Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אוסף של מוקד ראמאן ספקטרום מן הנושאים האנושיים במחקרים קליניים בשילוב עם גישות כימומטרי עבור הסרת ספקטרליר להסרת ואת החילוץ הבא של תכונות מפתח.
Abstract
פיתוח זה ב vivo קונפוקלית וקד ראמאן הספקטרוסקופית השיטה מאפשרת מדידה ישירה של מים, חלבונים, ושומנים עם רזולוציה עומק בנושאים אנושיים. מידע זה חשוב מאוד למחלות הקשורות לעור ולאפיון ביצועי מוצר לטיפוח העור. פרוטוקול זה ממחיש שיטה לאוסף ראמאן ספקטרום מוקד ואת הניתוח הבא של ערכת הנתונים ספקטרלית מינוף כימומטריקה. מטרת שיטה זו היא ליצור פרוטוקול סטנדרטי עבור איסוף נתונים ולספק הדרכה כללית לניתוח נתונים. עיבוד מקדים (למשל, הסרת ספקטרום חריג חשוד טעות) הוא צעד קריטי בעת עיבוד ערכות נתונים גדולים ממחקרים קליניים. כדוגמה, אנו מספקים הנחיה המבוססת על ידע מוקדם של ערכת נתונים כדי לזהות את סוגי הoutliers ולפתח אסטרטגיות ספציפיות כדי להסירם. מבוצעת ניתוח של רכיב ראשי, וספקטרום הטעינה מושווה לספקטרום מחומרי התייחסות כדי לבחור את מספר הרכיבים המשמשים בניתוח רזולוציית עקומת העקומות הסופית (MCR). גישה זו מוצלחת להפקת מידע משמעותי מערכת נתונים ספקטרלית גדולה.
Introduction
במחקרים קליניים, ב vivo קונפוקלית ראמאן ספקטרוסקופית הראה את היכולת הייחודית שלה לקביעת שכבה עובי של הקרנית ותוכן מים1,2,3,4, מעקב אחר חדירת חומרים פעילים למריחה על העור,5,6. כגישה שאינה פולשנית, ספקטרוסקופיית ראמאן מזהה אותות מולקולריים המבוססים על מצבי רטט. לכן, אין צורך בתוויות7. ב vivo קונפוקלית וקד ראמאן ספקטרוסקופית מספק מידע כימי עם רזולוציה עומק מבוסס על האופי הקונקמוקד של הטכניקה. מידע זה תלוי עומק שימושי מאוד ללמוד את ההשפעות של מוצרי טיפוח העור4,8, הזדקנות9,10, שינויים עונתיים3, כמו גם מכשול העור פונקציה מחלות, כגון אטופיק דרמטיטיס11,12. יש הרבה מידע באזור בתדר גבוה של מיקוד ראמאן (2500 – 4000 ס"מ-1), שם המים מייצרת פסגות נפרדות באזור בין 3250 – 3550 ס"מ-1. עם זאת, פסגות ראמאן של חלבונים ושומנים, אשר ממורכזים בין כ 2800 – 3000 ס"מ-1, חופפים זה לזה כי האותות מיוצרים בעיקר מ מתילן (-ch2-) ו מתיל (-ch3) קבוצות13 . מידע חופף זה מציג אתגר טכני בעת קבלת כמויות יחסיות של מינים מולקולריים בודדים. התאמת שיא14,15 ו שיא סלקטיבי מיקום12,16 גישות שימשו כדי לפתור את האתגר הזה. עם זאת, קשה לשיטות מבוססות-שיא אלה לחלץ מידע של רכיבים טהורים משום שפסגות ראמאן מרובות משינוי אותו רכיב בו17. בפרסום האחרון שלנו18, הציעו גישת mcr להבהיר את מידע הרכיבים הטהורים. באמצעות גישה זו, שלושה מרכיבים (מים, חלבונים, ושומנים) חולצו מ vivo קונפוקלית וקד הנתונים הספקטרוסקופית ראמאן.
