Summary
La méthode décrit les dommages hypoxiques-ischémiques et hyperoxiques hypoxiques et hyperoxic inflammation-sensibilités de cerveau dans le furet de P17 pour modeler l'interaction complexe entre l'inflammation prolongée et les dommages de cerveau oxydants éprouvés dans un certain nombre de enfants en bas âge prématurés en retard.
Abstract
Il existe un besoin continu de modèles cliniquement pertinents d'infection périnatale et d'hypoxie-ischémie (HI) dans lesquels tester des interventions thérapeutiques pour les nourrissons atteints de la séquelle neurologique de la prématurité. Les furets sont des candidats idéaux pour modéliser le cerveau humain prématuré, car ils naissent lissencephalic et développent des cerveaux gyrencephalic postnatally. À la naissance, le développement du cerveau du furet est semblable à un fœtus humain de 13 semaines, avec 17 trousses postnatales (P) considérées comme équivalentes à celles d'un nourrisson à 32 à 36 semaines de gestation. Nous décrivons un modèle de blessure dans le furet de P17, où l'administration de lipopolysaccharide est suivie par l'ischémie cérébrale bilatérale, l'hypoxie, et l'hyperoxia. Ceci simule l'interaction complexe de l'inflammation prolongée, de l'ischémie, de l'hypoxie, et du stress oxydatif éprouvé dans un certain nombre de nouveau-nés qui développent des dommages de cerveau. Les animaux blessés présentent une gamme de sévérité brute de blessure, avec des changements morphologiques dans le cerveau comprenant le rétrécissement du gyri cortical multiple et du sulci associé. Les animaux blessés montrent également un développement réflexe ralenti, une vitesse de locomotion plus lente et plus variable dans une passerelle automatisée, et une diminution de l'exploration dans un champ ouvert. Ce modèle fournit une plate-forme dans laquelle tester les thérapies putatives pour les nourrissons atteints d'encéphalopathie néonatale associée à l'inflammation et à l'HI, les mécanismes d'étude des blessures qui affectent le développement cortical, et d'étudier les voies qui fournissent la résilience dans animaux non affectés.
Introduction
Il existe un besoin continu de grands modèles animaux qui reflètent la physiopathologie de la prématurité et de l'hypoxie-ischémie périnatale dans lesquelles des interventions thérapeutiques pour les nourrissons peuvent être testées. En 2017, 9,93 % des 382 726 nourrissons nés aux États-Unis sont nés prématurément, et 84 % de ces nourrissons sont nés entre 32 et 36 semaines de gestation1. Chez les prématurés, l'exposition périnatale à l'infection ou à l'inflammation est courante, où l'activation immunitaire maternelle due à des agents pathogènes viraux ou bactériens peut initier un travail prématuré. Après la naissance, les nouveau-nés prématurés sont à risque élevé de septicémie précoce ou tardive2. Les enfants en bas âge prématurés éprouvent également fréquemment des périodes d'hypoxie, d'hypotension, et d'hyperoxia dues à leur système cardiorespiratoire immature, tension élevée d'oxygène dans l'atmosphère relative à ceux éprouvés in utero, et expositions iatrogenic. En outre, chez les nouveau-nés prématurés, les défenses antioxydantes sont immatures3 et les facteurs pro-apoptotiques sont naturellement upregulated4. Le stress oxydatif et la mort cellulaire conduisent à l'activation du système immunitaire et à la neuroinflammation. Ces facteurs combinés sont pensés pour contribuer à la vulnérabilité développementale et physiologique du cerveau, et ont comme conséquence ou exacerber l'encéphalopathie liée aux résultats développementaux pauvres dans les enfants en bas âge prématurés5,6,7.
En raison des similitudes physiques et développementales que le cerveau du furet partage avec le cerveau humain, le furet est une espèce attrayante dans laquelle modéliser les lésions cérébrales8,9,10,11,12. Les furets sont également des candidats idéaux pour modéliser le cerveau humain prématuré, car ils sont nés lissencephalic et développent des cerveaux gyrencephalic postnatally, qui fournit une fenêtre dans laquelle exposer le cerveau en développement aux insultes qui imitent ceux éprouvés par les enfants en bas âge prématurément. À la naissance, le développement du cerveau du furet est semblable à un fœtus humain de 13 semaines, avec 17 trousses postnatales (P) considérées comme équivalentes à celles d'un nourrisson à 32 à 36 semaines de gestation13.
Notre groupe a récemment publié un modèle de lésions cérébrales extrêmement prématurées (28 semaines de gestation) chez le furet P10 en combinant la sensibilisation inflammatoire avec escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) avec une exposition ultérieure à l'hypoxie et à l'hyperoxie12. Dans le protocole suivant, nous décrivons maintenant un modèle prématuré en retard dans le furet de P17, où la sensibilisation de LPS est suivie par l'ischémie cérébrale bilatérale, l'hypoxie, et l'hyperoxia. Il en résulte des blessures plus graves chez un sous-ensemble d'animaux, et modélise plus étroitement l'interaction complexe de l'inflammation prolongée, de l'ischémie, de l'hypoxie, et du stress oxydatif éprouvé dans un certain nombre de nouveau-nés prématurés qui développent des dommages de cerveau.
