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Immunology and Infection

इन विट्रो लिखित एमआरएनए के साथ प्राथमिक मैक्रोफेज का अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

मैक्रोफेज, विशेष रूप से प्राथमिक मैक्रोफेज, ट्रांसफेट करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि वे गैर-स्व उत्पत्ति के अणुओं का पता लगाने में विशेषज्ञ हैं। हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो प्लाज्मिड जैसे डीएनए टेम्पलेट्स से उत्पन्न एमआरएनए के साथ प्राथमिक मैक्रोफेज के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन की अनुमति देता है।

Abstract

मैक्रोफेज गैर-आत्म मूल के अणुओं का पता लगाने में विशेषज्ञता वाले फागोसाइटिक कोशिकाएं हैं। इस उद्देश्य के लिए, वे पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर) की एक बड़ी सरणी से लैस हैं। दुर्भाग्य से, यह मैक्रोफेज को विशेष रूप से ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान और ट्रांस्फन्यूलिक एसिड के रूप में ट्रांसफेक्ट करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है, जिसे अक्सर पीआरआरएस द्वारा गैर-स्व के रूप में मान्यता दी जाती है। इसलिए, ट्रांसफेक्शन के परिणामस्वरूप अक्सर मैक्रोफेज सक्रियण और ट्रांस्फन्यूलिक एसिड या यहां तक कि मैक्रोफेज की आत्महत्या में भी गिरावट आती है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) और बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) जैसे पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) और बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) जैसे डीएनए टेम्पलेट्स जैसे डीएनए टेम्पलेट्स से लिखित में एमआरएनए के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन की अनुमति देता है। इस सरल प्रोटोकॉल के साथ, पीएम के लिए लगभग 50-65% की ट्रांसफेक्शन दरें और बीएमडीएम के लिए लगभग 85% साइटोटॉक्सिसिटी या इम्यूनोजेनिसिटी के बिना प्राप्त की जाती हैं। हम डीएनए से ट्रांसफेक्शन के लिए एमआरएनए की पीढ़ी का विस्तार से वर्णन करते हैं जैसे प्लाज्मिड्स और ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया।

Introduction

मैक्रोफेज थैलोसाइटिक कोशिकाएं हैं जो रोगाणुओं, अपोप्टिक कोशिकाओं और सेलुलर मलबे का पता लगाने, करने और अपमानजनक करने में विशेषज्ञ हैं। इसके अलावा, वे साइटोकिन्स और केमोकिन्स को स्रावित करके और टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं को एंटीजन पेश करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आर्केस्ट्रा करने में मदद करते हैं। मैक्रोफेज घाव भरने, एथेरोस्क्लेरोसिस, ट्यूमरिजेनेसिस और मोटापे जैसी कई अन्य प्रक्रियाओं में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न (पीम्प्स) और आउट-ऑफ-प्लेस अणुओं जैसे क्षति-संबद्ध आणविक पैटर्न (डीएबीपीएस) जैसे गैर-आत्म अणुओं का पता लगाने में सक्षम होने के लिए, मैक्रोफेज पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (पीआरआर)1की एक बड़ी सरणी से लैस हैं। दुर्भाग्य से, यह मैक्रोफेज को विशेष रूप से ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थानकर्ता 3 और ट्रांससंक्रमित न्यूक्लिक एसिड4,5,6,7 के रूप में 2 को स्थानांतरित करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है, अक्सर पीआरआरएस द्वारा गैर-स्व के रूप में पहचाना जाता है। इस कारण से, रासायनिक या भौतिक तरीकों का उपयोग करके मैक्रोफेज का अंतरण8 आमतौर पर ट्रांस्रेंट न्यूक्लिक एसिड की मैक्रोफेज सक्रियता और क्षरण या पाइरोप्टोसिस के माध्यम से मैक्रोफेज आत्महत्या में भी होता है, प्रोग्राम किए गए लाइटिक सेल डेथ का एक रूप जो डीएनए या विदेशी आरएनए9जैसे साइटोसोलिक पाम्स/डैम्प्स की मान्यता के बाद शुरू होता है । एडेनोवायरस या लेंटिवायरस जैसे वायरस का उपयोग करके मैक्रोफेज का जैविक ट्रांसफेक्शन अक्सर अधिक कुशल होता है, फिर भी ऐसे वायरल वेक्टर का निर्माण समय लेने वाला होता है और इसके लिए बायोसेफ्टी लेवल 2 उपकरण10,11की आवश्यकता होती है।

इस प्रकार, यद्यपि मैक्रोफेज गहन अनुसंधान का विषय हैं, आणविक स्तर पर उनके कार्यों का विश्लेषण बाधित होता है क्योंकि आणविक जीव विज्ञान के सबसे महत्वपूर्ण उपकरणों में से एक, न्यूक्लिक एसिड का ट्रांसफेक्शन एक्सोजेनस अभिव्यक्ति के लिए निर्माण करता है प्रोटीन, शायद ही लागू होता है। यह अक्सर शोधकर्ताओं को सदाशयी मैक्रोफेज के बजाय मैक्रोफेज जैसी सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए बनाता है। न्यूक्लिक एसिड निर्माण ट्रांसफेक्शन के लिए आवेदनों में उत्परिवर्तित या टैग किए गए प्रोटीन संस्करणों की अभिव्यक्ति, एक विशिष्ट प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति, संबंधित नॉकआउट पृष्ठभूमि में प्रोटीन पुनः अभिव्यक्ति और अन्य प्रजातियों से प्रोटीन की अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए) शामिल हैं। , क्रे को लक्षित जीन नॉकआउट के लिए आरएनए और Cas9 का पुनर्संयोजन या मार्गदर्शन करना) ।

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो प्राथमिक मैक्रोफेज (आमतौर पर ट्रांसफेक्ट करने के लिए कठिन) के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन की अनुमति देता है, जो कि मोनी पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) और बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) है, जिसमें एमआरएनए से उत्पन्न एमआरएनए प्लाज्मिड्स से उत्पन्न होता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न इन विट्रो लिखित एमआरएनए में स्वाभाविक रूप से होने वाले संशोधित न्यूक्लियोसाइड्स 5-मिथाइल-सीटीपी और छद्म-यूटीपी शामिल हैं जो इम्यूनोजेनिसिटी को कम करते हैं और स्थिरताकोबढ़ाते हैं4,6,7,12,13। इसके अलावा, इन विट्रो लिखित एमआरएनए के 5'-सिरों को रिग-1 कॉम्प्लेक्स14,15द्वारा मान्यता को रोकने के लिए अंटार्कटिक फॉस्फेटेज़ द्वारा डिफोस्फेरिकेटेड किया जाता है। यह इन विट्रो लिखित एमआरएनए की जन्मजात प्रतिरक्षा मान्यता को कम करता है। प्रोटोकॉल करने में हमारी आसानी के साथ, 50-65% (पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम)) और 85% (बीएमडीएम) के बीच ट्रांसफेक्शन दरें पहुंच जाती हैं, जबकि महत्वपूर्ण बात यह है कि कोई साइटोटॉक्सिकिटी या इम्यूनोजेनिसिटी नहीं देखी जाती है। हम विस्तार से वर्णन करते हैं (i) कैसे ट्रांसफेक्शन के लिए इम्यूनोलॉजिकल रूप से खामोश एमआरएनए डीएनए निर्माण जैसे प्लाज्मिड्स और (ii) ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया से उत्पन्न हो सकता है।

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Protocol

चूहों से मैक्रोफेज अलगाव कोलोन विश्वविद्यालय में आचार समिति के अनुपालन में जर्मनी के पशु संरक्षण कानून के अनुसार किया गया था।

