Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la raccolta di spettri Raman confocali da soggetti umani in studi clinici combinati con approcci chemiometrici per la rimozione degli outlier spettrali e la successiva estrazione di caratteristiche chiave.
Abstract
Lo sviluppo di questo metodo spettroscopico Raman confocale in vivo consente la misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione di profondità nei soggetti umani. Queste informazioni sono molto importanti per le malattie legate alla pelle e caratterizzano le prestazioni dei prodotti per la cura della pelle. Questo protocollo illustra un metodo per la raccolta di spettri confocali Raman e la successiva analisi del set di dati spettrale sfruttando la chemiometria. L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standard per la raccolta dei dati e fornire indicazioni generali per l'analisi dei dati. La pre-elaborazione (ad esempio, la rimozione degli spettri anomali) è una fase critica nell'elaborazione di set di dati di grandi dimensioni da studi clinici. Ad esempio, forniamo indicazioni basate sulla conoscenza preliminare di un set di dati per identificare i tipi di outlier e sviluppare strategie specifiche per rimuoverli. Viene eseguita un'analisi dei componenti principali e gli spettri di carico vengono confrontati con gli spettri dei materiali di riferimento per selezionare il numero di componenti utilizzati nell'analisi finale della risoluzione della curva multivariata (MCR). Questo approccio ha esito positivo per l'estrazione di informazioni significative da un set di dati spettrale di grandi dimensioni.
Introduction
Negli studi clinici, la spettroscopia Raman confocale in vivo ha dimostrato la sua capacità unica di determinare lo spessore dello strato di corneo e il contenuto d'acqua1,2,3,4e di tracciare la penetrazione materiali attivi applicati topicamente alla pelle5,6. Come approccio non invasivo, la spettroscopia confocale Raman rileva i segnali molecolari in base alle modalità vibrazionali. Pertanto, l'etichettatura non è necessaria7. La spettroscopia Raman confocale in vivo fornisce informazioni chimiche con risoluzione di profondità basata sulla natura confocale della tecnica. Queste informazioni dipendenti dalla profondità sono molto utili per studiare gli effetti dei prodotti per la cura della pelle4,8, invecchiamento9,10, cambiamenti stagionali3, così come le malattie di funzione di barriera cutanea, come la dermatite atopica11,12. Ci sono molte informazioni nella regione ad alta frequenza della spettroscopia confocale Raman (2.500–4.000 cm-1), dove l'acqua produce picchi distinti nella regione tra 3.250–3.550 cm-1. Tuttavia, i picchi Raman di proteine e lipidi, che sono centrati tra circa 2.800-3.000 cm-1, si sovrappongono a vicenda perché i segnali sono prodotti principalmente da gruppi di metilene (-CH2-) e metili (-CH3)13 . Queste informazioni sovrapposte presentano una sfida tecnica quando si ottengono quantità relative di singole specie molecolari. Per risolvere questa sfida sono stati utilizzati il montaggio di picco14,15 e la posizione di picco selettiva12,16 approcci. Tuttavia, è difficile per questi singoli metodi basati sul picco estrarre le informazioni pure sui componenti perché più picchi Raman dallo stesso componente cambiano contemporaneamente17. Nella nostra recente pubblicazione18è stato proposto un approccio MCR per chiarire le informazioni pure sui componenti. Utilizzando questo approccio, tre componenti (acqua, proteine e lipidi) sono stati estratti da un grande set di dati spettroscopici Raman confocale in vivo.
