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Chemistry

एक केमोमीट्रिक दृष्टिकोण के माध्यम से Stratum Corneum के Vivo Confocal रमन स्पेक्ट्रा में से पानी, प्रोटीन, और लिपिड को हल करने

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/60186
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 4, 4, 2, 2
1Procter and Gamble, Beijing Innovative center, 2Procter and Gamble, Mason Business Center, 3Department of Dermatology, Beijing Children's Hospital, 4Chinese Academy of Inspection and Quarantine
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम नैदानिक अध्ययन में मानव विषयों से confocal रमन स्पेक्ट्रम के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत वर्णक्रमीय बाहरी हटाने और प्रमुख विशेषताओं के बाद निष्कर्षण के लिए chemometric दृष्टिकोण के साथ संयुक्त.

Abstract

विवो कोनफोकल रमन स्पेक्ट्रोस्कोपिक विधि में इसका विकास मानव विषयों में गहराई संकल्प के साथ पानी, प्रोटीन, और लिपिड के प्रत्यक्ष माप को सक्षम बनाता है। यह जानकारी त्वचा से संबंधित रोगों और त्वचा देखभाल उत्पाद के प्रदर्शन की विशेषता के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल confocal रमन स्पेक्ट्रम संग्रह और वर्णक्रमीय डेटासेट के बाद विश्लेषण chemometrics लाभ के लिए एक विधि दिखाता है. इस विधि का लक्ष्य डेटा संग्रह के लिए एक मानक प्रोटोकॉल स्थापित करना और डेटा विश्लेषण के लिए सामान्य मार्गदर्शन प्रदान करना है. नैदानिक अध्ययनों से बड़े डेटासेट संसाधित करते समय पूर्व प्रसंस्करण (जैसे, बाहरी स्पेक्ट्रम को हटाना) एक महत्वपूर्ण कदम है। एक उदाहरण के रूप में, हम बाहरी लोगों के प्रकार की पहचान करने और उन्हें निकालने के लिए विशिष्ट कार्यनीतियां विकसित करने के लिए डेटासेट के पूर्व ज्ञान के आधार पर मार्गदर्शन प्रदान करते हैं. एक प्रमुख घटक विश्लेषण किया जाता है, और लोडिंग स्पेक्ट्रा अंतिम बहुचर वक्र संकल्प (एमसीआर) विश्लेषण में इस्तेमाल घटकों की संख्या का चयन करने के लिए संदर्भ सामग्री से स्पेक्ट्रम के साथ तुलना कर रहे हैं. यह प्रकिया एक बड़े वर्णक्रमीय डेटासेट से सार्थक जानकारी निकालने में सफल होता है.

Introduction

नैदानिक अध्ययनों में, विवो कॉन्फोकल रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी में स्तर कॉर्नियम मोटाई और पानी की सामग्री का निर्धारण करने के लिए अपनी अनूठी क्षमता दिखाया गया है1,2,3,4, और के प्रवेश पर नज़र रखने सक्रिय सामग्री शीर्ष त्वचाके लिए लागू 5,6. एक noninvasive दृष्टिकोण के रूप में, confocal रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी कंपन मोड के आधार पर आणविक संकेतों का पता लगाता है. इस प्रकार लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है7. विवो कॉन्फोकल में रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक के confocal प्रकृति के आधार पर गहराई संकल्प के साथ रासायनिक जानकारी प्रदान करता है. यह गहराई से निर्भर जानकारी त्वचा देखभाल उत्पादोंकेप्रभाव का अध्ययन करने में बहुत उपयोगी है 4 ,8,उम्र बढ़ने9,10, मौसमी परिवर्तन3, साथ ही त्वचा बाधा समारोह रोगों , जैसे कि एटोपिक जिल्द की सूजन11,12. confocal रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (2,500-4,000 सेमी-1)के उच्च आवृत्ति क्षेत्र में जानकारी का एक बहुत कुछ है, जहां पानी 3,250-3,550 सेमी-1के बीच क्षेत्र में अलग चोटियों का उत्पादन करता है। हालांकि, प्रोटीन और लिपिड की रमन चोटियों, जो लगभग 2,800-3,000 सेमी-1के बीच केंद्रित हैं, एक दूसरे को ओवरलैप करते हैं क्योंकि सिग्नल मुख्य रूप से मेथिलीन (-सीएच2-) और मिथाइल (-सीएच3) समूहों 13 से उत्पादित होते हैं . व्यक्तिगत आणविक प्रजातियों के सापेक्ष मात्रा प्राप्त करते समय यह अति व्याप्त जानकारी एक तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करती है। पीक फिटिंग14,15 और चयनात्मक शिखर स्थिति12,16 दृष्टिकोण इस चुनौती को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इन एकल शिखर आधारित विधियों के लिए शुद्ध घटक जानकारी निकालना मुश्किल है क्योंकि एक ही घटक से कई रमन चोटियों एक साथ17बदल जाते हैं। हमारे हाल के प्रकाशन18में , एक एमसीआर दृष्टिकोण शुद्ध घटक जानकारी स्पष्ट करने का प्रस्ताव किया गया था. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, तीन घटकों (पानी, प्रोटीन, और लिपिड) vivo confocal रमन स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटासेट में एक बड़े से निकाले गए थे.

