Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Högeffektiv transfektion av primära makrofager med in vitro-transkriberad mRNA

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Makrofager, särskilt primära makrofager, är utmanande att transfect som de är specialiserade på att upptäcka molekyler av icke-själv ursprung. Vi beskriver ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av primära makrofager med mRNA genereras från DNA-mallar såsom plasmider.

Abstract

Makrofager är fagocyterande celler specialiserade på att upptäcka molekyler av icke-själv ursprung. För detta ändamål är de utrustade med ett stort utbud av mönster igenkännings receptorer (PRRs). Tyvärr gör detta också makrofager särskilt utmanande att transfect som transfektion reagens och transfekterade nukleinsyror ofta erkänns av PRRS som icke-jaget. Därför, transfektion resulterar ofta i makrofagaktivering och nedbrytning av transfekterade nukleinsyror eller ens i självmord av makrofager. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av murin primära makrofager såsom peritonealdialys makrofager (PM) och benmärg-derived makrofager (BMDM) med mRNA in vitro transkriberas från DNA-mallar såsom plasmider. Med detta enkla protokoll, transfektionshastigheter på cirka 50-65% för PM och om 85% för BMDM uppnås utan cytotoxicitet eller immunogenicitet observerats. Vi beskriver i detalj generering av mRNA för transfektion från DNA konstruktioner såsom plasmider och transfektion förfarande.

Introduction

Makrofager är fagocyterande celler som specialiserat sig på att upptäcka, intag och förnedrande mikrober, apoptotiska celler och cellulära skräp. Dessutom, de hjälper till att iscengöra immunsvar genom att utsönta cytokiner och chemokiner och genom att presentera antigener till T-celler och B-celler. Macrophages spelar också viktiga roller i många andra processer, såsom sårläkning, åderförkalkning, tumorigenes och fetma.

För att kunna detektera icke-själv-molekyler som patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) och out-of-Place molekyler såsom skadeassocierade molekylära mönster (DAMPs), makrofager är utrustade med ett stort utbud av mönsterigenkänning receptorer (PRR)1. Tyvärr gör detta också makrofager särskilt utmanande att transfect2 som transfektion reagens3 och transfekterade nukleinsyror4,5,6,7 ofta erkänns av PRRS som icke-jaget. Av denna anledning, transfektion av makrofager med kemiska eller fysikaliska metoder8 vanligtvis resulterar i makrofagaktivering och nedbrytning av transfekterade nukleinsyror eller ens i makrofagsjälvmord via pyroptos, en form av programmerad lytisk celldöd utlöst efter erkännande av cytosoliska PAMPs/damps såsom DNA eller främmande RNA9. Biologisk transfektion av makrofager med virus som adenovirus eller lentivirus som vektorer är ofta mer effektiv, men byggandet av sådana virusvektorer är tidskrävande och kräver biosäkerhet nivå 2 utrustning10,11.

Även om makrofager är föremål för intensiv forskning hämmas därför analys av deras funktioner på molekylär nivå eftersom ett av de viktigaste verktygen för molekylärbiologi, transfektion av nukleinsyra konstruktioner för EXOGEN uttryck av proteiner, är knappast tillämplig. Detta tvingar ofta forskare att använda makrofagliknande cellinjer i stället för bona fide makrofager. Tillämpningar för nukleinsyra konstruera transfektion inkludera uttryck av muterade eller märkta protein versioner, överuttryck av ett specifikt protein, protein nytt uttryck i en respektive knockout bakgrund och uttryck av proteiner från andra arter (t. ex. , CRE driver eller guide RNA och Cas9 för riktad genknockout).

Här, vi beskriver ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av (vanligtvis svårt att transfect) primära makrofager, som är murina peritonealdialys makrofager (PM) och benmärg-derived makrofager (BMDM) med mRNA genereras från DNA-mallar såsom plasmider. Viktigt, den in vitro-transkriberas mRNA genereras med hjälp av detta protokoll innehåller naturligt förekommande modifierade nukleosider 5-metyl-CTP och pseudo-UTP som minskar immunogenicitet och förbättra stabiliteten4,6,7,12,13. Dessutom är 5 '-ändarna av in vitro transkriberas mRNA defosforyleras av antarktisk fosfatas för att förhindra erkännande av Rig-i Complex14,15. Detta minimerar medfödda immun erkännande av in vitro transkriberas mRNA. Med vår lätt att utföra protokoll, transfektion priser mellan 50-65% (peritoneal makrofager (PM)) och 85% (BMDM) uppnås medan, viktigare, det finns ingen cytotoxicitet eller immunogenicitet observerats. Vi beskriver i detalj (i) hur immunologiskt tystade mRNA för transfektion kan genereras från DNA-konstruktioner som plasmider och (II) själva transfektioningreppet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Makrofagisolering från möss utfördes i enlighet med lagen om djurskydd i Tyskland i överensstämmelse med etikkommittén vid Kölns universitet.

Anmärkning: Utför alla steg som bär handskar. Utför alla transfektion steg under en laminär Flow Hood för att förhindra kontaminering av cellerna. Innan du arbetar med mRNA ska du rengöra alla instrument som pipetter och varje yta med 70% etanol och/eller ett RNAse-nedbrytande ytaktivt ämne (tabell över material). Säkerställ att alla reaktionsrör är RNAse-fria och sterila. Använd endast sterilt, RNAase-fritt vatten för spädningar. Använd endast pipettspetsar med filter. Ändra pipettspetsarna efter varje pipettsteg.

