Summary
Metoden beskriver inflammation-sensibiliserad hypoxisk-ischemisk och hyperoxic hjärnskada i P17 Ferret att modellera komplexa samspelet mellan långvarig inflammation och oxidativ hjärnskada upplevt i ett antal sena prematura spädbarn.
Abstract
Det finns ett kontinuerligt behov av kliniskt relevanta modeller av perinatal infektion och hypoxi-ischa (HI) för att testa terapeutiska ingrepp för spädbarn med den neurologiska följd av prematuritet. Illrar är idealiska kandidater för modellering av prematura mänskliga hjärnan, eftersom de föds lissencephalic och utveckla gyrencephalic hjärnor postnatally. Vid födseln, iller hjärnans utveckling liknar en 13 veckors mänskligt Foster, med postnatal-dag (P) 17 kit anses vara likvärdiga med ett spädbarn vid 32-36 veckors dräktigning. Vi beskriver en skada modell i P17 Ferret, där lipopolysackarid administration följs av bilaterala cerebral ischiller, hypoxi, och hyperoxia. Detta simulerar den komplexa interaktionen av långvarig inflammation, ischemia, hypoxi, och oxidativ stress upplevs i ett antal nyfödda som utvecklar hjärnskada. Skadade djur visar en rad av grov skada svårighetsgrad, med morfologiska förändringar i hjärnan inklusive förträngning av flera kortikala gyri och tillhörande sulci. Skadade djur visar också långsammare reflex utveckling, långsammare och mer varierande hastighet av förflyttning i en automatiserad catwalk, och minskade prospektering i ett öppet fält. Denna modell ger en plattform för att testa metoder för behandling av spädbarn med neonatal encefalopati associerad med inflammation och HI, studimekanismer för skada som påverkar kortikal utveckling, och undersöka vägar som ger motståndskraft i opåverkade djur.
Introduction
Det finns ett ständigt behov av stora djurmodeller som återspeglar patofysiologin av prematuritet och perinatal hypoxi-ischa där terapeutiska ingrepp för spädbarn kan testas. I 2017, 9,93% av de 382 726 spädbarn födda i USA föddes prematura, och 84% av dessa spädbarn föddes mellan 32 och 36 graviditetsveckor1. Hos prematura spädbarn, perinatal exponering för infektion eller inflammation är vanligt, där maternell immunaktivering på grund av virus eller bakteriella patogener kan initiera prematura Labor. Postnatalt, prematura spädbarn har hög risk för tidig eller sen debut sepsis2. Prematura spädbarn upplever också ofta perioder av hypoxi, hypotoni och inverkan på grund av deras omogna kardiorespiratoriska system, förhöjda syre spänningar i atmosfären i förhållande till de som upplevt i livmodern, och iatrogena exponeringar. Dessutom, hos prematura spädbarn, antioxidant försvar är omogen3 och pro-apoptotiska faktorer är naturligt uppreglerad4. Oxidativ stress och celldöd leder till aktivering av immunförsvaret och neuroinflammation. Dessa kombinerade faktorer tros bidra till utveckling och fysiologisk sårbarhet i hjärnan, och resultera i eller förvärra encefalopati i samband med dåliga utvecklings utfall hos prematura spädbarn5,6,7.
På grund av den fysiska och utvecklingsmässiga likheter som iller hjärnan delar med den mänskliga hjärnan, iller är en attraktiv art som att modellera hjärnskada8,9,10,11,12. Illrar är också idealiska kandidater för att modellera den prematura mänskliga hjärnan, eftersom de föds lissencephalic och utveckla gyrencephalic hjärnor postnatally, som ger ett fönster där för att exponera hjärnans utveckling till förolämpningar som efterliknar de upplevs av spädbarn födda prematura. Vid födseln, iller hjärnans utveckling liknar en 13 veckors mänskligt Foster, med postnatal-dag (P) 17 kit anses vara likvärdiga med ett spädbarn vid 32-36 veckors dräktifiering13.
Vår grupp har nyligen publicerat en modell av extremt prematur (< 28 veckors dräktigning) hjärnskada i P10 Ferret genom att kombinera inflammatorisk sensibilisering med Escherichia coli lipopolysackarid (LPS) med efterföljande exponering för hypoxi och inverkan12. I följande protokoll, vi nu beskriva en sen prematura modell i P17 Ferret, där LPS sensibilisering följs av bilaterala cerebral ischisin, hypoxi, och hyperoxia. Detta resulterar i mer allvarliga skador i en delmängd av djur, och närmare modeller den komplexa interaktionen av långvarig inflammation, ischemia, hypoxi, och oxidativ stress upplevt i ett antal prematura spädbarn som utvecklar hjärnskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden har utförts i enlighet med NIH guide för vård och användning av försöksdjur och som en del av ett godkänt protokoll från University of Washington institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. beredning och administration av LPS
Anmärkning: Se figur 1 för en tidsplan för procedurerna.