बड़े नैदानिक अध्ययन के निष्पादन vivo स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा में इकट्ठा व्यक्तियों पर मांग की जा सकती है. कुछ मामलों में, वर्णक्रमीय अधिग्रहण एक दिन में कई घंटे के लिए ऑपरेटिंग उपकरण की आवश्यकता कर सकते हैं और अध्ययन सप्ताह या महीनों तक का विस्तार कर सकते हैं. इन शर्तों के तहत, स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा की पहचान करने के लिए तकनीकी विशेषज्ञता की कमी है कि उपकरण ऑपरेटरों द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है, बाहर, और स्पेक्ट्रोस्कोपिक कलाकृतियों के सभी स्रोतों के लिए सही. परिणामस्वरूप डेटा सेट की पहचान की और विश्लेषण से पहले डेटा से बाहर रखा जा करने की आवश्यकता है कि स्पेक्ट्रोस्कोपिक outliers का एक छोटा सा अंश हो सकता है. इस कागज में विस्तार से एक chemometric विश्लेषण प्रक्रिया दिखाता है "साफ" एक नैदानिक रमन डेटासेट एमसीआर के साथ डेटा का विश्लेषण करने से पहले. सफलतापूर्वक outliers को दूर करने के लिए, outliers के प्रकार और बाहरी स्पेक्ट्रम की पीढ़ी के लिए संभावित कारण की पहचान की जरूरत है. फिर, लक्षित बाहरी लोगों को हटाने के लिए एक विशिष्ट दृष्टिकोण विकसित किया जा सकता है। इसके लिए डेटासेट के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता होती है, जिसमें डेटा उत्पादन प्रक्रिया और अध्ययन डिज़ाइन के बारे में विस्तृत जानकारी शामिल है. इस डेटासेट में, आउटलाइअर्स के बहुमत कम संकेत-से-शोर स्पेक्ट्रम होते हैं और मुख्य रूप से 1) त्वचा की सतह के ऊपर एकत्र स्पेक्ट्रम से उत्पन्न होते हैं (6,208 30,862 में से, और 2) फ्लोरोसेंट रूम लाइट से स्पेक्ट्रम के लिए मजबूत योगदान (30,862 में से 67)। स्पेक्ट्रा त्वचा की सतह के ऊपर एकत्र एक कमजोर रमन प्रतिक्रिया का उत्पादन, लेजर फोकल बिंदु त्वचा की सतह दृष्टिकोण के रूप में और त्वचा के नीचे साधन खिड़की में ज्यादातर है. फ्लोरोसेंट कमरे प्रकाश से एक मजबूत योगदान के साथ Spectra या तो साधन ऑपरेटर त्रुटि या विषय आंदोलन है, जो एक शर्त है जहाँ confocal रमन संग्रह खिड़की पूरी तरह से विषय के शरीर साइट द्वारा कवर नहीं है पैदा की वजह से उत्पन्न कर रहे हैं. हालांकि वर्णक्रमीय कलाकृतियों के इन प्रकार की पहचान की जा सकती है और डेटा अधिग्रहण के समय एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक विशेषज्ञ द्वारा वर्णक्रमीय अधिग्रहण के दौरान remediated, इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रशिक्षित साधन ऑपरेटरों सभी डेटा एकत्र करने के लिए निर्देश दिए गए थे जब तक एक भयावह विफलता देखी गई. आउटलियर्स की पहचान करने और उन्हें बाहर करने का कार्य डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस चुनौती को हल करने के लिए विकसित की है. त्वचा की सतह के ऊपर कम संकेत करने वाली शोर स्पेक्ट्रम को संबोधित करने के लिए, त्वचा की सतह के ऊपर एकत्र स्पेक्ट्रम को हटाने की अनुमति देने के लिए पहले त्वचा की सतह के स्थान को निर्धारित करने की आवश्यकता है। त्वचा की सतह के स्थान को उस गहराई के रूप में परिभाषित किया गया है जहां रमन लेजर फोकल बिंदु त्वचा में आधा और त्वचा का आधा भाग है जैसा कि पूरक चित्र 1में सचित्र दिया गया है . कम संकेत करने वाली शोर स्पेक्ट्रम को हटाने के बाद, एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) फ्लोरोसेंट कमरे प्रकाश चोटियों का प्रभुत्व कारक निकालने के लिए लागू किया गया है। ये बाहरी लोग इसी कारक के स्कोर मूल्य के आधार पर हटा दिए जाते हैं।

इस प्रोटोकॉल कैसे छह मुख्य घटक MCR प्रक्रिया में निर्धारित किया जाता है के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। यह मुख्य घटकों की एक अलग संख्या के साथ उत्पन्न मॉडल के लिए लोडिंग के बीच वर्णक्रमीय आकार तुलना के बाद एक पीसीए विश्लेषण के माध्यम से किया जाता है. संदर्भ सामग्री के डेटा संग्रह के साथ-साथ मानव विषयों के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया को भी विस्तार से समझाया गया है।

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Protocol

इस अध्ययन हेलसिंकी की 1975 घोषणा के नैतिक दिशा निर्देशों के अनुपालन में बीजिंग बाल अस्पताल की संस्थागत समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. यह अच्छा नैदानिक अभ्यास के लिए आईसीएच दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था. यह अध्ययन मई से जुलाई 2015 तक हुआ।

1. एटोपिक जिल्द की सूजन के साथ मानव विषयों से विवो confocal रमन स्पेक्ट्रम का संग्रह

