34 (n = 18 mannetjes, n = 16 vrouwtjes) dieren van zes nesten blootgesteld aan de belediging, acht dieren (24%; n = 4 mannetjes, n = 4 vrouwtjes) in de gewonde groep stierf tijdens de tweede hypoxie periode (n = 5), tijdens temperatuur Management (n = 2), of 's nachts na de belediging (n = 1). In de gewonde groep waren negen van de 26 overlevenden (35%) had zichtbare Grove schade. Vijf dieren (n = 5 mannetjes) hadden matig letsel, en vier dieren (n = 2 mannetjes, n = 2 vrouwtjes) hadden een ernstig letsel, gedefinieerd als bruto pathologie scores van 2 – 5 en 6 – 9, respectievelijk (Figuur 2A). Dieren die aan de belediging zijn blootgesteld, hebben dus een risico van 50% op overlijden of aanzienlijke schade. Bij toenemend letsel wordt de vernauwing van Gyri in de temporale en/of occipitale kwabben gezien, met geassocieerde sulcale verkorting, verbreding van de langssplijting, en grote delen van gebieden van cystische weefsel verlies bij de meest zwaar gewonde dieren (Figuur 2B). Bij het overleven van gewonde dieren (n = 26; n = 14 mannetjes, n = 12 vrouwtjes) is een significant grotere blootstelling van het cerebellum zichtbaar (Figuur 3A), evenals het inkorten van de longitudinale fissuren (Figuur 3D). Er is ook aanzienlijke vernauwing van de coronale en anterieure ectosylvian Gyri (Figuur 3B, E), evenals verkorting van de laterale en suprasylvian Sulci (Figuur 3C, F). Het mediane (IQR) hersengewicht was 8,1 g (7,9 – 9,7 g, n = 6) bij de controledieren en 7,0 g (6,5 – 7,7 g) bij gewonde dieren (n = 26, p = 0,005). Bij de controledieren was de mediane (IQR) hersen lengte 28,9 mm (27,8 – 29,6 mm, n = 6) vergeleken met 27,5 mm (25,5 – 38,0 mm, n = 26) bij gewonde dieren (p = 0,007). Vergelijkbare patronen worden gezien over de hersenen, met mediaan breedte en hoogte 5 – 7% kleiner bij gewonde dieren. Anatomische structuren aan zowel de linker-als de rechterkant worden op een vergelijkbare manier beïnvloed, zonder verschil tussen hemisferen. Zie afbeelding 1B voor afbeeldingen van de anatomische locaties. Over de reflex testperiode (P21 – P39), benadeelde dieren weergeven langzamer tijd om te roteren in de negatieve geotaxis taak (Figuur 4A), langzamer tijd om weg te draaien van de rand in de klif aversie taak (Figuur 4B), en langzamer tijd naar rechts (Figuur 4C). In de catwalk hebben gewonde dieren een vergelijkbare gemiddelde snelheid voor controles (Figuur 5a), maar vertonen een significant grotere snelheids variatie tijdens elke hardloopsessie (Figuur 5B). De gewicht-gecorrigeerde afstand tussen voorpoten en achterpoten (afdrukstand) is significant groter bij gewonde dieren (Figuur 5C), met minder druk uitgeoefend per unit poot oppervlak door de voorpoten (Figuur 5D). In het open veld bedekken de gewonde dieren minder totale afstand (Figuur 6A) en stoppen ze vaker (Figuur 6B). Ze besteden aanzienlijk meer tijd in het midden van het veld, en minder tijd in de hoeken (Figuur 6C, D). Representatieve warmtekaarten van controle en gewonde dieren worden weergegeven in Figuur 7A, B.
