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Immunology and Infection

Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

I macrofagi, in particolare i macrofagi primari, sono difficili da trasfecare in quanto sono specializzati nel rilevamento di molecole di origine non auto. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generati da modelli di DNA come i plasmidi.

Abstract

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento di molecole di origine non auto. A tal fine, sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei pattern (PRR). Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfecare poiché il reagente di trasfezione e gli acidi nucleici trafetti sono spesso riconosciuti dai PRR come non-sé. Pertanto, la trasfezione spesso si traduce nell'attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici trafetti o anche nel suicidio dei macrofagi. Qui, descriviamo un protocollo che consente la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari murini come macrofagi peritoneali (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA in vitro trascritto da modelli di DNA come plasmidi. Con questo semplice protocollo, i tassi di trasfezione di circa il 50-65% per il PM e circa l'85% per il BMDM sono raggiunti senza citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio la generazione di mRNA per la trasfezione da costrutti di DNA come plasmidi e la procedura di trasfezione.

Introduction

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento, l'ingestione e la degradazione di microbi, cellule apoptotiche e detriti cellulari. Inoltre, aiutano a orchestrare le risposte immunitarie secernendo citochine e chemiochine e presentando antigeni alle cellule T e alle cellule B. I macrofagi svolgono anche un ruolo importante in numerosi altri processi, come la guarigione delle ferite, l'aterosclerosi, la tumorigenesi e l'obesità.

Per essere in grado di rilevare molecole non autonome come i modelli molecolari associati ai patogeni (PEN) e le molecole fuori luogo come i modelli molecolari associati ai danni (DAMP), i macrofagi sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)1. Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfect2 come la reagente di trasfezione3 e gli acidi nucleici transfettici4,5,6,7 spesso sono riconosciuti dai PRR come non-sé. Per questo motivo, la trasfezione dei macrofagi utilizzando metodi chimici o fisici8 di solito si traduce nell'attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici transfettati o anche nel suicidio del macrofago tramite piroptosi, una forma di morte programmata delle cellule littiche innescata dopo il riconoscimento di PIS citosolici/DAMP come IL DNA o l'RNA estraneo9. La trasfezione biologica dei macrofagi utilizzando virus come adenovirus o lentivirus poiché i vettori sono spesso più efficienti, ma la costruzione di tali vettori virali richiede molto tempo e richiede il livello di biosicurezza 2 attrezzature10,11.

Così, anche se i macrofagi sono oggetto di un'intensa ricerca, l'analisi delle loro funzioni a livello molecolare è ostacolata perché uno degli strumenti più importanti della biologia molecolare, la trasfezione di costrutti di acido nucleico per l'espressione esogena di proteine, è difficilmente applicabile. Questo spesso costringe i ricercatori a usare linee cellulari simili a macrofagi piuttosto che macrofagi in buona fede. Le applicazioni per la trasfezione di costruzione dell'acido nucleico includono l'espressione di versioni proteiche mutate o marcate, la sovraespressione di una proteina specifica, la rielezione delle proteine in un rispettivo sottofondo knockout e l'espressione di proteine di altre specie (ad esempio, , Cre ricombinante o guida RNA e Cas9 per l'eliminazione mirata del gene).

Qui, descriviamo un protocollo che permette la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari (solitamente difficili da trasfecti), che sono macrofagi peritoneici murini (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA generato da modelli di DNA come plasmidi. È importante sottolineare che l'mRNA trascritto in vitro generato utilizzando questo protocollo contiene i nucleoside modificati naturali 5-metili-CTP e pseudo-UTP che riducono l'immunogenicità e migliorano la stabilità4,6,7,12,13. Inoltre, le 5'estremità dell'mRNA trascritto in vitro sono dephofosrylated da fosforesi antartiche per impedire il riconoscimento da parte del complesso RIG-I14,15. Questo riduce al minimo il riconoscimento immunitario innato dell'mRNA trascritto in vitro. Con il nostro protocollo facile da eseguire, i tassi di trasfezione tra 50-65% (macrofagi peritoneali (PM)) e 85% (BMDM) sono raggiunti mentre, soprattutto, non vi è alcuna citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio (i) come l'mRNA immunologicamente silenziato per la trasfezione può essere generato da costrutti di DNA come plasmidi e (ii) la procedura di trasfezione stessa.

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Protocol

L'isolamento dei macrofafi dai topi è stato eseguito in conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali, in conformità con il Comitato Etico dell'Università di Colonia.

NOT: Eseguire tutti i gradini indossando guanti. Eseguire tutte le fasi di trasfezione sotto un cappuccio a flusso laminare per prevenire la contaminazione delle cellule. Prima di lavorare con l'mRNA, pulire tutti gli strumenti come pipette e ogni superficie con 70% etanolo e/o un surfactant che degrada gli RNA (Tabella dei materiali). Assicurarsi che tutti i tubi di reazione siano privi di RNA e sterili. Utilizzare solo acqua sterile, senza RNAase, per le diluizioni. Utilizzare esclusivamente punte pipette con filtri. Cambiare le punte delle pipette dopo ogni passo di pipettatura.