- Innan du påbörjar förfarandet, tätning, sterilisera och autoklav alla kirurgiska instrument och kirurgiska draperier. Förbered preoperativa läkemedel i sterila injektionsflaskor. Beräkna den flödeshastighet som krävs för att ersätta luften i hypoxi/hyperoxia kammare med experimentell gas i 8 – 10 min.
- Bered lipopolysackarid (LP-skivor från E. coli 055: B5) i steril saltlösning för att producera en koncentration på 1 mg/ml. Ta bort P17 Ferret Kits från deras Jills. Väg och numrera dem. Randomisera djur genom strö och kön till kontroll eller skadade (eller behandling) grupper.
- Använd en 300 μL insulinspruta, administrera 3 mg/kg LPS intraperitonealt till byggsatser i skade gruppen, och en ekvivalent volym av sterilt saltlösning (3 μL/g) för att kontrollera djuren.
- Placera djuren i en kammare i ett vattenbad vid 37 – 40 ° c för att bibehålla en rektaltemperatur på 36 – 37 ° c under hela kirurgiska ingrepp.
2. anestesi
- Under förfarandet, kontinuerligt övervaka temperatur, andning hastighet, och hjärtfrekvens av djuret.
- Administrera buprenorfin (0,05 mg/kg) subkutant 30 min före ingreppet. Inducera anestesi i en blandning av 3% isofluran balanserad med 100% syre. Ta bort satsen från induktions kammaren och placera den liggande på en drasig kirurgisk vattenpläd inställd på 37 ° c. Överför anestesi till näsan konen och minska isofluran nivå till 2 – 3%.
3. kirurgisk beredning
- Använda små djur Clippers bort allt hår på ventrala halsen regionen. Raka i ett rektangulärt mönster med omsorg för att undvika att du nickar huden eller genererar rakblads utslag. Administrera lokalbedövning till rakade området med intradermal lidokain (4 mg/kg) och bupivakain (2,5 mg/kg).
- Förbered halsen genom omväxlande applicering av povidon-jod och 70% etanol skrubba med sterila bomullsvabb. Upprepa skrubben så att povidon-jod och 70% etanol varje appliceras 3x i omväxlande mode.
- Bekräfta djupet av anestesi via frånvaro av tå-nypa reflex. Bibehålla nivån av isofluran på den lägsta procentsats som krävs för ett kirurgiskt plan av anestesi. Använda sterila disponibel Cut-out draperier som utsätter halsen regionen, drapera djuret.
4. bilateral halspulsådern ligering
- Med en engångs-användning #11 skalpell blad, gör en 1,5 cm mittlinjen snitt i mitten av halsen. Med hjälp av fina Peanger och böjda pinken, rakt dissekera ner till vänster halspulsådern. Dissekera artären bort från den tillhörande neurovaskulära bunt.
- Med hjälp av ett par böjda fina tång, passera en loopas 10 cm längd steril 5-0 Silk suturen under artären. Skär suturen på mitten. Ligate artären genom att säkert binda båda längder av suturen, lämnar minst 2 mm mellan knutarna. Transect vänster halspulsådern mellan suturer, noga med att lämna nerven intakt.
- Upprepa dissektion på höger sida. Reversibelt ligera rätt halspulsådern med en enda steril 1/8 tum navelsträngen slips. Stäng såret med kirurgiska hud klämmor.
- Låt djuret återhämta sig i ett temperaturstyrt vattenbad i minst 30 min före hypoxi.
Anmärkning: Om artärerna inte är helt isolerade från resten av neurovaskulära bunt, ökad dödlighet kan ses före eller under senare hypoxi.
5. sekventiell hypoxi, Hyperoxia och hypoxi
- Under hypoxi och hyperoxia, Alter vattenbad temperatur som behövs för att bibehålla rektal temperatur under hypoxi vid 37 ° c i indikator djuret (s).