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Protocol
Les procédures ont été effectuées conformément au Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et dans le cadre d'un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Washington.
1. Préparation et administration LPS
REMARQUE: Reportez-vous à la figure 1 pour une chronologie des procédures.
- Avant de commencer la procédure, sceller, stériliser et autoclave tous les instruments chirurgicaux et rideaux chirurgicaux. Préparer des médicaments préopératoires dans des flacons stériles. Calculez le débit nécessaire pour remplacer l'air dans la chambre d'hypoxie/hyperoxie par le gaz expérimental en 8 à 10 min.
- Préparer le lipopolysaccharide (LPS de E. coli 055:B5) en salin stérile pour produire une concentration de 1 mg/mL. Retirez les kits de furet P17 de leurs jills. Pesez-les et numéroez-les. Randomisez les animaux par litière et sexe aux groupes témoins ou blessés (ou traités).
- À l'aide d'une seringue à insuline de 300 ll, administrer 3 mg/kg de LPS par voie intrapéritone à des trousses dans le groupe des blessés, et un volume équivalent de véhicule salin stérile (3 l/g) pour contrôler les animaux.
- Placer les animaux dans une chambre dans un bain d'eau à 37-40 oC afin de maintenir une température rectale cible de 36 à 37 oC tout au long des interventions chirurgicales.
2. Anesthésie
- Pendant la procédure, surveillez continuellement la température, la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque de l'animal.
- Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) sous-cutanée 30 min avant l'intervention chirurgicale. Induire l'anesthésie dans un mélange de 3% isoflurane équilibré avec 100% d'oxygène. Retirez le kit de la chambre d'induction et placez-le en supin sur une couverture d'eau chirurgicale drapée fixée à 37 oC. Transférer l'anesthésie sur le cône nasal et réduire le niveau d'isoflurane à 2 à 3%.
3. Préparation chirurgicale
- À l'aide de petites tondeuses pour animaux, enlever tous les poils de la région du cou ventral. Raser dans un modèle rectangulaire avec soin pour éviter de grignoter la peau ou de générer des éruptions cutanées de rasoir. Administrer l'anesthésie locale à la zone rasée en utilisant la lidocaïne intradermique (4 mg/kg) et la bupivacaine (2,5 mg/kg).
- Préparer le cou en alternant l'application de povidone-iode et 70% gommage à l'éthanol avec des cotons-tiges stériles. Répétez le gommage de telle sorte que le povidone-iode et 70% d'éthanol sont appliqués 3x en alternance.
- Confirmer la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réflexe de pincement des orteils. Maintenir le niveau d'isoflurane au pourcentage minimum requis pour un plan chirurgical d'anesthésie. À l'aide de rideaux stériles et jetables qui exposent la région du cou, drapez l'animal.
4. Ligation bilatérale de l'artère carotide
- Avec une lame #11 scalpel à usage unique, faire une incision médiane de 1,5 cm au centre du cou. À l'aide d'hémostats fins et de forceps incurvés, disséquez carrément vers le bas à l'artère carotide gauche. Disséquer l'artère loin du faisceau neurovasculaire associé.
- À l'aide d'une paire de forceps fins incurvés, passez une longueur en boucle de 10 cm de suture stérile de soie 5-0 sous l'artère. Couper la suture en deux. Ligate l'artère en attachant solidement les deux longueurs de suture, laissant au moins 2 mm entre les noeuds. Transect l'artère carotide gauche entre les sutures, en prenant soin de laisser le nerf intact.
- Répétez la dissection sur le côté droit. Ligate réversiblement ligate l'artère carotide droite avec une cravate ombilicale stérile simple 1/8 pouce. Fermez la plaie avec des pinces de peau chirurgicales.
- Laisser l'animal se rétablir dans un bain d'eau à température contrôlée pendant au moins 30 minutes avant l'hypoxie.
REMARQUE: Si les artères ne sont pas complètement isolées du reste du faisceau neurovasculaire, une mortalité accrue peut être observée avant ou pendant l'hypoxie ultérieure.
5. Hypoxie séquentielle, Hyperoxie et Hypoxie
- Pendant l'hypoxie et l'hyperoxyie, modifiez la température du bain d'eau au besoin pour maintenir la température rectale pendant l'hypoxie à 37 oC chez l'animal sentinelle.
- Placez les animaux dans le groupe de blessures dans une chambre hermétique à l'intérieur d'un bain d'eau. Surveillez continuellement la concentration en oxygène dans la chambre, ainsi que la température rectale dans au moins un animal sentinelle. Rincer la chambre avec de l'oxygène humidifié de 9 % (91 % d'azote) puis maintenir un débit de 3 à 5 L/min, selon la taille de la chambre. Une fois que la concentration d'oxygène dans la chambre a atteint 9%, continuer pendant 30 min.
