Summary
Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van Confocale Raman spectra van menselijke proefpersonen in klinische studies gecombineerd met chemometrische benaderingen voor spectrale uitschieter verwijdering en de daaropvolgende extractie van belangrijke functies.
Abstract
Ontwikkeling van deze in vivo Confocale Raman spectroscopische methode maakt de directe meting van water, eiwitten en lipiden met diepte resolutie bij menselijke proefpersonen mogelijk. Deze informatie is zeer belangrijk voor huid-gerelateerde ziekten en het karakteriseren van de prestaties van huidverzorgingsproducten. Dit protocol illustreert een methode voor Confocale Raman spectra Collection en de daaropvolgende analyse van de spectrale gegevensset, gebruikmakend van Chemometrie. Het doel van deze methode is het opstellen van een standaardprotocol voor het verzamelen van gegevens en het bieden van algemene richtlijnen voor gegevensanalyse. Voor verwerking (bijvoorbeeld het verwijderen van uitschieters Spectra) is een kritieke stap bij het verwerken van grote gegevenssets uit klinische studies. Als voorbeeld bieden we richtlijnen op basis van voorafgaande kennis van een gegevensset om de typen uitschieters te identificeren en specifieke strategieën te ontwikkelen om ze te verwijderen. Er wordt een hoofdcomponent analyse uitgevoerd en de laad spectra worden vergeleken met Spectra uit referentiematerialen om het aantal componenten te selecteren dat wordt gebruikt in de uiteindelijke analyse van de multivariate curve Resolution (MCR). Deze aanpak is succesvol voor het extraheren van zinvolle informatie uit een grote spectrale gegevensset.
Introduction
In klinische studies heeft Confocale Raman-spectroscopie in vivo zijn unieke vermogen aangetoond voor het bepalen van de dikte van stratum corneum en het watergehalte1,2,3,4en het volgen van de penetratie van actieve materialen die topisch op de huid worden aangebracht,5,6. Als een niet-invasieve aanpak detecteert Confocale Raman-spectroscopie moleculaire signalen op basis van vibrationele modi. Dus, labeling is niet nodig7. In vivo Confocale Raman-spectroscopie biedt chemische informatie met diepte resolutie op basis van het confocale karakter van de techniek. Deze diepte afhankelijke informatie is zeer nuttig bij het bestuderen van de effecten van huidverzorgingsproducten4,8, veroudering9,10, seizoensgebonden veranderingen3, evenals huidbarrière functie ziekten, zoals atopische dermatitis11,12. Er is veel informatie in de hoge frequentie regio van confocale Ramanspectroscopie (2500 – 4000 cm-1), waar water produceert verschillende pieken in de regio tussen 3250 – 3550 cm-1. Echter, de Raman pieken van eiwitten en lipiden, die zijn gecentreerd tussen ongeveer 2800 – 3000 cm-1, elkaar overlappen, omdat de signalen worden voornamelijk geproduceerd uit methyleen (-CH2-) en methyl (-CH3) groepen13 . Deze overlappende informatie geeft een technische uitdaging bij het verkrijgen van relatieve hoeveelheden van individuele moleculaire soorten. Piek fitting14,15 en selectieve piekpositie12,16 benaderingen zijn gebruikt om deze uitdaging op te lossen. Echter, het is moeilijk voor deze single Peak-gebaseerde methoden om zuivere component informatie te extraheren, omdat meerdere Raman pieken van dezelfde component tegelijkertijd veranderen17. In onze recente publicatie18werd een MCR-benadering voorgesteld om de zuivere component informatie te verheldering. Met behulp van deze benadering werden drie componenten (water, eiwitten en lipiden) geëxtraheerd uit een grote in vivo Confocale Raman spectroscopische gegevensset.