- Placera djuren i skade gruppen i en lufttät kammare inom ett vattenbad. Kontinuerligt övervaka syrekoncentrationen i kammaren, liksom rektaltemperatur hos minst ett vakt djur. Spola kammaren med fuktad 9% syre (91% kväve) och behåll sedan en flödeshastighet på 3 – 5 L/min, beroende på kammarens storlek. När syrehalten i kammaren har nått 9%, Fortsätt i 30 min.
- Efter 30 min, växla gasförsörjning till 80% befuktat syre (20% kväve), och låta kammaren att nå målkoncentrationen baserat på flöde och kammar storlek. Fortsätt i 30 min av hyperoxia. Öppna kammaren så att den snabbare når normoxia genom att för med rumsluft.
- Försegla kammaren och spola med 9% befuktat syre. Kontinuerligt övervaka alla djur visuellt, med anteckning av djur som visar bradypnea. När syrehalten i kammaren har nått 9%, Fortsätt i 30 min. Om intrahypoxisk dödlighet (andningsstillestånd) i något av djuren ses före slutet av 30 min-perioden, avsluta hypoxi omedelbart.
6. återföring av rätt halspulsådern ligering
- Returnera djur till det kirurgiska området, och inducera anestesi i en blandning av 3% isofluran balanserad med 100% syre. Överför anestesi till näsan konen och minska isofluran nivå till 2 – 3%. Ta bort de kirurgiska sår klämmorna och bered sårytan med povidon-jod. Bekräfta djupet av anestesi via frånvaro av tå-nypa reflex. Bibehålla nivån av isofluran på den lägsta procentsats som krävs för ett kirurgiskt plan av anestesi. Använda sterila disponibel Cut-out draperier som utsätter halsen regionen, drapera djuret.
- Använda böjda pinpett, identifiera och knyta navel bandet från höger halspulsådern. Stäng såret med kirurgiska hud klämmor.
7. återvinning och temperaturhantering
- Returnera alla satser till deras Jills för 60 min, för omvårdnad och återhämtning. Efter 60 min, returnera skadade djur till vatten Baden vid 37 – 40 ° c för 6 h, justera vattentemperaturen som behövs för att bibehålla rektal temperatur vid 36 – 37 ° c. Retur satser till sina Jills.
- Ta bort kirurgiska clips 10 – 14 dagar efter operationen (M27 – P31).
8. reflex provning
- Utför alla reflex test dagligen från P21 – P28, och minst 3x per vecka från P28 – P42, medan de förblir förblindade till exponering (eller behandling) grupp. Innan reflex provning, placera kit i en kammare med värme stöd (37 ° c vattenbad, värme pad, etc.) för 1 h. För varje test, Slutför alla prövningar per sats innan du testar nästa kit.
- Negativ geotaxis (25 °)
- Placera en platt bräda (16 1/2 in. x 12 in.) insvept i ett absorberande bänk skydd mot ett föremål så att brädan bildar en 25 ° vinkel med bordet. Placera ett kit på tavlan benägna och vänd nedför, cirka 75% av vägen upp i styrelsen.
- Se till att kit kropp är rak och att den har alla fyra tassar grep mot brädet innan du släpper den. Så snart satsen är placerad, starta tids bedömningen.
- Registrera tiden då satsen lyckas rotera sin kropp 90 ° i förhållande till sin utgångsposition. Registrera den tid då satsen roterar sin kropp 180 ° och tar ett helt steg mot toppen av styrelsen. Utför 3 försök vid 25 ° lutning innan du går vidare till nästa test.
- Negativ geotaxis (45 °)
- Utför 3 prövningar av tidigare beskrivna negativa geotaxis test igen, denna gång med styrelsen inställd på en 45 ° vinkel.
- Cliff riskaversion
- Placera en vadderad plattform runt 1 fot underkanten för att minimera skador på byggsatser om de faller.
- Placera ett kit vänd mot, och vinkelrätt mot, kanten av labbet bänken. Se till att kit kropp är rak, med dess främre tassar spola med kanten. Börja tids bedömningen från det ögonblick då satsen placeras. Var noga med att skilja mellan medveten rörelse bort från klippan och andra spontana rörelser som inte involverar samordnade promenader.
- Registrera tiden när satsen flyttar sin kropp bort från kanten (definierat som Kit säkerhetskopiering, vrida dess kropp, eller flytta dess främre armar och ben bort från kanten). Spela in den tid som satsen slutför sitt första steg i motsatt riktning av kanten (definierad som någon riktning eller vinkel förbi en 90 ° rotation från dess utgångsläge mot kanten).
- Utför 3 Cliff riskaversion prövningar per kit innan du går vidare till nästa test.