- Après 30 min, passez l'alimentation en gaz à 80 % d'oxygène humidifié (20 % d'azote) et permettez à la chambre d'atteindre la concentration cible en fonction du débit et de la taille de la chambre. Continuer pendant 30 min d'hyperoxie. Ouvrez la chambre pour lui permettre d'atteindre plus rapidement la normoxie en équilibrant avec l'air de la pièce.
- Scellez la chambre et rincez avec 9 % d'oxygène humidifié. Surveillez en permanence tous les animaux visuellement, en prenant note des animaux qui présentent la bradypnée. Une fois que la concentration d'oxygène dans la chambre a atteint 9%, continuer pendant 30 min. Si la mortalité intra-hypoxique (arrêt respiratoire) chez l'un des animaux est observée avant la fin de la période de 30 minutes, mettre fin à l'hypoxie immédiatement.
6. Inversion de la ligation de l'artère carotide droite
- Remettre les animaux dans la zone chirurgicale, et induire l'anesthésie dans un mélange de 3% isoflurane équilibré avec 100% d'oxygène. Transférer l'anesthésie sur le cône nasal et réduire le niveau d'isoflurane à 2 à 3%. Retirez les pinces de plaie chirurgicale et préparez à nouveau la zone de la plaie avec de la povidone-iode. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réflexe de pincement des orteils. Maintenir le niveau d'isoflurane au pourcentage minimum requis pour un plan chirurgical d'anesthésie. À l'aide de rideaux stériles et jetables qui exposent la région du cou, drapez l'animal.
- À l'aide de forceps incurvés, identifiez et détachez le ruban ombilical de l'artère carotide droite. Fermez la plaie avec des pinces de peau chirurgicales.
7. Récupération et gestion de la température
- Retournez tous les kits à leurs jills pendant 60 min, pour les soins infirmiers et la récupération. Après 60 min, remettre les animaux blessés dans les bains d'eau à 37'40 oC pendant 6 h, en ajustant la température de l'eau au besoin afin de maintenir la température rectale à 36-37 oC. Retournez les kits à leurs jills.
- Enlever les clips chirurgicaux 10 à 14 jours après la chirurgie (P27-P31).
8. Test réflexe
- Effectuez tous les tests réflexes quotidiens à partir de P21-P28, et au moins 3fois par semaine à partir de P28-P42, tout en restant aveuglé par le groupe d'exposition (ou de traitement). Avant les tests réflexes, placez les kits dans une chambre avec assistance thermique (bain d'eau de 37 oC, coussin chauffant, etc.) pendant 1 h. Pour chaque test, terminez tous les essais par kit avant de tester le kit suivant.
- Géotaxis négatifs (25 degrés)
- Placez une planche plate (16 1/2 po x 12 po.) enveloppée dans un protecteur absorbant sur le dessus de la table contre un objet de sorte que la planche forme un angle de 25 degrés avec la table. Placez une trousse sur la planche sujette et orientée vers la descente, environ 75 % du chemin jusqu'à la planche.
- Assurez-vous que le corps du kit est droit et qu'il a les quatre pattes saisies contre le conseil avant de le relâcher. Dès que le kit est placé, commencez l'évaluation de temps.
- Enregistrez le temps où le kit parvient à faire pivoter son corps à 90 degrés par rapport à sa position de départ. Enregistrez l'heure à laquelle le kit tourne son corps à 180 degrés et fait un pas en avant vers le haut de la planche. Effectuez 3 essais à l'inclinaison de 25 degrés avant de passer au test suivant.
- Géotaxis négatifs (45 degrés)
- Effectuez à nouveau 3 essais du test de géotaxie négatif décrit précédemment, cette fois avec la planche fixée à un angle de 45 degrés.
- Aversion de falaise
- Placez une plate-forme rembourrée environ 1 pied sous le rebord pour minimiser les blessures aux kits s'ils tombent.
- Placez un kit face, et perpendiculaire ment au bord du banc de laboratoire. Assurez-vous que le corps du kit est droit, avec ses pattes avant rincer avec le bord. Commencez l'évaluation de l'heure à partir du moment où le kit est placé. Veillez à faire la différence entre le mouvement conscient loin de la falaise et d'autres mouvements spontanés qui n'impliquent pas une marche coordonnée.
- Enregistrez le moment où le kit déplace son corps loin du bord (défini comme le kit de sauvegarde, tourner son corps, ou déplacer ses membres avant loin du bord). Enregistrez le temps que le kit effectue sa première étape dans la direction opposée du bord (définie comme n'importe quelle direction ou angle au-delà d'une rotation de 90 degrés à partir de sa position de départ face au bord).
- Effectuez 3 essais d'aversion à la falaise par kit avant de passer au test suivant.