नोट: दस्ताने पहने हुए सभी चरणों को पूरा करें। कोशिकाओं के संदूषण को रोकने के लिए लैमिनार प्रवाह हुड के तहत सभी ट्रांसफेक्शन चरणों को पूरा करें। एमआरएनए के साथ काम करने से पहले, सभी उपकरणों जैसे पिपेट और 70% इथेनॉल और/या एक RNAse-अपमानजनक सरफेसटैंट(सामग्री की तालिका)के साथ हर सतह को साफ करें। सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिक्रिया ट्यूब RNAse मुक्त और बाँझ हैं। कमजोर होने के लिए केवल बाँझ, आरएनएएसई-मुक्त पानी का उपयोग करें। विशेष रूप से फिल्टर के साथ पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। हर पाइपिंग स्टेप के बाद पिपेट टिप्स बदलें।

1. डीएनए टेम्पलेट की पीढ़ी

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन विट्रो एमआरएनए प्रतिलेखन के लिए डीएनए टेम्पलेट में आरएनए पॉलीमरेज के डॉकिंग की अनुमति देने के लिए एक T7 प्रमोटर अनुक्रम होना चाहिए। यदि ब्याज के प्रोटीन के डीएनए अनुक्रम युक्त प्लाज्मिड में पहले से ही एक सही ढंग से केंद्रित T7 प्रमोटर अनुक्रम सीधे ब्याज के अनुक्रम के ऊपर होता है, तो प्लाज्मिड का रैखिकीकरण (चरण 1.1.) को पूरा करने की आवश्यकता होती है। अन्यथा, पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर, चरण 1.2) द्वारा ब्याज के अनुक्रम में एक T7 प्रमोटर संलग्न करें।

  1. T7 प्रमोटर युक्त प्लाज्मिड्स का रैखिकीकरण
    1. रैखिकप्लाज्या प्लाज्मिड ्सपहले से ही पाचन द्वारा एक सही ढंग से केंद्रित T7 प्रमोटर अनुक्रम युक्त एक प्रतिबंध एंजाइम ब्याज के अनुक्रम के स्टॉप कोडन के डाउनस्ट्रीम को काटने के साथ। अन्यथा, ब्याज के अनुक्रम के बाद प्रतिलेखन ठीक से समाप्त नहीं होगा।
      नोट: कुंद सिरों या 5 ' ओवरहैंग छोड़ने वाले प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करना सबसे अच्छा है।
    2. पचाए हुए प्लाज्मिड डीएनए बनाम पचाए हुए प्लाज्मिड डीएनए के अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्लाज्मिड के पूर्ण रैखिकीकरण की पुष्टि करें।
    3. डीएनए शुद्धिकरण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके इन विट्रो एमआरएनए प्रतिलेखन के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने से पहले रैखिकीकृत प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें।
  2. पीसीआर द्वारा T7 पदोन्नतकर्ता की कुर्की
    1. निम्नलिखित घटकों वाले एक फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करें (5 से 3 तक संकेतित क्रम में'): प्रमोटर (जैसे, GAAAT) के लगभग 5 यादृच्छिक बीपी अपस्ट्रीम; T7 प्रमोटर अनुक्रम (TAATACGACTCACTATAG); बढ़ी हुई प्रतिलेखन दक्षता (जीजी) के लिए दो अतिरिक्त जीएस; लक्ष्य अनुक्रम-विशिष्ट हिस्सा जो स्टार्ट कोडन के आसपास के प्लाज्मिड अनुक्रम के अनुसार है।
      नोट: यह से बना होना चाहिए: 3-6 कोजाक अनुक्रम के ऊपर बीपी अपस्ट्रीम और कोडन शुरू, KOZAK अनुक्रम और कोडन शुरू (आमतौर पर GCCACC ATG जी), 12-18 बीपी शुरू कोडन के बहाव । यदि ब्याज के अनुक्रम में पहले से ही कोज़ाक अनुक्रम नहीं है या कोडन शुरू नहीं होता है, तो इन्हें इस चरण में केवल प्राइमर अनुक्रम में शामिल करके संलग्न किया जा सकता है।
    2. लक्ष्य अनुक्रम के अनुरूप भाग को ध्यान में रखकर ही फॉरवर्ड प्राइमर के टीएम की गणना करें।
    3. डिमर्स/हेयरपिन गठन का आकलन करने के लिए पूरे प्राइमर अनुक्रम का उपयोग करें, जो आसानी से ५० बीपी से अधिक हो सकता है ।
    4. स्टॉप कोडन के डाउनस्ट्रीम कहीं स्थित रिवर्स प्राइमर का उपयोग करें।
      नोट: यदि ब्याज के अनुक्रम में पहले से ही स्टॉप कोडन नहीं है, तो इसे प्राइमर अनुक्रम में शामिल करके इस कदम में संलग्न किया जा सकता है।
    5. प्रूफरीडिंग(सामग्रीकी तालिका) के साथ उच्च निष्ठा बहुलक का उपयोग करके पीसीआर करने के लिए आगे और रिवर्स प्राइमर का उपयोग करें।
    6. अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (उदाहरण के लिए, 1% अगारोज जेल और 100 वी लगातार वर्तमान का उपयोग करके एक उत्पाद और एम्प्लिसन आकार की पीढ़ी की पुष्टि करें)।
    7. डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके इन विट्रो एमआरएनए प्रतिलेखन के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने से पहले पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें।

2. एमआरएनए जनरेशन

  1. इन विट्रो एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शन किट के सभी घटकों को पिघलाएं (सामग्री की तालिकादेखें)। 5 एस के लिए भंवर और 2,000 x ग्रामपर 2 एस के लिए नीचे स्पिन। उपयोग तक बर्फ पर रखें।
  2. निम्नलिखित क्रम में 0.5 एमएल माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब में इन विट्रो एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शन के लिए रिएक्शन मिक्स तैयार करें (40 माइक्रोनल की कुल मात्रा): 10x एआरसीए/एनटीपी मिक्स (इन विट्रो एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शन किट में शामिल) का 20 माइक्रोनल; 5-मिथाइल-सीटीपी (अंतिम एकाग्रता (f.c.) का 0.25 माइक्रोन 1.25 एमएम है; कुल सीटीपी का 50%); छद्म यूटीपी का 0.25 माइक्रोन (एफ.सी. 1.25 एमएम है; कुल यूटीपी का 50%); डीएनए टेम्पलेट का एक्स माइक्रोन; T7 आरएनए बहुलक मिश्रण के 2 μL (इन विट्रो एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शन किट में शामिल); RNAse-मुक्त एच2O के वाई μL ।
    नोट: एक्स एक मात्रा है जिसमें डीएनए का कम से कम 1 μg होता है। उदाहरण के लिए, 625 एनजी/माइक्रोन स्टॉक समाधान से 1.6 माइक्रोन। वाई 40 μL की कुल मात्रा के लिए अतिरिक्त मात्रा है।
  3. 5 एस के लिए भंवर और 2,000 x ग्रामपर 2 एस के लिए नीचे स्पिन। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए थर्मल मिक्सर पर 400 आरपीएम पर 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. फिर, टेम्पलेट डीएनए को हटाने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में सीधे DNase के 2 μL जोड़ें। 5 एस के लिए भंवर और 2,000 x ग्रामपर 2 एस के लिए नीचे स्पिन।
  5. थर्मल मिक्सर पर 400 आरपीएम पर 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। नियंत्रण जेल (चरण 3.3) के लिए 2 माइक्रोन का एक बहाना लें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. पॉली (ए) टेलिंग के लिए, निम्नलिखित घटकों को सीधे पिछले प्रतिक्रिया मिश्रण (50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में) में जोड़ें: 10x पॉली (ए) बहुलक प्रतिक्रिया बफर के 5 μL और पॉली (ए) बहुलक के 5 μL (दोनों इन विट्रो एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शन किट में शामिल)। 5 एस के लिए भंवर और 2,000 x ग्रामपर 2 एस के लिए नीचे स्पिन।
  7. एक थर्मोमिक्सर पर 400 आरपीएम पर 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण इनक्यूबेट। नियंत्रण जेल (चरण 3.3) के लिए 2 माइक्रोन का एक बहाना लें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. एमआरएनए के 5'सिरों के विफोस्फोरिलेशन के लिए, निम्नलिखित घटकों को सीधे पिछले प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ें (60 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में): RNAse-मुक्त एच2ओ के 3 μL; 10x अंटार्कटिक फॉस्फेटेज़ रिएक्शन बफर के 6 माइक्रोन; अंटार्कटिक फॉस्फेटेज़ का 3 माइक्रोन (60 माइक्रोन रिएक्शन वॉल्यूम के लिए 15 यूनिट)। 5 एस के लिए भंवर और 2,000 x ग्रामपर 2 एस के लिए नीचे स्पिन।
  9. एक थर्मल मिक्सर पर 400 आरपीएम पर 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण इनक्यूबेट।
  10. 2 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा अंटार्कटिक फॉस्फेटेस को सक्रिय करें।
    नोट: आदर्श रूप से, एक अलग थर्मल मिक्सर का उपयोग करें, तब तक इंतजार न करें जब तक कि पहला मिक्सर वांछित तापमान तक न पहुंच जाता है।