1. generering av DNA-mall

Anmärkning: DNA-mallen för in vitro-mRNA-transkription med detta protokoll måste innehålla en T7 promotor sekvens för att tillåta dockning av RNA-polymeras. Om plasmiden innehållande DNA-sekvensen av proteinet av intresse redan innehåller en korrekt orienterad T7 promotor sekvens direkt uppströms sekvensen av intresse, Linearisering av plasmid (se steg 1,1.) måste utföras. Annars bifoga en T7 promotor till sekvensen av intresse genom polymeras kedjereaktion (PCR, se steg 1,2.).

  1. Linearisering av T7 promotor-innehållande plasmider
    1. Linearize plasmider som redan innehåller en korrekt orienterad T7 promotor sekvens av matsmältningen med en restriktion enzym skärning nedströms stopp kodon av sekvensen av intresse. I annat fall avslutas inte transkription korrekt efter den sekvens av intresse.
      Anmärkning: Det är bäst att använda restriktionsenzymer lämnar trubbiga ändar eller 5 ' överhäng.
    2. Bekräfta fullständig Linearisering av plasmid av agaros gel elektrofores av osmält kontra smält plasmid DNA.
    3. Purify linearized Plasmid DNA före användning som DNA-mall för in vitro-mRNA transkription med hjälp av en DNA rening Kit (tabell över material).
  2. Tillbehöret av T7 promotoren vid PCR
    1. Använd en framåtprimer som innehåller följande komponenter (i angiven ordning från 5 ' till 3 '): ca 5 slumpmässigt BP uppströms promotor (t. ex. GAAAT); T7 promotor sekvens (TAATACGACTCACTATAG); två extra GS för ökad transkription effektivitet (GG); målet sekvens-specifik del som är homolog till plasmid sekvens kring start kodon.
      Anmärkning: Det bör bestå av: 3-6 BP uppströms KOZAK sekvens och starta kodon, den KOZAK sekvens och starta kodon (vanligtvis GCCACC ATG G), 12-18 BP nedströms i början kodon. Om sekvensen av intresse inte redan innehåller en KOZAK sekvens eller starta kodon, dessa kan fästas i detta steg genom att helt enkelt inkludera dem i primersekvensen.
    2. Beräkna tm för framåtprimer endast genom att ta hänsyn till den del som är homolog mot målsekvensen.
    3. För att bedöma dimers/hårnål formation använda hela primer sekvens, som lätt kan överstiga 50 BP.
    4. Använd en omvänd primer placerad någonstans nedströms stopp kodon.
      Anmärkning: Om sekvensen av intresse inte redan innehåller en stopp kodon, det kan fästas i detta steg genom att helt enkelt inkludera den i primersekvensen.
    5. Använd framåt-och bakåtprimers för att utföra en PCR med en HiFi-polymeras med korrekturläsning (tabell över material).
    6. Bekräfta generering av en enda produkt och amplikon storlek av aguppstod gel elektrofores (t. ex., Använd en 1% agaros gel och 100 V konstant ström).
    7. Rena PCR-produkten före användning som DNA-mall för in vitro mRNA-transkription med hjälp av ett DNA-renings kit.

2. mRNA-generationen

  1. Tina alla komponenter i den in vitro mRNA transkription Kit (se tabellen av material). Vortex för 5 s och snurra för 2 s på 2 000 x g. Håll på is tills användning.
  2. Förbered reaktionsblandningen för in vitro-mRNA-transkription i ett 0,5 mL microcentrifugerör i följande ordning (total volym på 40 μL): 20 μL 10X ARCA/NTP mix (ingår i in vitro mRNA transkription Kit); 0,25 μL 5-metyl-CTP (slutlig koncentration (f.c.) är 1,25 mM; 50% av total CTP); 0,25 μL pseudo-UTP (f.c. är 1,25 mM; 50% av den totala UTP); X μL DNA-mall; 2 μL T7 RNA-polymerasblandning (ingår i mRNA-transkriptionssatsen in vitro). Y μL av RNAse-fritt H2O.
    Anmärkning: X är en volym som innehåller minst 1 μg DNA. Till exempel 1,6 μL från en 625 ng/μL stamlösning. Y är reserv volymen till den totala volymen 40 μL.
  3. Vortex för 5 s och snurra för 2 s på 2 000 x g. Inkubera vid 37 ° c i 30 min vid 400 rpm på en termisk mixer för in vitro-transkription.
  4. Tillsätt sedan 2 μL DNase I direkt i reaktionsblandningen för avlägsnande av mallDNA. Vortex för 5 s och snurra för 2 s på 2 000 x g.
  5. Inkubera vid 37 ° c i 15 min vid 400 rpm på en termisk mixer. Ta en alikvot av 2 μL för kontroll gelen (steg 3,3) och förvara vid-80 ° c.
  6. För poly (A) tailing, tillsätt följande komponenter direkt i den tidigare reaktionsblandningen (till en slutlig volym av 50 μl): 5 μl av 10X poly (a) polymeras reaktionsbuffert och 5 μl av poly (a) polymeras (båda ingår i in vitro mRNA transkription Kit). Vortex för 5 s och snurra för 2 s på 2 000 x g.
  7. Inkubera blandningen vid 37 ° c i 30 min vid 400 rpm på en termomixer. Ta en alikvot av 2 μL för kontroll gelen (steg 3,3) och förvara vid-80 ° c.
  8. För Defosforylering av 5 ́-ändarna av mRNA, tillsätt följande komponenter direkt i den tidigare reaktionsblandningen (till en slutlig volym på 60 μL): 3 μL av RNAse-fritt H2O; 6 μL av 10X Antarktisfosfatasreaktionsbuffert. 3 μL av Antarktiskt fosfatas (15 enheter för 60 μL reaktions volym). Vortex för 5 s och snurra för 2 s på 2 000 x g.
  9. Inkubera blandningen vid 37 ° c i 30 min vid 400 rpm på en termisk mixer.
  10. Värmeinaktivera Antarktiskt fosfatas genom inkubation vid 80 ° c i 2 min.
    Anmärkning: Helst använda en separat termisk mixer, vänta inte tills den första mixern når önskad temperatur.