Figuur 1: tijdlijn. Op P17 worden dieren 3 mg/kg LPS toegediend voordat de ligatie van de bilaterale halsslagader wordt ondergaan en 30 min elk (niet met inbegrip van de tijd voor de kamer tot het evenwichts veld) van hypoxie (9% zuurstof), hyperoxie (80% zuurstof) en hypoxie (9%). De ligatie van de rechterhalsslagader wordt omgekeerd. Dieren worden blootgesteld aan 6 h van normothermia om ervoor te zorgen dat ze niet spontaan hypothermie in het nest in de periode na letsel worden. Reflex testen wordt vervolgens dagelijks uitgevoerd van P21 – P28, en drie keer per week van P28 – P42. Op P42 worden dieren getest in de catwalk en open veld voor het offeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve schade verdeling en-voorstelling. a) debruto schade Score van 26 overlevenden (n = 14 mannetjes, n = 12 vrouwtjes) in de gewonde groep, vergeleken met zes personen met een nest mate. Vijf dieren (n = 5 mannetjes) hadden een matig letsel, en vier dieren (n = 2 mannetjes, n = 2 vrouwtjes) hadden een ernstig letsel, gedefinieerd als bruto pathologie scores van respectievelijk 2 – 5 en 6 – 9. Grafiek toont mediaan met interkwartiel bereik. (B) controle hersenen (linker paneel, score 0), met hersenen die de toenemende Grove schade scores van 2, 5 en 8 van een totaal mogelijke Score van 9, van links naar rechts. De controle hersenen toont anatomische structuren bijzonder vatbaar voor letsel; 1 = longitudinale Fissure, 2 = laterale Sulcus, 3 = suprasylvian Sulcus, a = coronale gyrus, b = anterieure ectosylvian gyrus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve hersen metingen. Vergeleken met besturingselementen (n = 6), gewonde dieren (n = 26) vertonen een significant toegenomen blootstelling van het cerebellum (a), verkorting van de longitudinale fissuren (D), vernauwing van de coronale (B) en anterieure ectosylvian (E) Gyri, en verkorting van de laterale (C) en suprasylvian (F) sulci. Grafieken tonen mediaan met interkwartiel bereik. * geeft p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve reflex ontwikkeling. Vergeleken met controles (n = 6), vertonen gewonde dieren (n = 26) een tragere ontwikkeling (gebied onder de curve, AUC) van negatieve geotaxi's (A), Cliff aversie (B), en de rechtse reflex (C). Grafieken tonen mediaan met interkwartiel bereik. * geeft p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve catwalk resultaten. Vergeleken met controles (n = 6) lopen gewonde dieren (n = 26) in een vergelijkbaar gemiddeld tempo (a), maar met een grotere variabiliteit in snelheid tijdens het lopen (B). Gewonde dieren vertonen ook een langere gemiddelde afdrukpositie (C), waarbij minder druk wordt uitgeoefend per eenheid gebied (D). Grafieken tonen mediaan met interkwartiel bereik. * geeft p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: representatieve open veld gedrag. In vergelijking met de controles (n = 6) bedekken gewonde dieren (n = 26) een kleinere totale afstand (a) en stoppen ze vaker (B). Gewonde dieren brengen ook meer tijd door in het midden (C) dan in de hoeken (D). Grafieken tonen mediaan met interkwartiel bereik. * geeft p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 7: representatieve open veld Heatmaps. a) controlevan de vrouw,B) gewonde vrouw. Gewonde dieren bedekken een aanzienlijk kleinere afstand binnen het open veld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de fysieke en ontwikkelingsovereenkomsten die tussen het brein van de fret en het menselijk brein worden gedeeld, wordt de Ferret steeds vaker gebruikt om zowel volwassen als ontwikkelings hersenletsel te modelleren. 8,9,10,11,12. Echter, onderzoek tot op heden suggereert dat het Ferret brein is zowel resistent tegen initiële letsel als zeer plastic, met gedrags tekorten afnemen na verloop van tijd zelfs in de setting van zichtbaar pathologisch letsel10,12. Hier beschrijven we het eerste model van ontsteking-gesensibiliseerde hypoxische-ischemische (HI) hersenletsel in de late preterm-equivalent Ferret, wat resulteert in aanzienlijke bilaterale schade en aanhoudende gedrags tekorten bij overlevenden. Zoals met elke preklinische model, het doel was niet om nauwkeurig te reproduceren de blootstellingen van premature zuigelingen klinisch, maar om een samenvloeiing van de mechanistische factoren gedacht te worden betrokken bij voortijdige hersenletsel. Deze omvatten ontsteking, hypoxie, en oxidatieve stress7.