L'esecuzione di grandi studi clinici può essere impegnativa per gli individui che raccolgono dati spettroscopici in vivo. In alcuni casi, l'acquisizione spettrale può richiedere attrezzature operative per molte ore in un giorno e lo studio può estendersi fino a settimane o mesi. In queste condizioni, i dati spettroscopici possono essere generati da operatori di apparecchiature che non dispongono delle competenze tecniche necessarie per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici. Il set di dati risultante può contenere una piccola frazione di outlier spettroscopici che devono essere identificati ed esclusi dai dati prima dell'analisi. Questo documento illustra in dettaglio un processo di analisi chemiometrica per "ripulire" un set di dati Clinico Raman prima di analizzare i dati con MCR. Per rimuovere correttamente gli outlier, è necessario identificare i tipi di outlier e la causa potenziale per la generazione degli spettri outlier. Quindi, è possibile sviluppare un approccio specifico per rimuovere gli outlier mirati. Ciò richiede una conoscenza preliminare del set di dati, inclusa una comprensione dettagliata del processo di generazione dei dati e della progettazione dello studio. In questo set di dati, la maggior parte degli outlier sono spettri bassi segnale-rumore e provengono principalmente da 1) spettri raccolti sopra la superficie della pelle (6.208 su 30.862) e 2) forte contributo allo spettro dalla luce della stanza fluorescente (67 su 30.862). Gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle producono una risposta Raman debole, poiché il punto focale laser si avvicina alla superficie della pelle ed è per lo più nella finestra dello strumento sotto la pelle. Gli spettri con un forte contributo dalla luce fluorescente della stanza vengono generati a causa dell'errore dell'operatore dello strumento o del movimento del soggetto, il che produce una condizione in cui la finestra di raccolta confocale Raman non è completamente coperta dal sito del corpo del soggetto. Sebbene questi tipi di artefatti spettrali possano essere identificati e corretti durante l'acquisizione spettrale da parte di un esperto spettroscopico al momento dell'acquisizione dei dati, gli operatori di strumenti addestrati utilizzati in questo studio sono stati istruiti a raccogliere tutti i dati, a meno che è stato osservato un guasto catastrofico. Il compito di identificare ed escludere gli outlier è incorporato nel protocollo di analisi dei dati. Il protocollo presentato è stato sviluppato per risolvere questa sfida. Per affrontare gli spettri basso segnale-rumore sopra la superficie della pelle, la posizione della superficie della pelle deve essere determinata prima per consentire la rimozione degli spettri raccolti sopra la superficie della pelle. La posizione della superficie della pelle è definita come la profondità in cui il punto focale laser Raman è la metà della pelle e la metà fuori della pelle, come illustrato nella figura supplementare 1. Dopo aver rimosso gli spettri bassi segnale-rumore, viene implementata un'analisi principale dei componenti (PCA) per estrarre il fattore dominato dai picchi di luce ambiente fluorescenti. Questi outlier vengono rimossi in base al valore del punteggio del fattore corrispondente.
Questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come vengono determinati sei componenti principali nel processo MCR. Questo viene fatto attraverso un'analisi PCA seguita da confronto forma spettrale tra i carichi per i modelli generati con un diverso numero di componenti principali. Il processo sperimentale per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento e dei soggetti umani è anche spiegato in dettaglio.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dell'Ospedale pediatrico di Pechino in conformità con le linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975. È stato condotto secondo le linee guida ICH per la buona pratica clinica. Lo studio ha avuto luogo da maggio a luglio 2015.
1. Collezione di spettri Raman confocali in vivo da soggetti umani con dermatite atopica
- Includere argomenti conformi ai seguenti criteri.
- Includere soggetti di età compresa tra 4 e 18 anni.
- Includere soggetti con dermatite atopica da lieve a moderata (punteggio di 2 o 3 secondo la valutazione globale del medico) con sintomi di malattia attivi sul 5%-30% della superficie corporea, con almeno due lesioni sulle braccia.
- Includere soggetti in buona salute, escludendo i sintomi direttamente correlati alla malattia di AD.
- Includere soggetti che forniscono il consenso informato scritto.
- Includere i soggetti con un valore ITA (Individual Topology Angle) superiore a 40 nella posizione di test.
- Escludere i soggetti che soddisfano uno dei seguenti criteri.
- Escludere i soggetti che stanno partecipando o che hanno precedentemente partecipato a uno studio clinico in qualsiasi struttura di prova nelle precedenti 4 settimane.
- Escludere soggetti con cancro o che sono stati diagnosticati o trattati per il cancro entro 5 anni prima dello studio.
- Escludere i soggetti diabetici.
- Escludere i soggetti affetti da una malattia immunologica o infettiva che potrebbe mettere il soggetto a rischio o interferire con l'accuratezza dei risultati dello studio (ad esempio, epatite, tubercolosi, HIV, AIDS, lupus o artrite reumatoide).
- Escludere i soggetti che hanno condizioni della pelle che potrebbero interferire con misurazioni strumentali o impediranno la chiara valutazione della pelle solo alla dermatite atopica. Esempi includono pelle estremamente secca, pelle danneggiata, tagli, graffi, scottature, segni di nascita, tatuaggi, cicatrici estese, eruzioni cutanee, crescita eccessiva dei capelli, o acne.