- Rätande reflex
- Placera ett kit liggande på bänken, hålla den försiktigt i den positionen innan du släpper den och samtidigt börjar stoppuret. Spela in den tid som satsen tar sig att vila med alla fyra tassar samtidigt platt mot bänken i viktbärande positioner. Registrera den tid då satsen tar ett helt steg i någon riktning (definierad som placeringen av alla fyra tassar för att uppnå framsteg i en given riktning utan spinning eller dra av kroppen).
- Utför 5 prövningar av det rätande reflex testet per djur.
- Efter varje Kit har slutfört 5 rätande reflex prövningar, returnera kullen till Jill.
9. Catwalk-testning
- På P42, ta bort kit från Jill. Placera satser i Plastburar cirka 10 min innan testning, så att de kan vänja sig vid miljön. Stäng av belysningen i provningsrummet för att säkerställa att omgivningsljuset inte påverkar catwalken-funktionen.
- Skapa ett nytt experiment i relevant programvara. Justera experimentella inställningar så att den maximala körningstiden inte överstiger 10,00 s och den kortaste körningstiden inte är mindre än 1,50 s. Ställ in den maximala hastighets variationen så att den inte överstiger 60%. Ange ett minimikrav för tre kompatibla körningar för varje djur.
- Justera bredden på gångväg i förhållande till storleken på djuret så att det kan fritt locomote utan att vidröra väggarna samtidigt som den är smal nog att avskräcka svarvning. Lägg till en ny identifierings inställning på fliken profiler för Identifieringsinställningar med hjälp av automatisk identifiering. Använd samma Identifieringsinställningar för alla kullar och djur vid en given ålder.
- Rengör gångvägen med låg ludd pappers vävnad och 70% etanol före och efter varje djur. Rengör iller ' s tassar regelbundet för att förbättra noggrannheten av detektering och klassificering. När gångväg och djur är förberedda, börja rättegång förvärv.
- Pausa förvärvet för att rengöra catwalken om fotavtryck ackumuleras på glaset, eller om djuren passerar urin eller avföring. Stoppa förvärvet när catwalken-programvaran har erkänt tre kompatibla körningar baserat på de förutbestämda experiment inställningarna.
10. öppna fälttester (P42)
- Använd en icke-porös akryl låda (55 cm x 55 cm x 40 cm hög) målad Matt-vit. Placera kameran så att den centreras direkt ovanför boxen och alla fyra väggarna fångas upp. Rengör test arenan med 70% etanol före första användning och mellan djur.
- I relevant programvara väljer du ny från mall och tillämpar en fördefinierad mall. Fortsätt ställa in proceduren genom att sekventiellt välja ämnes typ: annan; Arena mall: öppet fält, kvadrat; Zonmall: centrera, gränsa, tränga någon; Funktioner för att spåra: Center-Point.
- Öppna Arena inställningar och ta tag i bakgrundsbilden från kamerans ingång, se till att topparna på arenan väggarna är synliga. Kalibrera dimensionerna för arenan med hjälp av skalnings verktyget.
- Justera de fördefinierade Arena zonerna genom att ändra storlek på konturerna så att de passar vägg zonerna (NW, NE, SW, SE) och golv zoner (vänster överkant, mittentopp, höger överkant, vänster mitten, mitten, höger mitten, vänster nederkant, mitten botten, höger nederkant). Validera uppsättningen för att bekräfta att inga zoner överlappar varandra.
- Öppna fönstret förvärv och tryck på Starta förvärv. Placera iller i mitten av test arenan orienterade på ett sådant sätt som är konsekvent för varje test ämne. Låt vesslan att röra sig fritt hela arenan under en period av 5 min. Tryck på stoppa förvärvi slutet av testperioden. Upprepa proceduren med nästa iller.
Anmärkning: Alla praktiker i rummet bör positionera sig för att vara icke observerbara av vesslan och förbli tyst under testperioden.
11. fixering-perfusion
- På P42, djupt söva kit med 5% isofluran. Administrera en överdosering av pentobarbital (120 – 150 mg/kg i.p.). Säkerställ djup anestesi av brist på respons på tå nypa och förlust av andningsrörelser.
- Överför djuret till ett draghuv. Öppna bröstkorgen och klämma den fallande aorta med fina hemostats. Skär höger förmak. Med hjälp av en perfusion pump, parfymera den vänstra ventrikeln med 60 mL steril saltlösning med en hastighet av 30 mL/min. parfymera med 60 mL formalin (10% formaldehyd) med en hastighet av 30 mL/min.
