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Immunology and Infection

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Abstract

Los macrófagos son células fagocíticas especializadas en la detección de moléculas de origen no propio. Con este fin, están equipados con una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar, ya que el reactivo de transfección y los ácidos nucleicos transinfectados a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por lo tanto, la transfección a menudo resulta en la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transinfectados o incluso en el suicidio de los macrófagos. Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios murinos como macrófagos peritoneales (PM) y macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con ARNm en vitro transcrito a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Con este sencillo protocolo, se alcanzan tasas de transfección de aproximadamente 50-65% para PM y de aproximadamente 85% para BMDM sin citotoxicidad ni inmunogenicidad observada. Describimos en detalle la generación de ARNm para la transfección a partir de construcciones de ADN como plásmidos y el procedimiento de transfección.

Introduction

Los macrófagos son células fagocíticas que se especializan en la detección, ingesta y degradación de microbios, células apoptóticas y desechos celulares. Además, ayudan a orquestar las respuestas inmunitarias secretando citoquinas y quimioquinas y presentando antígenos a las células T y células B. Los macrófagos también desempeñan un papel importante en numerosos otros procesos, como la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, la tumorigenesis y la obesidad.

Para poder detectar moléculas no propias, como los patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) y las moléculas fuera de lugar, como los patrones moleculares asociados al daño (DAPP), los macrófagos están equipados con una amplia gama de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)1. Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar2 como el reactivo de transfección3 y los ácidos nucleicos transinfectados4,5,6,7 a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por esta razón, la transfección de macrófagos utilizando métodos químicos o físicos8 suele dar lugar a la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transcijos o incluso en el suicidio de macrófagos a través de la piroptosis, una forma de muerte celular lítica programada desencadenada después del reconocimiento de Los PamP/DMIP citosólicos, como el ADN o el ARN extraño9. La transfección biológica de macrófagos utilizando virus como adenovirus o lentivirus como vectores es a menudo más eficiente, sin embargo, la construcción de estos vectores virales es lenta y requiere equipos de nivel 2 de bioseguridad10,11.

Así, aunque los macrófagos son objeto de una intensa investigación, el análisis de sus funciones a nivel molecular se ve obstaculizado porque una de las herramientas más importantes de la biología molecular, la transfección de construcciones de ácido nucleico para la expresión exógena de proteínas, no es aplicable. Esto a menudo obliga a los investigadores a utilizar líneas celulares similares a macrófagos en lugar de macrófagos de buena fe. Las aplicaciones para la transfección de construcción de ácido nucleico incluyen la expresión de versiones de proteínas mutadas o etiquetadas, la sobreexpresión de una proteína específica, la reexpresión de proteínas en un fondo de eliminatoria respectivo y la expresión de proteínas de otras especies (por ejemplo. , Cre recombinase o ARN guía y Cas9 para el knockout genético dirigido).

Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios (generalmente difíciles de transfectar), es decir, macrófagos peritoneales murinos (PM) y macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) con ARNm generado a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Es importante destacar que el ARNm transcrito in vitro generado con este protocolo contiene los nucleósidos modificados de origen natural 5-metil-CTP y pseudo-UTP que reducen la inmunogenicidad y mejoran la estabilidad4,6,7,12,13. Además, los 5'-extremos del ARNm transcrito in vitro son desfosforilados por la fosfatasa antártica para evitar el reconocimiento por el complejo RIG-I14,15. Esto minimiza el reconocimiento inmune innato del ARNm transcrito in vitro. Con nuestro protocolo fácil de realizar, se alcanzan tasas de transfección entre 50-65% (macrófagos peritoneales (PM)) y 85% (BMDM) mientras que, lo que es importante, no se observacitotoxicidad ni inmunogenicidad. Describimos en detalle (i) cómo el ARNm silenciado inmunológicamente para la transfección se puede generar a partir de construcciones de ADN como plásmidos y (ii) el propio procedimiento de transfección.

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Protocol

El aislamiento de macrófagos de ratones se realizó de conformidad con la Ley de Protección Animal de Alemania en cumplimiento con el Comité de ética de la Universidad de Colonia.

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos con guantes. Llevar a cabo todos los pasos de transfección bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las células. Antes de trabajar con ARNm, limpie todos los instrumentos, como pipetas y todas las superficies con un 70% de etanol y/o un tensioactivo degradante de la ANR(Tabla de materiales). Asegúrese de que todos los tubos de reacción estén libres de ARSa y estériles. Utilice únicamente agua estéril y libre de ARGanase para diluirlas. Utilice exclusivamente puntas de pipeta con filtros. Cambie las puntas de las pipetas después de cada paso de pipeteo.

1. Generación de la plantilla de ADN

NOTA: La plantilla de ADN para la transcripción in vitro de ARNm utilizando este protocolo debe contener una secuencia promotora T7 para permitir el acoplamiento de la ARN polimerasa. Si el plásmido que contiene la secuencia de ADN de la proteína de interés ya contiene una secuencia promotora T7 correctamente orientada directamente aguas arriba de la secuencia de interés, es necesario realizar la linealización del plásmido (véase el paso 1.1.). De lo contrario, adjunte un promotor T7 a la secuencia de interés por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, véase el paso 1.2.).