- Escludere i soggetti che utilizzano farmaci immunosoppressori orali, antibiotici o altre terapie sistemiche nell'ultimo mese, ad eccezione dei tranquillanti minori.
- Escludere i soggetti con qualsiasi altra condizione medica che, a parere dello sperimentatore, li impedisca di partecipare allo studio.
- Escludere i soggetti con una maggiore pigmentazione nell'area di prova.
- Etichettare l'area di lesione del partecipante allo studio della dermatite atopica e contrassegnare con un'area di 3 cm x 4 cm sul sito di lesione o vicino al sito di lesione, come illustrato nella Figura 1A.
- Etichettare l'area di non lesione con lo stesso indicatore nel sito del corpo della controparte (ad esempio, l'avambraccio sinistro contro l'avambraccio destro) come illustrato nella Figura 1B.
- Posizionare il sito del corpo contrassegnato a stretto contatto con la finestra dello strumento in vivo confocal Raman, come illustrato nella Figura 2A e Nella Figura 2B. Coprire l'intera finestra per evitare l'impatto della luce della stanza sul sito del corpo.
- Eseguire la raccolta dei dati Raman.
NOTA: Lo strumento ha una risoluzione spettrale di 2 cm-1 e 50x microscopia obiettivo (NA - 0,9 immersione olio), utilizzando un laser da 671 nm con una potenza di 17 mW. La lunghezza d'onda viene calibrata utilizzando lo spettro di una lampada al neon-argon integrata. La calibrazione dell'intensità viene eseguita misurando lo spettro di uno standard di calibrazione del vetro DEL NIST (National Institute of Standards).- Spostare lo stato attivo fino a quando non viene osservato uno spettro come illustrato nella Figura 2C, quindi spostare la messa a fuoco lontano dalla superficie della pelle di 10 m.
- Iniziare la raccolta dei dati per 26 fasi con una dimensione di passo di 2 m nella regione di frequenza 2.510 cm-1–4.000 cm-1. Utilizzare un tempo di esposizione di 1 s e misurare otto repliche per ogni area della durata totale di 10-15 min.
2. Raccolta di spettri confocali Raman da materiali di riferimento
- Collocare i materiali di riferimento, i principali componenti dello strato della pelle umana, il corneo19,sulla finestra dello strumento confocale Raman (vedi Tabella dei materiali: Bovine Serum Albumin (BSA), acqua divinonizzata (acqua DI), ceramide, colesterolo, acidi grassi e squalene).
- Raccogliere gli spettri Raman dei materiali di riferimento consecutivamente dall'esterno del materiale al centro del materiale utilizzando gli stessi parametri di raccolta descritti in precedenza.
- Integrare l'area sotto ogni spettrale Raman tra l'intervallo di 2.510-4.000 cm-1 e identificare i primi tre punti valore massimo in queste 26 misurazioni. Media degli spettri Raman da questi tre punti per ottenere gli spettri finali del materiale di riferimento.
3. Rimozione degli spettri outlier attraverso l'analisi chemiometrica
- Determinare la superficie della pelle e rimuovere gli spettri fuori pelle.
- Modificare l'estensione del file da '.ric' a '.mat' e caricare il file .mat sulla piattaforma software MATLAB.
- Correggere la linea di base utilizzando Linea di base (quadrati minimi ponderati automaticamente) facendo clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati importato in Analizza . Altri strumenti Pre-elaborazione nel software PLS_Toolbox con impostazione predefinita.
- Sommare i valori compresi tra 2.910–2.965 cm-1 per ottenere i valori di intensità in ogni spettro Raman dalla misurazione di 26 passi consecutivi, come illustrato nella Figura 3A tramite la funzione sum in MATLAB.
- Interpolare il valore di offset dello strumento (valore nell'asse X nella figura 3B) da 26 a 260 utilizzando la funzione linspace in MATLAB.
- Interpolare il valore di intensità da 26 a 260 utilizzando il metodo spline in MATLAB, sfruttando i valori di posizione 260 appena generati.
- Utilizzare le funzioni polifit e polivale di MATLAB per ottenere il nuovo insieme di valori di intensità con 260 punti. In primo luogo, utilizzare i valori di posizione e intensità 260 come input X e Y per la funzione polifit, rispettivamente. Impostare il valore del grado su 20. Quindi, utilizzare i coefficienti di output e i 260 valori di posizione estesa come input per il polivale per ottenere i valori di intensità 260 finali.