ההוצאה להורג של מחקרים קליניים גדולים יכול להיות תובעני על אנשים האוספים נתונים vivo ספקטרוסקופיים. במקרים מסוימים, רכישה ספקטרלית יכולה לדרוש ציוד הפעלה במשך שעות רבות ביום והמחקר יכול להאריך עד שבועות או חודשים. בתנאים אלה, נתונים ספקטרוסקופיים עשויים להיווצר על ידי מפעילי ציוד כי חוסר המומחיות הטכנית לזהות, לכלול, ונכון עבור כל המקורות של ממצאים ספקטרוסקופיים. ערכת הנתונים שתיווצר עשויה להכיל חלק קטן מהמידע הספקטרוסקופי הדרוש לזיהוי ולהוצאה מהנתונים לפני הניתוח. נייר זה ממחיש בפרוטרוט תהליך ניתוח כימומטרי כדי "לנקות" ערכת נתונים של ראמאן קלינית לפני ניתוח הנתונים עם MCR. כדי להסיר בהצלחה את החלק החיצוני, את סוגי המיירס ואת הסיבה הפוטנציאלית עבור הדור של ספקטרום outliers צריך להיות מזוהה. אז, גישה מסוימת ניתן לפתח כדי להסיר את היעד המיועד. זה דורש ידע מוקדם של הנתונים, כולל הבנה מפורטת על תהליך יצירת הנתונים ועיצוב המחקר. בערכת נתונים זו, רוב המכריע של החוצה הם האותות האות אל הרעש, מקורם בעיקר 1) ספקטרום שנאסף מעל פני העור (6,208 מתוך 30,862), ו 2) תרומה חזקה לספקטרום של אור בחדר פלורסנט (67 מתוך 30,862). ספקטרה נאסף מעל פני השטח העור לייצר תגובה ראמאן חלשה, כמו נקודת מוקד לייזר מתקרב למשטח העור הוא בעיקר בחלון המכשיר מתחת לעור. ספקטרה עם תרומה חזקה של אור בחדר הפלורסנט נוצרות עקב שגיאה או אופרטור המכשיר או התנועה הנושא, אשר מייצרת מצב שבו חלון אוסף ראמאן מוקד לא מכוסה במלואו על ידי אתר הגוף של הנושא. למרות סוגים אלה של ממצאים ספקטרלים יכול להיות מזוהה לתיקון במהלך רכישת ספקטרלי על ידי מומחה ספקטרוסקופי בזמן רכישת נתונים, מפעילי כלי מיומן המשמשים במחקר זה הונחו לאסוף את כל הנתונים אלא אם כן כישלון קטסטרופלי נצפתה. המשימה לזיהוי וללא כלילת החוצה משולבת בפרוטוקול ניתוח הנתונים. הפרוטוקול שהוצג פותח כדי לפתור את האתגר הזה. כדי לטפל בספקטרום של האות לרעש הנמוך מעל פני העור, המיקום של משטח העור צריך להיקבע תחילה כדי לאפשר הסרה של ספקטרום שנאסף מעל פני השטח של העור. מיקומו של משטח העור מוגדר כמו עומק שבו נקודת מוקד לייזר ראמאן הוא חצי בעור וחצי מתוך העור כפי שמודגם באיור המשלים 1. לאחר הסרת ספקטרום של אות לרעש נמוך, ניתוח מרכיב ראשי (PCA) מיושם כדי לחלץ את הפקטור הנשלט על ידי פסגות אור בחדר פלורסנט. מיירס זה מוסרים על בסיס ערך הניקוד של הפקטור המקביל.
פרוטוקול זה מספק מידע מפורט לגבי האופן שבו שישה רכיבים עיקריים נקבעים בתהליך MCR. הדבר נעשה באמצעות ניתוח pca ואחריו השוואת צורה ספקטרלית בין עמסות עבור מודלים שנוצרו עם מספר שונה של רכיבים עיקריים. התהליך הניסיוני לאיסוף נתונים של חומרי ייחוס, כמו גם לנושאים אנושיים מוסבר בפרוטרוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת הסקירה המוסדית של בית החולים לילדים של בייג בציות להנחיות האתיות של 1975 הצהרת הלסינקי. היא נערכה על פי ההנחיות לפרקטיקה קלינית טובה. המחקר התקיים ממאי עד יולי 2015.