- Halshugga slaktkroppen, och ta bort hjärnan från skallen med hjälp av sax, pinps, rongeurs, och en spatel. Ta högupplösta fotografier av dorsala, ventrala, och laterala aspekter av varje hjärna. Efter fixera hjärnan i formalin för minst 48 h.
12. ex vivo hjärn mätning
- Ta bort hjärnan från formalin (steg 11,3) och placera på en pappershandduk för att absorbera överflödig vätska.
- Med hjälp av en elektronisk kaliper, mäta höjden av hjärnan genom att placera spetsarna på bromsklarna vid rygg och ventrala aspekter av hjärnan. Mät längden på hjärnan genom att placera spetsarna på den luktande glödlampan och den mest bakre gränsen av occipital LOB. Mät bredden på hjärnan genom att placera spetsarna på kaliper på de mest laterala delarna av tinningloberna. Väg hjärnan.
- Mät den longitudinella fissur (främre och bakre till kors sulcus), laterala sulci, suprasylvian sulci, koronalt sulci, pseudosylvian sulci, ansinate sulci, korsband sulci, presylvian sulci, lateral gyri, suprasylvian gyri, sigmoideum gyri ( främre och bakre), koronala gyri, ektosylvian gyri (främre och bakre), och orbital gyri. Mät alla sulci från början och slutet av den mest distinkta delen av motsvarande sulcus. Mät alla gyri från den bredaste aspekten av varje motsvarande gyrus.
- Mät mängden lillhjärnan exponeras genom att placera en spets av kaliper vid den mest bakre punkten i den longitudinella spricka och placera den andra spetsen av kaliper på den mest bakre delen av lillhjärnan.
Anmärkning: Iller Brain Atlas, som finns i biologi och sjukdomar i Ferret14, användes för att utveckla ex vivo iller hjärn mätningar.
13. bedömning av brutto skada
- Med hjälp av fotografierna tagna i steg 11,3, tillämpa bedömningskriterierna i steg 13.2 – 13.4 för att bedöma grov hjärnskada (0 – 9 skala) samtidigt som den förblir blind för exponering (eller behandling) grupper.
- Bedöma den longitudinella fissur. Om det verkar normalt, tilldela en poäng på 0. Om det är milt vidgad (ungefär 2x normal bredd), men ökningen av bredden är ofullständig längs längden på spricka, tilldela en poäng på 1. Om den är måttligt breddad (ungefär 2 – 3x normal), tilldela en poäng på 2. Om det är märkbart breddas, med en synlig lucka > 3x normal bredd längs de flesta av längden på spricka, tillämpa en poäng på 3.
- Bedöma den laterala sulci. Om de visar normal definition, med separation av den laterala gyri och suprasylvian gyri, tilldela en poäng på 0. Om mild ensidig eller bilateral reducerad definition av sulcus ses, särskilt i caudal portion, med minimal förträngning av frontal-och temporala lober i förhållande till occipital loberna, tilldela en poäng av 1.
- Om måttligt reducerad definition av sulci ses, med depression av suprasylvian gyri, förträngning av den koronala och ektosylvian gyri, och mild förträngning av frontal-och temporala lober i förhållande till occipital loberna, tilldela en poäng på 2. Om ensidig cystisk degeneration ses, med minimal förändring av kontralaterala halvklotet, tilldela en poäng på 3. Om dålig definition av den laterala sulci är närvarande, med bilaterala cystisk eller svår degeneration av occipital och temporala loberna, tilldela en poäng på 4.
- Bedöma den synliga delen av cerebellum. Om det verkar normalt, med (< 75% av vermis och < 66% av de synliga halvkloten, tilldela en poäng på 0. Om 75 – 90% av vermis och ≥ 66% av halvkloten är synliga, tilldela en poäng på 1. Om de flesta av lillhjärnan är synlig, visar alla vermis och ≥ 66% av halvklot, tilldela en poäng på 2.
14. data analys
- För reflex testdata, tilldela fel en poäng på 61 s så att de kan jämföras med framgångar i slutet av tiden (60 s), men med en sämre rangordning i den statistiska analysen. Beräkna ett område under kurvan för varje djur över tid i varje reflex test.
- Justera catwalken data som involverar Paw storlek tryck av vikten av djuret.