3. एमआरएनए शुद्धि

  1. एक समर्पित आरएनए शुद्धिकरण किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके इन विट्रो लिखित एमआरएनए को शुद्ध करें।
    1. चरण 2.10 से एमआरएनए प्रतिक्रिया मिश्रण में एल्यूशन समाधान के एक्स माइक्रोन जोड़ें। 5 बार उलटा कर मिलाएं। बाध्यकारी समाधान ध्यान केंद्रित करने के 300 μL जोड़ें। कोमल पाइपिंग द्वारा 5 बार मिलाएं।
      नोट: एक्स 100 μL की कुल मात्रा के लिए अतिरिक्त मात्रा है। उदाहरण के लिए, 60 माइक्रोन एमआरएनए रिएक्शन मिक्स में 40 माइक्रोन एल्युशन सॉल्यूशन जोड़ें।
    2. आरएनएएसई-फ्री इथेनॉल के 100 माइक्रोन जोड़ें। कोमल पाइपिंग द्वारा 5 बार मिलाएं।
    3. आपूर्ति संग्रह ट्यूबों में से एक में एक फिल्टर कॉलम रखें। फ़िल्टर को छूने के बिना फ़िल्टर के केंद्र पर धीरे-धीरे एमआरएनए प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 न्यूनतम के लिए 15,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    4. ध्यान से फिल्टर कॉलम उठाएं और संग्रह ट्यूब में प्रवाह-थ्रू को त्यागदें। फिल्टर कॉलम को वापस उसी संग्रह ट्यूब में रखें।
    5. वॉश सॉल्यूशन के 500 माइक्रोन जोड़ें (पहली बार वॉश सॉल्यूशन का उपयोग करने से पहले RNAase-मुक्त इथेनॉल के 20 mL को जोड़ना न भूलें)।
    6. आरटी में 1 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। 3.1.4-3.1.6 को एक और बार धोने के लिए कदम दोहराएं।
    7. फिल्टर कॉलम से किसी भी अवशिष्ट तरल पदार्थ को हटाने के लिए आरटी पर 1 मिन के लिए पूरी गति (17,900 x ग्राम)पर अपकेंद्रित्र। ध्यान से संग्रह ट्यूब से फिल्टर कॉलम लें। फिल्टर कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में रखें।
    8. फिल्टर को छूने के बिना फिल्टर के केंद्र पर elution बफर के 50 μL जोड़ें। थर्मल मिक्सर पर 10 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    9. आरटी पर 1 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। फ़िल्टर कॉलम निकालें और इसे डिस्कार्ड करें।
  2. उदाहरण के लिए, 260 और 280 एनएम पर अवशोषण को मापने के लिए माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, जटिल एमआरएनए की एकाग्रता और शुद्धता को मापें।
    नोट: 1.8-2.1 का A260/A280 अनुपात अत्यधिक शुद्ध एमआरएनए का संकेत है।
  3. एक एकल उत्पाद की उपस्थिति को सत्यापित करें, सही प्रतिलिपि लंबाई और पॉली (ए) टेलिंग चरण 2.5 और 2.7 से एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा डेनेचरिंग शर्तों के तहत एलिकोज़ का विश्लेषण करके (उदाहरण के लिए, 20 मीटर 3-(एन-मॉर्फोलिनो वाले 1.2% अगारोज जेल का उपयोग करें) प्रोपेनसल्फोनिक एसिड [एमओपीएस], 5 एमएम सोडियम एसीटेट, 1 एमई ईटीए और 20% फॉर्मलडिहाइड और 20 एमएम एम एमओपी, 5 एमएम सोडियम एसीटेट, 1 एमई ईटीए और 0.74% फॉर्मलडिहाइड में 100 वी लगातार करंट पर चलते हैं।
  4. शुद्ध एमआरएनए को एल्यूटियन ट्यूब में -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफेक्शन तक स्टोर करें। यदि ट्रांसफेक्शन के लिए एमआरएनए की केवल कम मात्रा का उपयोग करते हैं तो बार-बार फ्रीज-गल चक्र ों से बचने के लिए एमआरएनए को बदल दें।
    नोट: एमआरएनए को लगभग 1 वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. मैक्रोफेज तैयारी