- Réflexe de redressement
- Placez un kit en supine sur le banc, en le tenant doucement dans cette position avant de le relâcher et en commençant simultanément le chronomètre. Enregistrez le temps que le kit se met au repos avec les quatre pattes simultanément à plat contre le banc dans des positions portantes. Enregistrez le moment où le kit fait un pas complet dans n'importe quelle direction (défini comme le placement des quatre pattes pour réaliser des progrès dans une direction donnée sans rotation ou traînage du corps).
- Effectuer 5 essais du test réflexe de redressement par animal.
- Après que chaque kit a terminé les 5 essais réflexes de redressement, retournez la litière à la jill.
9. Test de passerelle
- Sur P42, retirez les kits de la jill. Placez les kits dans des cages en plastique environ 10 minutes avant les essais, afin qu'ils puissent s'acclimater à l'environnement. Éteignez les lumières dans la salle d'essai pour vous assurer que la lumière ambiante n'affecte pas la fonction de la passerelle.
- Créez une nouvelle expérience dans le logiciel pertinent. Ajuster les réglages expérimentaux de sorte que la durée maximale de l'exécution ne dépasse pas 10,00 s et la durée minimale de l'exécution n'est pas inférieure à 1,50 s. Définir la variation de vitesse maximale afin qu'elle ne dépasse pas 60 %. Définir une exigence minimale de trois courses conformes pour chaque animal.
- Ajuster la largeur de la passerelle par rapport à la taille de l'animal afin qu'il soit capable de locomote librement sans toucher les murs tout en restant assez étroit pour décourager tourner. Ajoutez un nouveau paramètre de détection dans l'onglet Paramètres de détection à l'aide de la détection automatique. Utilisez les mêmes paramètres de détection pour toutes les portées et les animaux à un âge donné.
- Nettoyez soigneusement la passerelle avec un papier à faible teneur en papier et 70 % d'éthanol avant et après chaque animal. Nettoyez régulièrement les pattes du furet pour améliorer la précision de la détection et de la classification. Une fois que la passerelle et l'animal sont préparés, commencez l'acquisition d'essai.
- Pause acquisition pour nettoyer la passerelle si les empreintes s'accumulent sur le verre, ou si les animaux passent l'urine ou les excréments. Arrêtez l'acquisition une fois que le logiciel de passerelle a reconnu trois exécutions conformes basées sur les paramètres d'expérience prédéterminés.
10. Essais sur le terrain (P42)
- Utilisez une boîte acrylique non poreuse (55 cm x 55 cm x 40 cm de haut) peinte en blanc mat. Placez la caméra de sorte qu'elle soit centrée directement au-dessus de la boîte et les quatre murs sont capturés. Nettoyez l'arène d'essai avec 70 % d'éthanol avant la première utilisation et entre les animaux.
- Dans le logiciel pertinent, sélectionnez New From Template et appliquez un modèle prédéfini. Poursuivre la procédure de mise en place en sélectionnant séquentiellement le type de sujet: Autres; Modèle d'arène: Champ ouvert, carré ; Modèle de zone: Centre, bordure, coins; Caractéristiques à suivre: Point central.
- Ouvrez les paramètres de l'arène et saisissez l'image de fond de l'entrée de la caméra, en veillant à ce que les sommets des murs de l'arène soient visibles. Calibrer les dimensions de l'arène à l'aide de l'outil d'échelle.
- Ajustez les zones d'arène prédéfinies en redimensionnant les contours pour s'adapter aux zones murales (NW, NE, SW, SE) et aux zones de plancher (en haut gauche, en haut du milieu, en haut droit, au centre gauche, au centre, au milieu droit, au bas gauche, au milieu, au bas droit). Valider la configuration pour confirmer qu'aucune zone ne se chevauche.
- Ouvrez la fenêtre acquisition et appuyez sur Start Acquisition. Placez le furet au centre de l'arène de test orienté de telle manière qui est cohérente pour chaque sujet de test. Laisser le furet se déplacer librement dans toute l'arène pendant une période de 5 min. À la fin de la période d'essai, appuyez sur Stop Acquisition. Répétez la procédure avec le furet suivant.
REMARQUE: Tous les expérimentateurs dans la pièce doivent se positionner pour être inobservables par le furet et rester silencieux pendant la période d'essai.
11. Perfusion de fixation
- Sur P42, anesthésiez profondément les kits avec 5% d'isoflurane. Administrer un surdosage de pentobarbital (120 à 150 mg/kg i.p.). Assurer une anesthésie profonde par manque de réponse au pincement des orteils et à la perte de mouvements respiratoires.
- Transférer l'animal sur une hotte à fumée. Ouvrez le thorax et pincez l'aorte descendante à l'aide de hemostats fins. Coupez l'atrium droit. À l'aide d'une pompe à perfusion, perfuser le ventricule gauche avec 60 ml de salin stérile à un taux de 30 ml/min. Perfuse avec 60 ml de formaline (10 % de formaldéhyde) à un taux de 30 ml/min.