  1. Linealización de plásmidos que contienen promotores T7
    1. Linealizar los plásmidos que ya contienen una secuencia promotora T7 correctamente orientada por digestión con una enzima de restricción que reduce aguas abajo del codón de parada de la secuencia de interés. De lo contrario, la transcripción no finalizará correctamente después de la secuencia de interés.
      NOTA: Es mejor utilizar enzimas de restricción dejando extremos contundentes o voladizos de 5'.
    2. Confirmar la linealización completa del plásmido por electroforesis de gel de agarosa del ADN de plásmido no digerido frente a digerido.
    3. Purificar el ADN de plásmido linealizado antes de utilizarlo como plantilla de ADN para la transcripción in vitro de ARNm utilizando un kit de purificación de ADN(Tabla de materiales).
  2. Adjunto del promotor T7 por PCR
    1. Utilice una imprimación directa que contenga los siguientes componentes (en el orden indicado de 5' a 3'): aproximadamente 5 bp al azar aguas arriba del promotor (por ejemplo, GAAAT); la secuencia promotora T7 (TAATACGACTCACTATAG); dos G adicionales para una mayor eficiencia de transcripción (GG); la parte específica de la secuencia objetivo que es homóloga a la secuencia plásmida que rodea el codón de inicio.
      NOTA: Debe estar compuesto por: 3-6 bp aguas arriba de la secuencia KOZAK e iniciar el codón, la secuencia KOZAK y iniciar el codón (generalmente GCCACC ATG G), 12-18 bp aguas abajo del codón de inicio. Si la secuencia de interés aún no contiene una secuencia KOZAK o iniciar codón, estos se pueden adjuntar en este paso simplemente incluyéndolos en la secuencia de imprimación.
    2. Calcule el tm de la imprimación delantera sólo teniendo en cuenta la parte homóloga a la secuencia de destino.
    3. Para evaluar la formación de dimers/hairpin utilice toda la secuencia de imprimación, que puede superar fácilmente los 50 bp.
    4. Utilice una imprimación inversa situada en algún lugar aguas abajo del codón de la parada.
      NOTA: Si la secuencia de interés aún no contiene un codón de parada, se puede adjuntar en este paso simplemente incluyéndolo en la secuencia de imprimación.
    5. Utilice las imprimaciones delantera e inversa para realizar una PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad con corrección(Tabla de materiales).
    6. Confirme la generación de un solo producto y tamaño de amplicon por electroforesis de gel de agarosa (por ejemplo, utilice un gel de agarosa al 1% y una corriente constante de 100 V).
    7. Purifique el producto PCR antes de utilizarlo como plantilla de ADN para la transcripción in vitro de ARNm utilizando un kit de purificación de ADN.

2. Generación de ARNm

  1. Descongelar todos los componentes del kit de transcripción de ARNm in vitro (ver la Tabla de Materiales). Vórtice para 5 s y girar hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g. Mantener en hielo hasta su uso.
  2. Preparar la mezcla de reacción para la transcripción in vitro de ARNm en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en el siguiente orden (volumen total de 40 l): 20 ml de mezcla ARCA/NTP de 10x (incluido en el kit de transcripción de ARNm in vitro); 0,25 l de 5-metil-CTP (concentración final (f.c.) es de 1,25 mM; 50% del CTP total); 0,25 ml de pseudo-UTP (f.c. es 1,25 mM; 50% del UTP total); X-L de la plantilla de ADN; 2 l de mezcla de ARN polimerasa T7 (incluida en el kit de transcripción de ARNm in vitro); Y-L de H 2 O libre deARNS.
    NOTA: X es un volumen que contiene al menos 1 g de ADN. Por ejemplo, 1,6 l de una solución de material de 625 ng/L. Y es el volumen de repuesto hasta el volumen total de 40 l.
  3. Vórtice para 5 s y girar hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g. Incubar a 37oC durante 30 min a 400 rpm en un mezclador térmico para transcripción in vitro.
  4. A continuación, añadir 2 l de DNase I directamente en la mezcla de reacción para la eliminación del ADN de la plantilla. Vórtice para 5 s y girar hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
  5. Incubar a 37oC durante 15 min a 400 rpm en un mezclador térmico. Tomar una alícuota de 2 l para el gel de control (paso 3.3) y almacenar a -80 oC.
  6. Para el relave de poli(A), añada los siguientes componentes directamente en la mezcla de reacción anterior (a un volumen final de 50 l): 5 ml de tampón de reacción polimerasa de 10x a A y 5 ml de polimerasa de poli(A) (ambos incluidos en el kit de transcripción de ARNm in vitro). Vórtice para 5 s y girar hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
  7. Incubar la mezcla a 37oC durante 30 min a 400 rpm en un termomezclador. Tomar una alícuota de 2 l para el gel de control (paso 3.3) y almacenar a -80 oC.
  8. Para la defosforilación de los extremos de 5o del ARNm, añada los siguientes componentes directamente en la mezcla de reacción anterior (a un volumen final de 60 l): 3 l de H2O libre de ARN; 6 l de 10x tampón de reacción de fosfatasa antártica; 3 l de fosfatasa antártica (15 unidades para un volumen de reacción de 60 l). Vórtice para 5 s y girar hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
  9. Incubar la mezcla a 37oC durante 30 min a 400 rpm en un mezclador térmico.
  10. Fosfatasa antártica inactiva al calor por incubación a 80 oC durante 2 min.
    NOTA: Idealmente, utilice un mezclador térmico separado, no espere hasta que el primer mezclador alcance la temperatura deseada.