  1. Euthanize C57/BL6 चूहों (एक ही लिंग के चूहों का उपयोग करें और 6-24 सप्ताह की उंर के) गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा ।
    नोट: एक ही चूहों का उपयोग पीएम (चरण 4.2) और बीएमडीएम (चरण 4.3 और 4.4) की पीढ़ी के अलगाव के लिए किया जा सकता है। पीएम के अलगाव के लिए कम से कम दो चूहों का उपयोग करें। यदि केवल बीएमडीएम को उत्पन्न किया जाना है तो आमतौर पर एक माउस पर्याप्त है।
  2. पेरिटोनियल मैक्रोफेज का इम्यूनोमैग्नेटिक संवर्धन।
    1. बर्फ के 8 मिलीएम-कोल्ड फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) और हवा के 2 मिलीमीटर के साथ 0.9 x 40 मिमी कैनुला के साथ 10 मिलीएल सिरिंज भरें। पीबीएस के साथ पेरिटोनियल गुहा फ्लश। हवा एक बुलबुला है कि PBS के रिसाव को कम से कम फार्म का होगा।
    2. जल्दी से एक ही सिरिंज के साथ पेरिटोनियल लैवेज इकट्ठा करें और 50 मिलील शंकुकेंद्रन ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो तो कई चूहों की पेरिटोनियल कोशिकाओं को मिलाएं। बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
    3. सेंट्रलाइज सेल निलंबन 650 x ग्राम पर 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। लाल रक्त कोशिकाओं को जन्म देने के लिए 30 एस के लिए 0.2% नैक के 5 mL में सेल पैलेट को त्यागें और फिर से निलंबित करें।
    4. आइसोटोनिक स्थितियों के पुनर्गठन के लिए 10 मीटर की कुल मात्रा में 1.6% नैल के 5 एमएएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 650 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    5. सुपरनेट को त्यागें और चुंबकीय कोशिका छंटाई (एमसीएस) बफर (2 एमएम एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड [EDTA], 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए] पीबीएस में प्रति 1 पेरिटोनियल लैवेज (जैसे, अगर तीन चूहों को फ्लश किया गया, तो 292.5 माइक्रोन लवा में फिर से निलंबित करें ).
    6. सेल निलंबन के 97.5 माइक्रोन प्रति CD11b-विशिष्ट एंटीबॉडी में संयुग्मित पैरामैग्नेटिक मोतियों के 2.5 माइक्रोन जोड़ें (उदाहरण के लिए, 292.5 माइक्रोन में 7.5 माइक्रोन जोड़ें)।
    7. एक कक्षीय शेखर पर 150 आरपीएम पर 15 min के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 650 x ग्राम पर सेंट्रलाइज सेल निलंबन, सुपरनेटेंट को त्यागें और एमसीएस बफर के 1 एमएल में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    9. एमसीएस बफर के 4 एमएल को कुल मात्रा में 5 एमएल में जोड़ें और कोशिकाओं को धीरे-धीरे तीन बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धोएं।
    10. कुल तीन वॉश चरणों के लिए चरण 4.2.8 और 4.2.9 दो बार और दोहराएं।
    11. वॉश स्टेप्स के दौरान एक चुंबकीय कोशिका विभाजक में एक एलएस कॉलम रखें (सामग्री की तालिकादेखें)। एमसीएस बफर के 3 एमएल के साथ कॉलम कुल्ला।
      नोट: किसी भी बुलबुले से बचें क्योंकि ये कॉलम को रोकना हो सकता है।
    12. एमसीएस बफर के 1 एमएल में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। 4 एमएल की कुल मात्रा में एमसीएस बफर के 3 एमएल जोड़ें, तीन बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
    13. सेल निलंबन के 4 mL को कुल्ला एलएस कॉलम पर स्थानांतरित करें।
      नोट: फिर, किसी भी बुलबुले से बचें क्योंकि ये कॉलम को रोकना हो सकता है।
    14. जब तक कॉलम का जलाशय पूरी तरह से खाली न हो जाए तब तक इंतजार करें। जब तक कॉलम टपकता नहीं जाता तब तक अतिरिक्त तरल पदार्थ न डालें।
    15. कॉलम पर एमसीएस बफर के 3 एमएल जोड़ें। फिर, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि स्तंभ का जलाशय पूरी तरह से खाली न हो जाए। दो बार और दोहराएं कदम 4.2.15।
    16. एलएस कॉलम को 15 एमएल शंकुवर्ती सेंट्रलाइज्ड ट्यूब में रखें। कॉलम पर एमसीएस बफर के 5 एमएल लागू करें। जब तक तरल पदार्थ के 2 mL कॉलम के माध्यम से पारित कर दिया है रुको, तो प्लंजर का उपयोग करने के लिए धीरे ट्यूब में शेष अंश धक्का ।
    17. सेंट्रलाइज सेल निलंबन 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 650 x ग्राम पर और अतिशयोक्ति को त्यागदें।
    18. डीएमईएम के 1 मिलील में सेल पैलेट को 10% हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) (डीएमईएम + एफसीएस) के साथ पूरक किया गया।
    19. संस्कृति प्लेटों में DMEM + FCS में एक Neubauer गिनती कक्ष और बीज कोशिकाओं में trypan नीले समाधान में गिनती द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें ।
      नोट: एक फ्लैट बॉटम माइक्रोटिटर प्लेट में १००,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से के घनत्व पर बीज प्रधानमंत्री । टिश्यू कल्चर-ट्रीट प्लेट्स का इस्तेमाल न करें क्योंकि पीएम को इनसे अलग नहीं किया जा सकता । इसके बजाय गैर-इलाज प्लेटों का उपयोग करें।
  3. बीएमडीएम का उत्पादन
    1. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर पिछले पैरों से त्वचा और मांसपेशियों को हटा दें। प्रत्येक पैर को 70% इथेनॉल में कम पनडुब्बी द्वारा धोएं।
    2. पैरों को अलग करें और कैंची से काटकर फीमर और टिबिया के दोनों सिरों को खोलें।
    3. एक 5 मिलीएम सिरिंज भरें 0.6 मिमी x 30 मिमी कैनुला से भरे 5 मिलील के साथ बहुत कम एंडोटॉक्सिन (वीएलई) आरपीएमआई 1640 और बोन मैरो को खुली हड्डियों से बाहर निकालें।
    4. चरण 4.3.1-4.3.3 दोहराकर आवश्यक होने पर कई चूहों के अस्थि मज्जा को मिलाएं। बोन मैरो को 50 एमएल शंकुवर्ती सेंट्रलियूगन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. सेंट्रलाइज बोन मैरो सस्पेंशन 650 x ग्राम पर 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और सुपरनेटेंट को त्याग दें।
    6. लाल रक्त कोशिका लिसिस बफर (8.3% एनएच4सीएल, 0.1 एम ट्रिस) के 5 मीटर में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और लाल रक्त कोशिकाओं को ले ज़मीन करने के लिए आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 650 x ग्राम पर सेल निलंबन को केंद्राधीक्षक और सुपरनेटेंट को त्यागदें।
    8. वीएलई आरपीएमआई 1640 मीडियम सप्लीमेंट के 1 एमआईएल में सेल पेलेट को फिर से सस्पेंड करें 10% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% हेप्स, 1% सोडियम पायरुवेट और 10 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ) (आरपीएमआई++++++)।
    9. 5 mL की कुल मात्रा में RPMI+++++ के 4 mL जोड़ें।
    10. प्रत्येक डिश में RPMI+++++ मध्यम के 7 mL पाइपिंग द्वारा कैम के साथ 5 92 मिमी x 16 मिमी अनुपचारित पेट्री व्यंजन तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रति माउस।
    11. सेल समाधान के 1 मिलीएल को 5 तैयार संस्कृति व्यंजनों में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
    12. 4 दिनों के बाद, आरपीएमआई++++++के 4 mL जोड़कर कोशिकाओं को खिलाएं। 6-7 दिनों के बाद बोन मैरो कोशिकाओं को पूरी तरह से बीएमडीएम में अलग कर दिया जाता है।
  4. बीएमडीएम की कटाई
    1. संस्कृति के व्यंजनों से माध्यम को पूरी तरह से हटा दें। प्रत्येक डिश में पीबीएस में गर्म 0.2 m EDTA के 5 mL जोड़ें।
    2. बीएमडीएम को अलग करने के लिए एक सेल स्क्रैपर के साथ पूरी प्लेट को धीरे से कुरेदना। सेल निलंबन को 50 एमएल शंकुकेंद्रीय ट्यूब में मिलाएं।
    3. सभी 5 व्यंजनों को फिर से फ्लश करें। सभी 5 व्यंजनों के लिए पीबीएस में गर्म 0.2 m EDTA के 5 mL की एक ही मात्रा का उपयोग करें। इस सेल निलंबन को पिछले चरण से एक के साथ मिलाएं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 650 x ग्राम पर सेल निलंबन को केंद्राधीक्षक और सुपरनेटेंट को त्यागदें।
    5. वीएलई आरपीएमआई 1640 मीडियम के 1 एमआईएल में सेल पैलेट को 10% एफसीएस, 1% हेप्स, 1% सोडियम पायरुवेट और 10 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट एम-सीएसएफ के साथ पूरक किया गया लेकिन कोई एंटीबायोटिक् यिका (आरपीएमआई++++++)।
    6. संस्कृति प्लेटों में एक Neubauer गिनती कक्ष और RPMI++++ में बीज कोशिकाओं में ट्राइपैन नीले समाधान में गिनती करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
      नोट: एक फ्लैट बॉटम माइक्रोटिटर प्लेट में ५०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से अधिकतम के घनत्व पर बीज बीएमडीएम । टिश्यू कल्चर-इलाज प्लेटों का इस्तेमाल न करें क्योंकि बीएमडीएम को इनसे शायद ही अलग किया जा सकता है । इसके बजाय गैर-इलाज प्लेटों का उपयोग करें।