1. Generazione del modello DNA

NOT: Il modello di DNA per la trascrizione dell'mRNA in vitro che utilizza questo protocollo deve contenere una sequenza promotoria T7 per consentire l'attracco della polimerasi dell'RNA. Se il plasmide contenente la sequenza di DNA della proteina di interesse contiene già una sequenza promotore T7 correttamente orientata direttamente a monte della sequenza di interesse, è necessario eseguire la linearizzazione del plasmide (vedi passo 1.1.). In caso contrario, collegare un promotore T7 alla sequenza di interesse mediante reazione a catena polimerasi (PCR, vedere il passaggio 1.2.).

  1. Linearizzazione dei plasmidi contenenti promotori T7
    1. Linearizzare i plasmidi già contenenti una sequenza promotore T7 correttamente orientata mediante digestione con un enzima di restrizione che taglia a valle il codone di arresto della sequenza di interesse. In caso contrario, la trascrizione non terminerà correttamente dopo la sequenza di interesse.
      NOT: È meglio usare enzimi di restrizione lasciando estremità smussate o sbalzi 5'.
    2. Confermare la linearizzazione completa del plasmide mediante elettroforesi gel agarose di DNA plasmide non digerito contro digerito.
    3. Purificare il DNA plasmide linearizzato prima dell'uso come modello di DNA per la trascrizione in mRNA in vitro utilizzando un kit di purificazione del DNA (Tabella dei materiali).
  2. Attacco del promotore T7 tramite PCR
    1. Utilizzare un primer in avanti contenente i seguenti componenti (nell'ordine indicato da 5' a 3'): circa 5 bp casuali a monte del promotore (ad esempio, GAAAT); la sequenza promotoria T7 (TAATACGACTCACTATAG); due G in più per una maggiore efficienza di trascrizione (GG); la parte specifica della sequenza di destinazione che è omologa alla sequenza plasmide che circonda il codone di partenza.
      NOT: Dovrebbe essere composto da: 3-6 bp a monte della sequenza KO-AK e iniziare codon, la sequenza KO-AK e iniziare codon (di solito GCCACC ATG G), 12-18 bp a valle del codone di partenza. Se la sequenza di interesse non contiene già una sequenza DI KO-AK o un codon iniziale, questi possono essere collegati in questo passaggio semplicemente includendoli nella sequenza primer.
    2. Calcolare il tm del primer in avanti solo tenendo conto della parte omologa alla sequenza di destinazione.
    3. Per valutare la formazione di dische/fornaci, utilizzare l'intera sequenza di primer, che può facilmente superare i 50 bp.
    4. Utilizzare un primer inverso situato da qualche parte a valle del codon di arresto.
      NOT: Se la sequenza di interesse non contiene già un codone di arresto, può essere collegata in questo passaggio semplicemente includendola nella sequenza di primer.
    5. Utilizzare le primer in avanti e in retromarcia per eseguire una PCR utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà con correzione di bozze (Tabella dei materiali).
    6. Confermare la generazione di un singolo prodotto e la dimensione dell'amplificatore mediante elettroforesi gel agarose (ad esempio, utilizzare un gel di agarose dell'1% e una corrente costante 100 V).
    7. Purificare il prodotto PCR prima dell'uso come modello di DNA per la trascrizione dell'mRNA in vitro utilizzando un kit di purificazione del DNA.

2. Generazione di mRNA

  1. Scongelare tutti i componenti del kit di trascrizione dell'mRNA in vitro (vedere la Tabella dei materiali). Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Tenere sul ghiaccio fino all'uso.
  2. Preparare il mix di reazione per la trascrizione in vitro mRNA in un tubo di microcentrifuga da 0,5 ml nel seguente ordine (volume totale di 40:L): 20 L di 10x mix ARCA/NTP (incluso nel kit di trascrizione dell'mRNA in vitro); 0,25 - L di 5-metil-CTP (concentrazione finale (f.c.) è 1,25 mM; 50% del CTP totale); 0,25 l di pseudo-UTP (f.c. è 1,25 mM; 50% dell'UTP totale); X -L del modello di DNA; 2 -L di miscela di polimerasi di RNA T7 (incluso nel kit di trascrizione dell'mRNA in vitro); Y-L di H2O senza RNAse.
    NOT: X è un volume che contiene almeno 1 g di DNA. Ad esempio, 1,6 litri da una soluzione di stock da 625 ng/L. Y è il volume di riserva per il volume totale di 40 l.
  3. Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min a 400 rpm su un miscelatore termico per la trascrizione in vitro.
  4. Quindi, aggiungere 2 -L di DNase I direttamente nel mix di reazione per la rimozione del DNA del modello. Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g.
  5. Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min a 400 rpm su un mixer termico. Prendere una aliquota di 2 gradi per il gel di controllo (passaggio 3.3) e conservare a -80 gradi centigradi.
  6. Per la coda poli(A), aggiungere i seguenti componenti direttamente nella miscela di reazione precedente (ad un volume finale di 50:L): 5 l of 10x poly(A) polymerase remerase reammae (entrambi inclusi nel kit di trascrizione in vitro mRNA). Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g.
  7. Incubare il mix a 37 gradi centigradi per 30 min a 400 giri/m su un termomixer. Prendere una aliquota di 2 gradi per il gel di controllo (passaggio 3.3) e conservare a -80 gradi centigradi.
  8. Per la depforosofolazione delle estremità a 5 o più estremità dell'mRNA, aggiungere i seguenti componenti direttamente nella miscela di reazione precedente (ad un volume finale di 60 : 3 L di L2O senza RNAse; 6 - L di 10 volte buffer di reazione al fosfoculo articolare; 3 - L di fosfofofasi antartico (15 unità per 60 volume di reazione). Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g.
  9. Incubare il mix a 37 gradi centigradi per 30 min a 400 giri/m su un miscelatore termico.
  10. La fosfofasi antartica per incapacità di calore a 80 gradi centigradi per 2 minuti.
    NOT: Idealmente, utilizzare un mixer termico separato, non attendere fino a quando il primo mixer raggiunge la temperatura desiderata.