De uitvoering van grote klinische studies kan veeleisend zijn voor individuen die in vivo spectroscopische gegevens verzamelen. In sommige gevallen kan spectrale acquisitie gedurende vele uren op een dag besturingsapparatuur vereisen en kan de studie tot weken of maanden duren. Onder deze omstandigheden kunnen spectroscopische gegevens worden gegenereerd door exploitanten van apparatuur die niet over de technische deskundigheid beschikken om alle bronnen van spectroscopische artefacten te identificeren, uit te sluiten en te corrigeren. De resulterende gegevensset kan een kleine fractie van spectroscopische uitschieters bevatten die voorafgaand aan de analyse moeten worden geïdentificeerd en uitgesloten van de gegevens. Dit document illustreert in detail een chemometrische analyseproces voor het "opschonen" van een klinisch Raman gegevensset voordat de gegevens met MCR analyseren. Om de uitschieters met succes te verwijderen, moeten de typen uitschieters en de mogelijke oorzaak voor het genereren van de spectra in uitschieter worden geïdentificeerd. Vervolgens kan een specifieke aanpak worden ontwikkeld om de beoogde uitschieters te verwijderen. Dit vereist voorafgaande kennis van de gegevensset, inclusief een gedetailleerd inzicht in het proces voor het genereren van gegevens en het ontwerp van de studie. In deze gegevensset zijn de meeste uitschieters laag signaal-ruis Spectra en komen voornamelijk uit 1) spectra die boven het huidoppervlak worden verzameld (6.208 van 30.862), en 2) sterke bijdrage aan het spectrum van fluorescerende kamer verlichting (67 van 30.862). Spectra die boven het huidoppervlak worden verzameld, produceren een zwakke Raman-respons, omdat het Laser brandpunt het huidoppervlak benadert en zich meestal in het instrumenten venster onder de huid bevindt. Spectra met een sterke bijdrage van fluorescerende kamer licht worden gegenereerd als gevolg van een fout in de instrument operator of een beweging van het onderwerp, die een voorwaarde oplevert waarbij het Confocale Raman-collectie venster niet volledig wordt gedekt door de lichaams site van het onderwerp. Hoewel deze soorten spectrale artefacten kunnen worden geïdentificeerd en hersteld tijdens spectrale verwerving door een spectroscopische deskundige op het moment van gegevensverwerving, werden de in deze studie gebruikte getrainde instrumenten operatoren geïnstrueerd om alle gegevens te verzamelen, tenzij een onherstelbare fout is waargenomen. De taak van het identificeren en uitsluiten van uitschieters is opgenomen in het Data Analysis protocol. Het gepresenteerde protocol is ontwikkeld om deze uitdaging op te lossen. Om de lage signaal-ruis Spectra boven het huidoppervlak aan te pakken, moet de locatie van het huidoppervlak eerst worden bepaald om het verwijderen van spectra die boven het huidoppervlak zijn verzameld mogelijk te maken. De locatie van het huidoppervlak wordt gedefinieerd als de diepte waar het brandpunt van de Raman-laser de helft van de huid is en de helft uit de huid, zoals geïllustreerd in aanvullend figuur 1. Na het verwijderen van lage signaal-ruis spectra, wordt een principal component Analysis (PCA) geïmplementeerd om de factor te extraheren die gedomineerd wordt door fluorescerende kamer licht pieken. Deze uitschieters worden verwijderd op basis van de Score waarde van de corresponderende factor.
Dit protocol bevat gedetailleerde informatie over de manier waarop zes hoofdonderdelen worden bepaald in het MCR-proces. Dit gebeurt via een PCA-analyse gevolgd door spectrale vorm vergelijking tussen de ladingen voor modellen die worden gegenereerd met een verschillend aantal hoofdcomponenten. Het experimentele proces voor het verzamelen van gegevens van referentiematerialen en de menselijke proefpersonen wordt ook gedetailleerd toegelicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Commissie voor institutionele toetsing van het Children's Hospital in Beijing in overeenstemming met de ethische richtsnoeren van de verklaring van 1975 van Helsinki. Het werd uitgevoerd volgens ICH richtlijnen voor goede klinische praktijk. De studie vond plaats van mei tot en met 2015 juli.
1. verzameling van in vivo Confocale Raman spectra van menselijke proefpersonen met atopische dermatitis
- Onderwerpen opnemen in overeenstemming met de volgende criteria.
- Omvatten onderwerpen tussen de leeftijden van 4 – 18.