5. एमआरएनए के साथ मैक्रोफेज का ट्रांसफेक्शन

  1. एमआरएनए ट्रांसफेक्शन बफर की आवश्यक मात्रा की गणना करें।
    नोट: MRNA ट्रांसफेक्शन बफर की मात्रा अच्छी तरह से आकार पर निर्भर करता है: एक 6 अच्छी तरह से थाली में ट्रांसफेक्शन के लिए २०० μL का उपयोग करें, एक 12 अच्छी तरह से थाली में १०० μL और इतने पर । हमेशा पाइपिंग हानि (लेकिन बहुत ज्यादा नहीं, mRNA के अनुचित कमजोर पड़ने को रोकने के लिए) की वजह से थोड़ा अतिरिक्त मात्रा जोड़ें। उदाहरण के लिए, 12-अच्छी प्लेट के 4 कुओं में ट्रांसफेक्ट करने के लिए 4 x 100 माइक्रोन = 400 माइक्रोन के बजाय 450 माइक्रोन का उपयोग करें।
  2. एमआरएनए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट की आवश्यक मात्रा की गणना करें। एमआरएनए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट को 1:50 के अनुपात में जोड़ा जाता है। उदाहरण के लिए, 450 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए एमआरएनए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के 9 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।
  3. आवश्यक एमआरएनए की कुल राशि की गणना करें। कुशल ट्रांसफेक्शन के लिए प्रति 100,000 मैक्रोफेज में कम से कम 100 एनजी की आवश्यकता होती है, 200 एनजी भी बेहतर काम करता है (उदाहरण के लिए, 800 एनजी एमआरएनए को 400,000 मैक्रोफेज को स्थानांतरित करना)।
    1. कुओं की कुल संख्या के साथ आवश्यक एमआरएनए की गणना की गई राशि को गुणा करें जिन्हें ट्रांससंक्रमित किया जाना है (उदाहरण के लिए, 400,000 मैक्रोफेज के साथ 4 कुएं प्रत्येक: 4 x 800 एनजी = 3,200 एनजी एमआरएनए सभी कुओं के लिए कुल में आवश्यक है)। उदाहरण के लिए, यदि आपका एमआरएनए स्टॉक 426.8 एनजी/माइक्रोन है, तो 4 कुओं के इष्टतम ट्रांसफेक्शन के लिए 7.49 माइक्रोन की आवश्यकता है जिसमें 400,000 मैक्रोफेज प्रत्येक हैं।
  4. एमआरएनए ट्रांसफेक्शन बफर (चरण 5.1.) की गणना की गई मात्रा को एक प्रतिक्रिया ट्यूब में एमआरएनए ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान (चरण 5.2) और एमआरएनए (चरण 5.3) के लिए मात्रा को घटादें। उदाहरण के लिए, 450 माइक्रोन - 9 माइक्रोन - 7.49 माइक्रोन = 433.51 माइक्रोन।
  5. एमआरएनए स्टॉक को पिघलाएं और इसे एल्यूटियन ट्यूब की कोमल फ्लिपिंग द्वारा मिलाएं। एमआरएनए प्रतिक्रिया बफर (ऊपर प्रस्तुत उदाहरण में: 433.51 माइक्रोन में 7.49 माइक्रोन) के साथ प्रतिक्रिया ट्यूब में एमआरएनए (चरण 5.3) की गणना की गई मात्रा जोड़ें।
  6. 5 एस के लिए भंवर और 2,000 x ग्रामपर 2 एस के लिए नीचे स्पिन।
  7. भंवर 5 एस के लिए mRNA ट्रांसफेक्शन रिएजेंट और 2,000 x ग्राम पर 2 एस के लिए नीचे स्पिन।
  8. एमआरएनए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट (चरण 5.2) की गणना की गई मात्रा को एमआरएनए ट्रांसफेक्शन बफर और एमआरएनए युक्त प्रतिक्रिया ट्यूब में जोड़ें (ऊपर प्रस्तुत उदाहरण में: एमआरएनए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट का 9 माइक्रोन)।
  9. भंवर 5 एस के लिए ट्रांसफेक्शन मिश्रण और 2,000 x ग्रामपर 2 एस के लिए नीचे स्पिन।
  10. आरटी में 15 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  11. इस बीच, मैक्रोफेज की संस्कृति माध्यम को ताजा, गर्म संस्कृति माध्यम से प्रतिस्थापित करें (चरण 4.2.18 और 4.4.5 देखें)।
  12. ऊष्मायन चरण 5.10 के बाद, अच्छी तरह से आकार के लिए उपयुक्त मात्रा में मैक्रोफेज युक्त कुओं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें (चरण 5.1 देखें)। बाहर से कुएं के बीच तक एक सर्कल में ट्रांसफेक्शन मिक्स ड्रॉपवाइज जोड़ें।
  13. धीरे-धीरे प्लेट को रॉक करें, पहले एक ऊर्ध्वाधर में और फिर एक क्षैतिज दिशा में अच्छी तरह से ट्रांसफेक्शन मिश्रण का समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट। ट्रांससंक्रमित एमआरएनए द्वारा एन्कोड प्रोटीन का संश्लेषण ट्रांसफेक्शन के तुरंत बाद शुरू हो जाएगा। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, कम से कम 6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  14. ऊष्मायन के बाद, (इम्यूनो) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, प्रवाह साइटोमेट्री या इम्यूनोब्लॉट16द्वारा ट्रांसफेक्शन दक्षता का विश्लेषण करें, या पसंद के प्रयोग के लिए ट्रांससंक्रमित मैक्रोफेज का उपयोग करें।

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Representative Results

हमने प्राथमिक मैक्रोफेज16के ट्रांसफेक्शन के लिए फ्लैग-टैग किए गए निमो और IKKο वेरिएंट के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। फ्लैग-टैग किए गए वाइल्ड-टाइप (नीमोडब्ल्यूटी)और C54/347A उत्परिवर्ती नीमो (NEMOC54/374A) (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एन्कोडिंग प्लाज्मिड्स में पहले से ही सही अभिविन्यास(चित्रा 1ए)में एक T7 प्रमोटर शामिल हैं । इस प्रकार, हमें केवल इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए प्लाज्मिड को रैखिक करना पड़ा। इस उद्देश्य के लिए, प्लाज्मिड डीएनए के 10 μg 5 μL Xbal के साथ पचा रहे थे जिसके परिणामस्वरूप स्टॉप कोडन के एक कट 3 ' के कारण प्लाज्मिड का रैखिकीकरण हुआ । प्लाज्मिड डीएनए का पूरा रैखिकीकरण अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस(चित्रा 1बी)द्वारा सत्यापित किया गया था।