3. mRNA rening

  1. Rena in vitro transkriberas mRNA med hjälp av en dedikerad RNA rening Kit (tabell över material).
    1. Tillsätt X μL elueringslösning till mRNA reaktionsblandning från steg 2,10. Blanda genom att invertera 5 gånger. Tillsätt 300 μL bindnings lösningskoncentrat. Blanda med mild pipettering 5 gånger.
      Anmärkning: X är reserv volymen till en total volym på 100 μL. Till exempel, tillsätt 40 μL elueringslösning till 60 μL mRNA reaktionsblandning.
    2. Tillsätt 100 μL Rnaasfri etanol. Blanda med mild pipettering 5 gånger.
    3. Placera en filter kolumn i en av de medföljande uppsamlings rören. Överför mRNA-reaktionsblandningen försiktigt till mitten av filtret utan att vidröra filtret. Centrifugera vid 15 000 x g i 1 min vid rumstemperatur (RT).
    4. Lyft försiktigt filter kolonnen och kassera genomflödet i Samlingsröret. Lägg tillbaka filter kolumnen i samma samlingsrör.
    5. Tillsätt 500 μL tvättlösning (Glöm inte att lägga till 20 mL RNAase-fri etanol innan du använder tvättlösningen för första gången).
    6. Centrifugera vid 15 000 x g i 1 min vid RT. Upprepa steg 3.1.4-3.1.6 för att tvätta en gång till.
    7. Centrifugera vid full hastighet (17 900 x g) i 1 min vid RT för att avlägsna eventuell restvätska från filter kolonnen. Ta försiktigt filter kolonnen från Samlingsröret. Placera filter kolumnen i ett nytt samlingsrör.
    8. Tillsätt 50 μL elueringbuffert på mitten av filtret utan att vidröra filtret. Inkubera vid 65 ° c i 10 minuter på en termoblandare.
    9. Centrifugera vid 15 000 x g i 1 min vid RT. ta bort filter kolumnen och kassera den.
  2. Mät koncentrationen och renheten hos den eluerade mRNA, till exempel genom att använda en mikrovolyms spektrofotometer för att mäta absorbans vid 260 och 280 nm.
    Anmärkning: Ett A260/A280-förhållande på 1,8-2,1 är ett tecken på högt renat mRNA.
  3. Kontrollera närvaron av en enda produkt, korrekt avskrift längd och poly (A) tailing genom att analysera alikvoter från steg 2,5 och 2,7 av agaros gel elektrofores under denaturering (till exempel, Använd en 1,2% aguppstod gel som innehåller 20 mM 3-(N-morpholino) propansulfonsyra [MOPS], 5 mM natriumacetat, 1 mM EDTA och 20% formaldehyd och drivs i 20 mM moppar, 5 mM natriumacetat, 1 mM EDTA och 0,74% formaldehyd vid 100 V konstant ström).
  4. Förvara den renade mRNA i elutionsröret vid-80 ° c till transfektion. Om du använder endast låga mängder av mRNA för transfektion sedan alikvot Den mRNA för att undvika upprepade frysa-Tina cykler.
    Obs: mRNA kan förvaras vid-80 ° c i ca 1 år.