3. Purificazione dell'mRNA

  1. Purificare l'mRNA trascritto in vitro utilizzando un kit di purificazione dell'RNA dedicato (Tabella dei materiali).
    1. Aggiungere X :L della soluzione di eluizione al mix di reazione mRNA dal punto 2.10. Mescolare invertendo 5 volte. Aggiungere 300 l di concentrato di soluzione di binding. Mescolare con pipettaggio delicato 5 volte.
      NOT: X è il volume di riserva ad un volume totale di 100 l. Ad esempio, aggiungere una soluzione di eluzione di 40 ll al mix di reazione mRNA di 60.
    2. Aggiungete 100 l di etanolo senza RNAase. Mescolare con pipettaggio delicato 5 volte.
    3. Posizionare una colonna di filtro in uno dei tubi di raccolta forniti. Trasferire delicatamente la miscela di reazione mRNA al centro del filtro senza toccare il filtro. Centrifuga a 15.000 x g per 1 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Sollevare con attenzione la colonna del filtro e scartare il flow-through nel tubo di raccolta. Riportare la colonna del filtro nello stesso tubo di raccolta.
    5. Aggiungere 500 l di soluzione di lavaggio (non dimenticate di aggiungere 20 mL di etanolo senza RNAase prima di utilizzare la soluzione di lavaggio per la prima volta).
    6. Centrifuga a 15.000 x g per 1 min a RT. Ripetere i passaggi 3.1.4-3.1.6 per lavare ancora una volta.
    7. Centrifuga a piena velocità (17.900 x g) per 1 min a RT per rimuovere qualsiasi fluido residuo dalla colonna filtro. Prendere con attenzione la colonna del filtro dal tubo di raccolta. Posizionare la colonna del filtro in un nuovo tubo di raccolta.
    8. Aggiungere 50 l di tampone di eluizione al centro del filtro senza toccare il filtro. Incubare a 65 gradi centigradi per 10 min su un mixer termico.
    9. Centrifuga a 15.000 x g per 1 min a RT. Rimuovere la colonna del filtro e scartarla.
  2. Misurare la concentrazione e la purezza dell'mRNA eluito, ad esempio, utilizzando uno spettrometro a microvolume per misurare l'assorbimento a 260 e 280 nm.
    NOT: Un rapporto A260/A280 di 1,8-2,1 è indicativo di mRNA altamente purificato.
  3. Verificare la presenza di un singolo prodotto, la lunghezza corretta della trascrizione e la coda poli(A) analizzando le aliquote dai passaggi 2.5 e 2.7 da un'elettroforesi gel agarose in condizioni di denatura (ad esempio, utilizzare un gel di agarose dell'1,2% contenente 20 mM 3-(N-morpholino) acido propanesulfonico [MOPS], acetato di sodio 5 mM, 1 mM EDTA e 20% di formaldeide ed eseguito in 20 mM MOPS, acetato di sodio 5 mM, 1 mM EDTA e 0.74 % formaldeide a 100 V corrente costante).
  4. Conservare l'mRNA purificato nel tubo di eluizione a -80 gradi centigradi fino alla trasfezione. Se si utilizzano solo quantità basse di mRNA per la trasfezione, l'mRNA è aliquota per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
    NOTA: l'mRNA può essere conservato a -80 gradi centigradi per circa 1 anno.