3. Purificación de ARNm

  1. Purificar el ARNm transcrito in vitro utilizando un kit de purificación de ARN dedicado(Tabla de materiales).
    1. Añadir X l de solución de elución a la mezcla de reacción de ARNm del paso 2.10. Mezclar invirtiendo 5 veces. Añadir 300 sl de concentrado de solución de unión. Mezclar con pipeteo suave 5 veces.
      NOTA: X es el volumen de repuesto a un volumen total de 100 l. Por ejemplo, añada una solución de elución de 40 L a una mezcla de reacción de ARNm de 60 ol.
    2. Añadir 100 l de etanol libre de ARNase. Mezclar con pipeteo suave 5 veces.
    3. Coloque una columna de filtro en uno de los tubos de recogida suministrados. Transfiera suavemente la mezcla de reacción del ARNm al centro del filtro sin tocar el filtro. Centrífuga a 15.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Levante cuidadosamente la columna del filtro y deseche el flujo en el tubo de recogida. Vuelva a colocar la columna de filtro en el mismo tubo de recogida.
    5. Añadir 500 l de solución de lavado (no olvide añadir 20 ml de etanol libre de ARNiase antes de usar la solución de lavado por primera vez).
    6. Centrífuga a 15.000 x g durante 1 min en RT. Repita los pasos 3.1.4-3.1.6 para lavar una vez más.
    7. Centrífuga a toda velocidad (17.900 x g) durante 1 min a RT para eliminar cualquier fluido residual de la columna del filtro. Tome cuidadosamente la columna de filtro del tubo de recogida. Coloque la columna de filtro en un nuevo tubo de recogida.
    8. Añadir 50 s l de búfer de elución en el centro del filtro sin tocar el filtro. Incubar a 65oC durante 10 min en un mezclador térmico.
    9. Centrífuga a 15.000 x g durante 1 min en RT. Retire la columna del filtro y deséchela.
  2. Mida la concentración y pureza del ARNm eludado, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes para medir la absorbancia a 260 y 280 nm.
    NOTA: Una relación A260/A280 de 1.8-2.1 es indicativa de ARNm altamente purificado.
  3. Verificar la presencia de un solo producto, la longitud correcta de la transcripción y el relave de poli(A) analizando las alícuotas de los pasos 2.5 y 2.7 mediante electroforesis de gel de agarosa en condiciones de desnaturalización (por ejemplo, utilice un gel de agarosa del 1,2% que contenga 20 mM 3-(N-morpholino) ácido propanesulfónico [MOPS], acetato de sodio de 5 mM, EDTA de 1 mM y 20% de formaldehído y se ejecutan en 20 mM MOPS, 5 mM de acetato de sodio, 1 mM EDTA y 0,74 % de formaldehído a 100 V de corriente constante).
  4. Almacene el ARNm purificado en el tubo de elución a -80 oC hasta la transfección. Si utiliza sólo cantidades bajas del ARNm para la transfección, alípeele el ARNm para evitar ciclos repetidos de congelación-deshielo.
    NOTA: el ARNm se puede almacenar a -80 oC durante aproximadamente 1 año.