- Décapiter la carcasse et retirer le cerveau du crâne à l'aide de ciseaux, de forceps, de rongeurs et d'une spatule. Prenez des photos à haute résolution des aspects dorsaux, ventrals et latéraux de chaque cerveau. Post-fixer le cerveau en formaline pendant au moins 48 h.
12. Ex Vivo Brain Measurement
- Retirer le cerveau de la formaline (étape 11.3) et placer sur un essuie-tout pour absorber l'excès de liquide.
- À l'aide d'un étrier électronique, mesurer la hauteur du cerveau en plaçant les extrémités du étrier aux aspects dorsaux et ventrals du cerveau. Mesurer la longueur du cerveau en plaçant les extrémités de l'étrier à l'ampoule olfactive et la bordure la plus postérieure du lobe occipital. Mesurer la largeur du cerveau en plaçant les extrémités de l'étrier sur les parties les plus latérales des lobes temporels. Pesez le cerveau.
- Mesurer la fissure longitudinale (antérieure et postérieure au sulcus cruciforme), sulci latérale, sulci suprasylvian, sulci coronal, sulci pseudosylvian, sulci ansinate, sulci cruciforme, sulci présylvian, gyri latéral, gyri suprasylvian, gyri sigmoïde ( antérieur et postérieur), gyri coronal, gyri ectosylvian (antérieur et postérieur), et gyri orbital. Mesurer tous les sulci du début et de la fin de la partie la plus distincte du sulcus correspondant. Mesurer tous les gyri à partir de l'aspect le plus large de chaque gyrus correspondant.
- Mesurer la quantité de cervelet exposée en plaçant une pointe de l'étrier au point le plus postérieur de la fissure longitudinale et en plaçant l'autre pointe de l'étrier à la partie la plus postérieure du cervelet.
REMARQUE: L'atlas du cerveau du furet, tel que trouvé dans Biology and Diseases of the Ferret14, a été utilisé pour développer les mesures du cerveau ex vivo furet.
13. Notation des blessures graves
- À l'aide des photographies prises à l'étape 11.3., appliquez les critères de notation dans les étapes 13.2-13.4 pour évaluer les lésions cérébrales brutes (échelle 0-9) tout en restant aveuglés par les groupes d'exposition (ou de traitement).
- Évaluer la fissure longitudinale. Si cela semble normal, attribuez un score de 0. S'il est légèrement élargi (environ 2 fois la largeur normale), mais que l'augmentation de la largeur est incomplète le long de la longueur de la fissure, attribuez un score de 1. S'il est modérément élargi (environ 2 à 3 fois la normale), attribuez un score de 2. S'il est nettement élargi, avec un écart visible -gt;3x largeur normale le long de la plupart de la longueur de la fissure, appliquer un score de 3.
- Évaluer les sulci latéraux. S'ils montrent la définition normale, avec la séparation du gyri latéral et du gyri suprasylvian, assignent un score de 0. Si la définition réduite unilatérale ou bilatérale douce du sulcus est vue, particulièrement dans la partie caudale, avec le rétrécissement minimal des lobes frontaux et temporels par rapport aux lobes occipitaux, attribuent un score de 1.
- Si la définition modérément réduite du sulci est vue, avec la dépression du gyri suprasylvian, le rétrécissement du gyri coronal et d'ectosylvian, et le rétrécissement doux des lobes frontaux et temporels par rapport aux lobes occipitaux, assignent un score de 2. Si la dégénérescence cystique unilatérale est vue, avec le changement minimal de l'hémisphère contralatéral, assignent un score de 3. Si une mauvaise définition du sulci latéral est présente, avec la dégénérescence cystique ou grave bilatérale des lobes occipital et temporel, assignent un score de 4.
- Évaluer la partie visible du cervelet. S'il semble normal, avec (lt;75% du vermis et 'lt;66% des hémisphères visibles, attribuez un score de 0. Si 75 à 90 % du vermis et 66 % des hémisphères sont visibles, attribuez un score de 1. Si la majeure partie du cervelet est visible, montrant tout le vermis et 66 % des hémisphères, attribuez un score de 2.
14. Analyse des données
- Pour les données de test réflexe, attribuez des échecs d'un score de 61 s pour leur permettre d'être comparés aux succès à la fin des temps (60 s), mais avec un classement pire dans l'analyse statistique. Calculer une zone sous la courbe pour chaque animal au fil du temps dans chacun des tests réflexes.
- Ajuster les données de passerelle qui impliquelant la taille de la patte de la pression par le poids de l'animal.
- Analyser les données à l'aide de méthodes statistiques non paramétriques, en décrivant les données à l'aide de la plage médiane et interquartile (IQR).