4. Preparazione del macrofago

  1. Topi eutanasia C57/BL6 (utilizzare topi dello stesso sesso e di 6-24 settimane di età) per lussazione cervicale.
    NOT: Gli stessi mouse possono essere utilizzati per l'isolamento di PM (passaggio 4.2) e generazione di BMDM (passaggi 4.3 e 4.4). Per l'isolamento di PM utilizzare almeno due topi. Se solo BMDM devono essere generato un mouse di solito è sufficiente.
  2. Arricchimento immunomagnetico di macrofagi peritoneali.
    1. Riempire una siringa da 10 mL con una cannula da 0,9 x 40 mm con 8 mL di salina con buffer di fosfato ghiacciato (PBS) e 2 mL di aria. Svuotare la cavità peritoneale con PBS. L'aria formerà una bolla che riduce al minimo la perdita di PBS.
    2. Raccogli rapidamente la lavanda peritoneale con la stessa siringa e trasferiscila in un tubo di centrifugazione conica da 50 ml. Combinare cellule peritoneali di più topi, se necessario. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
    3. Sospensione delle cellule centrifuga a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di 0,2 % NaCl per 30 s per lizzare i globuli rossi.
    4. Aggiungere 5 mL dell'1,6% NaCl ad un volume totale di 10 mL per ricostituire le condizioni isotoniche. Centrifuga a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
    5. Eliminare il supernatante e rimettere in sospensione il pellet cellulare in 97,5 ll di tampone di sbarramento delle cellule magnetiche (MCS) (2 mM di acido etilenediaminetracetraacetico [EDTA], 5% di albumina di siero bovino [BSA] in PBS) per 1 lavage peritoneale (ad esempio, se tre topi sono stati lavati, risolare in 292.5L) per 1 lavage peritoneale (ad esempio, se tre topi sono stati lavati, risospendere in 292.5L ).
    6. Aggiungete 2,5 lofazioni di perline paramagnetiche coniugate a un anticorpo specifico di CD11b per 97,5 gradi di sospensione cellulare (ad es., aggiungete 7,5 l a 292,5 l).
    7. Incubare sul ghiaccio per 15 min a 150 rpm su uno shaker orbitale.
    8. Centrifuga sospensione cellulare a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatale e rimettere in sospensione il pellet cellulare in 1 mL di buffer MCS.
    9. Aggiungere 4 mL di buffer MCS per un volume totale di 5 mL e lavare le cellule pipetting su e giù delicatamente tre volte.
    10. Ripetere i passaggi 4.2.8 e 4.2.9 altre due volte per un totale di tre passaggi di lavaggio.
    11. Durante i passaggi di lavaggio posizionare una colonna LS in un separatore di celle magnetiche (vedere Tabella dei materiali). Risciacquare la colonna con 3 mL di buffer MCS.
      NOT: Evitare eventuali bolle in quanto questi possono ostare la colonna.
    12. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di buffer MCS. Aggiungere 3 mL di buffer MCS ad un volume totale di 4 mL, mescolare conilare su e giù tre volte.
    13. Trasferire i 4 mL di sospensione cellulare sulla colonna LS risciacquata.
      NOT: Anche in questo caso, evitare eventuali bolle in quanto questi possono ostare la colonna.
    14. Attendere che il serbatoio della colonna sia completamente vuoto. Non aggiungere ulteriore fluido fino a quando la colonna non smette di gocciolare.
    15. Aggiungere 3 mL di buffer MCS nella colonna. Quindi, attendere che il serbatoio della colonna sia completamente vuoto. Ripetere il passaggio 4.2.15 altre due volte.
    16. Posizionare la colonna LS in un tubo di centrifugazione conico da 15 mL. Applicare 5 mL di buffer MCS sulla colonna. Attendere fino a quando 2 mL di liquido è passato attraverso la colonna, quindi utilizzare lo stantuffo per spingere delicatamente la frazione rimanente nel tubo.
    17. Centrifuga sospensione cellulare a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante.
    18. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM integrato con il 10% di siero di vitello fetale inattivato dal calore (FCS) (DMEM-FCS).
    19. Determinare il numero di cellule vitali contando in soluzione blu trypan in una camera di conteggio Neubauer e celle di semi in DMEM-FCS in piastre di coltura.
      NOT: Seme PM ad una densità di 100.000 cellule / pozzo in una piastra di microtitolto piatto inferiore. Non utilizzare piastre trattate con coltura tissutale come PM non può essere staccato da questi. Utilizzare invece piastre non trattate.
  3. Generazione di BMDM
    1. Rimuovere la pelle e i muscoli dalle zampe posteriori utilizzando un paio di forbici. Lavare ogni gamba con un'immersione corta nel 70% di etanolo.
    2. Staccare le gambe e aprire entrambe le estremità del femore e la tibia tagliando con le forbici.
    3. Riempire una siringa da 5 mL riempita con una cannula da 0,6 mm x 30 mm con 5 mL di endotossina molto bassa (VLE) RPMI 1640 e sciacquare il midollo osseo dalle ossa aperte in un piatto di coltura.
    4. Combinare il midollo osseo di più topi se necessario ripetendo i passaggi 4.3.1-4.3.3. Trasferire il midollo osseo in un tubo di centrifugazione conico da 50 ml.
    5. Centrifugare la sospensione del midollo osseo a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante.
    6. Risospendere il pellet delle cellule in 5 mL di lisi di lissi del globulo rosso (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) e incubare per 5 min a RT per lassizzare i globuli rossi.
    7. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g a 4o C per 5 min e scartare il supernatante.
    8. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di VLE RPMI 1640 medio integrato con 10% FCS, 1% penicillina/streptomycin, 1% HEPES, 1% pyruvate di sodio e 10 ng/mL recombinante macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) (RP
    9. Aggiungere 4 mL diRPMI a un volume totale di 5 mL.
    10. Preparare 5 piatti Petri non trattati da 92 mm x 16 mm con camme (vedere la Tabella dei Materiali)per mouse con il pipetting di 7 mL diRPMI in ogni piatto.
    11. Trasferire la soluzione cellulare di 1 mL nei 5 piatti di coltura preparati e incubare a 37 e 5% CO2.
    12. Dopo 4 giorni, alimentale aggiungendo 4 mL diRPMI. Dopo 6-7 giorni, le cellule del midollo osseo sono completamente differenziate in BMDM.
  4. Raccolta di BMDM
    1. Rimuovere completamente il mezzo dai piatti di coltura. Aggiungere 5 mL di EDTA caldo da 0,2 mM in PBS ad ogni piatto.
    2. Raschiare delicatamente l'intera piastra con un raschietto cellulare per staccare il BMDM. Combinare le sospensioni cellulari in un tubo di centrifugazione conico da 50 mL.
    3. Sciacquare di nuovo tutti e 5 i piatti. Utilizzare lo stesso volume di 5 mL di CALDO 0.2 mM EDTA in PBS per tutti e 5 i piatti. Combina questa sospensione cellulare con quella del passaggio precedente.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g per 5 min a 4o C e scartare il supernatante.
    5. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di VLE RPMI 1640 medio integrato con 10% FCS, 1% HEPES, 1% pironeva di sodio e10 ng/mL ricombinante M-CSF ma senza antibiotici (RPMI )
    6. Determinare il numero di celle vitali contando in soluzione blu trypan in una camera di conteggio Neubauer e le cellule di semi inRPMI .
      NOT: Seme BMDM ad una densità di 50.000 cellule/ pozzo massimo in una piastra di microtitolazione piatta inferiore. Non utilizzare piastre trattate con la coltura dei tessuti come BMDM difficilmente può essere staccato da questi. Utilizzare invece piastre non trattate.