4. makrofagpreparat

  1. Euthanize C57/BL6 möss (Använd möss av samma kön och av 6-24 veckors ålder) genom cervikal dislokation.
    Anmärkning: Samma möss kan användas för isolering av PM (steg 4,2) och generering av BMDM (steg 4,3 och 4,4). För isolering av PM Använd minst två möss. Om endast BMDM ska genereras en mus vanligtvis är nog.
  2. Immunomagnetisk anrikning av peritoneala makrofager.
    1. Fyll en 10 mL spruta med en 0,9 x 40 mm kanyl med 8 mL iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 2 mL luft. Spola peritonealhålan med PBS. Luften kommer att bilda en bubbla som minimerar läckage av PBS.
    2. Snabbt samla upp peritonealsköljning med samma spruta och överför till ett 50 mL koniskt centrifugeringsrör. Kombinera peritonealceller av flera möss om det behövs. Håll cellsuspensionen på isen.
    3. Centrifugera cellsuspension vid 650 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 5 mL 0,2% NaCl för 30 s för att lysera röda blodkroppar.
    4. Tillsätt 5 mL 1,6% NaCl till en total volym på 10 mL för att rekonstruera Isotoniska förhållanden. Centrifugera vid 650 x g i 5 min vid 4 ° c.
    5. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 97,5 μL magnetisk cell sortering (MCS) buffert (2 mM etylendiamintetraättiksyra [EDTA], 5% bovint serumalbumin [BSA] i PBS) per 1 peritonealsköljning (t. ex. om tre möss spolas, omsuspenderas i 292,5 μL ).
    6. Tillsätt 2,5 μL paramagnetiska pärlor konjugerat till en CD11b-specifik antikropp per 97,5 μL cellsuspension (t. ex. Tillsätt 7,5 μL till 292,5 μL).
    7. Inkubera på isen i 15 min vid 150 rpm på en orbitalshaker.
    8. Centrifugera cellsuspension vid 650 x g i 5 min vid 4 ° c, Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 ml MCS-buffert.
    9. Tillsätt 4 mL MCS-buffert till en total volym på 5 mL och tvätta cellerna genom att försiktigt Pipettera upp och ner tre gånger.
    10. Upprepa steg 4.2.8 och 4.2.9 ytterligare två gånger för totalt tre tvättsteg.
    11. Under tvätt stegen placera en LS-kolonn i en magnetisk cell separator (se tabell över material). Skölj kolonnen med 3 mL MCS-buffert.
      Anmärkning: Undvik bubblor eftersom dessa kan täppa till kolonnen.
    12. Omsuspendera cellpelleten i 1 mL MCS-buffert. Tillsätt 3 mL MCS-buffert till en total volym på 4 mL, blanda genom att Pipettera upp och ner tre gånger.
    13. Överför 4 mL av cellsuspensionen till den sköljde LS-kolonnen.
      Anmärkning: Igen, undvika eventuella bubblor eftersom dessa kan täppa till kolumnen.
    14. Vänta tills kolonnen är helt tom. Tillsätt inte ytterligare vätska tills kolonnen slutar droppande.
    15. Tillsätt 3 mL MCS-buffert på kolonnen. Vänta sedan tills kolonnen i kolumnen är helt tom. Upprepa steg 4.2.15 ytterligare två gånger.
    16. Placera LS-kolonnen i ett 15 mL koniskt centrifugeringsrör. Applicera 5 mL MCS-buffert på kolonnen. Vänta tills 2 mL vätska har passerat genom kolonnen och Använd sedan kolven för att försiktigt trycka in den återstående fraktionen i röret.
    17. Centrifugera cellsuspension vid 650 x g i 5 min vid 4 ° c och Kassera supernatanten.
    18. Omsuspendera cellpelleten i 1 mL DMEM kompletterad med 10% värmeinaktiverat fetalt kalv serum (FCS) (DMEM + FCS).
    19. Bestäm antalet livskraftiga celler genom att räkna i trypan blå lösning i en Neubauer räknar kammare och frö celler i DMEM + FCS till kultur plattor.
      Anmärkning: Seed PM vid en densitet av 100 000 celler/väl i en platt botten mikrotiterplatta. Använd inte vävnadskultur-behandlade plattor som PM kan inte skiljas från dessa. Använd ej behandlade plåtar istället.
  3. Generering av BMDM
    1. Ta bort hud och muskler från bakbenen med hjälp av ett par sax. Tvätta varje ben med kort nedsänkning i 70% etanol.
    2. Lossa benen och öppna båda ändarna av lårbenet och skenbenet genom att skära med sax.
    3. Fyll en 5 mL spruta fylld med en 0,6 mm x 30 mm kanyl med 5 mL mycket låg endotoxin (VLE) RPMI 1640 och spola benmärgen ur de öppna benen i en kultur rätt.
    4. Kombinera benmärg av flera möss om det behövs genom att upprepa stegen 4.3.1-4.3.3. Överför benmärgen till ett 50 mL koniskt centrifugeringsrör.
    5. Centrifugera benmärgs suspensionen vid 650 x g i 5 min vid 4 ° c och Kassera supernatanten.
    6. Omsuspendera cellpelleten i 5 mL av den röda blod cells lysbufferten (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) och inkubera i 5 minuter vid RT för att lysera de röda blodkropparna.
    7. Centrifugera cellsuspensionen vid 650 x g vid 4 ° C i 5 min och Kassera supernatanten.
    8. Omsuspendera cellpelleten i 1 mL VLE RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 1% HEPES, 1% natriumpyruvat och 10 ng/mL rekombinant makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) (RPMI+ ++ + +).
    9. Tillsätt 4 ml RPMI+ + + + + till en total volym på 5 ml.
    10. Förbered 5 92 mm x 16 mm obehandlad petriskålar med kammar (se tabell över material) per mus genom att Pipettera 7 ml RPMI+ + + + + medium i varje skål.
    11. Överför 1 mL av cell lösningen till de 5 tillagade kultur rätterna och inkubera vid 37 ° c och 5% CO2.
    12. Efter 4 dagar, mata cellerna genom att tillsätta 4 mL RPMI++ + + +. Efter 6-7 dagar är benmärgscellerna helt differentierade till BMDM.
  4. Skörd av BMDM
    1. Helt ta bort mediet från kultur rätter. Tillsätt 5 mL varm 0,2 mM EDTA i PBS till varje maträtt.
    2. Skrapa försiktigt hela plattan med en cell skrapa för att lossa BMDM. Kombinera cellsuspensionen i ett 50 mL koniskt centrifugeringsrör.
    3. Spola alla 5 rätter igen. Använd samma volym av 5 mL varm 0,2 mM EDTA i PBS för alla 5 rätter. Kombinera den här cellsuspensionen med en från föregående steg.
    4. Centrifugera cellsuspensionen vid 650 x g i 5 min vid 4 ° C och Kassera supernatanten.
    5. Omsuspendera cellpelleten i 1 mL VLE RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FCS, 1% HEPES, 1% natriumpyruvat och 10 ng/mL rekombinant M-CSF men ingen antibiotika (RPMI+ ++ +).
    6. Bestäm antalet livskraftiga celler genom att räkna i trypan blå lösning i en Neubauer räknings kammare och frö celler i RPMI+ + + + till odlings plåtar.
      Anmärkning: Seed BMDM vid en densitet av 50 000 celler/väl maximum i en platt botten mikrotiterplatta. Använd inte vävnadsodling-behandlade plattor som BMDM kan knappast skiljas från dessa. Använd ej behandlade plåtar istället.