1. אוסף של vivo קונפוקלית ראמאן ספקטרום מתוך נושאים אנושיים עם דרמטיטיס אטופית
- כלול נושאים בהתאם לקריטריונים הבאים.
- כלול נושאים בין הגילאים 4 – 18.
- כלול נושאים עם מתון עד בינוני דרמטיטיס אטופית (ציון של 2 או 3 על פי הערכה הכללית של הרופא) עם תסמיני המחלה הפעילים על 5% – 30% של פני השטח, עם לפחות שתי נגעים על הזרועות.
- כלול נושאים הנמצאים במצב בריאותי טוב, למעט סימפטומים הקשורים ישירות למחלת ה-AD.
- כלול נושאים המספקים הסכמה מושכלת בכתב.
- כלול נושאים בעלי ערך טופולוגיה בודד (ITA) גבוה מ-40 במיקום הבדיקה.
- אל תכלול נושאים העונים על כל אחד מהקריטריונים הבאים.
- אל תכלול נושאים המשתתפים כעת או שהשתתפו בעבר במחקר קליני בכל מתקן בדיקה במהלך 4 השבועות הקודמים.
- אל תכלול נושאים עם סרטן או שאובחנו או טופלו עבור סרטן בתוך 5 שנים לפני המחקר.
- אל תכלול נושאי סוכרת.
- אל תכלול נושאים שיש להם חיסוני או מחלה זיהומית שיכולים למקם את הנושא בסיכון או להפריע לדיוק של תוצאות המחקר (כלומר, צהבת, שחפת, HIV, איידס, זאבת, או דלקת מפרקים שגרונית).
- אל תכלול נושאים בעלי מצבי עור שעלולים להפריע למדידות אינסטרומנטליים או למנוע הערכה ברורה של העור רק לדלקת עור אטופית. דוגמאות כוללות עור יבש במיוחד, עור פגום, חתכים, שריטות, כוויות שמש, כתמי ליום, קעקועים, הצטלקות נרחבת, פריחות, צמיחת שיער מוגזמת, או אקנה.
- אל תכלול נושאים המשתמשים בתרופות מדכאים חיסוני אוראלי, אנטיביוטיקה, או טיפולים מערכתית אחרים בחודש האחרון, למעט סמי הרגעה קלים.
- אין לכלול נושאים בתנאים רפואיים אחרים, שלפי דעתו של החוקר, מונע מהם להשתתף בלימוד.
- אל תכלול נושאים עם פיגמנטציה גבוהה יותר באזור הבדיקה.
- תווית את אזור הנגע של משתתף המחקר דרמטיטיס אטופית ולסמן עם שטח 3 ס"מ x 4 ס מ על או ליד האתר נגע כפי שמוצג באיור 1.
- התווית את האזור שאינו נגע עם אותו סמן באתר הגוף המקביל (למשל, זרוע שמאל לעומת זרוע ימין) כמוצג באיור 1B.
- מניחים את אתר הגוף המסומן בקשר קרוב עם החלון של vivo קונפוקלית וקד מכשיר ראמאן כפי שמוצג באיור 2A ואיור 2ב. כסו את כל החלון כדי למנוע את השפעת אור החדר באתר הגוף.
- בצע את איסוף הנתונים ראמאן.
הערה: המכשיר יש ברזולוציה ספקטרלית של 2 ס"מ-1 ו- 50x מטרה מיקרוסקופ (NA = 0.9 שמן טבילה), באמצעות 671 לייזר nm עם כוח של 17 mW. אורך הגל מכויל באמצעות הספקטרום של מנורה מובנית של ארגון ניאון. כיול האינטנסיביות נעשה על-ידי מדידת הספקטרום של מתקן לכיול זכוכית (המכון הלאומי לתקנים).- להעביר את המוקד עד ספקטרום כפי מומחש באיור 2C הוא נצפתה, ולאחר מכן להעביר את המוקד מן פני העור 10 μm.