5. Trasfezione di macrofagi con mRNA

  1. Calcolare il volume richiesto del buffer di trasfezione mRNA.
    NOT: Il volume del buffer di trasfezione dell'mRNA richiesto dipende dalle dimensioni del pozzo: utilizzare 200 -L per la trasfezione in una piastra di 6 pozze, 100 l in una piastra di 12 pozze e così via. Aggiungere sempre un po 'di volume di ricambio a causa della perdita di pipettaggio (ma non troppo, per prevenire la diluizione indebita di mRNA). Ad esempio, utilizzare 450 L invece di 4 x 100 L - 400 L per trasfecare in 4 pozzetti di una piastra di 12 pozzetti.
  2. Calcolare il volume richiesto del reagente di trasfezione mRNA. Il reagente di trasfezione mRNA viene aggiunto a un rapporto di 1:50. Ad esempio, per un volume finale di 450 l è necessario 9 L di reagente di trasfezione di mRNA.
  3. Calcolare la quantità totale di mRNA necessaria. Almeno 100 ng per 100.000 macrofagi sono necessari per una trasfezione efficiente, 200 ng funziona ancora meglio (ad esempio, 800 ng mRNA a transfect 400,000 macrofagi).
    1. Moltiplicare la quantità calcolata di mRNA necessaria con il numero totale di pozzi che devono essere trasfettati (ad esempio, 4 pozzi con 400.000 macrofagi ciascuno: 4 x 800 ng x 3.200 ng mRNA è richiesto in totale per tutti i pozzi). Ad esempio, se il vostro stock di mRNA è 426,8 ng/L, sono necessari 7,49 gradi per una trasfezione ottimale di 4 pozzi con 400.000 macrofagi ciascuno.
  4. Aggiungere il volume calcolato del buffer di trasfezione mRNA (passaggio 5.1.) meno i volumi per il reagente di trasfezione mRNA (passaggio 5.2) e l'mRNA (passaggio 5.3) a un tubo di reazione. Ad esempio, 450 l - 9 - L - 7,49 -L - 433,51 l.
  5. Scongelare il supporto mRNA e mescolare con un leggero capovolgimento del tubo di eluizione. Aggiungere il volume calcolato di mRNA (passaggio 5.3) al tubo di reazione con buffer di reazione mRNA (nell'esempio sopra riportato: 7,49 L in 433,51 .
  6. Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g.
  7. Vortice il reagente di trasfezione mRNA per 5 s e spin down per 2 s a 2.000 x g.
  8. Aggiungere il volume calcolato del reagente di trasfezione mRNA (passaggio 5.2) al tubo di reazione contenente il buffer di trasfezione mRNA e l'mRNA (nell'esempio sopra presentato: 9 -L di reagente di trasfezione mRNA).
  9. Vorticare il mix di trasfezione per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g.
  10. Incubare per 15 min a RT.
  11. Nel frattempo, sostituire il mezzo di coltura dei macrofagi con un mezzo di coltura fresco e caldo (vedere i passaggi 4.2.18. e 4.4.5).
  12. Dopo la fase di incubazione 5.10, aggiungere il mix di trasfezione ai pozze contenenti i macrofagi in un volume appropriato per le dimensioni del pozzo (vedere il passaggio 5.1). Aggiungere la miscela di trasfezione dropwise in un cerchio dall'esterno al centro del pozzo.
  13. Rocciare delicatamente la piastra, prima in verticale e poi in direzione orizzontale per garantire una distribuzione uniforme del mix di trasfezione nel pozzo. Quindi, incubare a 37 e 5 % CO2. La sintesi della proteina codificata dall'mRNA transfetgiato inizierà poco dopo la trasfezione. Per ottenere i migliori risultati, incubare per almeno 6 h.
  14. Dopo l'incubazione, analizzare l'efficienza della trasfezione mediante microscopia (immuno)fluorescenza, citometria di flusso o immunoblot16,oppure utilizzare i macrofagi trafitti per l'esperimento di scelta.

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Representative Results

Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare la codifica mRNA per le varianti NEMO e IKK per la trasfezione dei macrofagi primari16. La codifica plasmids per il tipo selvaggio con tag FLAG (NEMOWT) e il tipo di mutante C54/347A NEMO (NEMOC54/374A) (si veda la Tabella dei Materiali) contengono già un promotore T7 nell'orientamento corretto ( Figura1A). Così, abbiamo dovuto solo linearizzare i plasmidi per generare modelli di DNA per la trascrizione in vitro. A tal fine, sono stati digeriti 10 g di DNA plasmide con 5 Xbal con conseguente linearizzazione del plasmide a causa di un solo taglio 3' del codone di stop. La linearizzazione completa del DNA plasmide è stata verificata dall'elettroforesi gel di agarose (Figura 1B).