  1. निम्नलिखित मानदंडों के अनुपालन में विषयों को शामिल करें।
    1. 4-18 की उम्र के बीच विषयों को शामिल करें.
    2. शरीर की सतह के 5%-30% पर सक्रिय रोग के लक्षणों के साथ हल्के से मध्यम एटोपिक जिल्द की सूजन (चिकित्सक के वैश्विक मूल्यांकन के अनुसार 2 या 3 के स्कोर) के साथ विषयों को शामिल करें, बाहों पर कम से कम दो घावों के साथ।
    3. अच्छे स्वास्थ्य में हैं कि विषयों को शामिल करें, सीधे विज्ञापन रोग से संबंधित लक्षणों को छोड़कर.
    4. ऐसे विषय शामिल करें जो लिखित सूचित सहमति प्रदान करते हैं.
    5. परीक्षण स्थान पर 40 से अधिक एक व्यक्तिगत टोपोलॉजी कोण (ITA) मान है विषयशामिल करें।
  2. उन विषयों को शामिल न करें जो निम्न में से किसी भी मापदंड को पूरा करते हैं.
    1. विषयों है कि या तो वर्तमान में भाग ले रहे हैं या पहले पिछले 4 सप्ताह के भीतर किसी भी परीक्षण की सुविधा में एक नैदानिक अध्ययन में भाग लिया है शामिल नहीं है.
    2. कैंसर के साथ विषयों को छोड़ दें या कि निदान किया गया है या अध्ययन से पहले 5 साल के भीतर कैंसर के लिए इलाज किया.
    3. मधुमेह के विषयों को छोड़ दें।
    4. उन विषयों को छोड़ दें जिनके पास इम्यूनोलॉजिक या संक्रामक बीमारी है जो विषय को जोखिम में डाल सकते हैं या अध्ययन परिणामों की सटीकता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं (यानी, हेपेटाइटिस, तपेदिक, एचआईवी, एड्स, ल्यूपस, या रूमेटोइड गठिया)।
    5. विषयों है कि त्वचा की स्थिति है कि वाद्य माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं या केवल atopic जिल्द की सूजन के लिए त्वचा का स्पष्ट आकलन को रोकने जाएगा बाहर निकलें. उदाहरण अत्यंत शुष्क त्वचा, क्षतिग्रस्त त्वचा, कटौती, खरोंच, सनबर्न, birthmarks, टैटू, व्यापक scarring, चकत्ते, अत्यधिक बाल विकास, या मुँहासे शामिल हैं.
    6. उन विषयों को छोड़ दें जो पिछले महीने के भीतर मौखिक इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं, एंटीबायोटिक दवाओं, या अन्य प्रणालीगत उपचारों का उपयोग करते हैं, मामूली प्रशांतकों को छोड़कर।
    7. किसी भी अन्य चिकित्सा शर्तों के साथ विषयों को शामिल नहीं है कि, अन्वेषक की राय में, उन्हें अध्ययन भागीदारी से precludes.
    8. परीक्षण क्षेत्र में उच्च pigmentation के साथ विषयों को शामिल नहीं.
  3. एटोपिक जिल्द की सूजन अध्ययन भागीदार के घाव क्षेत्र को लेबल करें और चित्र 1कमें दर्शाए अनुसार घाव स्थल पर या उसके निकट 3 सेमी x 4 सेमी क्षेत्र के साथ चिह्नित करें।
  4. समकक्ष शरीर साइट में एक ही मार्कर के साथ गैर-लेशन क्षेत्र लेबल (उदाहरण के लिए, बाएं बांह बनाम सही बांह) के रूप में चित्र 1Bमें दिखाया गया है।
  5. चित्र 2ए और चित्र 2ख में दर्शाए अनुसार इन विवो कॉन्फोकल रमन यंत्र की खिड़की के निकट संपर्क में चिह्नित शरीर स्थल को रखें। शरीर की साइट पर कमरे की रोशनी के प्रभाव से बचने के लिए पूरी खिड़की को कवर करें।
  6. रमन डेटा संग्रह प्रदर्शन.
    नोट: साधन 2 सेमी-1 और 50x माइक्रोस्कोपी उद्देश्य (एनए $ 0.9 तेल विसर्जन) का एक वर्णक्रमीय संकल्प है, 17 mW की शक्ति के साथ एक 671 एनएम लेजर का उपयोग कर. तरंगदैर्ध्य एक निर्मित नीयन-आर्गन दीपक के स्पेक्ट्रम का उपयोग कर calibrated है। तीव्रता अंशांकन एक NIST के स्पेक्ट्रम को मापने के द्वारा किया जाता है (राष्ट्रीय मानक संस्थान) कांच अंशांकन मानक.
    1. फोकस को तब तक ले जाएं जब तक कि चित्र 2ग में दर्शाए अनुसार स्पेक्ट्रम को देखा जाए, तब फोकस को त्वचा की सतह से 10 डिग्री सेल्सियस दूर ले जाएं।
    2. 2,510 सेमी-1-4,000 सेमी-1 आवृत्ति क्षेत्र में 2 $m चरण आकार के साथ 26 चरणों के लिए डेटा संग्रह प्रारंभ करें। 1 s के एक जोखिम समय का उपयोग करें और प्रत्येक क्षेत्र के लिए आठ प्रतिकृति उपाय $ 10-15 न्यूनतम कुल स्थायी.

2. संदर्भ सामग्री से confocal रमन स्पेक्ट्रम का संग्रह

  1. संदर्भ सामग्री प्लेस, मानव त्वचा स्तर corneum19में प्रमुख घटक, confocal रमन साधन की खिड़की पर (सामग्री की मेजदेखें: बोवाइन सीरम Albumin (BSA), deionized पानी (DI पानी), ceramide, कोलेस्ट्रॉल, मुक्त फैटी एसिड, और स्क्वालीन).
  2. संदर्भ सामग्री ले लीजिए' रमन स्पेक्ट्रम लगातार सामग्री के बाहर से सामग्री के केंद्र के लिए ऊपर वर्णित के रूप में एक ही संग्रह मापदंडों का उपयोग कर.
  3. 2,510-4,000 सेमी-1 की सीमा के बीच प्रत्येक रमन स्पेक्ट्रम के तहत क्षेत्र को एकीकृत और इन 26 माप में शीर्ष तीन अधिकतम मूल्य अंक की पहचान. अंतिम संदर्भ सामग्री स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए उन तीन बिंदुओं से रमन स्पेक्ट्रम औसत.