- הפעל את אוסף הנתונים עבור 26 שלבים עם גודל הצעד 2 יקרומטר ב-2,510 ס"מ-1-4,000 ס מ-1 באזור התדר. השתמש בזמן חשיפה של 1 s ולמדוד שמונה משכפל עבור כל אזור שנמשך ~ 10 – 15 דקות בסך הכל.
2. אוסף של ספקטרום ראמאן מתוך חומרי ייחוס
- מניחים את חומרי הייחוס, את המרכיבים העיקריים של העור האנושי שכבה הקרנית19, על החלון של המכשיר ראמאן מוקד (ראה טבלת חומרים: סרום בשור (bsa), מים מוכי (די מים), ceramide, כולסטרול, חינם חומצת שומן וסקוואלן).
- לאסוף את חומרי הייחוס ראמאן ספקטרום ברציפות מן החיצוני של החומר למרכז החומרים באמצעות פרמטרי אוסף זהה כמתואר לעיל.
- לשלב את האזור תחת כל ספקטרום ראמאן בין טווח של 2510 – 4000 ס"מ-1 ולזהות את שלוש נקודות הערך המקסימלי העליון ב -26 המידות. ממוצע ספקטרום ראמאן מתוך שלוש נקודות אלה כדי להשיג את ספקטרום חומר התייחסות הסופי.
3. הסרת ספקטרום החיצוני באמצעות ניתוח כימומטריקה
- לקבוע את משטח העור ולהסיר את ספקטרום מחוץ לעור.
- שנה את סיומת הקובץ מ-'. ric ' ל-'. mat ' וטען את קובץ ה-. mat לפלטפורמת התוכנה MATLAB.
- תקן את התוכנית הבסיסית באמצעות תוכנית בסיסית (ריבועים לפחות משוקללים) על-ידי לחיצה ימנית על קבוצת הנתונים המיובאת תחת נתח | כלים אחרים | עיבוד מקדים בתוכנת PLS_Toolbox עם הגדרת ברירת המחדל.
- סכם את הערכים בין 2910 – 2965 ס"מ-1 כדי לקבל את ערכי העוצמה שמתחת לכל קשת ראמאן ממדידת המדידה של 26 השלבים העוקבים כפי שמוצג באיור 3A באמצעות הפונקציה sum ב-MATLAB.
- מבצעת אינטרפולציה בערך ההיסט של המכשיר (ערך בציר ה-X באיור 3ב) מתוך 26-260 באמצעות פונקציית הרווח linspace ב-MATLAB.
- אינטרפולציה בערך העוצמה בין 26 ל-260 באמצעות שיטת ליטת חיבור ב-MATLAB, מינוף ערכי המיקום החדשים שנוצרו ב-260.
- השתמש בפונקציות POLYFIT ו polyfit כדי לקבל את הסט החדש של ערכי עוצמה עם 260 נקודות. ראשית, השתמש בערכי המיקום והעוצמה של 260 כתשומות X ו-Y עבור הפונקציה polyfit , בהתאמה. הגדר את ערך המידה ל-20. לאחר מכן, השתמש במקדמים הפלט ובערכי המיקום המורחבים 260 כקלט עבור polyval כדי להשיג את ערכי העוצמה הסופית 260.
- השתמש בפונקציות max ו- min של MATLAB כדי לזהות את הנקודות המרביות והמינימליות מערכי העוצמה החדשים ש260 אינטרפולציה.
- חשב את ערך העוצמה הממוצע על-ידי חלוקת הסכום של ערך העוצמה המרבי והמזערי בשתיים.