- Utilizzare le funzioni max e min di MATLAB per identificare i punti massimi e minimi dai valori di intensità 260 appena interpolati.
- Calcolare il valore dell'intensità media dividendo la somma del valore di intensità massima e minima per due.
- Identificare il valore di intensità dai valori di intensità 260 (calcolati dal punto 3.1.6) più vicino al valore di intensità media e impostare il valore della posizione corrispondente come superficie della pelle. Impostare questo valore di posizione come punto zero nell'asse X come illustrato nella Figura 3B.
- Modificare tutti gli altri valori di posizione in base al punto zero e alla dimensione nota del passo di 2 m.
- Rimuovere tutti gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle in base al loro valore di posizione.
- Importare il resto dei dati in PLS_Toolbox per creare un set di dati e rinominarlo "RamanData.mat".
- Rimuovere gli spettri outlier con l'effetto di luce della stanza.
- Caricare il set di dati degli spettri Raman (RamanData.mat) dopo la rimozione degli spettri fuori interfaccia e implementare l'analisi PCA.
- Caricare il set di dati nel software PLS_Toolbox nella piattaforma MATLAB e fare clic con il pulsante destro del mouse sul dataset per scegliere Analizza . PCA.
- Selezionare Normalizza come approccio di pre-elaborazione e scegliere Nessuno per la convalida incrociata.
- Utilizzare i tre componenti per l'analisi di scomposizione PCA, come illustrato nella figura 2 supplementare.
- Rimuovere il coperchio nella finestra di raccolta dello strumento Raman in vivo e raccogliere gli spettri della luce ambiente nella regione ad alta frequenza utilizzando gli stessi parametri utilizzati per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento.
- Identificare il fattore di effetto della luce della stanza attraverso il confronto con gli spettri di sfondo della luce della stanza, come mostrato nella Figura 3 supplementare.
- Rimuovere gli spettri con un valore di punteggio corrispondente significativamente più alto del normale (più del 99,8% dei valori di punteggio dell'intero set di dati, ovvero 0,16 in questo studio).
4. Selezione del numero dei componenti nell'analisi della decomposizione MCR
- Correggere la linea di base degli spettri Raman utilizzando lo stesso approccio descritto in precedenza (sezione 3.1.2).
- Eseguire l'analisi PCA sul set di dati pre-elaborato come descritto in precedenza (sezione 3.2) ad eccezione della selezione di "PQN" – "Mean Center" anziché "Normalize" e tracciare i valori eigenvalues in scala logaritmica insieme al numero di componenti (20) come numero predefinito in l'analisi di scomposizione facendo clic sul pulsante Scegli componenti e selezionare log(eigenvalues) come valore Y. Scegliere da tre a otto come numero di componenti utilizzati per l'analisi MCR.
- Eseguire l'analisi MCR.
- Caricare il set di dati nel software MCR_main20 tramite il pulsante Selezione dati.
- Scegliere il numero di componenti (da tre a otto) facendo clic sul pulsante Determinazione del numero di componenti.
- Fare clic sul pulsante Pure nella scheda Stima iniziale, selezionare Concentrazione nella scheda Direzione selezione variabile e fare clic sul pulsante Fai.
- Fare clic sul pulsante OK e quindi sul pulsante Continua alla pagina successiva.
- Fare clic su Continua nella pagina successiva, quindi selezionare fnnls e 6 rispettivamente nelle schede Implementazione e Nr. delle specie con profili non negatività. Fare clic sul pulsante Continua.
- Scegliere gli stessi parametri della sezione 4.3.5 per questa pagina e fare clic su Continua.
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Representative Results
In questo studio clinico, sono stati raccolti spettri Raman confocali in vivo da 28 soggetti dai 4 ai 18 anni. Un totale di 30.862 spettri Raman sono stati raccolti con il protocollo di raccolta dati di cui sopra. Questo set di dati spettrale di grandi dimensioni contiene outlier spettrali del 20%, come illustrato nella figura 4A. Gli spettri outlier basso segnale-rumore sono stati rimossi dopo aver determinato la superficie della pelle, seguito dalla PCA per identificare gli spettri con caratteristiche di luce ambiente. Il terzo fattore in questo modello PCA è identificato picchi di luce stanza. Ciò è confermato dal confronto degli spettri di carico del fattore 3 con uno spettro di luce fluorescente della stanza raccolta separatamente nel sito di studio utilizzando lo stesso strumento confocale Raman (vedi Figura supplementare 3). Figura 4 B indica che la maggior parte degli spettri anomali sono stati rimossi dopo questo processo.