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Representative Results
Sur 34 animaux (n ' 18 mâles, n ' 16 femelles) de six portées exposées à l'insulte, huit animaux (24 %; n ' 4 mâles, n ' 4 femelles) dans le groupe blessé sont morts au cours de la deuxième période d'hypoxie (n - 5), pendant la gestion de la température (n ' 2), ou pendant la nuit après l'insulte (n - 1). Dans le groupe des blessés, neuf des 26 survivants (35 %) a eu un préjudice grave visible. Cinq animaux (n et 5 mâles) ont subi des blessures modérées, et quatre animaux (n 2 mâles, n et 2 femelles) ont subi des blessures graves, définies comme des scores de pathologie brutes de 2 à 5 et 6 à 9, respectivement (figure 2A). Les animaux exposés à l'insulte ont donc un risque de 50% de décès ou de blessures graves importantes. Avec l'augmentation des blessures, le rétrécissement des gyri dans les lobes temporels et/ou occipitaux est observé, avec le raccourcissement sulcal associé, l'élargissement de la fissure longitudinale, et de grandes zones des zones de perte de tissu cystique chez les animaux les plus gravement blessés (Figure 2B). Chez les animaux blessés survivants (n ' 26; n ' 14 mâles, n ' 12 femelles), une exposition significativement plus grande du cervelet est observée (figure 3A), ainsi que le raccourcissement de la fissure longitudinale (Figure 3D). Il y a également un rétrécissement significatif du gyri ectosylvian coronal et antérieur (figure 3B,E), ainsi que le raccourcissement des sulci latéraux et suprasylvians (Figure 3C,F). Le poids médian du cerveau (IQR) était de 8,1 g (7,9 à 9,7 g, n - 6) chez les animaux témoins, et de 7,0 g (6,5 à 7,7 g) chez les animaux blessés (n ' 26, p - 0,005). Chez les animaux témoins, la longueur médiane du cerveau (IQR) était de 28,9 mm (27,8 à 29,6 mm, n - 6) comparativement à 27,5 mm (25,5 à 38,0 mm, n et 26) chez les animaux blessés (p - 0,007). Des modèles similaires sont observés dans tout le cerveau, avec une largeur médiane et une hauteur de 5 à 7 % plus petites chez les animaux blessés. Les structures anatomiques sur le côté gauche et droit sont affectées d'une manière similaire, sans différence entre les hémisphères. Voir Figure 1B pour les représentations des lieux anatomiques. Au cours de la période d'essai réflexe (P21-P39), les animaux blessés affichent un temps plus lent pour tourner dans la tâche de géotaxie négative (Figure 4A),le temps plus lent de tourner loin du bord dans la tâche d'aversion de falaise (Figure 4B), et le temps plus lent à droite (figure 4C). Sur la passerelle, les animaux blessés ont une vitesse moyenne similaire aux commandes (figure 5A), mais présentent un degré de variation de vitesse beaucoup plus élevé à chaque course (figure 5B). La distance ajustée en poids entre les pattes avant et les pattes postérieures (position d'impression) est significativement plus grande chez les animaux blessés (figure 5C), avec moins de pression exercée par zone de patte unitaire à travers les pattes avant (figure 5D). En plein champ, les animaux blessés couvrent moins de distance totale (figure 6A)et s'arrêtent plus fréquemment (figure 6B). Ils passent beaucoup plus de temps au centre du terrain, et moins de temps dans les coins (Figure 6C,D). Les cartes thermiques représentatives des animaux témoins et blessés sont indiquées à la figure 7A,B.
Figure 1: Chronologie. Sur P17, les animaux sont administrés 3 mg/kg LPS avant de subir la ligature bilatérale des artères carotides et 30 min chacun (sans compter le temps pour la chambre d'équilibre) de l'hypoxie (9% d'oxygène), l'hyperoxie (80% d'oxygène) et l'hypoxie (9%). La bonne ligature de l'artère carotide est alors inversée. Les animaux sont exposés à 6 h de normothermia pour s'assurer qu'ils ne deviennent pas spontanément hypothermiques dans le nid dans la période après la blessure. Les tests réflexes sont ensuite effectués quotidiennement à partir de P21-P28, et trois fois par semaine à partir de P28-P42. Sur P42, les animaux sont testés sur la passerelle et le champ ouvert avant le sacrifice. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Répartition et représentation desblessures représentatives. (A) Score de blessures graves de 26 survivants (n - 14 mâles, n - 12 femelles) dans le groupe blessé, comparativement à six contrôles de litière. Cinq animaux (n - 5 mâles) ont eu des dommages modérés, et quatre animaux (n - 2 mâles, n - 2 femelles) ont eu des dommages graves, définis comme des scores bruts de pathologie de 2-5 et 6-9, respectivement. Le graphique montre la médiane avec la gamme interquartile. (B) Contrôlez le cerveau (panneau gauche, score 0), avec des cerveaux représentant des scores croissants de blessures brutes de 2, 5 et 8 sur un score total possible de 9, de gauche à droite. Le cerveau témoin montre des structures anatomiques particulièrement sensibles aux blessures; 1 - fissure longitudinale, 2 sulcus latéral, 3 sulcus suprasylvian, un gyrus coronal, b - gyrus ectosylvian antérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Mesures cérébrales représentatives. Par rapport aux témoins (n - 6), les animaux blessés (n - 26) présentent une exposition significativement accrue au cervelet (A), le raccourcissement de la fissure longitudinale (D),le rétrécissement de la coronale (B) et l'ectosylvian antérieur (E) gyri, et le raccourcissement du latéral (C) et suprasylvian (F) sulci. Les graphiques montrent médiane avec la gamme interquartile. 