- Analysera data med hjälp av icke-parametriska statistiska metoder som beskriver data med median-och interkvartilintervall-intervallet (IQR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Av 34 (n = 18 hanar, n = 16 honor) djur från sex kullar utsatta för förolämpning, åtta djur (24%, n = 4 hanar, n = 4 honor) i den skadade gruppen dog under den andra hypoxi period (n = 5), under Temperaturhantering (n = 2), eller över natten efter förolämpningen (n = 1). I den skadade gruppen var nio av 26 överlevande (35%) hade synlig brutto skada. Fem djur (n = 5 hanar) hade måttlig skada, och fyra djur (n = 2 hanar, n = 2 honor) hade allvarlig skada, definierad som brutto patologi betyg på 2 – 5 respektive 6 – 9 (figur 2a). Djur som utsätts för förolämpning har därför en 50% risk för dödsfall eller betydande grov skada. Med ökande skada, förträngning av gyri i den temporala och/eller occipital loberna ses, med tillhörande gyral förkortning, utvidgning av den longitudinella spricka, och stora områden av områden av cystisk vävnad förlust i de mest allvarligt skadade djur (figur 2B). Hos överlevande skadade djur (n = 26; n = 14 hanar, n = 12 honor) sågs signifikant större exponering av lillhjärnan (figur 3A), samt förkortning av den longitudinella fissur (figur 3D). Det finns också betydande förträngning av den koronala och främre ektosylvian gyri (figur 3B, E), samt förkortning av laterala och suprasylvian sulci (figur 3C, F). Median (IQR) hjärn vikt var 8,1 g (7,9 – 9,7 g, n = 6) hos kontrolldjur och 7,0 g (6,5 – 7,7 g) hos skadade djur (n = 26, p = 0,005). I kontrolldjur var median (IQR) hjärn längd 28,9 mm (27,8 – 29,6 mm, n = 6) jämfört med 27,5 mm (25,5 – 38,0 mm, n = 26) hos skadade djur (p = 0,007). Liknande mönster ses i hela hjärnan, med median bredd och höjd 5 – 7% mindre hos skadade djur. Anatomiska strukturer på både vänster och höger sida påverkas på ett liknande sätt, utan skillnad mellan halvklot. Se figur 1B för skildringar av de anatomiska platserna. Under reflex testperioden (P21-P39), skadade djur visar långsammare tid att rotera i den negativa geotaxis uppgift (figur 4A), långsammare tid att rotera bort från kanten i Klippan riskaversion uppgift (figur 4B), och långsammare tid till höger (figur 4C). I catwalken har skadade djur en liknande medelhastighet för kontrollerna (figur 5a), men uppvisar en signifikant högre grad av hastighets variation under varje körning (figur 5B). Det viktjusterade avståndet mellan framtassarna och bakbenen (utskriftspositionen) är betydligt större hos skadade djur (figur 5C), med mindre tryck per enhet Paw Area genom förgrunden tassar (figur 5D). På det öppna fältet täcker skadade djur mindre total distans (figur 6A) och stannar oftare (figur 6B). De tillbringar betydligt mer tid i mitten av fältet, och mindre tid i hörnen (figur 6C, D). Representativa värmekartor över kontroll och skadade djur visas i figur 7A, B.
Bild 1: tidslinje. På P17, djuren administreras 3 mg/kg LPS innan de genomgår bilaterala halspulsådern ligering och 30 min vardera (inte inklusive tid för kammaren att equilibrate) av hypoxi (9% syre), inverkan (80% syre) och hypoxi (9%). Rätt halspulsådern ligering är sedan omvänd. Djur utsätts för 6 h av normothermia att se till att de inte blir spontant hypotermiska i boet under perioden efter skada. Reflex testning utförs sedan dagligen från P21 – P28, och tre gånger per vecka från P28 – P42. På P42, djur testas i catwalken och öppna fältet innan offret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ skade fördelning och skildring. a) grovskadepoäng från 26 överlevande (n = 14 hanar, n = 12 honor) i den skadade gruppen, jämfört med sex kontroller av skräp kompis. Fem djur (n = 5 hanar) hade måttlig skada, och fyra djur (n = 2 hanar, n = 2 honor) hade allvarlig skada, definierad som brutto patologi betyg på 2 – 5 respektive 6 – 9. Grafen visar median med interkvartilintervall Range. (B) kontroll hjärna (vänster panel, Poäng 0), med hjärna som skildrar ökande brutto skada poäng av 2,5 och 8 av en total möjlig poäng på 9, från vänster till höger. Kontrollera hjärnan visar anatomiska strukturer särskilt mottagliga för skada; 1 = längsgående fissur, 2 = laterala sulcus, 3 = suprasylvian sulcus, a = koronala gyrus, b = främre ektosylviska gyrus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa hjärn mätningar. Jämfört med kontroller (n = 6), skadade djur (n = 26) uppvisar signifikant ökad exponering av lillhjärnan (a), förkortning av den longitudinella fissur (D), förträngning av den koronala (B) och främre ektosylvian (E) gyri, och förkortning av den laterala (C) och suprasylvian (F) sulci. Diagram visar median med interkvartilintervall Range. * betecknar p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativ reflex utveckling. Jämfört med kontroller (n = 6), skadade djur (n = 26) Visa långsammare utveckling (område under kurvan, AUC) av negativa geotaxis (a), Cliff riskaversion (B), och rätande reflex (C). Diagram visar median med interkvartilintervall Range. * betecknar p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa catwalken-resultat. Jämfört med kontroller (n = 6) går skadade djur (n = 26) i en liknande medelhastighet (a), men med en större variation i hastigheten undergång (B). Skadade djur visar också en längre genomsnittlig utskriftsposition (C), med mindre tryck per Area (D). Diagram visar median med interkvartilintervall Range. * betecknar p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativt öppet fält beteende. Jämfört med kontroller (n = 6) täcker skadade djur (n = 26) en mindre total distans (a), samt stannar oftare (B). Skadade djur tillbringar också mer tid i centrum (C) än i hörnen (D). Diagram visar median med interkvartilintervall Range. * betecknar p < 0,05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: representativa öppna fält värmekartor. akontroll av kvinnor,Bskadade kvinnor. Skadade djur täcker ett betydligt mindre avstånd inom det öppna fältet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av de fysiska och utvecklingsmässiga likheter som delas mellan iller hjärnan och den mänskliga hjärnan, är iller alltmer används för att modellera både vuxna och utvecklingsmässiga hjärnskador. 8,9,10,11,12. Emellertid, forskning hittills tyder på att iller hjärnan är både resistent mot initial skada samt hög-plast, med beteendemässiga underskott minskar över tid även i fastställandet av synlig patologisk skada10,12. Här, vi beskriver den första modellen av inflammation-sensibiliserad hypoxisk-ischemisk (HI) hjärnskada i sena Preterm-motsvarande vesslan, vilket resulterar i betydande bilaterala skador och ihållande beteendemässiga underskott i överlevande. Som med alla prekliniska modell, var målet inte att exakt reproducera de exponeringar som uppstått hos prematura spädbarn kliniskt, men att ge ett sammanflödet av de mekanistiska faktorer som tros vara inblandade i för tidig hjärnskada. Dessa inkluderar inflammation, hypoxi, och oxidativ stress7.
En kritisk aspekt av LPS administration i våra vessla modeller är en enda hög dos ges runt 4 h före hypoxi. LPS exponering i nära-term likvärdiga gnagare resulterar i en cirkulerande inflammatorisk cytokin topp runt 4 h efter exponering, vilket motsvarar sensibilisering av hjärnan till hypoxi-ischisin, och en signifikant ökning av hjärnskada15,16,17. En liknande tid kurs av inflammatorisk cytokin release (topp TNF-α och IL-6 Release 2 – 4 h efter LPS exponering) ses i isolerade iller perifera blod mononukleära celler18. Förutsatt en enda kirurgisk uppsättning, administrera LPS 30 – 60 min före starten av operationen ger tillräckligt med tid att utföra 12 – 15 bilaterala halspulsådern ligationer och initiera den första hypoxi exponering 4 h efter LPS administration. Under modell utvecklingen användes en LPS-dos på 5 mg/kg initialt, vilket beskrivs i vår P10-skademodell12. Emellertid, denna LPS dos var förknippad med betydande intrahypoxisk dödlighet och lungödem på nekropsy. Både dödlighet och lungödem reducerades genom att sänka dosen av LPS till 3 mg/kg.
Under hypoxi exponering, ett antal faktorer verkar vara avgörande för att säkerställa betydande grov skada samtidigt också förhindra höga nivåer av dödlighet. På grund av att laboratorie illrar är utavlade, det finns en inneboende variation i hypoxi tolerans över kullar. Enligt vår erfarenhet, Cross-främjande djur eller kombinera djur från olika kullar i samma hypoxi kammare leder främst till den tidigare döden av större djur eller djur från de mest mottagliga kullen. Om mer mottagliga djur dör innan målet 30 min hypoxi exponering och hypoxi stoppas tidigt, mindre djur från mindre mottagliga kullar kommer att få suboptimala hypoxi exponering, och är osannolikt att upprätthålla betydande skada. Som en följd av detta bör varje kull av djur utsättas för hypoxi i sin egen separata kammare. Den andra hypoxiperioden lades till som en del av en iterativ modell utvecklingsprocess som vi tidigare har beskrivit12. En enda hypoxi period resulterade antingen i döden eller överlevnad utan betydande skada, oavsett längd.