3. chemometrics विश्लेषण के माध्यम से बाहरी स्पेक्ट्रम को हटाना

  1. त्वचा की सतह का निर्धारण और बाहर के त्वचा स्पेक्ट्रम को हटा दें.
    1. फ़ाइल एक्सटेंशन को '.ric' से '.mat' में बदलें और .mat फ़ाइल को MATLAB सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म पर लोड करें.
    2. विश्लेषण के अंतर्गत आयातित डेटासेट पर राइट-क्लिक करके आधार रेखा (स्वचालित भारित कम से कम वर्ग) का उपयोग करके आधार रेखा को ठीक करें | अन्य उपकरण ] डिफ़ॉल्ट सेटिंग के साथ PLS-Toolbox सॉफ्टवेयर में पूर्व प्रसंस्करण.
    3. MATLAB में योग फ़ंक्शन के माध्यम से चित्र 3A में दर्शाए अनुसार प्रत्येक रमन स्पेक्ट्रम के अंतर्गत तीव्रता मान प्राप्त करने के लिए 2,910-2,965 cm-1 के बीच मानों का योग करें।
    4. साधन ऑफसेट मान (चित्र 3ठमें X-अक्ष में मान ) 26-260 MATLAB में linspace फ़ंक्शन का उपयोग करके interpolate.
    5. MATLAB में स्लाइन विधि का उपयोग करके तीव्रता मान को 26 से 260 तक Interpolate करें, नए-जनरेट किए गए 260 स्थिति मानों का लाभ उठाते हुए.
    6. 260 अंक के साथ तीव्रता मूल्यों का नया सेट प्राप्त करने के लिए MATLAB के polyfit और polyval कार्यों का उपयोग करें। सबसे पहले, polyfit समारोह के लिए एक्स और वाई आदानों के रूप में 260 स्थिति और तीव्रता मूल्यों का उपयोग करें, क्रमशः. डिग्री मान को 20 पर सेट करें. उसके बाद, अंतिम 260 तीव्रता मान प्राप्त करने के लिए polyval के लिए इनपुट के रूप में आउटपुट गुणांक और 260 विस्तारित स्थिति मान का उपयोग करें।
    7. नए interpolated 260 तीव्रता मान से अधिकतम और न्यूनतम अंक की पहचान करने के लिए MATLAB की अधिकतम और न्यूनतम कार्यों का उपयोग करें।
    8. अधिकतम और न्यूनतम तीव्रता मान के योग को दो से विभाजित करके माध्य तीव्रता मान की गणना कीजिए।
    9. 260 तीव्रता मानों से तीव्रता मान की पहचान करें (चरण 3.1.6) से गणना की गई जो माध्य तीव्रता मान के निकटतम है और त्वचा की सतह के रूप में इसकी संगत स्थिति मान सेट करता है। इस स्थिति मान को ग-अक्ष में शून्य बिंदु के रूप में निरूपित करें जैसा कि चित्र 3ठमें सचित्र है।
    10. शून्य बिंदु और ज्ञात 2 डिग्री मी चरण आकार के अनुसार अन्य सभी स्थिति मान परिवर्तित करें.
    11. उनकी स्थिति मूल्य के अनुसार त्वचा की सतह के ऊपर एकत्र सभी स्पेक्ट्रम निकालें.
    12. एक डेटासेट बनाने के लिए और यह "RamanData.mat" का नाम बदलने के लिए PLS-Toolbox के लिए डेटा के बाकी आयात करें।
  2. कमरे प्रकाश प्रभाव के साथ बाहरी स्पेक्ट्रम निकालें.
    1. बाहर की त्वचा स्पेक्ट्रम को हटाने और पीसीए विश्लेषण को लागू करने के बाद रमन स्पेक्ट्रम डेटासेट (RamanData.mat) लोड करें।
    2. DATAset को MATLAB प्लेटफ़ॉर्म के अंतर्गत PLS$Toolbox सॉफ़्टवेयर में लोड करें और विश्लेषण का चयन करने के लिए डेटासेट पर राइट-क्लिक करें | पीसीए|
    3. पूर्वप्रक्रमण प्रकिया के रूप में सामान्य का चयन करें और क्रॉस मान्यता के लिए कोई नहीं चुनें.
    4. पूरक चित्र 2में दर्शाए अनुसार पीसीए अपघटन विश्लेषण के लिए तीन घटकों का प्रयोग करें।
    5. में विवो रमन साधन के संग्रह खिड़की पर कवर निकालें और संदर्भ सामग्री डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया एक ही मापदंडों का उपयोग कर उच्च आवृत्ति क्षेत्र में कमरे प्रकाश स्पेक्ट्रम इकट्ठा।
    6. पूरक चित्र 3में दर्शाए अनुसार कक्ष प्रकाश पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम की तुलना के माध्यम से कक्ष प्रकाश प्रभाव कारक की पहचान करें।
    7. सामान्य से एक काफी अधिक इसी स्कोर मान के साथ स्पेक्ट्रम निकालें (इस अध्ययन में 0.16 है जो पूरे डेटासेट के स्कोर मूल्यों के 99.8% से अधिक).