'dénote p 'lt; 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Développement réflexe représentatif. Par rapport aux contrôles (n - 6), les animaux blessés (n ' 26) montrent un développement plus lent (zone sous la courbe, AUC) de géotaxis négatifs (A), aversion de falaise (B), et réflexe de redressement (C). Les graphiques montrent médiane avec la gamme interquartile. 'dénote p 'lt; 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Résultats des défilés représentatifs. Par rapport aux témoins (n - 6), les animaux blessés (n ' 26) marchent à un rythme moyen similaire (A), mais avec une plus grande variabilité de la vitesse pendant la marche (B). Les animaux blessés affichent également une position d'impression moyenne plus longue (C), avec moins de pression appliquée par zone unitaire (D). Les graphiques montrent médiane avec la gamme interquartile. - dénote p 'lt; 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Comportement représentatif sur le terrain ouvert. Par rapport aux témoins (n ' 6), les animaux blessés (n ' 26) couvrent une plus petite distance totale (A), ainsi que s'arrêtant plus fréquemment (B). Les animaux blessés passent également plus de temps au centre (C) que dans les coins (D). Les graphiques montrent médiane avec la gamme interquartile. 'dénote p 'lt; 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: Cartes de chaleur enplein champ représentatives. (A) contrôlez la femelle, (B) femelle blessée. Les animaux blessés couvrent une distance beaucoup plus petite dans le champ ouvert. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
En raison des similitudes physiques et développementales partagées entre le cerveau du furet et le cerveau humain, le furet est de plus en plus utilisé pour modéliser les lésions cérébrales adultes et développementales. 8,9,10,11,12. Cependant, la recherche à ce jour suggère que le cerveau de furet est résistant aux dommages initiaux aussi bien que fortement-plastique, avec des déficits comportementaux diminuant au fil du temps même dans l'arrangement des dommages pathologiques visibles10,12. Ici, nous décrivons le premier modèle des dommages de cerveau hypoxique-ischémiques hypoxiques -HI inflammation-sensibilisés (HI) dans le furet prématuré-équivalent tardif, qui a comme conséquence des dommages bilatéraux significatifs et des déficits comportementaux soutenus dans des survivants. Comme pour tout modèle préclinique, l'objectif n'était pas de reproduire avec précision les expositions rencontrées par les nouveau-nés prématurés sur le plan clinique, mais de fournir une confluence des facteurs mécanistes que l'on croyait être impliqués dans des lésions cérébrales prématurées. Ceux-ci incluent l'inflammation, l'hypoxie, et le stress oxydatif7.
Un aspect critique de l'administration de LPS dans nos modèles de furet est une dose élevée simple donnée autour de 4 h avant hypoxie. L'exposition au LPS chez les rongeurs équivalents à court terme entraîne un pic de cytokine inflammatoire circulant autour de 4 h après l'exposition, ce qui correspond à la sensibilisation du cerveau à l'hypoxie-ischémie, et à une augmentation significative des lésions cérébrales15,16,17. Un cours de temps semblable de libération inflammatoire de cytokine (le maximum de TNF-et-IL-6 libère ntl 2/4 h après exposition au LPS) est observé dans les cellules mononucléaires périphériques du furet isolé18. En supposant qu'une seule configuration chirurgicale, l'administration de LPS 30-60 min avant le début de la chirurgie permet un temps suffisant pour effectuer 12-15 ligations bilatérales d'artère carotide et initier la première exposition d'hypoxie 4 h après administration de LPS. Au cours du développement du modèle, une dose de LPS de 5 mg/kg a été initialement utilisée, comme décrit dans notre modèle de blessure P1012. Cependant, cette dose de LPS a été associée à la mortalité intra-hypoxique significative et à l'oedème pulmonaire sur l'autopsie. La mortalité et l'oedème pulmonaire ont été réduits en diminuant la dose de LPS à 3 mg/kg.
Pendant l'exposition à l'hypoxie, un certain nombre de facteurs semblent être essentiels pour assurer des dommages bruts significatifs tout en empêchant des niveaux élevés de mortalité. En raison de furets de laboratoire étant outbred, il y a une variabilité inhérente dans la tolérance d'hypoxie entre les portées. D'après notre expérience, l'accueil croisé d'animaux ou la combinaison d'animaux provenant de portées différentes dans la même chambre d'hypoxie entraîne principalement la mort plus précoce d'animaux plus grands ou d'animaux de la portée la plus sensible. Si plus d'animaux sensibles meurent avant que l'exposition à l'hypoxie cible de 30 min et que l'hypoxie soit arrêtée tôt, les petits animaux des portées moins sensibles recevront une exposition sous-optimale à l'hypoxie et ne subiront probablement pas de blessures importantes. Par conséquent, chaque portée d'animaux devrait être exposée à l'hypoxie dans sa propre chambre séparée. La deuxième période d'hypoxie a été ajoutée dans le cadre d'un processus de développement de modèles itératifs que nous avons précédemment décrit12. Une seule période d'hypoxie a entraîné la mort ou la survie sans blessure significative, indépendamment de la longueur.