Een kritisch aspect van LPS administratie in onze Ferret modellen is een enkelvoudige hoge dosis gegeven rond 4 h voor hypoxie. LPS blootstelling in near-term equivalente knaagdieren resulteert in een circulerende inflammatoire cytokine piek rond 4 h na blootstelling, die overeenkomt met sensibilisatie van de hersenen om hypoxie-ischemie, en een aanzienlijke toename van hersenletsel15,16,17. Een vergelijkbaar tijdsverloop van inflammatoire cytokine afgifte (piek TNF-α en IL-6 Release 2 – 4 h na blootstelling aan LPS) wordt gezien in geïsoleerde Ferret perifere bloed mononucleaire cellen18. Uitgaande van een enkele chirurgische opstelling, het toedienen van LPS 30 – 60 minuten vóór de aanvang van de operatie zorgt voor voldoende tijd om 12 – 15 bilaterale halsslagader liggingen uit te voeren en de eerste blootstelling aan hypoxie te initiëren 4 uur na de toediening van LPS. Tijdens de modelontwikkeling werd aanvankelijk een LPS dosis van 5 mg/kg gebruikt, zoals beschreven in onze P10 blessure model12. Echter, deze LPS dosis werd geassocieerd met significante intra-hypoxische sterfte en longoedeem op obductie. Zowel de sterfte als het longoedeem werden verminderd door de LPS-dosis te verlagen tot 3 mg/kg.
Bij blootstelling aan hypoxie blijken een aantal factoren van cruciaal belang te zijn voor het waarborgen van aanzienlijke Grove schade, terwijl ook hoge sterfte niveaus worden voorkomen. Als gevolg van de laboratorium fretten wordt gefokt, is er een inherente variabiliteit in hypoxie tolerantie over nesten. In onze ervaring leidt het kruislings stimuleren van dieren of het combineren van dieren uit verschillende nesten in dezelfde hypoxie kamer voornamelijk tot de eerdere dood van grotere dieren of dieren van het meest gevoelige zwerfvuil. Als er meer vatbare dieren sterven vóór het doel 30 min hypoxie blootstelling en hypoxie wordt vroegtijdig gestopt, kleinere dieren van minder gevoelige nesten krijgen suboptimale hypoxie blootstelling, en zullen waarschijnlijk geen aanzienlijke schade lijden. Als gevolg daarvan moet elk zwerfvuil in zijn eigen aparte kamer aan hypoxie worden blootgesteld. De tweede hypoxie periode werd toegevoegd als onderdeel van een iteratief model ontwikkelingsproces dat we eerder beschreven12. Een enkele hypoxie periode resulteerde ofwel in overlijden of overleving zonder significant letsel, ongeacht de lengte.
Aangezien fretten lange perioden van acute hypoxie of bilaterale halsslagader ligatie kunnen tolereren zonder significant hersenletsel te vertonen, is onze huidige hypothese dat de periode van hyperoxia resulteert in verhoogde stofwisseling en vasodilatatie die hersenen ischemie tijdens de tweede hypoxie periode. Om de variabiliteit in het model te minimaliseren, gebruikten we vooraf bestelde seks-gebalanceerde nestjes van 8 fretten die in onze faciliteit op P15 aankwamen. In elk nestje werden 6 – 7 dieren geopereerd, gevolgd door hypoxie binnen een enkele kamer.