- זהה את ערך העוצמה מערכי העוצמה 260 (שחושבו משלב 3.1.6) הקרוב ביותר לערך העוצמה הממוצע והגדר את ערך המיקום התואם שלו כמשטח המעטפת. הגדר ערך מיקום זה כנקודת האפס בציר ה-X כפי שמודגם באיור 3ב.
- שנה את כל ערכי המיקום האחרים בהתאם לנקודת האפס וגודל הצעד הידוע 2 יקרומטר.
- הסר את כל הספקטרום שנאסף מעל פני העור בהתאם לערך המיקום שלהם.
- יבא את שאר הנתונים ל-PLS_Toolbox כדי ליצור ערכת נתונים ולשנות את שמו "RamanData. mat".
- הסירו את הספקטרום החיצוני. עם אפקט האור בחדר
- טען את קבוצת הנתונים ראמאן ספקטרה (RamanData. mat) לאחר הסרת ספקטרום מחוץ לעור וליישם את ניתוח PCA.
- טען את ערכת הנתונים לתוך תוכנת PLS_Toolbox תחת פלטפורמת MATLAB ולחץ לחיצה ימנית על קבוצת הנתונים כדי לבחור באפשרות ' נתח ' | PCA.
- בחר באפשרות ' נרמל ' כגישה לעיבוד מקדים ובחר ' ללא ' עבור האימות הצולב.
- השתמש בשלושת הרכיבים עבור ניתוח פירוק ה-PCA כמוצג באיור המשלים 2.
- הסר את המכסה על vivo חלון אוסף של מכשיר ראמאן ולאסוף את ספקטרום אור החדר באזור בתדר גבוה באמצעות אותם פרמטרים המשמשים את חומרי הייחוס נתונים איסוף.
- זהה את גורם אפקט האור בחדר בהשוואה לספקטרום הרקע של החדר כמוצג באיור המשלים 3.
- הסר את הספקטרום עם ערך ניקוד גבוה באופן משמעותי יותר מהרגיל (יותר מ 99.8% של ערכי הניקוד של ערכת הנתונים כולה, שהוא 0.16 במחקר זה).
4. בחירת מספר הרכיבים בניתוח הפירוק של MCR
- תקן את הבסיס ראמאן ספקטרה באמצעות אותה גישה שתוארה לעיל (סעיף 3.1.2).
- בצע את ניתוח ה-pca בערכת הנתונים המעובדת מראש כמתואר לעיל (סעיף 3.2), למעט בחירת "pqn" – "מרכז ממוצע" ולא "לנרמל", ולהתוות את ערכי ערכים קנה מידה לוגריתמי יחד עם מספר הרכיבים (20) כמספר ברירת המחדל ב ניתוח הפירוק על-ידי לחיצה על לחצן בחירת רכיבים ובחירת יומן רישום (ערכי eigenvalues כערך Y. בחר שלוש עד שמונה כמספר הרכיבים המשמשים לניתוח MCR.
- בצע ניתוח MCR.
- טען את ערכת הנתונים לתוך תוכנת MCR_main20 באמצעות לחצן בחירת המידע .
- בחר את מספר הרכיבים (שלושה עד שמונה) על-ידי לחיצה על קביעת מספר הרכיבים .
- לחץ על הלחצן הנקי תחת הכרטיסיה שערוך התחלתי , בחר באפשרות ריכוז תחת הכיוון של הכרטיסיה בחירת משתנים ולחץ על לחצן בצע .
- לחץ על לחצן אישור ולאחר מכן המשך לחצן לעמוד הבא.
- לחץ על המשך בעמוד הבא ולאחר מכן בחר fnnls ו- 6 תחת היישום ו -Nr. של מינים עם כרטיסיות פרופילים לא שליליות , בהתאמה. לחץ על לחצן המשך .