La PCA è stata eseguita sul set di dati Raman confocale pre-elaborato e l'eigenvalue insieme al numero di fattori utilizzati sono tracciati nella Figura 5. Secondo gli studi precedenti12,19, il modello dovrebbe includere almeno tre componenti: acqua, proteine e lipidi. Una diminuzione significativa di eigenvalue è stata osservata per il fattore 9, come illustrato nella figura 5. Questa osservazione suggerisce di studiare modelli con il numero di componenti principali che varia da tre a otto fattori per l'inclusione nel modello MCR. I carichi MCR che contengono caratteristiche spettroscopiche più coerenti con proteine, acqua e lipidi sono illustrati nella Figura 6.
Figura 1 . Illustrazione del segno di lesione e non di lesione sull'avambraccio. (A) Un'area contrassegnata di 3 cm x 4 cm su un sito di lesione. (B) Un'area contrassegnata di 3 cm x 4 cm su un sito non a lesione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Illustrazione della raccolta confocale di dati Raman. (A) Strumento Confocal Raman. (B) Raccolta spectra sull'avambraccio del soggetto umano. (C) Cattura di schermata per determinare la posizione di riferimento per la raccolta dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Determinazione della superficie della pelle. (A) Integrazione dell'area proteica sotto ogni spettro Raman. (B) Impostazione della superficie della pelle in base ai punti massimo e minimo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Spettri del set di dati Raman. (A) Spettri Confocal Raman prima della rimozione degli spettri outlier. (B) Spettri Confocal Raman dopo la rimozione degli spettri outlier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Determinazione del numero di componenti dall'analisi PCA. (A) Eigenvalue su una scala logaritmica tracciata in funzione del numero di componenti utilizzati nel modello PCA. (B) Differenza nei valori eigeni tra i componenti 'n' e 'n ' 1' Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6 . Confronto tra la forma di carico e gli spettri dei materiali di riferimento corrispondenti con tre-otto componenti nel modello MCR. (A) L'acqua(B)eifattori lipidici con tre-otto componenti nel modello MCR rispetto rispettivamente agli spettri di riferimento BSA, acqua e lipidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 . I tre carichi aggiuntivi del modello MCR a sei componenti non utilizzati nel modello finale. Questi tre componenti MCR sono dominati da artefatti di fluorescenza e linea di base. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1. Illustrazione della determinazione della superficie della pelle in cui il centro della messa a fuoco laser tocca la pelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2. Illustrazione della selezione di tre componenti nell'analisi PCA del software PLS_Toolbox. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 3. Identificazione del fattore di carico dominato dalla luce ambiente sovrapposta su uno spettro di riferimento della luce del locale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 4. Confronto dei carichi dal modello MCR prima e dopo la rimozione dei raggi cosmici. (A), (B) e (C) sono i fattori che rappresentano rispettivamente acqua, proteine e lipidi. I fattori di caricamento aggiuntivi non utilizzati nel modello MCR finale sono d, e f. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 5. Raman spettri di materiali lipidici tipici in strato cornea. (A)Colesterolo 3-solfato sodio e colesterolo. (B) Acido oleico, palmitico, palmitoleico e stearico. (C) Squalene. (D) N-behenoyl-D-erythro-sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine e D-Erythro-Dihyrosphingosine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Durante la raccolta dei dati, come descritto nei paragrafi 2 e 3 del protocollo, ogni profilo di profondità è stato raccolto in un'area con contatto tra la finestra dello strumento e la pelle trovando le aree più scure dalle immagini microscopiche evidenziate nei cerchi rossi in Figura 2C. Una volta individuate queste aree, è stato fondamentale iniziare il profilo di profondità sopra la superficie della pelle per determinare con precisione la posizione della