4. एमसीआर अपघटन विश्लेषण में घटकों की संख्या का चयन

  1. ऊपर वर्णित समान प्रकिया (अनुभाग 3.1.2) का उपयोग करके रमन स्पेक्ट्रम आधार रेखा को ठीक करें.
  2. ऊपर वर्णित के रूप में preprocessed डेटासेट पर PCA विश्लेषण निष्पादित करें (अनुभाग 3.2) चयन करने के अलावा "PQN" - "Mean केंद्र" के बजाय "सामान्यीकृत", और घटकों की संख्या के साथ लघुगणकीय पैमाने में eigenvalues प्लॉट (20) में डिफ़ॉल्ट संख्या के रूप में घटक चुनें बटन पर क्लिक करके अपघटन विश्लेषण और Y मान के रूप में लॉग (eigenvalues) का चयन करें। MCR विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए घटकों की संख्या के रूप में तीन से आठ चुनें.
  3. MCR विश्लेषण करें।
    1. डेटा चयन बटन के माध्यम से20 MCR-main सॉफ़्टवेयर में डेटासेट लोड करें।
    2. घटकों की संख्या का निर्धारण बटन पर क्लिक करके घटकों की संख्या (तीन से आठ) चुनें.
    3. प्रारंभिक अनुमान टैब के अंतर्गत शुद्ध बटन क्लिक करें, चर चयन टैब की दिशा के तहत एकाग्रता का चयन करें, और क्या करें बटन क्लिक करें।
    4. क्लिक करें OK बटन और उसके बाद जारी रखें बटन अगले पृष्ठ पर.
    5. अगले पृष्ठ में जारी रखें क्लिक करें और फिर कार्यान्वयन और गैर-नेगटिविटी प्रोफाइल टैब के साथ प्रजातियों के एनआर के तहत fnnls और 6 का चयन करें, क्रमशः. जारी रखें बटन क्लिक करें.
    6. इस पृष्ठ के लिए अनुभाग 4.3.5 के समान पैरामीटर चुनें और जारी रखेंक्लिक करें.

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Representative Results

इस नैदानिक अध्ययन में, विवो confocal रमन स्पेक्ट्रम में 4-18 साल पुराने से 28 विषयों से एकत्र किए गए थे. ऊपर उल्लिखित डेटा संग्रह प्रोटोकॉल के साथ कुल 30,862 रमन स्पेक्ट्रम एकत्र किए गए थे। इस बडे़ वर्णक्रमीय डेटासेट में चित्र 4कमें दर्शाए अनुसार 20% वर्णक्रमीय बाहरी होते हैं. कम संकेत करने वाली शोर बाहरी स्पेक्ट्रम त्वचा की सतह का निर्धारण करने के बाद हटा दिया गया था, पीसीए द्वारा पीछा कमरे प्रकाश सुविधाओं के साथ स्पेक्ट्रम की पहचान करने के लिए. इस पीसीए मॉडल में तीसरा कारक कमरे प्रकाश चोटियों की पहचान की है. यह एक ही confocal रमन साधन का उपयोग कर अध्ययन स्थल पर अलग से एकत्र फ्लोरोसेंट कमरे प्रकाश के एक स्पेक्ट्रम के साथ कारक 3 के लोडिंग स्पेक्ट्रम की तुलना द्वारा पुष्टि की है (देखें अनुपूरक चित्र 3) . चित्र 4 बी इंगित करता है कि इस प्रक्रिया के बाद बाहरी स्पेक्ट्रम के अधिकांश हटा दिया गया.

पीसीए पूर्वसंसाधित confocal रमन डेटासेट पर किया गया था और eigenvalue के साथ प्रयोग किया जाता है कारकों की संख्या के साथ चित्र 5में साजिश रची जाती है . पूर्व अध्ययन के अनुसार12,19, मॉडल कम से कम तीन घटक शामिल करना चाहिए: पानी, प्रोटीन, और लिपिड. चित्र 5में दर्शाए अनुसार कारक 9 के लिए इगेनमान में महत्वपूर्ण कमी देखी गई . इस अवलोकन एमसीआर मॉडल में शामिल करने के लिए तीन और आठ कारकों के बीच बदलती प्रमुख घटकों की संख्या के साथ जांच मॉडल पता चलता है. एमसीआर लोडिंग कि स्पेक्ट्रोस्कोपिक सुविधाओं में सबसे प्रोटीन के साथ संगत सुविधाओं, पानी, और लिपिड चित्र 6में दिखाए गए हैं.