4. Preparación de macrófagos

  1. Ratones Euthanizar C57/BL6 (utilizar ratones del mismo sexo y de 6-24 semanas de edad) por luxación cervical.
    NOTA: Los mismos ratones se pueden utilizar para el aislamiento de PM (paso 4.2) y la generación de BMDM (pasos 4.3 y 4.4). Para el aislamiento de PM utilizar al menos dos ratones. Si sólo se va a generar BMDM un ratón por lo general es suficiente.
  2. Enriquecimiento inmunomagnético de macrófagos peritoneales.
    1. Llene una jeringa de 10 ml con una cánula de 0,9 x 40 mm con 8 ml de solución salina tamponada con fosfato helado (PBS) y 2 ml de aire. Enjuague la cavidad peritoneal con PBS. El aire formará una burbuja que minimiza las fugas del PBS.
    2. Recoja rápidamente el lavado peritoneal con la misma jeringa y transfiera a un tubo de centrifugación cónica de 50 ml. Combine las células peritoneales de varios ratones si es necesario. Mantenga la suspensión celular sobre hielo.
    3. Suspensión de la célula centrífuga a 650 x g durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 5 ml de NaCl al 0,2 % para 30 s para controlar los glóbulos rojos.
    4. Añadir 5 ml de 1,6% de NaCl a un volumen total de 10 ml para reconstituir condiciones isotónicas. Centrífuga a 650 x g durante 5 min a 4oC.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 97,5 l de tampón de clasificación de células magnéticas (MCS) (2 mM de ácido etilendiaminetetraacético [EDTA], albúmina sérica bovina al 5% [BSA] en PBS) por 1 lavado peritoneal (por ejemplo, si tres ratones fueron lavados, resuspend en 292.5L ).
    6. Añadir 2,5 l de perlas paramagnéticas conjugadas a un anticuerpo específico de CD11b por 97,5 ml de suspensión celular (p. ej., añadir 7,5 ml a 292,5 l).
    7. Incubar sobre hielo durante 15 minutos a 150 rpm en un agitador orbital.
    8. Suspensión de células centrífugas a 650 x g durante 5 min a 4 oC, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 ml de tampón MCS.
    9. Agregue 4 ml de búfer MCS a un volumen total de 5 ml y lave las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces.
    10. Repita los pasos 4.2.8 y 4.2.9 dos veces más para un total de tres pasos de lavado.
    11. Durante los pasos de lavado, coloque una columna LS en un separador de celdas magnéticas (consulte Tabla de materiales). Enjuague la columna con 3 ml de búfer MCS.
      NOTA: Evite cualquier burbuja, ya que puede obstruir la columna.
    12. Resuspenda el pellet celular en 1 ml del búfer MCS. Añadir 3 ml de búfer MCS a un volumen total de 4 ml, mezclar canalizando hacia arriba y hacia abajo tres veces.
    13. Transfiera los 4 ml de suspensión celular a la columna LS enjuagada.
      NOTA: Una vez más, evite cualquier burbuja, ya que pueden obstruir la columna.
    14. Espere hasta que el depósito de la columna esté completamente vacío. No agregue líquido adicional hasta que la columna deje de gotear.
    15. Agregue 3 mL del buffer MCS sobre la columna. A continuación, espere hasta que el depósito de la columna esté completamente vacío. Repita el paso 4.2.15 dos veces más.
    16. Coloque la columna LS en un tubo centrífugo cónico de 15 ml. Aplique 5 mL del buffer MCS sobre la columna. Espere hasta que haya pasado 2 ml de líquido a través de la columna y, a continuación, utilice el émbolo para empujar suavemente la fracción restante en el tubo.
    17. Suspensión de la célula centrífuga a 650 x g durante 5 min a 4 oC y desechar el sobrenadante.
    18. Resuspender el pellet celular en 1 ml de DMEM complementado con 10% de suero de becerro fetal inactivado por calor (FCS) (DMEM+FCS).
    19. Determine el número de células viables contando en la solución azul de tripa en una cámara de recuento Neubauer y células de semillas en DMEM+FCS en placas de cultivo.
      NOTA: Semilla PM a una densidad de 100.000 células/pozo en una placa microtíter de fondo plano. No utilice placas tratadas con cultivo de tejido, ya que la PM no se puede separar de ellas. Utilice placas no tratadas en su lugar.
  3. Generación de BMDM
    1. Retire la piel y los músculos de las patas traseras con un par de tijeras. Lave cada pierna por inmersión corta en 70% etanol.
    2. Separe las piernas y abra ambos extremos del fémur y la tibia cortando con tijeras.
    3. Llene una jeringa de 5 ml llena con una cánula de 0,6 mm x 30 mm con 5 ml de ENdotoxina muy baja (VLE) RPMI 1640 y enjuague la médula ósea de los huesos abiertos en un plato de cultivo.
    4. Combine la médula ósea de varios ratones si es necesario repitiendo los pasos 4.3.1-4.3.3. Transfiera la médula ósea a un tubo centrífugo cónico de 50 ml.
    5. Centrifugar la suspensión de la médula ósea a 650 x g durante 5 min a 4 oC y desechar el sobrenadante.
    6. Resuspender el pellet celular en 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) e incubar durante 5 minutos a RT para cargar los glóbulos rojos.
    7. Centrifugar la suspensión celular a 650 x g a 4oC durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    8. Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio VLE RPMI 1640 complementado con 10% FCS, 1% penicilina/estreptomicina, 1% HEPES, 1% piruvato sódico y 10 ng/ml de factor estimulante de colonias recombinantes (M-CSF) (M-CSF)(RPM++++++).
    9. Añadir 4 ml de RPMI+++++ a un volumen total de 5 ml.
    10. Preparar 5 platos Petri sin tratar de 92 mm x 16 mm con levas (ver la Tabla de Materiales)por ratón pipeteando 7 ml de medio RPMI+++++ en cada plato.
    11. Transfiera los 1 ml de solución celular a los 5 platos de cultivo preparados e incubar a 37oC y 5%CO2.
    12. Después de 4 días, alimente las celdas agregando 4 ml de RPMI++++. Después de 6-7 días, las células de la médula ósea se diferencian completamente en BMDM.
  4. Cosecha de BMDM
    1. Retire completamente el medio de los platos de cultivo. Añadir 5 mL de EDTA caliente de 0,2 mM en PBS a cada plato.
    2. Raspe suavemente toda la placa con un rascador de celda para separar el BMDM. Combine las suspensiones celulares en un tubo de centrifugación cónica de 50 ml.
    3. Enjuague los 5 platos de nuevo. Utilice el mismo volumen de 5 ml de EDTA caliente de 0,2 mM en PBS para los 5 platos. Combine esta suspensión celular con la del paso anterior.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 650 x g durante 5 min a 4oC y desechar el sobrenadante.
    5. Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio VLE RPMI 1640 complementado con 10% FCS, 1% HEPES, 1% piruvato de sodio y 10 ng/mL recombinante M-CSF pero sin antibióticos (RPMI++++).
    6. Determine el número de células viables contando en la solución azul de tripa en una cámara de recuento Neubauer y células de semillas en RPMI++++ en placas de cultivo.
      NOTA: Semilla BMDM a una densidad de 50.000 células/máximo de pozo en una placa microtíter de fondo plano. No utilice placas tratadas con cultivo de tejido, ya que el MMDM difícilmente se puede separar de ellas. Utilice placas no tratadas en su lugar.