- בחר את אותם הפרמטרים כמו המקטע 4.3.5 עבור דף זה ולחץ על המשך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר קליני זה, vivo קונפוקלית וקד ראמאן ספקטרום נאספו מ 28 נושאים מ 4 – 18 בן. סך של 30,862 ספקטרום ראמאן נאספו עם פרוטוקול איסוף נתונים שהוזכרו לעיל. זו ערכת נתונים ספקטרלית גדולה מכיל 20%החוצהספקטרלי כפי שמוצג באיור 4א. לאחר קביעת משטח העור ולאחריה PCA הוסרו האותות הנמוכים של האות לרעש. הגורם השלישי במודל PCA זה מזוהה פסגות אור החדר. זה מאושר על ידי השוואה של ספקטרום הטעינה של פקטור 3 עם ספקטרום של אור בחדר פלורסנט שנאסף בנפרד באתר המחקר באמצעות אותו מוקד מכשיר ראמאן (ראה איור משלים 3). איור 4 B מציין כי רוב ספקטרום חריג חשוד טעות הוסרו לאחר תהליך זה.
Pca התבצע על ערכת הנתונים ראמאן מעובד מראש ואת הערך בעיית עם מספר הגורמים המשמשים מותווים באיור 5. על פי מחקרים קודמים12,19, המודל צריך לכלול לפחות שלושהמרכיבים: מים, חלבון, ו ליפיד. ירידה משמעותית בערך העצמי נצפתה לפקטור 9 כפי שמוצג באיור 5. התבוננות זו מרמזת על חקירת מודלים עם מספר רכיבים עיקריים משתנה בין שלושה לשמונה גורמים להכללה במודל MCR. העמסה MCR המכילים תכונות ספקטרוסקופיות העקביים ביותר עם חלבון, מים ושומנים בדם מוצגים באיור 6.
איור 1 . איור של הנגע ואת סימן לא נגע על הזרוע. (א) שטח של 3 ס"מ x 4 ס מ באתר הנגע. (ב) 3 ס מ x 4 ס מ שטח מסומן על האתר לא נגע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 . איור של אוסף הנתונים ראמאן מוקד. (A) מכשיר ראמאן מוקד. (ב) ספקטרום אוסף על הזרוע של הנושא האנושי. (ג) צילום מסך של קביעת מיקום הייחוס עבור איסוף נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 . קביעת משטח העור. (א) שילוב של אזור החלבון תחת כל קשת ראמאן. (ב) הגדרת משטח העור על בסיס הנקודות המרביות והמינימליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 . ספקטרום הנתונים ראמאן. (A) confocal וקד ראמאן ספקטרום לפני ההסרה של ספקטרום חריג חשוד טעות. (ב) confocal וקד ראמאן ספקטרום לאחר ההסרה של ספקטרום חריג חשוד טעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 . קביעת מספר הרכיבים מניתוח PCA. (א) eigenvalue בקנה מידה לוגריתמי המותווה כפונקציה של מספר הרכיבים בהם נעשה שימוש במודל pca. (ב) הבדל בערכי הערכים רכיבי ' n ' ו-' n + 1 ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 . השוואה בין צורת הטעינה לבין מעבד החומרים המתאים ספקטרום עם שלושה עד שמונה רכיבים במודל MCR. (א) חלבון, (ב) מים, ו (ג) גורמי השומנים הצורה עם שלושה עד שמונה רכיבים במודל mcr לעומת bsa, מים, ו השומנים חומרים התייחסות ספקטרום, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7 . שלושת ההגים הנוספים ממודל MCR של שישה רכיבים שאינם בשימוש במודל הסופי. שלושת רכיבי MCR אלה נשלטים על ידי ממצאים של קרינה פלואורסצנטית ובסיסית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 1. איור של קביעת משטח העור שבו מרכז מיקוד הלייזר נוגע בעור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 2. איור של הבחירה של שלושה רכיבים בניתוח PCA של תוכנת PLS_Toolbox. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 3. זיהוי של גורם ההעמסה שנשלט על ידי אור החדר על גבי ספקטרום התייחסות של אור החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 4. השוואת העמסה של מודל MCR לפני ואחרי הסרת קרניים קוסמיות. (א), (ב) ו-(ג) הם הגורמים המייצגים מים, חלבונים וליפיד, בהתאמה. גורמי הטעינה הנוספים שאינם משתמשים במודל MCR הסופי הם d, e ו-f. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 5. ראמאן ספקטרום של חומרי השומנים טיפוסי ברובד הקרנית. (א) כולסטרול3-סולפט נתרן וכולסטרול. (ב) אולאית, פלמיטיק, פאלמיאולאית וחומצה סטארית. (ג) סקוואלן. (ד) n-behenoyl-d-אריאנא-ספיגוסינוס, n-ליגנוצרורקסיל-ד-אריאו-ספיגנין, ו-d-אריקה-דיהירוספיגוסין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך איסוף הנתונים, כפי שמתואר בסעיף 2 ו-3 של הפרוטוקול, כל פרופיל עומק נאסף באזור עם מגע בין חלון המכשיר לבין העור על ידי מציאת האזורים הכהים יותר מהתמונות המיקרוסקופיים המסומנים בעיגולים האדומים ב איור 2ג. ברגע שאזורים אלה היו ממוקמים, זה היה קריטי להתחיל את פרופיל העומק מעל פני השטח העור כדי לקבוע במדויק את המיקום של משטח העור עבור הליך ניתוח נתונים. מיקום משטח העור שימש לאחר מכן כדי לקבוע את העומק היחסי של כל ספקטרום בפרופיל העומק המתאים. כפי שהוזכר בסעיף 1 של הפרוטוקול, החל פרופיל עומק 10 יקרומטר מעל פני השטח העור מייצרת חמש נקודות נתונים מחוץ לעור. זה מאפשר לקבוע בהצלחה את המיקומים של עוצמת האות המקסימלית והמינימלית משני הצדדים של משטח העור. חשוב גם להימנע ממדידת מיקומים המכילים סימוני עט ואזורי פיגמנט גבוהים יותר כגון נמשים, מכיוון שאזורים אלה מייצרים אות רקע גבוה ברוחב הזריחה. הבחירה של זמן החשיפה היא איזון בין האיכות הספקטרלית ומשך המדידה. זמן חשיפה ארוך יותר משפר את האות לרעש ומגדיל באופן משמעותי את זמן המדידה הכולל. עם זאת, נושאים רבים מוצאים שהוא מאתגר להישאר ללא תנועה לפרקי זמן ארוכים. זה מאוד מאתגר לילדים, למשל. הגדלת כוח הלייזר מגבירה את אות הרעש. עם זאת, יותר מדי כוח יכול לגרום נזק לעור בשל ספיגת האנרגיה. כיווני החשיפות המותר, 17 mW כוח הלייזר כפי שהוגדר על ידי התקן הלאומי הסיני (GB 7247.1-2012), ואת תקן בטיחות הלייזר הבינלאומי (IEC 60285-1:2007; < 20 mW עבור 671 nm ו < 30 mW עבור 785 nm), לא ניתן לחרוג. אמצעי זהירות אחרים בטיחות כוללים להבטיח כי כל נושא לובש הגנה העין לפני רכישת נתונים, כי לאתרי הגוף יש זווית הטופולוגיה האישית (ITA) ערך גבוה יותר מ 40, והימנעות אזורים עם פיגמנטציה בעור גבוה.