- Neem proefpersonen met milde tot matige atopische dermatitis (Score van 2 of 3 volgens de algemene beoordeling van de arts) met actieve ziektesymptomen op 5% – 30% van het lichaamsoppervlak, met ten minste twee laesies op de armen.
- Bevatten onderwerpen die in goede gezondheid zijn, met uitzondering van symptomen die rechtstreeks verband houden met de ziekte van AD.
- Onderwerpen opnemen die schriftelijke geïnformeerde toestemming geven.
- Neem onderwerpen met een individuele topologie hoek (ITA)-waarde op die hoger is dan 40 op de testlocatie.
- Uitsluiten van onderwerpen die voldoen aan een van de volgende criteria.
- Uitsluiten van onderwerpen die momenteel deelnemen of eerder hebben deelgenomen aan een klinisch onderzoek bij een testfaciliteit in de afgelopen 4 weken.
- Uitsluiten van proefpersonen met kanker of die zijn gediagnosticeerd of behandeld voor kanker binnen 5 jaar voorafgaand aan de studie.
- Diabetische proefpersonen uitsluiten.
- Uitsluiten van personen die een immunologische of besmettelijke ziekte die het onderwerp in gevaar kunnen brengen of interfereren met de nauwkeurigheid van de studieresultaten (dat wil zeggen, hepatitis, tuberculose, HIV, AIDS, lupus, of reumatoïde artritis).
- Uitsluiten van onderwerpen die huidaandoeningen die kunnen interfereren met instrumentale metingen of zal de duidelijke beoordeling van de huid alleen te voorkomen atopische dermatitis. Voorbeelden zijn een extreem droge huid, beschadigde huid, sneden, krassen, zonnebrand, moedervlekken, tatoeages, uitgebreide littekens, uitslag, overmatige haargroei of acne.
- Uitsluiten van onderwerpen die gebruik maken van orale immunosuppressieve drugs, antibiotica, of andere systemische therapieën in de afgelopen maand, met uitzondering van kleine tranquillizers.
- Uitsluiten van onderwerpen met andere medische aandoeningen die, naar de mening van de onderzoeker, hen uitsluit van studie participatie.
- Uitsluiten van proefpersonen met een hogere pigmentatie in het testgebied.
- Label het laesie gebied van de deelnemer aan de atopische dermatitis-studie en Markeer met een gebied van 3 cm x 4 cm op of in de buurt van de laesie plaats, zoals afgebeeld in Figuur 1a.
- Label het niet-laesie gebied met dezelfde marker in de body van de tegenhanger (bijv. linker onderarm versus rechteronderarm) zoals afgebeeld in Figuur 1B.
- Plaats de gemarkeerde lichaams plaats in nauw contact met het venster van het in vivo Confocale Raman-instrument zoals afgebeeld in Figuur 2A en Figuur 2B. Bedek het hele venster om de impact van kamer verlichting op de lichaams plaats te voorkomen.
- De Raman-gegevensverzameling uitvoeren.
Opmerking: het instrument heeft een spectrale resolutie van 2 cm-1 en 50x microscopie doelstelling (NA = 0,9 olie onderdompeling), met behulp van een 671 nm laser met een vermogen van 17 MW. Golflengte is gekalibreerd met behulp van het spectrum van een ingebouwde Neon-argon lamp. De kalibratie van de intensiteit wordt uitgevoerd door het meten van het spectrum van een NIST (National Institute of Standards) glas kalibratie standaard.- Beweeg de scherpstelling totdat een spectrum zoals geïllustreerd in Figuur 2C wordt waargenomen, verplaats dan de focus weg van het huidoppervlak 10 μm.
- Start de gegevensverzameling voor 26 stappen met een stapgrootte van 2 μm in de frequentie regio 2.510 cm-1– 4.000 cm-1 . Gebruik een belichtingstijd van 1 s en meet acht replicaten voor elk gebied met een totale duur van ~ 10 – 15 min.
2. verzameling van Confocale Raman spectra uit referentiematerialen
- Plaats de referentiematerialen, de belangrijkste componenten in het humane huidstratum corneum19, op het venster van het Confocale Raman-instrument (Zie tabel met materialen: boviene serum albumine (BSA), GEDEÏONISEERD water (di water), ceramide, cholesterol, vrij vetzuur en squaleen).