La codifica plasmids per il tipo selvaggio con tag FLAG (IKK -WT) e la mutante S177/181E IKK (IKK -S177/181E) non contengono un promotore T7. Pertanto, abbiamo collegato un promotore T7 da PCR per generare i modelli di DNA per la trascrizione in vitro (Figura 2A). La generazione di un prodotto PCR specifico, vale a dire un singolo prodotto di dimensioni corrette, è stata verificata dall'elettroforesi gel di agarose (Figura 2B).

Dopo la trascrizione in vitro utilizzando i rispettivi modelli di DNA, abbiamo verificato la generazione di un singolo prodotto mRNA di dimensioni corrette e coda poli(A) da elettroforesi gel agarose in condizioni di denatura (Figura 3).

Per verificare che l'mRNA generato utilizzando questo protocollo consenta la trasfezione dei macrofagi primari (vedere la figura 4A,B per le analisi citometriche di flusso dell'arricchimento immunomagnetico del PM e dello stato di differenziazione del BMDM), abbiamo generato la codifica mRNA per eGFP (Figura 5A-C) e analizzato l'efficienza della trasfezione per citometria di flusso (Figura 6A). 100.000 PM o 50.000 BMDM per pozzo di una piastra di microtitola non trattata sono stati trascate con 50, 100 o 200 ng di mRNA eGFP per 6, 9 o 24 h. Sia in PM che in BMDM, alti livelli di espressione eGFP potrebbero essere rilevati a 6 h dopo la trasfezione. Il tasso di trasfezione è aumentato con la quantità di mRNA transinfetto ed è stato più alto per 200 ng mRNA (Figura 6B,C). Per PM, tasso di trasfezione raggiunto circa 50-65% a 6 a 9 h dopo la trasfezione (Figura 6B). A 24 h dopo la trasfezione, il tasso di trasfezione era sostanzialmente inferiore indicando l'espressione eGFP in scadenza. Pertanto, PM non deve essere trasinfezione durante la notte. Per BMDM, il tasso di trasfezione ha raggiunto circa l'80-85%(Figura 6C). Il calo del tasso di trasfezione dopo 24 h è stato molto meno pronunciato in BMDM. Così, BMDM può essere trasinfezione durante la notte. In entrambi i valori PM (Figura 6D,E) e BMDM (Figura 6F,G), il livello di espressione di eGFP nelle cellule trasfetate è aumentato in modo dipendente dal tempo e dalla dose. È importante sottolineare che la procedura di trasfezione non ha indotto la morte delle cellule littiche o apoptotiche in quanto non vi è stato alcun aumento dei macrofagi positivi propidio iodio positivo (PI) o di annessione V dopo la trasfezione (Figura 7A,B).

L'efficienza della trasfezione della codifica mRNA per le varianti NEMO o IK, con tag FLAG, è stata analizzata mediante microscopia immunofluorescenza. 300.000 PM per pozzo di una piastra di 12 pozzetti sono stati trasfettati con 300 ng di mRNA rispettiva per 6 h. Tasso di trasfezione era di circa il 60% per NEMO mRNA e circa il 55% per IKK mRNA(Figura 8A,B). Pertanto, i loro tassi di trasfezione erano simili a quelli dell'mRNA eGFP che indicava un tasso di trasfezione generale di circa il 55% per la PM.

Abbiamo anche usato questo protocollo per generare la codifica mRNA per Cre ricombinase. La trasfezione di 400.000 BMDM da topineMO flox/flox 17 per pozzo di una piastra di 12 pozzetti con 400 ng di mRNA ricombinante Cre ha portato all'esaurimento quasi completo della proteina NEMO dopo 48 h (Figura 9) indicando una trasfezione altamente efficiente del BMDM.

PM e BMDM non hanno secerneto alcuna quantità rilevabile di IL-1, IL-6 e TNF dopo la trasfezione (Figura 10A,B). Inoltre, le vie di segnalazione NF-kB e MAPK non sono state attivate dopo la trasfezione16, indicando che la procedura di trasfezione non attiva la segnalazione infiammatoria. Inoltre, non abbiamo osservato alterazioni funzionali dei macrofagi trasfettati rispetto ai macrofagi non trastrafazione16.