5. transfektion av makrofager med mRNA

  1. Beräkna den begärda volymen för mRNA-transfektionbuffert.
    Anmärkning: Volymen av mRNA transfektion buffert som krävs beror på väl storlek: Använd 200 μL för transfektion i en 6-brunn tallrik, 100 μL i en 12-brunn tallrik och så vidare. Tillsätt alltid lite extra volym på grund av pipettering förlust (men inte för mycket, för att förhindra onödig utspädning av mRNA). Använd till exempel 450 μL i stället för 4 x 100 μL = 400 μL till transfect i 4 brunnar på en 12-brunnsplatta.
  2. Beräkna den begärda volymen av mRNA-transfektionsreagens. MRNA-transfektionsreagens tillsätts med ett förhållande på 1:50. Till exempel krävs 9 μL mRNA-transfektionsreagens för en slutlig volym på 450 μL.
  3. Beräkna den totala mängden mRNA som krävs. Minst 100 ng per 100 000 makrofager krävs för effektiv transfektion, 200 ng fungerar ännu bättre (t. ex., 800 ng mRNA till transfect 400 000 makrofager).
    1. Multiplicera den beräknade mängden mRNA som krävs med det totala antalet brunnar som måste transfekterade (t. ex. 4 brunnar med 400 000 makrofager vardera: 4 x 800 ng = 3 200 ng mRNA krävs totalt för alla brunnar). Till exempel, om din mRNA lager är 426,8 ng/μL, 7,49 μL behövs för optimal transfektion av 4 brunnar med 400 000 makrofager vardera.
  4. Lägg till den beräknade volymen mRNA-transfektionbuffert (steg 5,1.) minus volymerna för mRNA-transfektionsreagens (steg 5,2) och mRNA (steg 5,3) till ett reaktionsrör. Till exempel 450 μL-9 μL-7,49 μL = 433,51 μL.
  5. Tina upp mRNA-beståndet och blanda det genom att försiktigt vrida elueringröret. Tillsätt den beräknade volymen mRNA (steg 5,3) till reaktionsröret med mRNA-reaktionsbuffert (i exemplet ovan: 7,49 μL i 433,51 μL).
  6. Vortex för 5 s och snurra för 2 s på 2 000 x g.
  7. Vortex mRNA transfektionsreagens för 5 s och snurra för 2 s vid 2 000 x g.
  8. Tillsätt den beräknade volymen mRNA-transfektionsreagens (steg 5,2) till reaktionsröret som innehåller mRNA-transfektionbufferten och mRNA (i exemplet ovan: 9 μL mRNA-transfektionsreagens).
  9. Vortex The transfection mix för 5 s och snurra för 2 s på 2 000 x g.
  10. Inkubera i 15 minuter vid RT.
  11. Under tiden ersätta makrofager kultur medium med färskt, varmt odlingssubstrat (se steg 4.2.18. och 4.4.5).
  12. Efter inkubations steget 5,10, tillsätt transfektionblandningen till brunnarna som innehåller makrofager i en volym som är lämplig för brunnen (se steg 5,1). Lägg till transfection mix droppvis i en cirkel från utsidan till mitten av brunnen.
  13. Försiktigt klippa plattan, först i en vertikal och sedan i en horisontell riktning för att säkerställa en jämn fördelning av transfektion blandningen i brunnen. Inkubera sedan vid 37 ° c och 5% CO2. Syntesen av proteinet kodat av transfekterade mRNA kommer att inledas strax efter transfektion. För bästa resultat, inkubera i minst 6 timmar.
  14. Efter inkubering, analysera transfektion effektivitet av (Immuno) fluorescens mikroskopi, flödescytometri eller immunoblot16, eller använda transfekterade makrofager för experiment val.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har framgångsrikt använt detta protokoll för att generera mRNA-kodning för flagga-taggade NEMO och IKKβ varianter för transfektion av primära makrofager16. Plasmiderna kodning för flagga-taggade Wild-Type (NEMOWT) och C54/347a Mutant NEMO (NemoC54/374a) (se tabellen av material) innehåller redan en T7 promotor i rätt riktning (figur 1a). Således var vi bara tvungna att linjärisera plasmiderna att generera DNA-mallar för in vitro-transkription. I detta syfte smältes 10 μg plasmid-DNA med 5 μL Xbal vilket resulterade i Linearisering av Plasmiden på grund av en enda cut 3 ' av stopp kodon. Fullständig Linearisering av plasmid-DNA kontrollerades av agaros gel elektrofores (figur 1B).