5. Transfección de macrófagos con ARNm

  1. Calcule el volumen requerido del búfer de transfección mRNA.
    NOTA: El volumen de tampón de transfección de ARNm requerido depende del tamaño del pozo: utilice 200 l para la transfección en una placa de 6 pocillos, 100 ol en una placa de 12 pocillos y así sucesivamente. Siempre agregue un poco de volumen de repuesto debido a la pérdida de pipeteo (pero no demasiado, para evitar la dilución indebida de ARNm). Por ejemplo, utilice 450 s l en lugar de 4 x 100 l a 400 l para transfectar en 4 pocillos de una placa de 12 pocillos.
  2. Calcule el volumen requerido del reactivo de transfección mRNA. El reactivo de transfección de ARNm se añade a una proporción de 1:50. Por ejemplo, se requiere un reactivo de transfección de 9 l de ARNm para un volumen final de 450 l.
  3. Calcule la cantidad total de ARNm necesaria. Se requieren al menos 100 ng por cada 100.000 macrófagos para una transfección eficiente, 200 ng funciona aún mejor (por ejemplo, 800 ng de ARNm a 400.000 macrófagos transfect).
    1. Multiplique la cantidad calculada de ARNm requerida con el número total de pozos que tienen que ser transinfectados (por ejemplo, 4 pozos con 400.000 macrófagos cada uno: 4 x 800 ng a 3.200 ng de ARNm en total para todos los pozos). Por ejemplo, si su stock de ARNm es de 426,8 ng/L, se necesitan 7,49 l para una transfección óptima de 4 pocillos con 400.000 macrófagos cada uno.
  4. Agregue el volumen calculado del tampón de transfección de ARNm (paso 5.1.) menos los volúmenes para el reactivo de transfección de ARNm (paso 5.2) y el ARNm (paso 5.3) a un tubo de reacción. Por ejemplo, 450 sL - 9 l - 7,49 sL a 433,51 l.
  5. Descongelar el stock de ARNm y mezclarlo con un suave volteo del tubo de elución. Añadir el volumen calculado de ARNm (paso 5.3) al tubo de reacción con tampón de reacción de ARNm (en el ejemplo presentado anteriormente: 7,49 l en 433,51 l).
  6. Vórtice para 5 s y girar hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
  7. Vortex el reactivo de transfección mRNA durante 5 s y girar hacia abajo durante 2 s a 2.000 x g.
  8. Añadir el volumen calculado del reactivo de transfección de ARNm (paso 5.2) al tubo de reacción que contiene el tampón de transfección de ARNm y el ARNm (en el ejemplo presentado anteriormente: 9 l de reactivo de transfección de ARNm).
  9. Vortex la mezcla de transfección durante 5 s y girar hacia abajo para 2 s a 2.000 x g.
  10. Incubar durante 15 min a RT.
  11. Mientras tanto, sustituya el medio de cultivo de los macrófagos por un medio de cultivo fresco y cálido (véanse los pasos 4.2.18. y 4.4.5).
  12. Después del paso de incubación 5.10, agregue la mezcla de transfección a los poridos que contienen los macrófagos en un volumen apropiado para el tamaño del pozo (ver paso 5.1). Agregue la mezcla de transfección en un círculo desde el exterior hasta el centro del pozo.
  13. Mece suavemente la placa, primero en una vertical y luego en una dirección horizontal para asegurar una distribución uniforme de la mezcla de transfección en el pozo. A continuación, incubar a 37oC y 5 % CO2. La síntesis de la proteína codificada por el ARNm transinfectado comenzará poco después de la transfección. Para obtener mejores resultados, incubar durante al menos 6 h.
  14. Después de la incubación, analizar la eficiencia de la transfección mediante la microscopía (inmuno)fluorescencia, la citometría de flujo o el inmunoblot16,o utilizar los macrófagos transinfectados para el experimento de elección.

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Representative Results

Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar codificación mRNA para las variantes ETIQUETADAs por FLAG NEMO e IKK para la transfección de macrófagos primarios16. La codificación de plásmidos para el tipo salvaje con etiqueta FLAG (NEMOWT) y C54/347A mutante NEMO (NEMOC54/374A) (véase la Tabla de Materiales) ya contienen un promotor T7 en la orientación correcta(Figura 1A). Por lo tanto, sólo tuvimos que linealizar los plásmidos para generar plantillas de ADN para la transcripción in vitro. Con este fin, se digerieron 10 g de ADN plásmido con Xbal de 5 l, lo que dio como resultado la linealización del plásmido debido a un solo corte de 3' del codón de parada. La linealización completa del ADN plásmido fue verificada por electroforesis de gel de agarosa(Figura 1B).

La codificación de los plásmidos para el tipo salvaje con etiqueta FLAG (IKKWT) y S177/181E mutante IKK (IKK-S177/181E) no contienen un promotor T7. Por lo tanto, hemos adjuntado un promotor T7 por PCR para generar las plantillas de ADN para la transcripción in vitro(Figura 2A). La generación de un producto PCR específico, es decir, un único producto de tamaño correcto, se verificó mediante electroforesis de gel de agarosa(Figura 2B).

Después de la transcripción in vitro utilizando las respectivas plantillas de ADN, verificamos la generación de un solo producto mRNA de tamaño correcto y el relazamiento poli(A) por electroforesis de gel de agarosa en condiciones de desnaturalización(Figura 3).

Para verificar que el ARNm generado mediante este protocolo permite la transfección de macrófagos primarios (véase la Figura 4A,B para los análisis citométricos de flujo de enriquecimiento inmunomagnético de PM y el estado de diferenciación de BMDM), hemos generado codificación de ARNm para eGFP(Figura 5A-C)y analizado la eficiencia de la transfección por citometría de flujo(Figura 6A). 100.000 PM o 50.000 BMDM por pozo de una placa de microtíter no tratada se transtornillaron con 50, 100 o 200 ng de ARNm de eGFP durante 6, 9 o 24 horas. Tanto en PM como en BMDM, se pudieron detectar altos niveles de expresión de eGFP a las 6 h después de la transfección. La tasa de transfección aumentó con la cantidad de ARNm transfectó y fue más alta para 200 ng mRNA(Figura 6B,C). Para PM, la tasa de transfección alcanzó alrededor del 50-65% a 6 a 9 h después de la transfección(Figura 6B). A las 24 h después de la transfección, la tasa de transfección fue sustancialmente menor, lo que indica que expiró la expresión de eGFP. Por lo tanto, PM no debe ser transinfectado durante la noche. Para BMDM, la tasa de transfección alcanzó alrededor del 80-85%(Figura 6C). La caída en la tasa de transfección después de 24 h fue mucho menos pronunciada en BMDM. Por lo tanto, BMDM puede ser transinfectado durante la noche. Tanto en PM(Figura 6D,E)como en BMDM(Figura 6F,G),el nivel de expresión de eGFP en células transfectó de manera dependiente del tiempo y la dosis. Es importante destacar que el procedimiento de transfección no indujo la muerte de células líticas o apoptóticas, ya que no hubo aumento en los macrófagos con yoduro de propidium (PI) o en V-positivos después de la transfección(Figura 7A,B).

La eficiencia de transfección de la codificación de ARNm para las variantes NEMO o IKK, etiquetadas por FLAG, se analizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. 300.000 PM por pozo de una placa de 12 pocillos fueron transinfectados con 300 ng de ARNm respectivo durante 6 h. La tasa de transfección fue de aproximadamente 60% para los ARNM NEMO y alrededor del 55% para los ARNM IKK (Figura 8A,B). Por lo tanto, sus tasas de transfección eran similares a las de eGFP mRNA, lo que indica una tasa general de transfección de alrededor del 55% para pm.

También hemos utilizado este protocolo para generar codificación mRNA para Cre recombinase. La transfección de 400.000 BMDM de ratonesde flox/flox NEMO17 por pozo de una placa de 12 pocillos con 400 ng de ARNm Cre recombinase dio lugar a un agotamiento casi completo de la proteína NEMO después de 48 h(Figura 9), lo que indica una transfección altamente eficiente del BMDM.

PM y BMDM no segregaron ninguna cantidad detectable de IL-1, IL-6 y TNF después de la fección(Figura 10A,B). Además, las vías de señalización NF-kB y MAPK no se activaron después de la transfección16, lo que indica que el procedimiento de transfección no activa la señalización proinflamatoria. Tampoco hemos observado alteraciones funcionales de los macrófagos transinfectados en comparación con los macrófagos no transtrofaje16.