फ्लैग-टैग किए गए जंगली-प्रकार (IKKοWT)और S177/181E उत्परिवर्ती IKKο (IKKοS177/181E)के लिए एन्कोडिंग प्लाज्मिड्स में T7 प्रमोटर शामिल नहीं है। इसलिए, हमने इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन(चित्रा 2ए)के लिए डीएनए टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए पीसीआर द्वारा एक T7 प्रमोटर संलग्न किया है। एक विशिष्ट पीसीआर उत्पाद का उत्पादन, यानी, सही आकार का एक उत्पाद, अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस(चित्रा 2बी)द्वारा सत्यापित किया गया था।

संबंधित डीएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के बाद, हमने सही आकार के एक एमआरएनए उत्पाद की एक ही एमआरएनए उत्पाद की पीढ़ी को सत्यापित किया और सही आकार (ए) टेलिंग को दनाटूरिंग स्थितियों(चित्रा 3)के तहत अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा टेलिंग किया।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न एमआरएनए प्राथमिक मैक्रोफेज के ट्रांसफेक्शन को सक्षम करता है (पीएम के इम्यूनोमैग्नेटिक संवर्धन और बीएमडीएम की विभेदन स्थिति के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषणों के लिए चित्रा 4ए, बी देखें), हमने ईजीएफपी(चित्रा 5ए-सी)के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग उत्पन्न की है और प्रवाह साइटोमेट्री(चित्र 6ए)द्वारा ट्रांसफेक्शन दक्षता का विश्लेषण किया है। अनुपचारित माइक्रोटिटर प्लेट के प्रति कुएं में 100,000 बजे या 50,000 बीएमडीएम को 6, 9 या 24 घंटे के लिए ईजीएफपी एमआरएनए के 50, 100 या 200 एनजी से ट्रांसकिया गया था। पीएम और बीएमडीएम दोनों में ट्रांसफेक्शन के बाद 6 घंटे में ईजीएफपी अभिव्यक्ति के उच्च स्तर का पता लगाया जा सकता है । ट्रांसफेक्शन दर ट्रांससंक्रमित एमआरएनए की मात्रा के साथ बढ़ी और 200 एनजी एमआरएनए(चित्रा 6बी, सी)के लिए सबसे अधिक थी। पीएम के लिए ट्रांसफेक्शन रेट ट्रांसफेक्शन के बाद 6 से 9 घंटे में करीब 50-65% तक पहुंच गया(चित्रा 6बी)। ट्रांसफेक्शन के बाद 24 घंटे में, ट्रांसफेक्शन दर काफी कम थी जो ईजीएफपी अभिव्यक्ति को अवसान करने का संकेत देता है। इस प्रकार पीएम को रात भर ट्रांससंक्रमित नहीं होना चाहिए। बीएमडीएम के लिए, ट्रांसफेक्शन दर लगभग 80-85% तक पहुंच गई(चित्रा 6सी)। 24 घंटे के बाद ट्रांसफेक्शन रेट में गिरावट बीएमडीएम में बहुत कम स्पष्ट थी । इस प्रकार, बीएमडीएम को रातोंरात ट्रांससंक्रमित किया जा सकता है। दोनों प्रधानमंत्री(चित्रा 6डी, ई)और BMDM(चित्रा 6एफ, जी),ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं में eGFP की अभिव्यक्ति का स्तर एक समय में वृद्धि हुई है-और खुराक पर निर्भर तरीके से । महत्वपूर्ण बात, ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया ने लिटिक या एपोप्टिक सेल डेथ को प्रेरित नहीं किया क्योंकि ट्रांसफेक्शन के बाद प्रोपिडियम आयोडिड-पॉजिटिव (पीआई) या एनेक्सिन वी-पॉजिटिव मैक्रोफेज(चित्रा 7ए, बी)में कोई वृद्धि नहीं हुई थी।

फ्लैग-टैग किए गए निमो या IKKο वेरिएंट के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग की ट्रांसफेक्शन दक्षता का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। 12-अच्छी प्लेट के प्रति कुएं 300,000 बजे 6 घंटे के लिए संबंधित एमआरएनए के 300 एनजी से ट्रांसफेक्शन रेट निमो mRNAs के लिए लगभग 60% और IKK m0rnAs(चित्रा 8ए, बी)के लिए लगभग 55% था। इस प्रकार, उनकी ट्रांसफेक्शन दरें ईजीएफपी एमआरएनए के समान थीं जो पीएम के लिए लगभग 55% की सामान्य ट्रांसफेक्शन दर का संकेत देती हैं।

हमने क्रे रिकॉम्बिनेज के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल का भी उपयोग किया है। एनएमओफ्लोक्स/फ्लोक्स चूहों से ४००,००० BMDM के ट्रांसफेक्शन17 प्रति अच्छी तरह से एक 12-अच्छी तरह से प्लेट के ४०० एनजी के साथ क्रे recombinase mRNA के ४८ घंटे(चित्रा 9)के बाद बीएमडीएम के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन का संकेत है ।

प्रधानमंत्री और बीएमडीएम ने ट्रांसफेक्शन के बाद आईएल-1ए, आईएल-6 और टीएनएफ की किसी भी पता लगाने योग्य मात्रा को स्रावित नहीं किया(चित्रा 10ए, बी)। इसके अलावा, एनएफ-केबी और एमके सिग्नलिंग पाथवे को ट्रांसफेक्शन16 के बाद सक्रिय नहीं किया गया था जो यह दर्शाता है कि ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया भड़काऊ सिग्नलिंग को सक्रिय नहीं करती है। हमने ट्रांसट्रांस मैक्रोफेज16की तुलना में ट्रांसट्रांस मैक्रोफेज के किसी भी कार्यात्मक परिवर्तन को भी नहीं देखा है ।