Figure 1
चित्र 1 . माथे पर घाव और गैर घाव के निशान की मिसाल| (ए) घाव स्थल पर 3 बउ x 4 बउ चिह्नित क्षेत्र। (ख)एक 3 सेमी x 4 सेमी एक गैर-लेशन साइट पर चिह्नित क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . confocal रमन डेटा संग्रह की मिसाल. (ए) कंफोकल रमन यंत्र। (बी) मानव विषय के अग्र भाग पर स्पेक्ट्रा संग्रह। (ग)डेटा संग्रहण के लिए संदर्भ स्थिति निर्धारित करने का एक स्क्रीन शॉट. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . त्वचा की सतह का निर्धारण| (क)प्रत्येक रमन स्पेक्ट्रम के अंतर्गत प्रोटीन क्षेत्र का एकीकरण। (बी) अधिकतम और न्यूनतम बिंदुओं के आधार पर त्वचा की सतह की स्थापना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . रमन डेटासेट स्पेक्ट्रम। (ए) बाहरी स्पेक्ट्रम को हटाने से पहले Confocal रमन स्पेक्ट्रम. (बी) बाहरी स्पेक्ट्रम को हटाने के बाद Confocal रमन स्पेक्ट्रम. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . PCA विश्लेषण से घटकों की संख्या का निर्धारण. (A) पीसीए मॉडल में प्रयुक्त घटकों की संख्या के एक फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट किए गए लघुगणक पैमाने पर Eigenvalue. (B) 'n' और 'n + 1' घटकों के बीच eigenvalues में अंतर कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 . एमसीआर मॉडल में तीन से आठ घटकों के साथ इसी संदर्भ सामग्री' स्पेक्ट्रम के साथ लोडिंग आकार की तुलना। (ए) प्रोटीन, (बी) पानी, और (सी) लिपिड कारकों के आकार में क्रमशः बीएसए, पानी, और लिपिड संदर्भ सामग्री की तुलना में एमसीआर मॉडल में तीन से आठ घटकों के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 . अंतिम मॉडल में उपयोग नहीं छह घटक MCR मॉडल से अतिरिक्त तीन लोडिंग। इन तीन एमसीआर घटकों फ्लोरोसेंट और आधारभूत कलाकृतियों का प्रभुत्व है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Figure 1
पूरक चित्र 1. त्वचा की सतह के निर्धारण की मिसाल जहां लेजर फोकस के केंद्र त्वचा को छूता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Figure 2
पूरक चित्र 2. PLS-Toolbox सॉफ्टवेयर पीसीए विश्लेषण में तीन घटकों के चयन का चित्रण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Figure 3
पूरक चित्र 3. कमरे की रोशनी के संदर्भ स्पेक्ट्रम पर आरोपित कक्ष प्रकाश द्वारा प्रभुत्व लोडिंग कारक की पहचान। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Figure 4
पूरक चित्र 4. कॉस्मिक किरणों को हटाने से पहले और बाद में एमसीआर मॉडल से लदान की तुलना. ((ए), (ठ) और (ब्) क्रमशः जल, प्रोटीन और लिपिड का प्रतिनिधित्व करने वाले कारक हैं। अंतिम MCR मॉडल में उपयोग नहीं किए गए अतिरिक्त लोडिंग कारक d, e, और f. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Figure 5
पूरक चित्र 5. स्तर कॉर्नियम में विशिष्ट लिपिड पदार्थोंका रमन स्पेक्ट्रम . (ए) कोलेस्ट्रॉल 3-सल्फेट सोडियम और कोलेस्ट्रॉल. (बी)ओलिक, पामिटिक, पामिटोलिक, और स्टेरिक एसिड। (सी) स्क्वालेन। (डी)एन-बेहेनॉल-डी-एरिथ्रो-स्फिंगोसाइन, एन-लिग्नोसिरोइल-डी-एरिथ्रो-स्फीनेन, और डी-एरिथ्रो-डिहाइरोस्फिंगोसाइन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

डेटा संग्रह के दौरान, के रूप में प्रोटोकॉल के अनुभाग 2 और 3 में वर्णित है, प्रत्येक गहराई प्रोफ़ाइल में लाल हलकों में प्रकाश डाला सूक्ष्म छवियों से गहरा क्षेत्रों को खोजने के द्वारा साधन खिड़की और त्वचा के बीच संपर्क के साथ एक क्षेत्र में एकत्र किया गया था चित्र 2C| एक बार इन क्षेत्रों स्थित थे, यह सही डेटा विश्लेषण प्रक्रिया के लिए त्वचा की सतह के स्थान का निर्धारण करने के लिए त्वचा की सतह के ऊपर गहराई प्रोफ़ाइल शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण था. त्वचा की सतह के स्थान बाद में इसी गहराई प्रोफ़ाइल में प्रत्येक स्पेक्ट्रम के सापेक्ष गहराई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रोटोकॉल के अनुभाग 1 में उल्लेख के रूप में, गहराई प्रोफ़ाइल शुरू त्वचा की सतह के ऊपर 10 डिग्री मीटर त्वचा के बाहर पांच डेटा अंक पैदा करता है. यह सफलतापूर्वक त्वचा की सतह के दोनों पक्षों पर अधिकतम और न्यूनतम संकेत तीव्रता के स्थानों का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है. यह भी स्थानों है कि कलम के निशान और freckles के रूप में उच्च pigmented क्षेत्रों होते मापने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि इन क्षेत्रों में एक उच्च फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत का उत्पादन. जोखिम समय का चयन वर्णक्रमीय गुणवत्ता और माप अवधि के बीच एक संतुलन है. लंबे समय तक जोखिम समय संकेत करने के लिए शोर में सुधार और काफी समग्र माप समय बढ़ जाती है. हालांकि, कई विषयों यह समय की विस्तारित अवधि के लिए गतिहीन रहने के लिए चुनौतीपूर्ण लगता है. यह बच्चों के लिए बेहद चुनौतीपूर्ण है, उदाहरण के लिए. लेजर शक्ति में वृद्धि संकेत करने के लिए शोर बढ़ जाती है. हालांकि, बहुत अधिक शक्ति ऊर्जा के अवशोषण के कारण त्वचा को नुकसान पहुंचा सकती है। अधिकतम अनुमेय जोखिम, 17 mW लेजर शक्ति के रूप में चीनी राष्ट्रीय मानक (GB 7247.1-2012) द्वारा परिभाषित किया गया है, और अंतरराष्ट्रीय लेजर सुरक्षा मानक (आईईसी 60285-1:2007; और lt;20 mW के लिए 671 एनएम और lt;30 mW 785 एनएम के लिए, पार नहीं किया जा सकता है. अन्य सुरक्षा सावधानियों सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक विषय डेटा अधिग्रहण से पहले आंख संरक्षण पहने हुए है शामिल हैं, कि शरीर साइटों एक व्यक्तिगत टोपोलॉजी कोण (ITA) मूल्य 40 से अधिक है, और उच्च त्वचा pigmentation के साथ क्षेत्रों से परहेज.