superficie della pelle per la procedura di analisi dei dati. La posizione della superficie della pelle è stata successivamente utilizzata per determinare la profondità relativa di ogni spettro nel profilo di profondità corrispondente. Come accennato nella sezione 1 del protocollo, l'avvio del profilo di profondità di 10 m sopra la superficie cutanea produce cinque punti dati all'esterno dello skin. Ciò consente di determinare con successo le posizioni dell'intensità massima e minima del segnale su entrambi i lati della superficie della pelle. È anche importante evitare di misurare le posizioni che contengono segni di penna e aree pigmentate più elevate come le lentiggini, perché queste aree producono un segnale di sfondo ad alta fluorescenza. La selezione del tempo di esposizione è un equilibrio tra qualità spettrale e durata di misurazione. Un tempo di esposizione più lungo migliora il segnale al rumore e aumenta significativamente il tempo di misurazione complessivo. Tuttavia, molti soggetti trovano difficile rimanere immobili per lunghi periodi di tempo. Questo è estremamente impegnativo per i bambini, per esempio. L'aumento della potenza del laser aumenta il segnale al rumore. Tuttavia, troppa potenza può danneggiare la pelle a causa dell'assorbimento dell'energia. Non è possibile superare le esposizioni massime consentite, la potenza laser di 17 mW definita dallo standard nazionale cinese (GB 7247.1-2012) e lo standard internazionale di sicurezza laser (IEC 60285-1:2007; <20 mW per 671 nm e <30 mW per 785 nm). Altre precauzioni di sicurezza includono la garanzia che ogni soggetto indossi la protezione degli occhi prima dell'acquisizione dei dati, che i siti del corpo abbiano un valore dell'angolo di topologia individuale (ITA) superiore a 40 ed evitare le aree con elevata pigmentazione della pelle.
Per determinare la posizione della superficie della pelle, l'area sotto il picco proteico Raman (2.910-2.965 cm-1) è stata integrata per ottenere il profilo di profondità del segnale proteico. Gli spettri Raman sono stati corretti per la prima volta utilizzando il metodo automatizzato ponderato minimo quadrato di PLS_Toolbox prima dell'integrazione dei picchi. I 26 punti dati da un profilo di profondità sono stati interpolati a 260 punti utilizzando il metodo linspace per il vaue di offset dello strumento (valore dell'asse X nella figura 3A)e il metodo spline per il valore di intensità corrispondente. I dati risultanti sono stati interpolati su un polinomio di 20esimo ordine utilizzando le funzioni polifit e polivaliche in MATLAB ed è stato determinato il numero massimo e minimo dei dati interpolati. Il valore dell'intensità media è stato calcolato dividendo la somma dei valori massimo e minimo per 2. La superficie della pelle è stata definita come la posizione in cui il valore di intensità del profilo di profondità interpolato era più vicino all'intensità media. Non è necessario che l'esatta posizione della superficie cutanea coincida con un punto dati sperimentale. Questo metodo può misurare solo una profondità limitata della pelle a causa dell'assorbimento e della dispersione del fascio21. La raccolta di dati spettroscopici al di sotto dei 50 dollari sotto la superficie della pelle può richiedere modifiche significative ai parametri sperimentali.
Come descritto nella sezione 3 del protocollo, dopo la rimozione degli spettri outlier con basso segnale-rumore e alto contributo dalle luci della stanza, una piccola frazione di spettri contenenti raggi cosmici è rimasta nel set di dati. Un confronto degli spettri di carico generati prima e dopo la rimozione dei raggi cosmici è mostrato nella Figura supplementare 4. Un confronto degli spettri di carico mostrato nella Figura supplementare 4 indica che l'impatto di un piccolo numero di spettri con raggi cosmici era trascurabile. I tre fattori che rappresentavano acqua, proteine e lipidi erano identici, e anche i tre carichi aggiuntivi associati al rumore e agli artefatti spettrali erano molto simili. Ciò potrebbe essere attribuito a una bassa incidenza di raggi cosmici negli spettri (0,25%) perché la posizione dei raggi cosmici negli spettri è casuale.