Figure 1
चित्रा 1: निमो-एन्कोडिंग प्लाज्मिड ्स का लीनियराइजेशन पहले से ही सही अभिविन्यास में T7 प्रमोटर युक्त है। (A) फ्लैग-टैग किए गए निमोडब्ल्यूटी या एनएमओC54/347Aके लिए प्लाज्मिड एन्कोडिंग का अनुक्रम अंश । सही अभिविन्यास में एक T7 प्रमोटर और KOZAK अनुक्रम के करीब है और कोडन शुरू पहले से ही मौजूद है । T7 प्रचार क्षेत्र, फ्लैग टैग और निमो के लिए कोडिंग अनुक्रम (सीडीएस), स्टार्ट एंड स्टॉप कोडन और एक्सबीएआई के साथ रैखिकीकरण के लिए प्रतिबंध साइट रंग-कोडित हैं। (ख)प्रतिनिधि 1% अगारोज जेल एक्सबल के साथ रैखिकीकरण से पहले और बाद में प्लाज्मिडदिखाता दिखा रहा है; अनुपचारित, रैखिकीकृत या शुद्ध रैखिक प्लाज्मिड डीएनए के 1 μL प्रति लेन लोड किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीसीआर द्वारा IKKß-एन्कोडिंग प्लाज्मिड्स के लिए T7 प्रमोटर या लगाव। (क) फ्लैग-टैग किए गए IKKοWT या IKKοS177/181Eके लिए प्लाज्मिड एन्कोडिंग का अनुक्रम अंश । प्लाज्मिड्स में उपयुक्त टी7 प्रमोटर नहीं होता है, जो इसलिए पीसीआर द्वारा संलग्न है। आगे प्राइमर का स्थान, अभिविन्यास और अनुक्रम (टी 7 प्रमोटर अनुक्रम को जोड़ा जाना है) और रिवर्स प्राइमर तीर द्वारा इंगित किया जाता है। T7 प्रचार क्षेत्र, फ्लैग टैग और IKKο के लिए सीडीएस और स्टार्ट एंड स्टॉप कोडन रंग-कोडित हैं। (ख)प्रतिनिधि 1% अगारोज जेल ऊपर इंगित प्राइमर का उपयोग करके सही आकार के एक पीसीआर उत्पाद की पीढ़ी की पुष्टि करता है। शुद्ध पीसीआर उत्पाद का 1 माइक्रोन प्रति लेन लोड किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: NEMO से mRNA संश्लेषण- और IKKο-एन्कोडिंग डीएनए टेम्पलेट्स। (A)प्रतिनिधि 1.2% अगारोज जेल की निंदा करते हैं जिसमें 0.7% फॉर्मलडिहाइड होता है जो पॉली (ए) टेलिंग से पहले और बाद में निमो और IKKके निर्माण के शुद्ध एमआरएनए को दिखाता है। निमोडब्ल्यूटीके 2 μL, NEMOC54/347A,IKKοWT और IKKοS177/181E mRNA प्रति लेन लोड किया गया । आरएनए लंबाई निर्धारण के लिए 32 माइक्रोन स्एसआरना सीढ़ी भरी हुई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र4: प्रधानमंत्री के इम्यूनोमैग्नेटिक संवर्धन और बीएमडीएम के विभेदन की स्थिति के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण । (क)इम्यूनोमैग्नेटिक संवर्धन से पहले और बाद में पेरिटोनियल लैवेज में F4/80+/CD11b+ पीएम का प्रतिशत फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया । (ख)6 दिनों के भेदभाव के बाद बीएमडीएम द्वारा F4/80 और CD11b की अभिव्यक्ति प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सत्यापित की गई थी । प्रति नमूना क्रमशः 10,000 या 5,000 कोशिकाओं की गणना की गई। डेटा n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों, प्रत्येक के मतलब ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है। * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001 और **** पी एंड एलटी; 0.0001 छात्र टी-टेस्ट द्वारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: eGFP की पाली (ए) टेलिंग के साथ mRNA संश्लेषण। (ए)ईजीएफपी के लिए प्लाज्मिड एन्कोडिंग का अनुक्रम अंश। प्लाज्मिड में एक उपयुक्त T7 प्रमोटर नहीं है, जो इसलिए पीसीआर द्वारा संलग्न है। आगे प्राइमर का स्थान, अभिविन्यास और अनुक्रम (टी 7 प्रमोटर अनुक्रम को जोड़ा जाना है) और रिवर्स प्राइमर तीर द्वारा इंगित किया जाता है। T7 पदोन्नत क्षेत्र, eGFP के लिए सीडीएस और शुरू और बंद कोडन रंग कोडित कर रहे हैं । (ख)प्रतिनिधि 1% अगारोज जेल ऊपर इंगित प्राइमर का उपयोग कर पीसीआर के बाद शुद्ध एम्प्लिस दिखाता है। शुद्ध पीसीआर उत्पाद का 1 माइक्रोन प्रति लेन लोड किया गया था। (ग)प्रतिनिधि 1.2% अगारोज जेल की निंदा करते हैं जिसमें 0.7% फॉर्मलडिहाइड होता है जो पॉली (ए) टेलिंग से पहले और बाद में ईजीएफपी के शुद्ध एमआरएनए को दिखाता है। ईजीएफपी एमआरएनए के 2 माइक्रोन को प्रति लेन लोड किया गया था। आरएनए लंबाई निर्धारण के लिए 32 माइक्रोन स्एसआरना सीढ़ी भरी हुई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ईजीएफपी एमआरएनए के साथ पेरिटोनियल मैक्रोफेज और बीएमडीएम दोनों का अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन। मैक्रोफेज को 6, 9 या 24 घंटे के लिए 50, 100 या 200 एनजी ईजीएफपी एमआरएनए के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था, जो जेटमैसेंजर के लिए या अकेले जेटमैसेंजर (मॉक) के साथ जटिल था और फिर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था। (A)गेटिंग रणनीति का उपयोग व्यवहार्य मैक्रोफेज, व्यवहार्य ईजीएफपी+ मैक्रोफेज और पीआई+ (यानी मृत) मैक्रोफेज की आबादी को परिभाषित करने के लिए किया जाता है। 6 घंटे के लिए 200 एनजी mRNA के साथ ट्रांसफेक्शन के लिए प्रतिनिधि डेटा दिखाया गया है। (बी, सी) (बी)पीएम और(सी)बीएमडीएम की ट्रांसफेक्शन दरों का निर्धारण प्रवाह साइटोमेट्री (एन = 5-7 और एन = 4-5 स्वतंत्र प्रयोगों द्वारा व्यवहार्य ईजीएफपी-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण करके किया गया था। (डी-जी) ईजीएफपी के अभिव्यक्ति स्तर का निर्धारण व्यवहार्य(डी)पीएम और(एफ)बीएमडीएम और व्यवहार्य और ईजीएफपी-सकारात्मक उपजनसंख्या(ई)पीएम और(जी)बीएमडीएम (एन = 5-7 और एन = 4-5 स्वतंत्र प्रयोगों) के मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) का विश्लेषण करके किया गया था। प्रति सैंपल 10,000 कोशिकाओं की गिनती की गई। डेटा के रूप में दिखाया गया है मतलब ± SEM. n.s= महत्वपूर्ण नहीं; * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001 और **** पी एंड एलटी; 0.0001 छात्र टी-टेस्ट द्वारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ट्रांसफेक्शन लिटिक या अपोप्टिक सेल डेथ को प्रेरित नहीं करता है। ट्रांसफेक्शन-प्रेरित सेल डेथ ऑफ(ए)पीएम और(बी)बीएमडीएम का निर्धारण पीआई-पॉजिटिव और एनेक्सिन वी-पॉजिटिव कोशिकाओं (एन = 5-7 और एन = 4-5 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिशत का विश्लेषण करके किया गया था। ट्रांसट्रांस्थ नमूनों में मौजूद मृत मैक्रोफेज का प्रतिशत (कोशिका मृत्यु की कुछ डिग्री गैर-इलाज प्लेटों के उपयोग के बावजूद कुओं से मैक्रोफेज की भौतिक टुकड़ी के कारण हुई थी) संबंधित ट्रांससंक्रमित नमूनों में केवल ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया द्वारा प्रेरित कोशिका मृत्यु को ध्यान में रखने के लिए उससे घटाया गया था। पीआई+की आबादी को परिभाषित करने के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति, एनेक्सिन वी+ और पीआई+/एनेक्सिन वी+ मैक्रोफेज को 6 घंटे के लिए २०० एनजी एमआरएनए से ट्रांससंक्रमित पीएम के प्रतिनिधि डेटा सेट के लिए दिखाया गया है । Staurosporine (1 घंटे के लिए 50 μM) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्रति सैंपल 10,000 कोशिकाओं की गिनती की गई। डेटा के रूप में दिखाया गया है मतलब ± SEM. n.d. = पता लगाने योग्य नहीं है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: NEMO और IKK निर्माण के लिए mRNA एन्कोडिंग का उपयोग कर ट्रांसफेक्शन दरें। (ए)एनएमओ निर्माण और(बी)आईकेके निर्माण के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग का उपयोग करके ट्रांसफेक्शन दरों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एन = 4 स्वतंत्र प्रयोगों) द्वारा निर्धारित किया गया था। स्केल बार = 4 μm. डेटा मतलब ± SEM. n.t. = ट्रांससंक्रमित नहीं, एन. एस= महत्वपूर्ण नहीं के रूप में दिखाया गया है; * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001 और **** पी एंड एलटी; 0.0001 छात्र टी-टेस्ट द्वारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: क्री recombinase के लिए mRNA एन्कोडिंग के साथ NEMOfl/fl BMDM के ट्रांसफेक्शन नेमो के लिए लगभग पूरी कमी में परिणाम है । NEMOfl/fl चूहों से BMDM को सीआरएनए एन्कोडिंग क्रे रिकॉम्बिनेज से 48 घंटे के लिए ट्रांसकिया गया था। क्रे-मध्यस्थता नॉकआउट के परिणामस्वरूप एनएमओ प्रोटीन के लिए कमी का आकलन पश्चिमी दाग द्वारा विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके निमो को पहचानने वाले विशिष्ट एंटीबॉडी या एन्मो-ऐक्टिन और डेंनेमेट्री (एन = 5 स्वतंत्र प्रयोगों) द्वारा निर्धारित किया गया था। डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है । * पी एंड एलटी; ०.०५, ** पी एंड एलटी; ०.०१, *** पी एंड एलटी; ०.००१ और **** पी एंड एलटी; ०.०००१ छात्र टी-टेस्ट द्वारा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: ट्रांसफेक्शन एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित नहीं करता है। (ए) पीएम औरबीबीएमडीएम को एनएमओडब्ल्यूटी या निमोC54/347Aके लिए एमआरएनए एन्कोडिंग से ट्रांसट्रांस किया गया । सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, मैक्रोफेज 1 के संक्रमण की बहुलता पर लिस्टिरिया मोनोसाइटोजीन से संक्रमित थे या 5 ग्राम (पीएम) या 24 एच (बीएमडीएम) के लिए 5 μg/mL एलपीएस या पॉली (I:C) के साथ उत्तेजित होते थे । आईएल-1 के स्राव को सुपरनेटेंट में आईएल-1, आईएल-6 और टीएनएफ का स्राव एलिसा (एन = 3 स्वतंत्र प्रयोगों) द्वारा निर्धारित किया गया था। डेटा के रूप में दिखाया गया है मतलब ± SEM. n.t. = ट्रांससंक्रमित नहीं, n.d. = पता लगाने योग्य नहीं है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम इन विट्रो लिखित एमआरएनए के साथ आमतौर पर हार्ड-टू-ट्रांसफेट प्राइमरी मैक्रोफेज के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मैक्रोफेज का ट्रांसफेक्शन सेल डेथ को प्रेरित नहीं करता है या भड़काऊ संकेत को सक्रिय नहीं करता है जो यह दर्शाता है कि न तो ट्रांसफेक्शन रिएजेंट और न ही ट्रांससंक्रमित एमआरएनए को गैर-स्व के रूप में पहचाना जाता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मैक्रोफेज के सफल ट्रांसफेक्शन के लिए एमआरएनए की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, बड़ी सावधानी बरती जानी चाहिए कि एमआरएनएआरए आरएनए (उदाहरण के लिए, दूषित बफ़र्स या शीशियों के माध्यम से) के संपर्क में न आए। यदि संदेह है, तो एमआरएनए क्षरण की जांच करें (उदाहरण के लिए, अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा)। ट्रांसफेक्शन दर और अभिव्यक्ति का स्तर पहले से ही ट्रांसफेक्शन के बाद 6 घंटे पर अधिकतम था। इसलिए, यह संभव है कि ब्याज का प्रोटीन ट्रांसफेक्शन के बाद पहले के समय बिंदुओं पर विश्लेषण के लिए पर्याप्त स्तरों पर व्यक्त किया जाए। हम इस का परीक्षण नहीं किया है, हालांकि । इसके अलावा, एमआरएनए की बड़ी मात्रा में ट्रांसफेक्शन दर और/या अभिव्यक्ति के स्तर में और वृद्धि हो सकती है । हालांकि, एमआरएनए की बड़ी मात्रा को स्थानांतरित करने से संभवतः कुछ हद तक इम्यूनोजेनिकिटी या साइटोटॉक्सिकिटी भी हो सकती है। इसके पूर्ण अभाव इस प्रोटोकॉल के मुख्य फायदों में से एक है । इस प्रकार, यदि बड़ी मात्रा में एमआरएनए को ट्रांससंक्रमित किया जाना है, तो इम्यूनोजेनिकिटी और साइटोटॉक्सिकिटी का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करना होगा।