Den plasmider-kodning för flagga-taggade Wild-Type (ikkβWT) och S177/181e Mutant ikkβ (ikkβS177/181e) innehåller inte en T7 promotor. Därför har vi bifogat en T7 promotor av PCR för att generera DNA-mallar för in vitro-transkription (figur 2a). Generering av en specifik PCR-produkt, d.v.s. en enda produkt av korrekt storlek, kontrollerades av agaros gel elektrofores (figur 2B).

Efter in vitro-transkription med hjälp av respektive DNA-mallar kontrollerade vi generering av en enda mRNA-produkt av korrekt storlek och poly (A) tailing av agaros gel elektrofores under denatureringsförhållanden (figur 3).

För att kontrollera att mRNA som genereras med detta protokoll aktiverar transfektion av primära makrofager (se figur 4A, B för flödescytometriska analyser av immunomagnetisk berikning av PM-och DIFFERENTIERINGS status för bmdm) har vi genererat mRNA-kodning för egfp (figur 5a-C) och analyserat transfektionseffektivitet med flödescytometri (figur 6a). 100 000 PM eller 50 000 bmdm per brunn av en obehandlad mikrotiterplatta transfekterade med 50, 100 eller 200 ng av egfp mRNA för 6, 9 eller 24 h. I både PM och BMDM, höga nivåer av eGFP-uttryck kunde detekteras vid 6 h efter transfektion. Transfektionshastigheten ökade med mängden transfekterade mRNA och var störst för 200 ng mRNA (figur 6B, C). För PM nådde transfektion cirka 50-65% vid 6 till 9 h efter transfektion (figur 6B). Vid 24 h efter transfektion var transfektionshastigheten väsentligt lägre och indikationen löper ut eGFP-uttryck. Således ska PM inte transfekterade över en natt. För BMDM nådde transfektionshastigheten cirka 80-85% (figur 6C). Minskningen i transfektion takt efter 24 h var mycket mindre uttalad i BMDM. Således kan bmdm transfekterade över natten. I både PM (figur 6D, E) och bmdm (figur 6F, G) ökade uttrycksnivån för egfp i transfekterade celler i ett tids-och dosberoende sätt. Viktigare, det transfektion förfarandet inte inducerade lytisk eller apoptotiska celldöd eftersom det inte fanns någon ökning av propidiumjodid jodid-positiva (PI) eller Annexin V-positiva makrofager efter transfektion (figur 7A, B).

Transfektion effektivitet mRNAs kodning för flagg-märkta NEMO eller IKKβ varianter analyserades av immunofluorescensmikroskopi. 300 000 PM per brunn av en 12-brunn plätera var transfekterade med 300 ng av respektive mRNA för 6 h. transfection klassar var omkring 60% för Nemo mrnas och omkring 55% för ikkβ mrnas (figur 8a, B). Sålunda, deras transfektion priser liknade den i eGFP mRNA indikerar en allmän transfektion hastighet av ca 55% för PM.

Vi har också använt detta protokoll för att generera mRNA-kodning för CRE driver. Transfektion av 400 000 BMDM från NEMOflox/flox möss17 per brunn av en 12-väl tallrik med 400 ng av CRE driver mRNA resulterade i nästan fullständig utarmning för Nemo protein efter 48 h (figur 9) indikerar mycket effektiv transfektion av bmdm.

PM och BMDM utsöndrar inte några detekterbara mängder av IL-1 β, IL-6 och TNF efter transfektion (figur 10A, B). Dessutom, NF-kB och MAPK signalering vägar aktiverades inte efter transfektion16 indikerar att transfektion förfarandet inte aktiverar proinflammatorisk signalering. Vi har inte heller observerat några funktionella förändringar av transfekterade makrofager jämfört med icke-transfekterade makrofager16.