La selezione del numero dei componenti utilizzati nell'analisi MCR è fondamentale, perché l'interpretazione della forma dei carichi in termini di specie molecolari corrispondenti responsabili di ogni carico influisce in modo significativo sia sul modo in cui il punteggio corrispondente vengono utilizzati i valori e le prestazioni complessive del metodo. Come descritto nella sezione 4 del protocollo, PCA è stato eseguito per primo per studiare l'evoluzione del valore eigenvalue associato all'aumento del numero dei componenti. Questa indagine è stata utilizzata per identificare il numero di componenti che devono essere utilizzati nell'analisi MCR successiva. La tracciatura dell'eigenvalue su una scala logaritmica può semplificare questo processo di identificazione rispetto all'esame dei valori eigen, come illustrato nella Figura 5A. Ogni eigenvalue è una rappresentazione della varianza che un componente può acquisire. Maggiore è l'eigenvalue, maggiore è la varianza che questo componente può modellare negli spettri. I valori eigen di dimensioni simili devono essere selezionati o eliminati insieme22. Seguendo questa linea guida, due, cinque e otto componenti sono stati presi in considerazione per l'analisi MCR perché i componenti tre, quattro e cinque producono eigenvalues di dimensioni simili. Una tendenza simile è stata osservata anche per i componenti sei, sette e otto. Figura 5 B è un grafico della differenza nei eigenvalues tra i componenti 'n' e 'n' 1 che mostrano la massima locale dopo il secondo, il quinto e l'ottavo componente. Conoscenze precedenti sulla composizione molecolare della pelle combinata con il progetto dello studio supportano un minimo di tre componenti necessari per modellare gli spettri Raman ad alta frequenza. Pertanto, sono stati studiati più modelli MCR contenenti da tre a otto componenti e i carichi sono stati confrontati con gli spettri dei materiali di riferimento per identificare i componenti chiave necessari per il modello finale.
Il confronto dei carichi con gli spettri Raman dai materiali di riferimento consente facilmente di identificare e assegnare due dei componenti MCR finali alle proteine e all'acqua perché dominano i carichi MCR per tutti i modelli testati e corrispondono al riferimento corrispondente spettri, che sono BSA e DI acqua. Tuttavia, le proprietà spettroscopiche previste del lipidico in alcuni dei componenti MCR erano una corrispondenza più debole allo spettro di riferimento dei lipidi illustrato nei modelli MCR che contengono tre e quattro componenti. Inoltre, sono stati osservati picchi proteici residui (2.840-3.000 cm-1) nei carichi d'acqua MCR per tutti i modelli testati al di sotto di sei componenti. Sulla base di queste osservazioni, un modello MCR a sei componenti è stato utilizzato nell'analisi finale dell'MCR. Tre dei sei componenti sono stati assegnati all'acqua, alle proteine e ai lipidi abbinando il loro spettro di carico allo spettro di riferimento corrispondente. L'interpretazione e l'assegnazione del fattore lipidico si basa sul confronto del carico agli spettri Raman di tre materiali rappresentativi della ceramide, tra cui N-behenoyl-D-erythro-sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine, e D-Erythro-Dihyrosphingosine. Sono stati esaminati anche gli spettri Raman di altri materiali lipidici nello strato corneo. Questi materiali includono acidi grassi (oleico, palmico, palmitoleico, e acido steasrico), colesterolo (colesterolo 3 solfato sodio e colesterolo), e squalene, come mostrato nella Figura supplementare 5. Il fattore lipidico utilizzato nel modello MCR finale era una forte corrispondenza con gli spettri della ceramide e coerente con altri materiali che contengono idrocarburi a catena lunga. Gli altri tre componenti MCR erano dominati dalla fluorescenza e dagli artefatti della linea di base e i loro valori di punteggio corrispondenti non sono stati utilizzati in alcun calcolo. Questi tre componenti sono illustrati nella Figura 7.
L'approccio di analisi generale presentato in questo manoscritto produce un metodo finale con una maggiore specificità e precisione per misurare i componenti chiave della pelle rispetto ad altri approcci di picco singolo o di adattamento al picco. Questa metodologia dimostra che i componenti critici possono essere estratti da un set di dati clinico che contiene una frazione relativamente piccola degli spettri non critici. Gli sforzi futuri si concentrano sull'automazione di questa metodologia in un pacchetto software per migliorarne l'efficienza e ridurre la quantità di competenze tecniche necessarie per l'analisi. Una metodologia simile è in fase di sviluppo per gli spettri Raman raccolti nella regione delle impronte digitali (400-1.800 cm-1) utilizzando una fonte laser da 785 nm piuttosto che il laser da 671 nm incorporato nello stesso strumento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono molto il sostegno finanziario del dipartimento di assistenza alla pulizia della pulizia aziendale. Vogliamo esprimere la nostra gratitudine ai direttori associati analitici Ms. Jasmine Wang e Dr. Robb Gardner per la loro guida e supporto e la signora Li Yang per il suo aiuto sulla raccolta dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
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