त्वचा की सतह के स्थान का निर्धारण करने के लिए, प्रोटीन रमन चोटी (2,910-2,965 सेमी-1)के तहत क्षेत्र प्रोटीन संकेत की गहराई प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए एकीकृत किया गया था। रमन स्पेक्ट्रम पहले आधार रेखा से सही थे चोटियों के एकीकरण से पहले PLS-Toolbox से स्वचालित भारित कम से कम वर्ग विधि का उपयोग कर. एक गहराई प्रोफ़ाइल से 26 डेटा बिंदुओं को साधन ऑफसेट vaue के लिए linspace विधि का उपयोग कर260 अंक के लिए interpolated थे (चित्र 3एमें X-अक्ष मान ) और इसी तीव्रता मान के लिए spline विधि. परिणामस्वरूप डेटा MATLAB में polyfit और polyval कार्यों का उपयोग कर एक 20वें क्रम बहुपद पर interpolated और interpolated डेटा के अधिकतम और न्यूनतम अंक निर्धारित किए गए थे. माध्य तीव्रता मान की गणना अधिकतम और न्यूनतम मानों के योग को 2 से विभाजित करके की गई थी। त्वचा की सतह स्थान जहां interpolated गहराई प्रोफ़ाइल से तीव्रता मूल्य मतलब तीव्रता के करीब था के रूप में परिभाषित किया गया था. त्वचा की सतह का सही स्थान एक प्रयोगात्मक डेटा बिंदु के साथ मेल करने की जरूरत नहीं है. यह विधि केवल बीम21के अवशोषण और प्रकीर्णन के कारण त्वचा की सीमित गहराई को माप सकती है . त्वचा की सतह के नीचे $50 डिग्री मीटर से नीचे स्पेक्ट्रमदर्शी डेटा एकत्रित प्रयोगात्मक मानकों के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है.

के रूप में प्रोटोकॉल के खंड 3 में वर्णित है, कम संकेत करने के लिए शोर और कमरे रोशनी से उच्च योगदान के साथ outlier स्पेक्ट्रम को हटाने के बाद, ब्रह्मांडीय किरणों युक्त स्पेक्ट्रम का एक छोटा सा अंश डेटा सेट में बने रहे. ब्रह्मांडीय किरण निष्कासन से पहले और बाद में उत्पन्न लोडिंग स्पेक्ट्रम की तुलना अनुपूरक चित्र 4में दर्शाया गया है . अनुपूरक चित्र 4 में दर्शाए गए स्पेक्ट्रम की तुलना यह इंगित करती है कि ब्रह्मांडीय किरणों के साथ स्पेक्ट्रम की एक छोटी संख्या का प्रभाव नगण्य था। पानी का प्रतिनिधित्व तीन कारकों, प्रोटीन, और लिपिड समान थे, और अतिरिक्त तीन शोर और वर्णक्रमीय कलाकृतियों के साथ जुड़े लदान भी बहुत समान थे. यह स्पेक्ट्रम में ब्रह्मांडीय किरणों की एक कम घटना के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है ($0.25%) क्योंकि स्पेक्ट्रम में ब्रह्मांडीय किरणों के स्थान यादृच्छिक हैं.

एमसीआर विश्लेषण में इस्तेमाल घटकों की संख्या का चयन महत्वपूर्ण है, क्योंकि प्रत्येक लोडिंग के लिए जिम्मेदार इसी आणविक प्रजातियों के संदर्भ में लोडिंग्स आकार की व्याख्या काफी दोनों कैसे इसी स्कोर को प्रभावित करता है मान और समग्र विधि प्रदर्शन का उपयोग किया जाता है। प्रोटोकॉल के खंड 4 में वर्णित के रूप में, पीसीए पहले घटकों की संख्या में वृद्धि के साथ जुड़े eigenvalue विकास की जांच करने के लिए किया गया था. यह जाँच निम्न MCR विश्लेषण में उपयोग किया जाना चाहिए घटकों की संख्या की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था। लघुगणक पैमाने पर eigenvalue प्लॉटिंग इस पहचान प्रक्रिया को कच्चे eigenvalues की जांच की तुलना में आसान बना सकते हैं, जैसा कि चित्र 5ए में दिखाया गयाहै। प्रत्येक eigenvalue एक घटक कैप्चर कर सकते हैं जो प्रसरण का एक प्रतिनिधित्व है। बड़ा eigenvalue, और अधिक विचरण इस घटक स्पेक्ट्रा में मॉडल कर सकते हैं. समान आकार वाले Eigenvalues का चयन या एक साथ समाप्त किया जाना चाहिए22. इस दिशानिर्देश के बाद, दो, पांच, और आठ घटकों एमसीआर विश्लेषण के लिए विचार किया गया क्योंकि घटक तीन, चार, और पांच उत्पादन eigenvalues आकार में समान. इसी तरह की प्रवृत्ति भी घटक छह, सात, और आठ के लिए मनाया गया. चित्र 5 B 'n' और 'n+1' घटकों के बीच eigenvalues में अंतर का एक प्लॉट है जो दूसरे, पांचवें और आठवें घटकों के बाद स्थानीय अधिकतमता दर्शाता है. अध्ययन डिजाइन के साथ संयुक्त त्वचा की आणविक संरचना के बारे में पहले ज्ञान उच्च आवृत्ति रमन स्पेक्ट्रम मॉडल के लिए आवश्यक तीन घटकों की एक न्यूनतम समर्थन करता है. इसलिए, तीन से आठ घटकों वाले कई एमसीआर मॉडल की जांच की गई और लोडिंग्स को अंतिम मॉडल के लिए आवश्यक प्रमुख घटकों की पहचान करने के लिए संदर्भ सामग्री से स्पेक्ट्रम की तुलना की गई थी।