Figure 1
Figur 1: Linearisering av Nemo-kodning plasmider som redan innehåller en T7 promotor i rätt riktning. (A) sekvens utdrag av plasmid kodning för flagg-märkta NemoWT eller NemoC54/347a. En T7 promotor i korrekt orientering och nära KOZAK sekvensen och starta kodon är redan närvarande. T7 promotor-regionen, kodnings ordningen (CDS) för flagg tag gen och Nemo, start-och stoppkodon och begränsnings platsen för linearisering med xbai är färgkodade. Brepresentativ 1% agaros gel som visar plasmiderna före och efter linearisering med xbal. 1 μL obehandlat, lineariserat eller renat lineariserat plasmid-DNA lastades per körfält. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: T7 promotor bilaga till IKKß-kodning plasmider av PCR. (A) sekvens utdrag av plasmid-kodning för flagga-taggade IkkβWT eller ikkβS177/181e. Plasmiderna innehåller inte en passande T7 promotor, som fästas därför av PCR. Läge, orientering och sekvens av framåt primer (som innehåller T7 promotor sekvens som ska läggas till) och omvänd primer indikeras med pilarna. T7 promotor-regionen, CDS för flagg-taggen och IKKβ och start-och stopp kodons är färgkodade. Brepresentativ 1% agangel som verifierar generering av en enda PCR-produkt av korrekt storlek med hjälp av de primers som anges ovan. 1 μL av den renade PCR-produkten lastades per körfält. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: mRNA-syntes från Nemo-och IKKβ-kodning av DNA-mallar. (A) representativ denaturering 1,2% aguppstod gel som innehåller 0,7% formaldehyd som visar den renade MRNA av Nemo och IKKβ konstruktioner före och efter poly (a) tailing. 2 μL av NEMOWT, NemoC54/347a, ikkβWT och IkkβS177/181e mRNA lastades per körfält. En 32 μL ssRNA-stege laddades för bestämning av RNA-längd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: flödescytometriska analyser av den immunomagnetiska anrikning av PM och differentierings status för BMDM. A) den procentuella andelen F4/80+/Cd11b+ PM i peritonealsköljningen före och efter den immunomagnetiska anrikningen analyserades genom flödescytometri. (B) uttryck av F4/80 och CD11B av bmdm efter 6 dagar av differentiering kontrollerades av flödescytometri. 10 000-eller 5 000-celler räknades per prov. Data visas som medelvärdet ± SEM av n = 3 oberoende experiment, vardera. * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 och * * * * p < 0,0001 efter Students t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: mRNA-syntes med poly (A)-tailing av eGFP. (A) sekvens utdrag av plasmid kodning för egfp. Plasmiden innehåller inte en passande T7 promotor, som fästas därför av PCR. Läge, orientering och sekvens av framåt primer (som innehåller T7 promotor sekvens som ska läggas till) och omvänd primer indikeras med pilarna. T7 promotor-regionen, CDS för eGFP och start-och stopp kodons är färgkodade. B) representativ 1% agangel som visar den renade amplikon efter PCR med hjälp av de primers som anges ovan. 1 μL av den renade PCR-produkten lastades per körfält. C) representativ denaturering 1,2% Agros gelinnehållande 0,7% formaldehyd som visar den renade mRNA av egfp före och efter poly (a) tailing. 2 μL eGFP mRNA lastades per körfält. En 32 μL ssRNA-stege laddades för bestämning av RNA-längd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: högeffektiv transfektion av både peritoneala makrofager och BMDM med eGFP mRNA. Makrofager inkuberades för 6, 9 eller 24 h med 50, 100 eller 200 ng av egfp mRNA komplex till jetmessenger eller med jetmessenger ensam (mock) och sedan analyseras med flödescytometri. Agating strategi som används för att definiera populationer av livskraftiga makrofager, livskraftiga egfp+ makrofager och PI+ (dvs döda) makrofager. Representativa data för transfektion med 200 ng mRNA för 6 h visas. (B, C) Transfektionshastigheter av (B) PM och (C) bmdm bestämdes genom att analysera procentandelen livskraftiga egfp-positiva celler med flödescytometri (n = 5-7 respektive n = 4-5 oberoende experiment). (D-G) Uttrycksnivåerna i eGFP fastställdes genom att analysera medelvärdet för fluorescensintensiteten (MFI) för livskraftiga (D) PM och (F) bmdm och den livskraftiga och egfp-positiva subpopulationen av (E) PM och (G) bmdm (n = 5-7 respektive n = 4-5 oberoende experiment). 10 000 celler räknades per prov. Data visas som medelvärde ± SEM. ns = inte signifikant. * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 och * * * * p < 0,0001 efter Students t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: transfektion inducerar inte lytisk eller apoptotisk celldöd. Transfektion-inducerad celldöd av (a) PM och (B) bmdm bestämdes genom att analysera andelen PI-positiva och Annexin V-positiva celler (n = 5-7 och n = 4-5 oberoende experiment, respektive). Den procentuella andelen döda makrofager som förekommer i obeställbara prover (en viss grad av celldöd orsakades av fysisk avlossning av makrofager från brunnarna trots användning av icke-behandlade plattor) subtrafördes från den i respektive transfekterade prover för att endast ta hänsyn till celldöd som induceras av transfektioningreppet. Den gating strategi som används för att definiera populationer av PI+, Annexin v+ och PI+/Annexin v+ makrofager visas för en representativ datauppsättning PM transfekterade med 200 ng mRNA för 6 h visas. Staurosporine (50 μM för 1 h) användes som positiv kontroll. 10 000 celler räknades per prov. Data visas som medelvärde ± SEM. nd = ej detekterbar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Transfektionspriser med mRNA-kodning för de nominerade Nemo-och IKK-konstrukterna. Transfektionspriser med mRNA-kodning för (a) Nemo-konstruktioner och (B) IKK-konstruktioner kvantifierades genom immunofluorescensmikroskopi (n = 4 oberoende experiment). Skalstapel = 4 μm. data visas som medelvärdet ± SEM. n.t. = inte transfected, ns = inte signifikant; * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 och * * * * p < 0,0001 efter Students t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: transfektion av Nemofl/fl Bmdm med mRNA-kodning för CRE driver resulterar i nästan fullständig brist för Nemo. Bmdm från Nemofl/fl möss var transfekterade med mRNA kodning CRE driver för 48 h. brist för Nemo protein som en följd av CRE-medierad knockout bedömdes av Western blot med hjälp av specifika antikroppar erkänna Nemo eller β-Actin och kvantifieras genom densitometri (n = 5 oberoende experiment). Data visas som medelvärde ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 och * * * * p < 0,0001 efter Students t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: transfektion inducerar inte ett proinflammatoriskt svar. (A) PM och (B) bmdm transfekterade med mRNA-kodning för NemoWT eller NemoC54/347a. Som positiv kontroll, makrofager var infekterade med Listeria monocytogenes på en mängd av infektion av 1 eller stimuleras med 5 μg/ml LPS eller poly (I:C) för 5 h (PM) eller 24 h (bmdm). Utsöndring av IL-1 β, IL-6 och TNF till supernatanten kvantifierades med ELISA (n = 3 oberoende experiment). Data visas som medelvärdet ± SEM. n.t. = ej transfected, nd = ej detekterbar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för mycket effektiv transfektion av vanligtvis svåra att transfect primära makrofager med in vitro transkriberas mRNA. Viktigt är att transfektion av makrofager som använder detta protokoll inte inducerar celldöd eller aktiverar proinflammatorisk signalering som indikerar att varken transfektion reagens eller transfekterade mRNA erkänns som icke-Self.