- Verzamel de referentiematerialen ' Raman spectra opeenvolgend van de buitenkant van het materiaal naar het materiaal centrum met dezelfde Verzamel parameters als hierboven beschreven.
- Integreer het gebied onder elke Raman-spectra tussen het bereik van 2510 cm-1 en Identificeer de bovenste drie maximale waarde punten in deze 26-metingen. Gemiddelde de Raman-spectra van deze drie punten om het uiteindelijke referentiemateriaal spectra te verkrijgen.
3. verwijdering van de spectra in de uitschieter door middel van Chemometrie analyse
- Bepaal het huidoppervlak en verwijder de niet-huidspectra.
- Wijzig de bestandsextensie van '. Ric ' naar '. mat ' en laad het. mat-bestand naar het MATLAB-software platform.
- Corrigeer de baseline met behulp van baseline (automatische gewogen kleinste kwadraten) door met de rechtermuisknop op de geïmporteerde gegevensset te klikken onder analyseren | Andere tools | Voor verwerking in de PLS_Toolbox-software met standaardinstelling.
- Som de waarden tussen 2910 – 2965 cm-1 op om de intensiteitswaarden onder elk Raman-spectrum te verkrijgen uit de 26 opeenvolgende stappen meting zoals weergegeven in Figuur 3A via de Sum -functie in MATLAB.
- Interpoleren de instrument offset waarde (waarde in de X-as in Figuur 3B) van 26 – 260 met de functie linspace in MATLAB.
- Interpoleren de intensiteitswaarde van 26 tot 260 met behulp van de spline -methode in MATLAB, gebruikmakend van de nieuw gegenereerde 260 positiewaarden.
- Gebruik de functies polyfit en POLYVAL van MATLAB om de nieuwe set intensiteitswaarden met 260 punten te verkrijgen. Gebruik eerst de waarden voor positie en intensiteit 260 als X-en Y-ingangen voor respectievelijk de functie polyfit . Stel de graad waarde in op 20. Gebruik vervolgens de uitvoer coëfficiënten en de 260 uitgebreide positiewaarden als de invoer voor polyval om de laatste 260 intensiteitswaarden te verkrijgen.
- Gebruik de Max -en min -functies van MATLAB om de maximum-en minimum punten te bepalen van de nieuwe geïnterpoleerd 260-intensiteitswaarden.
- Bereken de gemiddelde intensiteitswaarde door de som van de maximale en minimale intensiteitswaarde met twee te delen.
- Identificeer de intensiteitswaarde van de 260 intensiteitswaarden (berekend vanaf stap 3.1.6) die het dichtst bij de gemiddelde intensiteitswaarde ligt en stel de corresponderende positiewaarde in als huidoppervlak. Stel deze positiewaarde in als het nulpunt in de X-as, zoals afgebeeld in Figuur 3B.
- Verander alle andere positiewaarden op basis van het nulpunt en de bekende stapgrootte van 2 μm.
- Verwijder alle spectra die boven het huidoppervlak zijn verzameld op basis van hun positiewaarde.
- Importeer de rest van de gegevens naar PLS_Toolbox om een gegevensset te maken en de naam "RamanData. mat" te wijzigen.
- Verwijder de spectra van de uitschieter met het lichteffect van de kamer.
- Laad de Raman spectra DataSet (RamanData. mat) na verwijdering van de out-of-Skin Spectra en implementeer de PCA-analyse.
- Laad de gegevensset in de PLS_Toolbox-software onder het MATLAB-platform en klik met de rechtermuisknop op de gegevensset om te kiezen voor analyseren | PCA.
- Selecteer normaliseren als de voorbewerkings benadering en kies geen voor de kruisvalidatie.
- Gebruik de drie componenten voor de PCA-ontledings analyse zoals weergegeven in aanvullende figuur 2.
- Verwijder de afdekking van het in vivo collectie venster van Raman instrument en verzamel de kamer lichtspectra in de hoogfrequente regio met dezelfde parameters die worden gebruikt voor de gegevensverzameling referentiematerialen.