Som illrar kan tolerera långa perioder av akut hypoxi eller bilaterala halspulsådern ligering utan att Visa signifikant hjärnskada, vår nuvarande hypotes är att perioden av inverkan resulterar i förhöjd metabolism och vasodilatation som underlättar hjärnan ischemi under den andra hypoxi perioden. För att minimera variationen i modellen, använde vi förbeställda sex-balanserade kullar med 8 illrar som anlände till vår anläggning på p15. I varje kull genomgick 6 – 7 djur kirurgi följt av hypoxi i en enda kammare.
Efter hypoxi och återföring av rätt halspulsådern ligering, djur bör återlämnas till sina Jills för en tid för att föda på grund av en risk för uttorkning och hypoglykemi från den förlängda skadan protokollet. Om betydande dödlighet upplevs under temperatur hanterings perioden, kan djuren behöva ytterligare vätske återupplivning (subkutan saltlösning och/eller hand utfodring med formel och vatten) innan de placeras i vatten Baden för 6 h. Temperatur hanterings perioden är dock en kritisk faktor för långvarig skada, eftersom djur annars kan uppleva neuroskydd från relativ hypotermi i boet. Denna risk för hypotermi beror åtminstone delvis på den låga temperaturen hos de boendeförhållanden som krävs för vesslan (60 – 70 ° f).
Den beteendemässiga tester beskrivs utvecklades till stor del inom laboratoriet, med viss grund i reflex test som tidigare beskrivits i utvecklingen iller19, med catwalken och öppna fälttester anpassade från vuxna gnagare som skall användas i juvenila illrar. Andra grupper har också beskrivit öppna fält, labyrint, och gång provning hos vuxna illrar efter traumatisk hjärnskada10, samt effekten av in utero inflammation på social interaktion hos vuxna illrar20. Även om en lång faste period inte rekommenderas i illrar på grund av deras korta tarm transittid, placera dem i ett djur bärare för 30 – 60 min innan något av testerna är fördelaktigt för att tillåta dem att passera urin och avföring innan testerna. Som vesslan är vid naturen ett nyfikna djur, uppför det ofta i en motsats sätt till gnagare i dessa beteendemässiga testar. Detta är särskilt tydligt i catwalken, där ljus och ljud, särskilt inspelningar av en annan iller vocalizing ("dooking"), kan användas för att motivera iller att gå framåt.
Det aktuella protokollet har vissa begränsningar. Eftersom det utvecklades iterativt med hjälp av tidigare utvecklade metoder i P10 Ferret12, vi vet för närvarande inte de relativa bidragen av LPS, hypoxi, hyperoxia, och reperfusion till den slutliga graden av skada sett. Det är dock värt att notera att utvecklingen av den metod som beskrivs här ingår med hjälp av den ursprungliga Vannucci modellen (ensidig halspulsådern ligering följt av en enda period av hypoxi) i iller21, som inte leder till någon betydande skada. Därför är det troligt att interaktioner mellan de olika delarna av skade protokollet är nödvändiga för en varaktig skada. Trots detta återstår en tydlig variation i brutto skada hos överlevande djur, vilket är en annan potentiell begränsning. Även om djur utan betydande grov skada kan ha skada som är detekterbar med MRT eller histopatologi12, kommer framtida arbete på modellen inkludera iterationer för att försöka öka antalet djur som upprätthåller betydande skada, till exempel genom att använda permanenta bilaterala halspulsådern ligering. Slutligen, för att denna modell ska vara maximalt användbar för att testa förmodade neuroprotektiva terapier för utvecklings-hjärnskada, det bör valideras genom att bedöma effekten av nervskyddande medel som antingen är etablerade för behandling av Hi hjärnskada i mänskliga nyfödda, eller har varit framgångsrika i en rad andra djurmodeller av neonatal hjärnskada. Framtida studier kommer därför att bedöma effekten av terapeutisk hypotermi och erytropoietin i denna modell, inklusive könsbaserade terapeutiska svar och ex vivo MRT12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Utvecklingen av modellen finansierades Bill och Melinda Gates Foundation, samt av NIH Grant 5R21NS093154-02 (NICHD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