Kvaliteten på mRNA är av avgörande betydelse för framgångsrik transfektion av makrofager med hjälp av detta protokoll. Sålunda, stor försiktighet bör iakttas att mRNA inte kommer i kontakt med RNAses (till exempel genom förorenade buffertar eller flaskor). Om du är osäker, kontrollera om mRNA nedbrytning (till exempel, genom agaros gel elektrofores). Transfektion och uttrycksnivå var redan maximal vid 6 timmar efter transfektion. Därför är det möjligt att proteinet av intresse uttrycks på nivåer som är tillräckliga för analys vid tidigare tidpunkter efter transfektion. Vi har dock inte testat detta. Dessutom kan transfecting större mängder mRNA ytterligare öka transfektion hastighet och/eller uttrycksnivå. Dock kan transfecting större mängder mRNA potentiellt också leda till en viss grad av immunogenicitet eller till och med cytotoxicitet. Den fullständiga avsaknaden därav är en av de främsta fördelarna med detta protokoll. Således, om större mängder av mRNA ska transfected, immunogenicitet och cytotoxicitet måste utvärderas noggrant.

Uttrycksnivån är tydligt korrelerad med mängden transfekterade mRNA. Ändå, re-uttryck av Nemo i Nemo-bristfällig bmdm resulterade i liknande Nemo proteinuttryck som i vildtyp bmdm16 indikerar att mRNA transfektion med detta protokoll inte leder till betydande överuttryck av proteinet av intresse. Detta protokoll kan därför inte lämpar sig för att studera konsekvenserna av överuttryck av proteinet av intresse. Vi anser snarare att detta är en fördel, dock som överuttryck av ett protein ofta förändrar dess beteende.

Den viktigaste begränsningen av mRNA transfektion, i allmänhet, är att det endast resulterar i övergående uttryck av proteinet av intresse (eftersom mRNA genereras och transfekterade med hjälp av detta protokoll kommer att vara föremål för normal omsättning). PM verkar uttrycka protein av intresse för en kortare tid jämfört med BMDM. Således, i motsats till bmdm, PM bör inte transfekterade över natten. Hur länge ett givet protein av intresse kommer att uttryckas varierar (eftersom både stabiliteten hos mRNA och proteinet kommer att variera). Vi rekommenderar ändå att utföra experimentet val på samma dag som transfektion. Om uttrycket av det protein av intresse krävs för längre tidsperioder, cellerna förmodligen kan transfekterade flera gånger (t. ex., varje dag som beskrivs i18).

Vi har framgångsrikt använt det protokoll som beskrivs här för att transfect murina PM och bmdm och mus embryonala fibroblaster (MEFS)16. I teorin, den mRNA genereras med hjälp av detta protokoll kan användas för att transfect varje given celltyp av alla däggdjursarter. Den optimala mRNA transfektion reagens och innehåll av modifierade nukleosider kan variera för andra celltyper, dock.

Lovande framtida ändringar inkluderar införandet av 5 '-och 3 '-UTRs. De flesta redan existerande plasmider innehåller endast de CCD: er av protein av intresse men inte 5 '-och 3 '-utr. Deras införande (som beskrivs i19) kan ytterligare förbättra mRNA stabilitet och uttryck. Också, fästa epitop taggar till proteinet av intresse genom att helt enkelt inkludera sekvensen av epitop tagg i framåt eller bakåt primer (för N-och C-Terminal epitop märkning, respektive), bör vara möjligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Tags

Immunologi och infektion fråga 153 primära makrofager peritoneala makrofager benmärgshärledda makrofager immunceller in vitro-transkription mRNA transfektion
Högeffektiv transfektion av primära makrofager med in vitro-transkriberad mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A.,… More

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter