Summary
ここでは、スペクトル外れ値除去およびその後の主要特徴の抽出に対する化学的アプローチと組み合わせた臨床研究におけるヒト被験者からの共焦点ラマンスペクトルの収集のためのプロトコルを提示する。
Abstract
生体内共焦点ラマン分光法の開発により、ヒト被験者の深度分解能を持つ水、タンパク質、脂質の直接測定が可能になります。この情報は、皮膚関連疾患やスキンケア製品の性能を特徴付けるための非常に重要です。このプロトコルは、共焦点ラマンスペクトル収集の方法と、化学測定を利用したスペクトルデータセットのその後の分析を示す。この方法の目的は、データ収集の標準プロトコルを確立し、データ分析の一般的なガイダンスを提供することです。前処理(例えば、外れ値スペクトルの除去)は、臨床研究から大規模なデータセットを処理する際の重要なステップです。例として、データセットの事前知識に基づくガイダンスを提供し、外れ値の種類を特定し、それらを削除するための具体的な戦略を開発します。主成分解析が行われ、負荷スペクトルを参照材料からのスペクトルと比較し、最終的な多変量曲線分解能(MCR)解析で使用される成分の数を選択します。このアプローチは、大規模なスペクトル データセットから意味のある情報を抽出する場合に成功します。
Introduction
臨床研究では、生体内共焦点ラマン分光法において、角質層の厚さと水分含有量1、2、3、4を決定し、その浸透を追跡する独自の能力を示している。皮膚5、6にトフェックに適用される活性材料。非侵襲的なアプローチとして、共焦点ラマン分光法は振動モードに基づいて分子信号を検出する。したがって、ラベリングは7を必要としません。インビボ共焦点ラマン分光法は、技術の共焦点性質に基づく深度分解能を有する化学情報を提供する。この深度依存性情報は、スキンケア製品4、8、老化9、10、季節変化3、ならびに皮膚バリア機能疾患の影響を研究する上で非常に有用であり、アトピー性皮膚炎11、12など。高周波ラマン分光法(2,500~4,000cm-1)には多くの情報があり、水は3,250~3,550cm-1の間に異なるピークを生み出します。しかし、約2,800~3,000cm-1の間に集中するタンパク質と脂質のラマンピークは、主にメチレン(-CH2-)とメチル(-CH3)グループ13から生成されるので、互いに重なり合います。.この重複した情報は、個々の分子種の相対的な量を得る際の技術的な課題を提示します。ピークフィッティング14、15および選択的ピーク位置12、16のアプローチは、この課題を解決するために使用されてきた。しかし、これらの単一ピークベースの方法では、同じ成分から複数のラマンピークが同時に変化するため、純粋な成分情報を抽出することは困難です17.我々の最近の出版物18では、純粋な成分情報を解明するためにMCRアプローチが提案された。このアプローチを用いて、生体内共焦点ラマン分光データセットの大きな3つの成分(水、タンパク質、脂質)を抽出した。
大規模な臨床研究の実行は、生体内分光データを収集する個人に要求することができます。場合によっては、スペクトルの取得には1日に何時間も稼働する機器が必要であり、研究は数週間または数ヶ月まで延長することができます。このような条件下では、分光アーティファクトのすべてのソースを特定、除外、および修正するための技術的専門知識を持たない機器オペレータによって分光データが生成される場合があります。結果のデータセットには、分析前にデータから識別および除外する必要がある分光外れ値のごく一部が含まれている場合があります。本論文では、MCRでデータを分析する前に、臨床ラマンデータセットを「クリーンアップ」するための化学測定分析プロセスを詳細に示す。外れ値を正常に除去するには、外れ値の種類と外れ値スペクトルの生成の潜在的な原因を特定する必要があります。次に、特定のアプローチを開発して、ターゲット外れ値を除去できます。これには、データ生成プロセスとスタディ設計に関する詳細な理解を含む、データセットに関する事前の知識が必要です。このデータセットでは、外れ値の大部分は低信号対雑音スペクトルであり、主に1)皮膚表面の上に収集されたスペクトル(30,862のうち6,208)、および2)蛍光室光からのスペクトルへの強い寄与(30,862点中67個)に起因する。皮膚表面の上に集められたスペクトルは、レーザー焦点が皮膚表面に近づき、主に皮膚の下の器械の窓にあるように、弱いラマン応答を生じる。蛍光室光からの強い寄与を持つスペクトルは、計器オペレータのエラーまたは被写体の動きによって生成され、共焦点ラマンコレクションウィンドウが被験者の身体部位によって完全に覆われない状態を生じる。これらのタイプのスペクトルアーティファクトは、データ取得時に分光専門家によるスペクトル獲得時に同定され、修復される可能性がありますが、この研究で使用された訓練を受けた計測器オペレータは、致命的な障害が観察されました。外れ値を識別して除外するタスクは、データ分析プロトコルに組み込まれます。提示されたプロトコルは、この課題を解決するために開発されています。皮膚表面の上の低信号対雑音スペクトルに対処するために、皮膚表面の位置を最初に決定し、皮膚表面の上に収集されたスペクトルの除去を可能にする必要があります。皮膚表面の位置は、補足図1に示すように、ラマンレーザー焦点が皮膚の半分と皮膚の半分である深さとして定義される。低信号対雑音スペクトルを除去した後、主成分分析(PCA)を実施し、蛍光室光ピークが支配する因子を抽出する。これらの外れ値は、対応する因子のスコア値に基づいて削除されます。
このプロトコルは、MCR プロセスで 6 つの主要コンポーネントを決定する方法の詳細情報を提供します。これは、PCA 解析の後に、異なる数の主成分で生成されたモデルの荷重間のスペクトル形状比較を行います。また、参考資料やヒト被験者のデータ収集の実験過程についても詳しく説明する。
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Protocol
この研究は、1975年ヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに従って、北京小児病院の制度審査委員会によって承認されました。これは、良好な臨床実践のためのICHガイドラインに従って行われました。調査は2015年5月から7月にかけて行われた。
1. アトピー性皮膚炎を持つヒト被験者からの生体内共焦点ラマンスペクトルの採取
- 次の基準に従って被験者を含めます。
- 4~18歳の被験者を含める。
- 軽度から中等度のアトピー性皮膚炎(医師のグローバル評価に従って2または3のスコア)を有する被験者を含み、身体表面の5%〜30%の活動的な疾患症状を有し、腕に少なくとも2つの病変を有する。
- AD疾患に直接関連する症状を除き、健康な被験者を含める。
- 書面によるインフォームド・コンセントを提供するサブジェクトを含めます。
- 個々のトポロジ角度(ITA)値がテスト場所で40より高い被験者を含めます。
- 次のいずれかの条件を満たすサブジェクトを除外します。
- 現在参加している被験者、または過去4週間以内に任意の試験施設で臨床研究に参加した被験者を除外します。
- がんの被験者、または研究前の5年以内に癌の診断または治療を受けた被験者を除外する。
- 糖尿病の被験者を除外する。
- 被験者を危険にさらすか、または研究結果の正確性を妨げる可能性のある免疫学的または感染症を有する被験者(すなわち、肝炎、結核、HIV、エイズ、ループス、または関節リウマチ)を除外する。
- 器械の測定を妨げるか、またはアトピー性皮膚炎だけに皮膚の明確な評価を妨げる皮膚の状態を持つ被験者を除外する。例としては、極端に乾燥した皮膚、損傷した皮膚、切り傷、傷、日焼け、母斑、入れ墨、広範な瘢痕、発疹、過剰な毛の成長、またはにきびが含まれます。
- 軽度の精神安定剤を除き、過去1ヶ月以内に経口免疫抑制薬、抗生物質、またはその他の全身療法を使用する被験者を除外する。
- 研究者の意見では、研究参加を妨げる他の病状を持つ被験者を除外する。
- 試験区域の色素沈着が高い被験者を除外する。
- アトピー性皮膚炎研究参加者の病変領域にラベルを付け、図1Aに示すように、病変部位の上または近くに3cm x 4cmの面積を付けてマークする。
- 図 1Bに示すように、非病変領域に対して、対応するボディ サイト (左前腕と右前腕) に同じマーカーを付けます。
- 図2Aおよび図2Bに示すように、インビボ共焦点ラマン器具の窓に密着してマークされたボディサイトを配置します。ボディサイトに室内光の影響を避けるために、窓全体をカバーします。
- ラマン データ収集を実行します。
注:器械に17 mWの力の671 nmレーザーを使用して2 cm-1および50x顕微鏡の目的(NA = 0.9オイル浸漬)のスペクトル決断を有する。波長は、内蔵のネオンアルゴンランプのスペクトルを使用して校正されます。強度の口径測定はNIST(国立標準研究所)ガラス校正標準のスペクトルを測定することによって行われます。- 図2Cに示すようにスペクトルが観察されるまでフォーカスを移動し、次に焦点を皮膚表面から10μm離します。
- 2,510 cm-1 -4,000cm-1周波数領域の 2 μm ステップ サイズで 26 ステップのデータ収集を開始します。1 s の露出時間を使用し、合計で約 10 ~ 15 分続く各領域に対して 8 回の反復を測定します。
2. 参考資料からの共焦点ラマンスペクトルの収集
- 参考資料を置き、人間の皮膚層角質体19の主要成分を、共焦点ラマン器具の窓に置く(資料表:牛血清アルブミン(BSA)、脱イオン水(DI水)、セラミド、コレステロール、無料)。脂肪酸、およびスクアレン)。
- 上記と同じ収集パラメータを使用して、材料の外側から材料中心に連続して参照材料のラマンスペクトルを収集します。
- 2,510~4,000 cm-1の範囲の間に各ラマンスペクトルの下の領域を統合し、これらの26の測定でトップ3の最大値ポイントを特定します。これらの3点からラマンスペクトルを平均して、最終的な基準材料スペクトルを得る。
3. 化学測定解析による外れ値スペクトルの除去
- スキンサーフェスを決定し、皮膚外スペクトルを除去します。
- ファイル拡張子を '.ric' から '.mat' に変更し、.mat ファイルを MATLAB ソフトウェア プラットフォームにロードします。
- [分析] の下にあるインポートされたデータセットを右クリックして、ベースライン (自動加重最小二乗)を使用してベースラインを修正する|その他のツール |デフォルト設定の PLS_Toolbox ソフトウェアでの前処理。
- 2,910~2,965 cm-1の値を合計すると、MATLABの合計関数を介して図3Aに示すように、26の連続したステップ測定から各ラマンスペクトルの下の強度値を得ます。
- MATLAB のリンスペース関数を使用して、計測器オフセット値(図 3Bの X 軸の値)を 26 ~ 260 から補間します。
- MATLAB のスプライン法を使用して強度値を 26 ~ 260 に補間し、新しく生成された 260 の位置値を活用します。
- MATLAB のポリフィット関数とポリヴァル関数を使用して、260 ポイントの新しい強度値のセットを取得します。まず、ポリフィット関数の X 入力と Y 入力として 260 の位置と強度の値をそれぞれ使用します。度の値を 20 に設定します。次に、出力係数と 260 の拡張位置値をポリバルの入力として使用して、最終的な 260 強度値を取得します。
- MATLAB の最大関数と最小関数を使用して、新しく補間された 260 強度の値から最大ポイントと最小ポイントを識別します。
- 最大強度と最小強度値の合計を 2 で割って、平均強度値を計算します。
- 平均強度値に最も近い 260 強度値(ステップ 3.1.6 から計算)の強度値を識別し、対応する位置値をスキン サーフェスとして設定します。図 3Bに示すように、この位置値を X 軸のゼロ点として設定します。
- ゼロ点と既知の 2 μm ステップ サイズに従って、他のすべての位置値を変更します。
- 位置値に従って、皮膚表面の上に収集されたすべてのスペクトルを取り除きます。
- 残りのデータを PLS_Toolbox にインポートしてデータセットを作成し、"RamanData.mat" の名前を変更します。
- 部屋のライト効果で外れ値スペクトルを削除します。
- 皮膚外スペクトルを除去した後、ラマンスペクトルデータセット(RamanData.mat)をロードし、PCA解析を実装します。
- MATLAB プラットフォームの下で PLS_Toolbox ソフトウェアにデータセットをロードし、データセットを右クリックして[分析] を選択します。PCA.
- 前処理アプローチとして[正規化]を選択し、クロス検証に [なし]を選択します。
- 補足図 2に示すように、PCA 分解分析には 3 つのコンポーネントを使用します。
- インビボラマン計器のコレクションウィンドウのカバーを取り外し、参照材料データ収集に使用されるのと同じパラメータを使用して、高周波領域の部屋の光スペクトルを収集します。
- 補足図 3に示すように、ルーム ライトの背景スペクトルとの比較を通じて、ルーム ライト効果係数を識別します。
- 通常よりも有意に高い対応するスコア値を持つスペクトルを削除します(この調査では、データセット全体のスコア値の99.8%以上、この調査では0.16です)。
4. MCR分解解析における成分数の選択
- 上記と同じ方法(セクション3.1.2)を使用して、ラマンスペクトルベースラインを修正します。
- 前述の前処理データセット (セクション 3.2) に対して PCA 分析を実行しますが、"正規化" ではなく "PQN" – "平均中心" を選択し、固有値を対数スケールでプロットし、コンポーネントの数 (20) を既定の数値としてプロットします。[コンポーネントの選択]ボタンをクリックし、Y 値としてlog (固有値)を選択して分解解析を行います。MCR 解析に使用するコンポーネントの数として、3 ~ 8 個を選択します。
- MCR 解析を実行します。
- データ選択ボタンを使用して、MCR_main ソフトウェア20にデータセットをロードします。
- [コンポーネント数の決定] ボタンをクリックして、コンポーネントの数(3 ~ 8) を選択します。
- [初期推定]タブの下にあるピュアボタンをクリックし、変数選択タブの [方向]の下にある[集中]を選択し、[操作]ボタンをクリックします。
- [OK]ボタンをクリックし、次のページに[続行] ボタンをクリックします。
- 次のページで[続行]をクリックし、それぞれ否定的でないプロファイルタブを持つ種の実装とNr.の下にfnnlsと6を選択します。 [続行]ボタンをクリックします。
- このページのセクション 4.3.5 と同じパラメータを選択し、[続行]をクリックします。
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Representative Results
本臨床研究では、生体内共焦点ラマンスペクトルを4~18歳の28人の被験者から採取した。上記のデータ収集プロトコルで合計30,862のラマンスペクトルが収集されました。この大きなスペクトル データセットには、図 4Aに示すように、20% のスペクトル外れ値が含まれています。低信号対ノイズ外れ光線スペクトルは、皮膚表面を決定した後に除去され、続いてPCAがルームライト機能を備えたスペクトルを識別した。このPCAモデルの第3の要因は、ルームライトピークを同定する。これは、同じ共焦点ラマン器具を用いて研究部位で別々に集められた蛍光室光のスペクトルと因子3の負荷スペクトルを比較することによって確認される(補足図3参照)。図 4Bは、このプロセスの後に外れ値スペクトルのほとんどが除去されたことを示します。
PCAは、前処理された共焦点ラマンデータセットに対して行われ、使用される因子の数と共に元値が図5にプロットされる。先行研究12、19によれば、モデルは少なくとも3つの成分を含むべきである:水、タンパク質、および脂質。図5に示すように、因子9では、発生率の有意な減少が認められた。この観察は、MCR モデルに含めるための 3 ~ 8 つの因子の間で変化する主成分の数を持つモデルを調査することをお示唆します。タンパク質、水、脂質と最も一貫性のある分光機能を含む MCR 荷重を図 6 に示します。
図 1.前腕の病変および非病変記号の図。(A)病変部位に3cm×4cmのマークを付けた。(B) 非病変部位に3 cm x 4 cmのマークされた領域を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.共焦点ラマンデータ収集の図。(A)共focalラマン楽器。(B)ヒト被験者の前腕に関するスペクトルコレクション。(C)データ収集の基準位置を決定するスクリーンショット。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.皮膚表面の決定:(A)各ラマンスペクトル下のタンパク質領域の統合。(B)最大点と最小点に基づいてスキンサーフェスを設定します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.ラマンデータセットスペクトル。(A)外れ値スペクトルを除去する前に、共焦点ラマンスペクトル。(B)外れ値スペクトルを除去した後の共焦点ラマンスペクトル。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.PCA 分析からコンポーネントの数を決定する。(A)PCAモデルで使用される成分の数の関数としてプロットされた対数スケールの固有値。(B)'n' と 'n + 1' コンポーネントの固有値の違いは、この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図 6.MCRモデルの3~8個の成分との対応する参照材料のスペクトルとの荷重形状の比較。(A)タンパク質、(B)水、および(C)脂質因子の形状は、それぞれBSA、水、脂質参照材料のスペクトルと比較して、MCRモデルにおいて3~8成分である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.最終モデルでは使用されていない 6 つのコンポーネント MCR モデルからの追加の 3 つの荷重。これらの3つのMCR成分は、蛍光およびベースラインアーティファクトによって支配されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 1.レーザー焦点の中心が皮膚に触れる皮膚表面の決定の図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 2.PLS_Toolbox ソフトウェア PCA 分析における 3 つのコンポーネントの選択の図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 3.ルームライトの基準スペクトルに重ね合わせたルームライトによって支配される荷重係数の識別。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 4.宇宙線除去前後のMCRモデルからの負荷の比較。(A)、(B)、および(C)は、それぞれ水、タンパク質、脂質を表す因子である。最終的な MCR モデルで使用されていない追加の荷重係数は d、e、および f.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 5.角質層における典型的な脂質材料のラマンスペクトル。(A)コレステロール3硫酸ナトリウムとコレステロール。(B)オレイン、パルミティック、パルミトレイン、ステアリン酸。(C) スクアレン。(D)N-ベヘノイル-D-エリスロ・スフィンゴシン、N-リグノセロイル-D-エリスロ・スフィンガニン、およびD-エリスロ・ジヒドロスフィン。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルのセクション2および3で説明するように、データ収集中に、各深度プロファイルは、赤い円で強調表示された顕微鏡画像から暗い領域を見つけることによって、計器の窓と皮膚の間に接触する領域で収集されました。図 2C.これらの領域が見つかったら、データ解析手順のスキン サーフェスの位置を正確に決定するために、皮膚表面の上の深度プロファイルを開始することが重要でした。その後、皮膚表面の位置を用いて、対応する深さプロファイルにおける各スペクトルの相対的な深さを決定した。プロトコルのセクション1で述べたように、皮膚表面の上に深さプロファイル10 μmを開始すると、皮膚の外側に5つのデータポイントが生成されます。これにより、皮膚表面の両側の最大信号強度と最小信号強度の位置を正常に決定することができます。また、これらの領域は高い蛍光バックグラウンド信号を生成するため、ペンマークやそばかすなどの高い色素領域を含む場所を測定しないようにすることも重要です。露光時間の選択は、スペクトル品質と測定時間のバランスです。露光時間が長いほど、信号対雑音が改善され、全体的な測定時間が大幅に増加します。しかし、多くの被験者は、長期間動かずにいるのは難しいと考えています。これは、例えば、子供たちのために非常に挑戦的です。レーザーパワーを上げると、信号対雑音が増加します。しかし、あまりにも多くの電力は、エネルギーの吸収のために皮膚を損傷することができます。最大許容露出、中国の国家規格(GB 7247.1-2012)で定義されている17 mWレーザーパワー、および国際レーザー安全規格(IEC 60285-1:2007;<20 mW 671 nmおよび<30 mW 785 nm)を超えることはできません。その他の安全上の注意事項としては、各被験者がデータ取得前に目の保護を着用していることを確認すること、身体部位が40を超える個々のトポロジ角度(ITA)値を有すること、および皮膚色素沈着の高い領域を避けることなどが含まれます。
皮膚表面の位置を決定するために、タンパク質ラマンピーク(2,910〜2,965cm-1)の下の領域を統合し、タンパク質シグナルの深度プロファイルを得た。ラマンスペクトルは、ピークの統合前にPLS_Toolboxの自動加重最小二乗法を使用して、最初にベースライン補正を行いました。1つの深さプロファイルからの26のデータポイントは、計測器オフセットvaueのリンスペース法(図3AのX軸値)と対応する強度値のスプライン法を使用して260点に補間されました。結果として得られたデータは、MATLABのポリフィット関数とポリヴァル関数を使用して20番目の順序の多項式に補間され、補間されたデータの最大点と最小点が決定されました。平均強度値は、最大値と最小値の合計を 2 で割って計算しました。スキン サーフェスは、補間された深度プロファイルからの強度値が平均強度に最も近い位置として定義されました。皮膚表面の正確な位置は、実験データポイントと一致する必要はありません。この方法は、ビーム21の吸収および散乱による皮膚の限られた深さを測定することができる。皮膚表面下で約50μm以下の分光データを収集するには、実験パラメータに大幅な変更が必要な場合があります。
プロトコルのセクション3で説明したように、低信号対雑音と室内照明からの高い寄与を有する外れ値スペクトルを除去した後、宇宙線を含むスペクトルのごく一部がデータセットに残った。宇宙線除去前後に生成された負荷スペクトルの比較を補足図4に示す。補足図4に示す負荷スペクトルの比較は、宇宙線に対する少数のスペクトルの影響がごくわずかであることを示している。水、タンパク質、脂質を表す3つの因子は同一であり、ノイズとスペクトルアーティファクトに関連する追加の3つの荷重も非常に類似していました。これは、スペクトル内の宇宙線の発生が少ない(約0.25%)に起因する可能性があります。スペクトル内の宇宙線の位置はランダムであるためです。
MCR分析で使用される成分の数の選択は重要であり、各荷重を担当する対応する分子種の観点から荷重の形状を解釈することは、対応するスコアの両方に大きな影響を与えるため、値が使用され、メソッド全体のパフォーマンスが向上します。プロトコルのセクション4で説明するように、PCAは、コンポーネントの数の増加に関連する線源値の進化を調査するために最初に行われた。この調査は、次の MCR 分析で使用するコンポーネントの数を識別するために使用されました。対数スケールで固有値をプロットすると、図 5Aに示すように、生の固有値を調べるよりもこの識別プロセスが簡単になります。各元値は、1 つのコンポーネントがキャプチャできる分散を表します。発生率が大きいほど、この成分がスペクトル内でモデル化できるばらつきが大きくなります。同じようなサイズの固有値を一緒に選択するか、一緒に排除する必要があります22.このガイドラインに従って、コンポーネント3、4、および5はサイズが類似した固有値を生成するため、MCR分析では2、5、8個の成分が考慮されました。コンポーネント6、7、8についても同様の傾向が見られました。図 5Bは、2番目、5番目、および8番目の成分の後にローカル最大値を示す'n'と'n+1'成分の間の固有値の違いのプロットです。研究設計と組み合わせた皮膚の分子組成に関する事前の知識は、高周波ラマンスペクトルをモデル化するために必要な3つの成分の最小値をサポートしています。そこで、3~8個の成分を含む複数のMCRモデルを調査し、負荷を基準材料からのスペクトルと比較し、最終モデルに必要な主要成分を特定した。
参考材料からのラマンスペクトルとの負荷の比較は、テストされたすべてのモデルのMCR負荷を支配し、対応する基準と一致するので、最終的なMCR成分の2つをタンパク質と水に識別し、割り当てることを容易にします。スペクトルは、BSAおよびDI水である。しかし、一部のMCR成分における脂質の予想分光特性は、3成分および4成分を含むMCRモデルに示されている脂質参照スペクトルとの一致が弱かった。さらに、残留タンパク質ピーク(2,840~3,000 cm-1)は、6成分以下で試験したすべてのモデルのMCR水負荷で観察されました。これらの観測値に基づいて、最終的なMCR解析に6つの成分MCRモデルが使用された。6つの成分のうち3つは、その負荷スペクトルを対応する基準スペクトルに一致させることにより、水、タンパク質、脂質に割り当てられました。脂質因子の解釈と割り当ては、N-ベヘノイル-D-エリスロ・スフィンゴシン、N-リグノセロイル-D-エリスロ・スフィンガニンを含む3つの代表的なセラミド材料のラマンスペクトルへの負荷の比較に基づいています。D-エリスロ・ジヒロスフィンジン角質層における他の脂質材料のラマンスペクトルも調べた。これらの材料には、補足図5に示すように、脂肪酸(オレイン、パルミチン、パルミトレイン、ステアリン酸)、コレステロール(コレステロール3-硫酸ナトリウムおよびコレステロール)、およびスクアレンが含まれる。最終的なMCRモデルで使用される脂質因子は、セラミドスペクトルに強く一致し、長鎖炭化水素を含む他の材料と一致した。他の3つのMCR成分は蛍光およびベースラインアーティファクトによって支配され、対応するスコア値はいずれの計算にも使用されなかった。これらの 3 つのコンポーネントを図 7 に示します。
この原稿で提示される全体的な分析アプローチは、他の単一ピークまたはピークフィッティングアプローチと比較して、皮膚の主要成分を測定するための改善された特異性および正確性を持つ最終的な方法を作り出す。この方法論は、悪いスペクトルの比較的小さな部分を含む臨床データセットから重要なコンポーネントを抽出できることを示しています。今後は、この方法論をソフトウェアパッケージに自動化し、効率を向上させ、分析に必要な技術的専門知識の量を削減することに焦点を当てています。同様の方法論は、同じ器械に組み込まれた671 nmレーザーではなく785 nmレーザー源を使用して指紋領域(400-1,800 cm-1)で集められたラマンスペクトルのために開発されている。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、企業機能分析およびパーソナルクレンジングケア部門からの財政的支援を大いに認めています。分析アソシエイト・ディレクターのジャスミン・ワン氏とロブ・ガードナー博士の指導と支援、そしてデータ収集に関する彼女の支援に対するLi Yang氏に感謝の意を表したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
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