Comme les furets sont capables de tolérer de longues périodes d'hypoxie aigue ou de ligature bilatérale d'artère carotide sans montrer des dommages significatifs de cerveau, notre hypothèse courante est que la période de l'hyperoxia a comme conséquence le métabolisme et la vasodilatation élevés qui facilite ischémie cérébrale au cours de la deuxième période d'hypoxie. Pour minimiser la variabilité du modèle, nous avons utilisé des portées sexo-équilibrées précommandées de 8 furets qui sont arrivés dans notre établissement sur P15. Dans chaque portée, 6 à 7 animaux ont subi une intervention chirurgicale suivie d'une hypoxie dans une seule chambre.
Après l'hypoxie et l'inversion de la ligature droite d'artère carotide, les animaux devraient être retournés à leurs jills pendant une période de temps pour se nourrir dû à un risque de déshydratation et d'hypoglycémie du protocole prolongé de blessure. Si une mortalité importante est ressentie pendant la période de gestion de la température, les animaux peuvent avoir besoin d'une réanimation liquide supplémentaire (saline sous-cutanée et/ou alimentation à la main avec de la formule et de l'eau) avant d'être placés dans les bains d'eau pendant 6 h. La période de gestion de la température est, cependant, un déterminant critique des dommages à long terme, car les animaux peuvent autrement éprouver la neuroprotection de l'hypothermie relative dans le nid. Ce risque d'hypothermie est dû au moins en partie à la basse température des conditions de logement requises pour le furet (60 à 70 oF).
Les essais comportementaux décrits ont été en grande partie développés dans le laboratoire, avec une certaine base dans les essais réflexes précédemment décrits dans le furet en développement19, avec des essais de passerelle et de champ ouvert adaptés des rongeurs adultes pour être employés dans les furets juvéniles. D'autres groupes ont également décrit le champ ouvert, le labyrinthe, et l'essai de démarche dans les furets adultes après des dommages traumatiques de cerveau10,aussi bien que l'effet de l'inflammation in utero sur l'interaction sociale dans les furets adultes20. Bien qu'une longue période de jeûne ne soit pas recommandée chez les furets en raison de leur court temps de transit intestinal, les placer dans un porte-animaux pendant 30 à 60 minutes avant que l'un des tests ne soit bénéfique afin de leur permettre de passer de l'urine et des excréments avant les tests. Comme le furet est par nature un animal curieux, il se comporte souvent d'une manière opposée aux rongeurs dans ces tests comportementaux. Cela est particulièrement évident dans la passerelle, où les lumières et les sons, en particulier les enregistrements d'un autre furet vocalisant ("dooking"), peut être utilisé pour motiver le furet à marcher vers l'avant.
Le protocole actuel comporte certaines limites. Comme il a été développé itératif en utilisant des méthodes précédemment développées dans le furet P1012, nous ne connaissons pas actuellement les contributions relatives de LPS, hypoxie, hyperoxie, et la réperfusion au degré final de blessure vu. Cependant, il est intéressant de noter que le développement de la méthode décrite ici inclus en utilisant le modèle vannucci original (ligature unilatérale de l'artère carotide suivie d'une seule période d'hypoxie) dans le furet21, qui n'a pas entraîné de blessure significative. Par conséquent, les interactions entre les multiples parties du protocole de blessure sont susceptibles d'être nécessaires pour les blessures subies. Malgré cela, il reste une variabilité distincte des blessures graves chez les animaux survivants, ce qui est une autre limitation potentielle. Bien que les animaux sans blessure grave significative peuvent avoir des blessures qui sont détectables à l'aide de l'IRM ou l'histopathologie12, les travaux futurs sur le modèle comprendra des itérations pour essayer d'augmenter le nombre d'animaux qui subissent des blessures importantes, par exemple en utilisant la ligature bilatérale permanente de l'artère carotide. Enfin, pour que ce modèle soit au maximum utile pour tester les thérapies neuroprotectrices putatives pour les lésions cérébrales développementales, il devrait être validé en évaluant l'efficacité des agents neuroprotecteurs qui sont soit établis pour le traitement des lésions cérébrales HI chez les nouveau-nés humains, ou ont réussi dans une gamme d'autres modèles animaux de lésions cérébrales néonatales. Les études futures évalueront donc l'efficacité de l'hypothermie thérapeutique et de l'érythropoïétine dans ce modèle, y compris les réponses thérapeutiques fondées sur le sexe et l'IRM ex vivo12.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
L'élaboration du modèle a été financée par la Fondation Bill et Melinda Gates, ainsi que par la subvention 5R21NS093154-02 (NICHD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