अभिव्यक्ति स्तर स्पष्ट रूप से ट्रांससंक्रमित एमआरएनए की मात्रा से सहसंबद्ध है। फिर भी, निमो-कमी वाले बीएमडीएम में निमो की पुन: अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप वाइल्डटाइप बीएमडीएम16 में इसी तरह की निमो प्रोटीन अभिव्यक्ति हुई, जो यह दर्शाती है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से एमआरएनए ट्रांसफेक्शन से ब्याज के प्रोटीन की पर्याप्त अतिअभिव्यक्ति नहीं होती है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल ब्याज के प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति के परिणामों का अध्ययन करने के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है। हम बल्कि इस एक लाभ पर विचार, हालांकि, एक प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति के रूप में अक्सर अपने व्यवहार बदल जाते हैं ।

MRNA ट्रांसफेक्शन की मुख्य सीमा, सामान्य रूप से, यह है कि इसके परिणामस्वरूप केवल ब्याज के प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति होती है (क्योंकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न और ट्रांससंक्रमित एमआरएनए सामान्य कारोबार के अधीन होगा)। पीएम बीएमडीएम की तुलना में कम समय के लिए ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करने लगते हैं । इस प्रकार बीएमडीएम के विपरीत पीएम को रात भर ट्रांसफारमर नहीं किया जाना चाहिए। कब तक ब्याज का एक दिया प्रोटीन व्यक्त किया जाएगा अलग-अलग होगा (के रूप में दोनों mRNA की स्थिरता और प्रोटीन के अलग-अलग होगा) । फिर भी हम ट्रांसफेक्शन के समान दिन पसंद के प्रयोग करने की सलाह देते हैं। यदि ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति समय की लंबी अवधि के लिए आवश्यक है, कोशिकाओं को शायद कई बार ट्रांससंक्रमित किया जा सकता है (जैसे, हर दिन के रूप में18में वर्णित है) ।

हमने यहां वर्णित प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया है ताकि मोमूत्र पीएम और बीएमडीएम और माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)16को ट्रांसफेर्ट किया जा सके । सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करउत्पन्न एमआरएनए का उपयोग किसी भी स्तनधारी प्रजातियों के किसी भी सेल प्रकार को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, संशोधित न्यूक्लियोसाइड्स की इष्टतम एमआरएनए ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान और सामग्री अन्य सेल प्रकारों के लिए भिन्न हो सकती है।

भविष्य के आशाजनक संशोधनों में 5'-और 3'-यूटीआर को शामिल करना शामिल है। अधिकांश पूर्व-मौजूदा प्लाज्मिड में केवल ब्याज के प्रोटीन के सीसीडीएस होते हैं, न कि 5'-और 3'-यूटीआर। उनके समावेश (जैसा कि19में वर्णित है) MRNA स्थिरता और अभिव्यक्ति को और बढ़ा सकता है । इसके अलावा, आगे या रिवर्स प्राइमर (एन और सी-टर्मिनल एपिटोप टैगिंग के लिए) में एपिटोप टैग के अनुक्रम को शामिल करके ब्याज के प्रोटीन के लिए एपिटोप टैग संलग्न करना संभव होना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमिन्सफ्ट (एसएफबी 670) ने समर्थन दिया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

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References

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Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

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