Figure 1
Figura 1: Linearizzazione dei plasmidi di codifica NEMO che contengono già un promotore T7 nell'orientamento corretto. (A) Sequenza estratto della codifica plasmid per la codifica CON tag FLAG NEMOWT o NEMOC54/347A. Un promotore T7 nell'orientamento corretto e vicino alla sequenza KO-AK e all'inizio del codon è già presente. La regione promotore T7, la sequenza di codifica (CDS) per il tag FLAG e NEMO, i codoni start e stop e il sito di restrizione per la linearizzazione con XbaI sono codificati a colori. (B) Rappresentante 1% gel di agarose che mostra i plasmidi prima e dopo la linearizzazione con Xbal; 1 -L di DNA plasmide linearizzato non trattato, linearizzato o purificato è stato caricato per corsia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: l'attacco promotore T7 ai plasmidi codificai iKK da PCR. (A) Sequenza estratto della codifica plasmid per la codifica con tag FLAG IK ,WT o IKKS177/181E. I plasmidi non contengono un promotore T7 adatto, che è quindi collegato da PCR. Posizione, orientamento e sequenza del primer in avanti (contenente la sequenza promotore T7 da aggiungere) e il primer inverso sono indicati dalle frecce. La regione promotore T7, il CDS per il tag FLAG e l'IKK, e i codoni start and stop sono codificati a colori. (B) Rappresentante 1% gel agarose verificando la generazione di un singolo prodotto PCR di dimensioni corrette utilizzando le primer sopra indicate. 1 - L del prodotto PCR purificato è stato caricato per corsia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: sintesi di mRNA da modelli di DNA codificati NEMO e IKK. (A) Rappresentante di denaturazione dell'1,2% di gel di agarose contenente lo 0,7% di formaldeide che mostra l'mRNA purificato dei costrutti NEMO e IKK, prima e dopo il tailing poli(A). 2 -L di NEMOWT, NEMOC54/347A, IKKWT e IKKKS177/181E mRNA sono stati caricati per corsia. È stato caricato un modulo ssRNA di 32 luna per la determinazione della lunghezza dell'RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Analisi citometriche di flusso dell'arricchimento immunomagnetico del PM e dello stato di differenziazione del BMDM. (A) La percentuale di F4/80-/CD11b- PM nel lavanda peritoneale prima e dopo l'arricchimento immunomagnetico è stata analizzata dalla citometria di flusso. (B) L'espressione di F4/80 e CD11b da parte di BMDM dopo 6 giorni di differenziazione è stata verificata dalla citometria di flusso. sono state conteggiate 10.000 o 5.000 cellule per campione, rispettivamente. I dati sono mostrati come media : SEM di n - 3 esperimenti indipendenti, ciascuno. - P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001 e P < 0.0001 dal test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: sintesi di mRNA con coda poli(A) di eGFP. (A) Sequenza estratto della codifica plasmid per eGFP. Il plasmide non contiene un promotore T7 adatto, che è quindi collegato da PCR. Posizione, orientamento e sequenza del primer in avanti (contenente la sequenza promotore T7 da aggiungere) e il primer inverso sono indicati dalle frecce. La regione promotore T7, il CDS per eGFP e i codoni start and stop sono codificati a colori. (B) Rappresentante 1% gel di agarose che mostra l'amplificatore purificato dopo PCR utilizzando i primer sopra indicati. 1 - L del prodotto PCR purificato è stato caricato per corsia. (C) Rappresentante di denaturazione dell'1,2% di gel di agarose contenente lo 0,7% di formaldeide che mostra l'mRNA purificato di eGFP prima e dopo la coda poli(A). 2 -L di mRNA eGFP sono stati caricati per corsia. È stato caricato un modulo ssRNA di 32 luna per la determinazione della lunghezza dell'RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Trasfezione altamente efficiente di entrambi i macrofagi peritoneali e BMDM con mRNA eGFP. I macrofagi sono stati incubati per 6, 9 o 24 h con 50, 100 o 200 ng di mRNA eGFP complessi a jetMESSENGER o con jetMESSENGER da solo (mock) e poi analizzati dalla citometria di flusso. (A) Strategia Gating utilizzata per definire le popolazioni di macrofagi vitali, eGFP vitali, macrofagi e PI(cioè morti) macrofagi. Vengono visualizzati i dati rappresentativi per la trasfezione con 200 ng mRNA per 6 h. (B, C) I tassi di trasfezione di (B) PM e (C) BMDM sono stati determinati analizzando la percentuale di cellule eGFP-positive vitali per citometria di flusso (n , 5-7 e n - 4-5 esperimenti indipendenti, rispettivamente). (D-G) I livelli di espressione di eGFP sono stati determinati analizzando l'intensitàmedia della fluorescenza (MFI) di 19- PM e(F)BMDM e di quelli perlati ed eGFP-positivi rispettivamente di (E) PM e(G)BMDM (n - 5-7 e n - 4-5 esperimenti indipendenti). Sono state conteggiate 10.000 cellule per campione. I dati vengono visualizzati come media : SEM. n.s. non significativo; - P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001 e P < 0.0001 dal test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: La trasfezione non induce la morte delle cellule littiche o apoptotiche. La morte cellulare indotta dalla trasfezione di (A) PM e(B) BMDM è stata determinata analizzando la percentuale di cellule PI-positive e allegato V-positive (n , 5-7 e n - 4-5 esperimenti indipendenti, rispettivamente). La percentuale di macrofagi morti presenti in campioni non transettati (un certo grado di morte cellulare è stata causata dal distacco fisico dei macrofagi dai pozzi nonostante l'uso di placche non trattate) è stata sottratta da quella dei rispettivi campioni transfettati per tener conto solo della morte cellulare indotta dalla procedura di trasfezione. La strategia di gating utilizzata per definire le popolazioni di PI,di annessinaV e PI,/annexin Ve macrofagi, è illustrata per un set rappresentativo di dati di PM trasinfezione con 200 ng mRNA per 6 h. La staurosporina (50 m per 1 h) è stata usata come controllo positivo. Sono state conteggiate 10.000 cellule per campione. I dati vengono visualizzati come media : SEM. n.d. - non rilevabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Tassi di trasfezione utilizzando la codifica mRNA per i costrutti NEMO e IKK. I tassi di trasfezione utilizzando la codifica dell'mRNA per i costrutti NEMO(A) e i costrutti IKK(B)sono stati quantificati dalla microscopia immunofluorescenza (n - 4 esperimenti indipendenti). Barra della scala : 4 m. I dati sono indicati come media : SEM. n.t. - non trascurato, n.s. - non significativo; - P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001 e P < 0.0001 dal test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: La trasfezione di NEMOfl/fl BMDM con codifica mRNA per la ricombinante Cre produce una carenza quasi completa per NEMO. La bMDM dei topi fl/fl NEMO sono stati trafitti con codifica mRNA Cre recombinase per 48 h. La carenza di proteine NEMO a seguito di un knockout mediato da Cre è stata valutata da macchie occidentali utilizzando anticorpi specifici che riconoscono NEMO o z-actin e quantificati dalla densitometria (n . 5 esperimenti indipendenti). I dati vengono visualizzati come valore : SEM. , P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001 e P < 0,0001 dal test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: La trasfezione non induce una risposta infiammatoria. (A) PM e(B) BMDM sono stati transinfettati con codifica mRNA per NEMOWT o NEMOC54/347A. Come controllo positivo, i macrofagi sono stati infettati da Listeria monocytogenes a molteplicità di infezione di 1 o stimolati con 5 G/mL LPS o poly(I:C) per 5 h (PM) o 24 h (BMDM). La secrezione di IL-1, IL-6 e TNF nel supernatore è stata quantificata da ELISA (n. 3 esperimenti indipendenti). I dati vengono visualizzati come media: SEM. n.t. - non transfettati, n.d. - non rilevabili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui presentiamo un protocollo per la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari solitamente difficili da raggiungere con mRNA tranincato in vitro. È importante sottolineare che la trasfezione dei macrofagi utilizzando questo protocollo non induce la morte cellulare né attiva la segnalazione infiammatoria che indica che né il reagente di trafezione né l'mRNA trascurato sono riconosciuti come non-sé.