Na hypoxie en omkering van de ligatie van de rechter halsslagader, moeten dieren worden teruggestuurd naar hun Jills voor een periode van tijd om te voeden als gevolg van een risico van uitdroging en hypoglykemie van het verlengde verwondings protocol. Als er tijdens de temperatuur beheersperiode significante sterfte wordt ervaren, kunnen dieren extra vocht reanimatie (subcutane zoutoplossing en/of hand voeding met formule en water) nodig hebben voordat ze in de waterbaden voor 6 uur worden geplaatst. De temperatuur beheersperiode is echter een kritische determinant van langdurig letsel, omdat dieren anders neuroprotectie kunnen ondervinden van relatieve hypothermie in het nest. Dit risico op hypothermie is ten minste deels te wijten aan de lage temperatuur van de woning omstandigheden die nodig zijn voor de fret (60 – 70 °F).
De beschreven gedragstesten werden grotendeels ontwikkeld in het laboratorium, met een aantal basis in reflex tests die eerder werden beschreven in de ontwikkelende Ferret19, met Catwalk en open veld testen aangepast van volwassen knaagdieren om te worden gebruikt bij jonge fretten. Andere groepen hebben ook beschreven open veld, doolhof, en het testen van de gang bij volwassen fretten na traumatisch hersenletsel10, evenals het effect van in utero ontsteking op sociale interactie bij volwassen fretten20. Hoewel een lange vastenperiode niet wordt aanbevolen in fretten vanwege hun korte gut transittijd, het plaatsen van hen in een dieren drager voor 30 – 60 minuten voordat een van de tests is gunstig om hen in staat om te passeren urine en ontlasting vóór de tests. Omdat de fret van nature een nieuwsgierig dier is, gedraagt het zich vaak op tegengestelde wijze tegen knaagdieren in deze gedragstesten. Dit is vooral duidelijk in de catwalk, waar lichten en geluiden, met name opnames van een andere fret vocalizing ("dooking"), kan worden gebruikt om de fret te motiveren om vooruit te lopen.
Het huidige protocol heeft enkele beperkingen. Omdat het iteratief werd ontwikkeld met behulp van eerder ontwikkelde methoden in de P10 Ferret12, weten we momenteel niet de relatieve bijdragen van LPS, hypoxie, hyperoxia en reperfusie aan de laatste graad van letsel gezien. Echter, het is vermeldenswaard dat de ontwikkeling van de hier beschreven methode opgenomen met behulp van de oorspronkelijke Vannucci model (unilaterale carotis slagader ligatie gevolgd door een enkele periode van hypoxie) in de Ferret21, die niet resulteren in een aanzienlijke verwonding. Daarom zijn interacties tussen de verschillende delen van het verwondings protocol waarschijnlijk noodzakelijk voor aanhoudende verwondingen. Desondanks blijft er een duidelijke variabiliteit in grove schade bij overlevende dieren, wat een andere potentiële beperking is. Hoewel dieren zonder ernstige Grove schade letsel kunnen hebben dat aantoonbaar is met behulp van MRI of histopathologie12, zullen toekomstige werkzaamheden aan het model iteraties omvatten om te proberen het aantal dieren dat significant letsel in stand kan houden te verhogen, bijvoorbeeld door gebruik te maken van permanente ligatie van de bilaterale halsslagader. Tot slot, om dit model maximaal bruikbaar te maken voor het testen van putatieve neuroprotectieve therapieën voor ontwikkelings hersenletsel, moet het worden gevalideerd door de werkzaamheid van neuroprotectieve agentia te beoordelen die ofwel zijn vastgesteld voor de behandeling van HI-hersenletsel bij humane neonaten, of succesvol zijn geweest in een reeks andere diermodellen van neonatale hersenletsel. Toekomstige studies zullen daarom de werkzaamheid van therapeutische hypothermie en Erytropoëtine in dit model beoordelen, inclusief op seks gebaseerde therapeutische reacties en ex vivo MRI12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De ontwikkeling van het model werd gefinancierd Bill en Melinda Gates Foundation, evenals door NIH Grant 5R21NS093154-02 (NICHD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