Figure 1
Figura 1: Linealización de plásmidos codificadores NEMO que ya contienen un promotor T7 en la orientación correcta. (A) Extracto de secuencia de la codificación plásmido para NEMOWT o NEMOC54/347Acon etiqueta FLAG. Ya está presente un promotor T7 en la orientación correcta y cerca de la secuencia KOZAK y el codón de inicio. La región promotora T7, la secuencia de codificación (CDS) para la etiqueta FLAG y NEMO, los codones de inicio y parada y el sitio de restricción para la linealización con XbaI están codificados por colores. (B) Representativo 1% gel de agarosa que muestra los plásmidos antes y después de la linealización con Xbal; Se cargó por carril 1 l de ADN de plásmido linealizado no tratado, linealizado o purificado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Conexión del promotor T7 a plásmidos de codificación IKK por PCR. (A) Extracto de secuencia de la codificación plásmido para IKK-WT o IKK-S177/181Econ etiqueta FLAG . Los plásmidos no contienen un promotor T7 adecuado, que por lo tanto está conectado por PCR. La ubicación, la orientación y la secuencia de la imprimación delantera (que contiene la secuencia promotora T7 que se va a añadir) y la imprimación inversa se indican mediante las flechas. La región promotora T7, el CDS para la etiqueta FLAG y los codones DE inicio y parada están codificados por colores. (B) Representante 1% gel de agarosa que verifica la generación de un único producto PCR de tamaño correcto utilizando las imprimaciones indicadas anteriormente. Se cargó por carril 1 l del producto PCR purificado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: síntesis de ARNm a partir de plantillas de ADN de codificación NEMO e IKK. (A) Representante desnaturalizando 1.2% gel de agarosa que contiene 0.7% de formaldehído que muestra el ARNm purificado de las construcciones NEMO e IKK. 2 l de NEMOWT,NEMOC54/347A,IKKWT y EL ARNm IKKS177/181E se cargaron por carril. Se cargó una escalera de ARN de 32 l para la determinación de la longitud del ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis citométricos de flujo del enriquecimiento inmunomagnético de PM y el estado de diferenciación de BMDM. (A) El porcentaje de F4/80+/CD11b+ PM en el lavado peritoneal antes y después del enriquecimiento inmunomagnético fue analizado por citometría de flujo. (B) La expresión de F4/80 y CD11b por BMDM después de 6 días de diferenciación se verificó mediante citometría de flujo. Se contaron 10.000 o 5.000 celdas por muestra, respectivamente. Los datos se muestran como medias: SEM de n 3 experimentos independientes, cada uno. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 y **** P < 0.0001 por la prueba t del estudiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: síntesis de ARNm con cola poli(A) de eGFP. (A) Extracto de secuencia de la codificación plásmido para eGFP. El plásmido no contiene un promotor T7 adecuado, que por lo tanto está conectado por PCR. La ubicación, la orientación y la secuencia de la imprimación delantera (que contiene la secuencia promotora T7 que se va a añadir) y la imprimación inversa se indican mediante las flechas. La región promotora T7, el CDS para eGFP y los codones de inicio y parada están codificados por colores. (B) Representante 1% gel de agarosa que muestra el amplicon purificado después de PCR utilizando las imprimaciones indicadas anteriormente. Se cargó por carril 1 l del producto PCR purificado. (C) Representante desnaturalización del 1,2% gel de agarosa que contiene un 0,7% de formaldehído que muestra el ARNm purificado de eGFP antes y después del relave de poli(A). Se cargaron 2 l de ARNm de eGFP por carril. Se cargó una escalera de ARN de 32 l para la determinación de la longitud del ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Transfección altamente eficiente tanto de macrófagos peritoneales como de BMDM con ARNm eGFP. Los macrófagos se incubaron durante 6, 9 o 24 horas con 50, 100 o 200 ng de ARNm eGFP complejo a jetMESSENGER o con jetMESSENGER solo (mock) y luego analizado por citometría de flujo. (A) Estrategia de gating utilizada para definir las poblaciones de macrófagos viables, eGFP viable+ macrófagos y pi+ (es decir, muertos) macrófagos. Se muestran datos representativos de la transfección con 200 ng mRNA para 6 h. (B,C) Las tasas de transfección de (B) PM y(C) BMDM se determinaron mediante el análisis del porcentaje de células eGFP positivas viables por citometría de flujo (n a 5-7 y n a 4-5 experimentos independientes, respectivamente). (D-G) Los niveles de expresión de eGFP se determinaron mediante el análisis de la intensidad media de fluorescencia (IMF) de viables (D) PM y (F) BMDM y de la subpoblación viable y eGFP positiva de (E) PM y (G) BMDM (n a 5-7 y n a 4-5 experimentos independientes, respectivamente). Se contaron 10.000 celdas por muestra. Los datos se muestran como medias, NO son significativas, no son significativas; * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 y **** P < 0.0001 por la prueba t del estudiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: La transfección no induce la muerte de células líticas o apoptoticas. La muerte celular inducida por transfección de (A) PM y (B) BMDM se determinó mediante el análisis del porcentaje de células positivas de PI y anexión en V (n -5-7 y n a 4-5 experimentos independientes, respectivamente). El porcentaje de macrófagos muertos presentes en muestras no transinfectadas (algún grado de muerte celular fue causado por el desprendimiento físico de macrófagos de los pozos a pesar del uso de placas no tratadas) se restó del que en las respectivas muestras transinfectadas sólo tuvo en cuenta la muerte celular inducida por el procedimiento de transfección. Se muestra la estrategia de gating utilizada para definir las poblaciones de PI+, annexin V+ y PI+/annexin V+ macrófagos para un conjunto de datos representativo de PM transinfectados con 200 ng mRNA para 6 h. La estaurosporina (50 m durante 1 h) se utilizó como control positivo. Se contaron 10.000 celdas por muestra. Los datos se muestran como medias, NO detectables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Tasas de transfección mediante codificación mRNA para construcciones NEMO e IKK. Las tasas de transfección utilizando la codificación mRNA para (A) construcciones NEMO y (B) construcciones IKK se cuantificaron mediante microscopía de inmunofluorescencia (n 4 experimentos independientes). La barra de escala s 4 m. Los datos se muestran como medias , n.t. n.t. , no transfectó, n.s. , no es significativo; * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 y **** P < 0.0001 por la prueba t del estudiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: La transfección de NEMOfl/fl BMDM con codificación mRNA para Cre recombinase da como resultado una deficiencia casi completa para NEMO. El BMDM de los ratones NEMOfl/fl se transfectó con cre recombinasa de codificación de ARN m durante 48 h. La deficiencia de la proteína NEMO como resultado de la eliminación mediada por Cre fue evaluada por la mancha occidental utilizando anticuerpos específicos que reconocen NEMO o actina y cuantificado por densitometría (n 5 experimentos independientes). Los datos se muestran como medias: SEM. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 y **** P < 0.0001 para la prueba t del estudiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: La transfección no induce una respuesta proinflamatoria. (A) PM y (B) BMDM se transtornudaron con codificación mRNA para NEMOWT o NEMOC54/347A. Como control positivo, los macrófagos se infectaron con Listeria monocytogenes a una multiplicidad de infección de 1 o se estimularon con 5 g/ml de LPS o poli(I:C) durante 5 h (PM) o 24 h (BMDM). La secreción de IL-1, IL-6 y TNF en el sobrenadante fue cuantificada por ELISA (n 3 experimentos independientes). Los datos se muestran como medias: SEM. n.t. , no transfectó, n.d. , no detectable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí presentamos un protocolo para la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios generalmente difíciles de transfectar con ARNm transcrito in vitro. Es importante destacar que la transfección de los macrófagos utilizando este protocolo no induce la muerte celular ni activa la señalización proinflamatoria, lo que indica que ni el reactivo de transfección ni el ARNm transfectóse se reconocen como no autónomos.