- Identificeer de kamer lichteffect factor door vergelijking met de kamer lichte achtergrond Spectra zoals weergegeven in aanvullende figuur 3.
- Verwijder de spectra met een significant hogere corresponderende Score waarde dan normaal (meer dan 99,8% van de scorewaarden van de gehele gegevensset, die is 0,16 in deze studie).
4. selectie van het nummer van de componenten in de MCR-ontledings analyse
- Corrigeer de Raman spectra Baseline met dezelfde aanpak als hierboven beschreven (paragraaf 3.1.2).
- Voer de PCA-analyse uit op de voorverwerkte gegevensset zoals hierboven beschreven (sectie 3,2), met uitzondering van het selecteren van "PQN" – "Mean Center" in plaats van "normaliseren", en plot de eigen waarden in logaritmische schaal samen met het aantal componenten (20) als het standaard getal in de ontledings analyse door te klikken op de knop onderdelen kiezen en log (eigen waarden) als de Y-waarde te selecteren. Kies drie tot acht als het nummer van de componenten die worden gebruikt voor de MCR-analyse.
- MCR-analyse uitvoeren.
- Laad de gegevensset in de MCR_main software20 via de knop gegevensselectie .
- Kies het aantal componenten (drie tot acht) door te klikken op de knop bepaling van het aantal componenten .
- Klik op de knop pure onder het tabblad initiële raming , Selecteer concentratie onder de richting van het tabblad variabele selectie en klik op de knop do .
- Klik op de knop OK en vervolgens op de knop Doorgaan naar de volgende pagina.
- Klik op Doorgaan op de volgende pagina en selecteer vervolgens fnnls en 6 onder de implementatie en Nr. van soorten met tabs van niet-negativiteit profielen , respectievelijk. Klik op de button Doorgaan .
- Kies dezelfde parameters als paragraaf 4.3.5 voor deze pagina en klik op Doorgaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze klinische studie werden in vivo Confocale Raman spectra verzameld van 28 personen van 4 – 18 jaar oud. In totaal werden 30.862 Raman spectra verzameld met het hierboven genoemde protocol voor gegevensverzameling. Deze grote spectrale gegevensset bevat 20% spectrale uitschieters zoals weergegeven in Figuur 4A. De lage signaal-ruis-uitschieter Spectra werden verwijderd na het bepalen van het huidoppervlak, gevolgd door de PCA om de spectra te identificeren met kamer lichtfuncties. De derde factor in dit PCA-model is het identificeren van kamer licht pieken. Dit wordt bevestigd door vergelijking van de belastingsspectra van factor 3 met een spectrum van tl-licht dat afzonderlijk op de studie plaats wordt verzameld met hetzelfde Confocale Raman-instrument (Zie aanvullend Figuur 3). Figuur 4 B geeft aan dat de meeste van de uitschieter Spectra na dit proces zijn verwijderd.
PCA werd uitgevoerd op de voorverwerkte Confocale Raman dataset en de eigenwaarde samen met het aantal gebruikte factoren worden uitgezet in Figuur 5. Volgens eerdere onderzoeken12,19, het model moet omvatten ten minste drie componenten: water, eiwitten, en lipide. Een significante afname van de eigenwaarde werd waargenomen voor factor 9, zoals weergegeven in Figuur 5. Deze constatering suggereert het onderzoeken van modellen met het aantal hoofdcomponenten variërend tussen drie en acht factoren voor opname in het MCR-model. MCR-ladingen die spectroscopische kenmerken bevatten die het meest consistent zijn met eiwitten, water en lipide, worden weergegeven in Figuur 6.
Figuur 1 . Afbeelding van de laesie en de niet-laesie markering op de onderarm. A) eengebied van 3 cm x 4 cm op een laesie plaats. B) een gemarkeerde oppervlakte van 3 cm x 4 cm op een niet-laesie plaats. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Illustratie van de Confocale Raman-gegevensverzameling. A) Confocale Raman-instrument. B) de verzameling van spectra op de onderarm van het menselijk subject. C) een schermopname om de referentiepositie voor het verzamelen van gegevens te bepalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . Bepalen van het huidoppervlak. A) integratie van het eiwit gebied onder elk Raman-spectrum. B) het huidoppervlak instellen op basis van de maximum-en minimum punten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 . Raman dataset spectra. A) Confocale Raman spectra vóór verwijdering van de spectra van de uitschieter. B) Confocale Raman spectra na verwijdering van de spectra in de uitschieter. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 . Bepalen van het aantal onderdelen van PCA-analyse. A) eigenwaarde op een logaritmische schaal die wordt uitgezet als functie van het aantal componenten dat in PCA-model wordt gebruikt. B) verschil in eigen waarden tussen de componenten "n" en "n + 1" Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 . Vergelijking van de beladings vorm met de bijbehorende spectra van het referentiemateriaal met drie tot acht componenten in het MCR-model. A) eiwitten, (B) water en (C) de vorm van lipide factoren met drie tot acht componenten in het MCR-model vergeleken met de spectra van respectievelijk BSA, water en lipide-referentiematerialen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7 . De extra drie ladingen van het zes component MCR-model die niet in het uiteindelijke model worden gebruikt. Deze drie MCR componenten worden gedomineerd door fluorescentie en baseline artefacten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1. Illustratie van de bepaling van het huidoppervlak waar het midden van de laser focus de huid raakt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 2. Illustratie van de selectie van drie componenten in de PLS_Toolbox software PCA-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3. Identificatie van de laad factor gedomineerd door kamer licht bovenop een referentiespectrum van kamer licht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 4. Vergelijking van ladingen van het MCR-model voor en na het verwijderen van kosmische stralen. A), (B) en (C) zijn de factoren die respectievelijk water, eiwitten en lipide vertegenwoordigen. De extra belastingsfactoren die niet in het uiteindelijke MCR-model worden gebruikt, zijn d, e en f. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 5. Raman spectra van typische lipide materialen in stratum corneum. (A) cholesterol 3-sulfaat natrium en cholesterol. B) oleïne, Palmitoleïnezuur en stearinezuur. (C) squaleen. (D) n-Behenoyl-D-erythro-Sphingosine, n-Lignoceroyl-d-erythro-sphinganine en d-Erythro-Dihyrosphingosine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens het verzamelen van gegevens, zoals beschreven in sectie 2 en 3 van het Protocol, werd elk diepte profiel verzameld in een gebied met contact tussen het instrument venster en de huid door het vinden van de donkere gebieden van de microscopische beelden gemarkeerd in de rode cirkels in Figuur 2C. Zodra deze gebieden waren gevestigd, was het van cruciaal belang om het diepte profiel boven het huidoppervlak te starten om de locatie van het huidoppervlak voor de data-analyseprocedure nauwkeurig te bepalen. De locatie van het huidoppervlak werd vervolgens gebruikt om de relatieve diepte van elk spectrum in het corresponderende diepte profiel te bepalen. Zoals vermeld in punt 1 van het Protocol, produceert het diepte profiel 10 μm boven het huidoppervlak vijf gegevenspunten buiten de huid. Dit zorgt voor het succesvol bepalen van de locaties van de maximale en minimale signaalintensiteit aan beide zijden van het huidoppervlak. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat locaties worden gemeten die penmarkeringen en hogere gepigmenteerde gebieden zoals sproeten bevatten, omdat deze gebieden een hoog fluorescentie-achtergrond signaal produceren. De selectie van de belichtingstijd is een balans tussen spectrale kwaliteit en Meetduur. Langere belichtingstijd verbetert de signaal ruis en verhoogt de totale meet tijd aanzienlijk. Veel onderwerpen vinden het echter lastig om gedurende langere tijd beweegloos te blijven. Dit is bijvoorbeeld buitengewoon uitdagend voor kinderen. Het verhogen van het Laser vermogen verhoogt het signaal-ruis. Echter, te veel vermogen kan de huid beschadigen als gevolg van de absorptie van de energie. De maximaal toelaatbare blootstellingen, 17 mW Laser vermogen zoals gedefinieerd door de Chinese nationale norm (GB 7247.1-2012), en de International Laser Safety Standard (IEC 60285-1:2007; < 20 mW voor 671 nm en < 30 mW voor 785 nm), kunnen niet worden overschreden. Andere veiligheidsmaatregelen omvatten ervoor te zorgen dat elk onderwerp oogbescherming draagt voorafgaand aan het verzamelen van gegevens, dat de sites van het lichaam een individuele topologie hoek (ITA) hebben die hoger is dan 40, en gebieden met een hoge huidpigmentatie vermijden.