संदर्भ सामग्री से रमन स्पेक्ट्रम के साथ लदान की तुलना आसानी से पहचान और प्रोटीन और पानी के लिए अंतिम एमसीआर घटकों के दो बताए क्योंकि वे परीक्षण किया और इसी संदर्भ मैच के लिए एमसीआर लदान पर हावी की अनुमति देता है स्पेक्ट्रम, जो बीएसए और डीआई पानी हैं। हालांकि, एमसीआर घटकों में से कुछ में लिपिड की अपेक्षित स्पेक्ट्रोस्कोपिक गुण तीन और चार घटक ों वाले एमसीआर मॉडल में सचित्र लिपिड संदर्भ स्पेक्ट्रम के लिए एक कमजोर मैच था। इसके अतिरिक्त, छह घटकों से नीचे परीक्षण किए गए सभी मॉडलों के लिए एमसीआर जल लदान में अवशिष्ट प्रोटीन चोटियों (2,840-3,000 सेमी-1) को देखा गया। इन अवलोकनों के आधार पर, अंतिम MCR विश्लेषण में एक छह घटक MCR मॉडल का उपयोग किया गया था। छह घटकों में से तीन पानी के लिए आवंटित किया गया, प्रोटीन, और लिपिड इसी संदर्भ स्पेक्ट्रम के लिए उनके लोडिंग स्पेक्ट्रम मिलान द्वारा. लिपिड कारक की व्याख्या और असाइनमेंट तीन प्रतिनिधि ceramide सामग्री के रमन स्पेक्ट्रम के लिए लोड करने की तुलना पर आधारित है, एन-behenoyl-डी-एरिथ्रो-स्फिंगोसिन, एन-Lignoceroyl-डी-एरिथ्रो-स्फीनेन सहित, और डी-एरिथ्रो-डाइहोस्फिंगोसाइन। स्तर कॉर्नियम में अन्य लिपिड पदार्थों के रमन स्पेक्ट्रम की भी जांच की गई। इन सामग्रियों में फैटी एसिड (ओलिक, पामिटिक, पामिटोलिक, और स्टेरिक एसिड), कोलेस्ट्रॉल (कोलेस्टेरॉल 3-सल्फेट सोडियम और कोलेस्ट्रॉल), और स्क्वालीन शामिल हैं, जैसा कि पूरक चित्र 5में दिखाया गया है। लिपिड कारक अंतिम एमसीआर मॉडल में इस्तेमाल किया एक मजबूत मैच के लिए ceramide स्पेक्ट्रम और अन्य सामग्री है कि लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन होते हैं के साथ संगत था. अन्य तीन एमसीआर घटकों फ्लोरोसेंट और आधारभूत कलाकृतियों का प्रभुत्व था और उनके इसी स्कोर मूल्यों किसी भी गणना में इस्तेमाल नहीं किया गया. इन तीन घटकों को चित्र 7 में दर्शाया गया है।

समग्र विश्लेषण दृष्टिकोण इस पांडुलिपि में प्रस्तुत अन्य एकल चोटी या चोटी फिटिंग दृष्टिकोण की तुलना में त्वचा में प्रमुख घटकों को मापने के लिए बेहतर विशिष्टता और सटीकता के साथ एक अंतिम विधि पैदा करता है. इस पद्धति को दर्शाता है कि महत्वपूर्ण घटक एक नैदानिक डेटासेट है कि बुरा स्पेक्ट्रम के एक अपेक्षाकृत छोटे अंश शामिल से निकाला जा सकता है. भविष्य के प्रयासों को अपनी दक्षता में सुधार लाने और विश्लेषण के लिए आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता की मात्रा को कम करने के लिए एक सॉफ्टवेयर पैकेज में इस पद्धति के स्वचालन पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। इसी तरह की पद्धति फिंगरप्रिंट क्षेत्र में एकत्र रमन स्पेक्ट्रम के लिए विकसित किया जा रहा है (400-1,800 सेमी-1) एक ही साधन में शामिल 671 एनएम लेजर के बजाय एक 785 एनएम लेजर स्रोत का उपयोग कर.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकबहुत कॉर्पोरेट समारोह विश्लेषणात्मक और व्यक्तिगत सफाई देखभाल विभाग से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं. हम विश्लेषणात्मक सहयोगी निर्देशकों सुश्री चमेली वांग और डॉ रॉब Gardner उनके मार्गदर्शन और समर्थन और सुश्री ली यांग डेटा संग्रह पर उसकी मदद के लिए के लिए हमारी कृतज्ञता व्यक्त करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich
Cholesterol Sigma-Aldrich
Cholesterol 3-sulfate sodium Sigma-Aldrich
D-Erythro-Dihydrosphingosine Sigma-Aldrich
DI water Purified with Milipore(18.2MΩ)
Gen2-SCA skin analyzer River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands Gen2
Matlab 2018b Mathwork 2018b
N-behenoyl-D-erythro-sphingosine Avanti Polar Lipids, Inc.
N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) Avanti Polar Lipids, Inc.
Oleic Acid Sigma-Aldrich
Palmitic Acid Sigma-Aldrich
Palmitoleic Acid Sigma-Aldrich
PLS_Toolbox version 8.2 Eigenvector Research Inc. 8.2
RiverICon River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands version 3.2
Squalene Sigma-Aldrich
Stearic Acid Sigma-Aldrich

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References

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रसायन विज्ञान अंक 151 में विवो confocal रमन प्रमुख घटक विश्लेषण बहुचर वक्र संकल्प chemometrics preprocessing बाहरी हटाने
एक केमोमीट्रिक दृष्टिकोण के माध्यम से Stratum Corneum के Vivo Confocal रमन स्पेक्ट्रा में से पानी, प्रोटीन, और लिपिड को हल करने
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Zhang, L., Cambron, T., Niu, Y., Xu, … More

Zhang, L., Cambron, T., Niu, Y., Xu, Z., Su, N., Zheng, H., Wei, K., Ray, P. Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach. J. Vis. Exp. (151), e60186, doi:10.3791/60186 (2019).

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