La calidad del ARNm es de vital importancia para el éxito de la transfección de macrófagos utilizando este protocolo. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado de que el ARNm no entre en contacto con ARNm (por ejemplo, a través de tampones o viales contaminados). En caso de duda, compruebe la degradación del ARNm (por ejemplo, mediante electroforesis de gel de agarosa). La tasa de transfección y el nivel de expresión ya eran máximos a las 6 h después de la transfección. Por lo tanto, es posible que la proteína de interés se exprese a niveles suficientes para el análisis en momentos anteriores después de la transfección. Sin embargo, no hemos probado esto. Además, la transfección de grandes cantidades de ARNm puede aumentar aún más la tasa de transfección y/o el nivel de expresión. Sin embargo, la transfección de grandes cantidades de ARNm puede potencialmente también conducir a cierto grado de inmunogenicidad o incluso citotoxicidad. La total falta de este protocolo es una de las principales ventajas de este protocolo. Por lo tanto, si se van a transtornificar grandes cantidades de ARNm, la inmunogenicidad y la citotoxicidad deben evaluarse cuidadosamente.

Nivel de expresión claramente correlacionado con la cantidad de ARNm transfectó. Sin embargo, la reexpresión de NEMO en el MMDM deficiente de NEMO dio lugar a una expresión de proteína NEMO similar como en el tipo salvaje BMDM16, lo que indica que la transfección de ARNm utilizando este protocolo no conduce a una sobreexpresión sustancial de la proteína de interés. Por lo tanto, este protocolo puede no ser adecuado para estudiar las consecuencias de la sobreexpresión de la proteína de interés. Más bien consideramos esto una ventaja, sin embargo, ya que la sobreexpresión de una proteína a menudo altera su comportamiento.

La principal limitación de la transfección de ARNm, en general, es que sólo resulta en la expresión transitoria de la proteína de interés (porque el ARNm generado y transfectó utilizando este protocolo estará sujeto a un volumen de negocios normal). PM parecen expresar la proteína de interés durante un período de tiempo más corto en comparación con BMDM. Por lo tanto, a diferencia de BMDM, PM no debe ser transinfectado durante la noche. El tiempo que se expresará una proteína de interés determinada variará (ya que tanto la estabilidad del ARNm como la de la proteína variarán). Sin embargo, recomendamos realizar el experimento de elección en el mismo día de la transfección. Si se requiere la expresión de la proteína de interés durante períodos de tiempo más largos, las células probablemente pueden ser transfectó varias veces (por ejemplo, todos los días como se describe en18).

Hemos utilizado con éxito el protocolo descrito aquí para transfectar PM murino y BMDM y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)16. En teoría, el ARNm generado utilizando este protocolo se puede utilizar para transfectar cualquier tipo de célula dado de cualquier especie de mamífero. Sin embargo, el reactivo óptimo de transfección de ARNm y el contenido de los nucleósidos modificados pueden diferir para otros tipos de células.

Entre las modificaciones futuras prometedoras se incluyen la inclusión de los UtR 5'- y 3'-. La mayoría de los plásmidos preexistentes sólo contienen el CCDS de la proteína de interés, pero no los 5'- y 3'-UTRs. Su inclusión (como se describe en19) puede mejorar aún más la estabilidad y la expresión del ARNm. Además, debe ser posible adjuntar etiquetas de epítopos a la proteína de interés simplemente incluyendo la secuencia de la etiqueta de epítopo en la imprimación delantera o inversa (para el etiquetado de epítopos N y C-terminal, respectivamente).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

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References

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Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

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