La qualità dell'mRNA è di fondamentale importanza per la trasfezione di successo dei macrofagi utilizzando questo protocollo. Occorre quindi fare molta attenzione al fatto che l'mRNA non entri in contatto con gli RNA (ad esempio, attraverso tamponi o fiale contaminate). In caso di dubbio, verificare la degradazione dell'mRNA (ad esempio, da elettroforesi gel agarose). Il tasso di trasfezione e il livello di espressione erano già massimi a 6 h dopo la trasfezione. Pertanto, è possibile che la proteina di interesse sia espressa a livelli sufficienti per l'analisi in punti precedenti dopo la trasfezione. Non abbiamo testato questo, però. Inoltre, la traduzione di grandi quantità di mRNA può aumentare ulteriormente il tasso di trasfezione e/o il livello di espressione. Tuttavia, la traduzione di grandi quantità di mRNA può potenzialmente portare anche a un certo grado di immunogenicità o addirittura di citotossicità. La sua totale mancanza è uno dei principali vantaggi di questo protocollo. Pertanto, se si vogliono trafettare grandi quantità di mRNA, l'immunogenicità e la citotossicità devono essere valutate attentamente.

Livello di espressione chiaramente correlato con la quantità di mRNA transinfetto. Tuttavia, la rielezione di NEMO in BMDM CARETa di NEMO ha portato a un'espressione proteica NEMO simile a quella del tipo selvatico BMDM16 che indica che la trasfezione di mRNA usando questo protocollo non porta a una sostanziale sovraespressione della proteina di interesse. Pertanto, questo protocollo potrebbe non essere adatto a studiare le conseguenze della sovraespressione della proteina di interesse. Consideriamo piuttosto questo un vantaggio, tuttavia, come sovraespressione di una proteina spesso altera il suo comportamento.

La principale limitazione della trafezione dell'mRNA, in generale, è che si traduce solo nell'espressione transitoria della proteina di interesse (perché l'mRNA generato e trasinfezione utilizzando questo protocollo sarà soggetto a un normale turnover). PM sembrano esprimere la proteina di interesse per un periodo di tempo più breve rispetto alla BMDM. Pertanto, a differenza di BMDM, PM non dovrebbe essere trasinfezione durante la notte. La durata di una determinata proteina di interesse varierà (poiché sia la stabilità dell'mRNA che quella della proteina varieranno). Si consiglia tuttavia di eseguire l'esperimento di scelta nello stesso giorno della trasfezione. Se l'espressione della proteina di interesse è necessaria per periodi di tempo più lunghi, le cellule possono probabilmente essere trasfetate più volte (ad esempio, ogni giorno come descritto in18).

Abbiamo utilizzato con successo il protocollo descritto qui per trasfect murine PM e BMDM e topi fibroblasti embrionali (MEF)16. In teoria, l'mRNA generato utilizzando questo protocollo può essere utilizzato per trasfecare qualsiasi tipo di cellula di qualsiasi specie di mammiferi. Il reagente ottimale di trasfusione di mRNA e il contenuto dei nucleosides modificati possono differire per altri tipi di cellule, però.

Le modifiche future promettenti includono l'inclusione delle UDR da 5 e 3'. La maggior parte dei plasmidi preesistenti contiene solo i CCD della proteina di interesse, ma non i 5' e 3'-UTR. La loro inclusione (come descritto nel19) può migliorare ulteriormente la stabilità e l'espressione dell'mRNA. Inoltre, è possibile collegare tag dell'epitopo alla proteina di interesse includendo semplicemente la sequenza del tag epitope nel primer in avanti o inverso (rispettivamente per l'etichetta epitopo n e terminale C.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

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References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

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