Om de locatie van het huidoppervlak te bepalen, werd het gebied onder de proteïne Raman Peak (2910-2965 cm-1) geïntegreerd om het diepte Profiel van het eiwit signaal te verkrijgen. De Raman spectra waren eerste Baseline-gecorrigeerd met behulp van de geautomatiseerde gewogen minst vierkante methode van PLS_Toolbox voorafgaand aan de integratie van de pieken. De 26 gegevenspunten van één diepte profiel werden geïnterinterpoleerd tot 260 punten met behulp van de linspace -methode voor de instrument offset waarde (X-Aswaarde in Figuur 3A) en de spline -methode voor de corresponderende intensiteitswaarde. De resulterende gegevens werden geïnterniteerd op een 20th -orde veelterm met behulp van de polyfit -en POLYVAL -functies in MATLAB en de maximum-en minimum punten van de geïntermuleerde gegevens werden bepaald. De gemiddelde intensiteitswaarde werd berekend door de som van de maximum-en minimumwaarden met 2 te delen. Het huidoppervlak werd gedefinieerd als de locatie waar de intensiteitswaarde van het geïntermuleerde diepte profiel het dichtst bij de gemiddelde intensiteit lag. De exacte locatie van het huidoppervlak hoeft niet samen te vallen met een experimenteel gegevenspunt. Deze methode kan alleen een beperkte diepte van de huid te meten als gevolg van de absorptie en verstrooiing van de balk21. Het verzamelen van spectroscopische gegevens onder ~ 50 μm onder het huidoppervlak kan belangrijke wijzigingen in de experimentele parameters vereisen.
Zoals beschreven in punt 3 van het Protocol, bleef een kleine fractie van spectra met kosmische stralen in de gegevensset na verwijdering van uitschieter spectra met een lage signaal-ruis en een hoge bijdrage van de kamer verlichting. Een vergelijking van de voor en na de verwijdering van kosmische stralen gegenereerde belastingspectra wordt weergegeven in aanvullende figuur 4. Een vergelijking van de in aanvullende figuur 4 getoonde belastingspectra geeft aan dat de impact van een klein aantal spectra met kosmische stralen verwaarloosbaar was. De drie factoren die water, eiwitten en lipide representeren waren identiek, en de drie extra ladingen geassocieerd met lawaai en spectrale artefacten waren ook erg gelijkaardig. Dit kan worden toegeschreven aan een laag optreden van kosmische stralen in de spectra (~ 0,25%) omdat de locatie van kosmische stralen in de spectra willekeurig is.
De selectie van het aantal componenten dat in de MCR-analyse wordt gebruikt, is van cruciaal belang, omdat de interpretatie van de vorm van de belasting in termen van de overeenkomstige moleculaire soorten die verantwoordelijk zijn voor elke lading, significant van invloed is op hoe de corresponderende Score waarden worden gebruikt en de algehele methode prestaties. Zoals beschreven in paragraaf 4 van het Protocol, werd PCA eerst uitgevoerd om de eigenwaarde-evolutie te onderzoeken die gepaard ging met de toename van het aantal componenten. Dit onderzoek is gebruikt om het aantal onderdelen te identificeren dat moet worden gebruikt in de volgende MCR-analyse. Het uitzetten van de eigenwaarde op een logaritmische schaal kan dit identificatieproces gemakkelijker maken dan het onderzoeken van de onbewerkte eigen waarden, zoals weergegeven in Figuur 5a. Elke eigenwaarde is een representatie van de variantie die een component kan vastleggen. Hoe groter de eigenwaarde, hoe meer variantie dit onderdeel kan modelleren in de spectra. Eigen waarden met vergelijkbare grootte moeten worden geselecteerd of samen worden geëlimineerd22. Na deze richtlijn werden twee, vijf en acht componenten overwogen voor de MCR-analyse, omdat componenten drie, vier en vijf eigen waarden produceren die vergelijkbaar zijn met die van grootte. Een soortgelijke trend werd ook waargenomen voor onderdelen zes, zeven en acht. Figuur 5 B is een plot van het verschil in eigen waarden tussen ' n ' en ' n + 1 ' componenten die lokale maxima weergeven na de tweede, vijfde en achtste componenten. Voorafgaande kennis over de moleculaire samenstelling van de huid in combinatie met het studie ontwerp ondersteunt minimaal drie componenten die nodig zijn om de hoge frequentie Raman spectra te modelleren. Daarom werden meerdere MCR-modellen met drie tot acht componenten onderzocht en werden de ladingen vergeleken met Spectra uit referentiematerialen om de belangrijkste componenten te identificeren die nodig waren voor het uiteindelijke model.
Vergelijking van de ladingen met Raman spectra uit referentiematerialen maakt het gemakkelijk om twee van de laatste MCR-componenten te identificeren en toe te wijzen aan eiwitten en water, omdat ze de MCR-ladingen domineren voor alle geteste modellen en overeenkomen met de bijbehorende referentie Spectra, die BSA en DI water zijn. De verwachte spectroscopische eigenschappen van lipide in sommige van de MCR-componenten was echter een zwakkere overeenkomst met het lipide referentiespectrum geïllustreerd in MCR-modellen die drie en vier componenten bevatten. Daarnaast werden residuele eiwit pieken (2840 cm-1) waargenomen in de MCR waterbelasting voor alle modellen getest onder zes componenten. Op basis van deze observaties werd een zes-componenten MCR-model gebruikt in de uiteindelijke MCR-analyse. Drie van de zes componenten werden toegewezen aan water, eiwitten en lipide door hun laad spectrum te matchen met het overeenkomstige referentiespectrum. De interpretatie en toewijzing van de lipide factor is gebaseerd op vergelijking van het laden naar Raman spectra van drie representatieve ceramide materialen, met inbegrip van N-behenoyl-D-erythro-Sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine, en D-Erythro-Dihyrosphingosine. De Raman spectra van andere lipide-materialen in het stratum corneum werden ook onderzocht. Deze materialen omvatten vetzuren (oleïne, palmitoleïne, en stearinezuur), cholesterol (cholesterol 3-sulfaat-natrium en cholesterol), en squaleen, zoals weergegeven in aanvullende figuur 5. De lipide factor die in het uiteindelijke MCR-model werd gebruikt, was een sterke match met ceramide Spectra en consistent met andere materialen die lange keten koolwaterstoffen bevatten. De andere drie MCR componenten werden gedomineerd door fluorescentie en baseline artefacten en hun corresponderende scorewaarden werden niet gebruikt in berekeningen. Deze drie componenten worden weergegeven in Figuur 7.
De algemene analyse benadering die in dit manuscript wordt gepresenteerd, produceert een definitieve methode met een verbeterde specificiteit en nauwkeurigheid voor het meten van de belangrijkste componenten in de huid in vergelijking met andere enkele piek-of piek fitting-benaderingen. Deze methodologie toont aan dat kritische componenten kunnen worden geëxtraheerd uit een klinische gegevensset die een relatief kleine fractie van slechte Spectra bevat. Toekomstige inspanningen zijn gericht op de automatisering van deze methodologie in een softwarepakket om de efficiëntie te verbeteren en de hoeveelheid technische expertise die nodig is voor de analyse te verminderen. Vergelijkbare methodologie wordt ontwikkeld voor Raman spectra verzameld in de vingerafdruk regio (400 – 1800 cm-1) met behulp van een 785 nm laserbron in plaats van de 671 nm Laser opgenomen in hetzelfde instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen sterk de financiële steun van de afdeling analytische en persoonlijke reinigings zorg van het bedrijf. We willen onze dankbaarheid betuigen aan de analytische Associate Directors MS. Jasmine Wang en Dr. Robb Gardner voor hun begeleiding en ondersteuning en mevrouw Li Yang voor haar hulp bij het verzamelen van gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M.
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