כדי לקבוע את המיקום של משטח העור, את האזור תחת החלבון ראמאן שיא (2910-2965 ס"מ-1) שולבו כדי להשיג את פרופיל העומק של האות חלבון. ספקטרום ראמאן היו הראשונה בסיסית-תוקן באמצעות שיטה מרובעת אוטומטית לפחות מרובע מ PLS_Toolbox לפני שילוב של הפסגות. 26 נקודות הנתונים מפרופיל עומק אחד עברו אינטרפולציה ל-260 נקודות באמצעות שיטת linspace עבור הסטת המכשיר (ערך ציר X באיור 3א) ושיטת ליטת חיבור עבור ערך העוצמה המתאים. הנתונים המתקבלים הוערכו באינטרפולציה על הפולינוםבסדר 20 באמצעות פונקציות polyfit ופוליבל ב MATLAB והנקודות המרביות והמינימליות של הנתונים באינטרפולציה נקבעו. ערך העוצמה הממוצע חושב על-ידי חלוקת סכום הערכים המקסימליים והמינימליים ב-2. משטח העור הוגדר כמיקום שבו ערך האינטנסיביות מפרופיל העומק שבאינטרפולציה היה הקרוב ביותר לעוצמה הממוצע. המיקום המדויק של משטח העור אינו צריך להיות חופף לנקודת נתונים ניסויית. שיטה זו יכולה רק למדוד עומק מוגבל של העור בשל הספיגה והפיזור של הקרן21. איסוף נתונים ספקטרוסקופיים להלן ~ 50 יקרומטר מתחת למשטח העור עשוי לדרוש שינויים משמעותיים בפרמטרים הניסיוניים.
כפי שמתואר בסעיף 3 של הפרוטוקול, לאחר הסרת ספקטרום חריג חשוד טעות עם האות לרעש נמוך ותרומה גבוהה מאורות החדר, חלק קטן של ספקטרום המכיל קרניים קוסמיות נשאר בערכת הנתונים. השוואה בין ספקטרום הטעינה שנוצר לפני ואחרי הסרת הקרן הקוסמית מוצג באיור המשלים 4. השוואת ספקטרום ההעמסה המוצג באיור המשלים 4 מצביעה על כך שהשפעת מספר קטן של ספקטרום עם קרניים קוסמיות הייתה זניחה. שלושת הגורמים המייצגים את המים, החלבון והשומנים היו זהים, ושלושת המיגים הנוספים הקשורים ברעש ובחפצים ספקטרלים היו דומים מאוד. זה יכול להיות מיוחס להתרחשות נמוכה של קרניים קוסמיות בספקטרום (~ 0.25%) מכיוון שהמיקום של הקרניים הקוסמיות בספקטרום הוא אקראי.
הבחירה של מספר הרכיבים המשמשים בניתוח MCR היא קריטית, מכיוון שפענוח הצורה של העמסה במונחים של המין המולקולרי המתאים האחראי לכל טוען משפיע באופן משמעותי על התוצאה המתאימה נעשה שימוש בערכים ובביצועי השיטה הכוללים. כפי שמתואר בסעיף 4 של פרוטוקול, pca בוצעה הראשון כדי לחקור את האבולוציה בעיית הקשורים להגדלת מספר הרכיבים. בחקירה זו נעשה שימוש כדי לזהות את מספר הרכיבים שיש להשתמש בהם בניתוח MCR הבא. התוויית הערך העצמי בקנה מידה לוגריתמי יכולה לגרום לתהליך זיהוי זה להיות קל יותר מאשר בדיקת ערכי בעיית, כפי שמוצג באיור 5א. כל ערך בעיית ייצוג של השונות שרכיב אחד יכול ללכוד. ככל שהערך מיותר גדול יותר, כך מרכיב זה יכול להיות מודל בספקטרום. ערכים בעלי גודל דומה צריכים להיבחר או להימחק ביחד22. בעקבות מנחה זה, שניים, חמישה ושמונה מרכיבים נחשבו לניתוח MCR מכיוון שהרכיבים שלושה, ארבעה וחמישה יוצרים ערכים דומים בגודלם. מגמה דומה נצפתה גם לגבי רכיבים שישה, שבעה ושמונה. איור 5 ב הוא מגרש של ההבדל בערכי ערכים רכיבי ' n ' ו-' n + 1 ' המציגים מקומי מקסימה לאחר הרכיבים השני, החמישי והשמיני. ידע מוקדם על ההרכב המולקולרי של העור בשילוב עם עיצוב המחקר תומך למינימום של שלושה רכיבים הדרושים למודל בתדר גבוה ראמאן. לכן, מודלים mcr מרובים המכילים שלושה עד שמונה רכיבים נחקרו ואת עמסות הושוו ספקטרום מחומרים התייחסות כדי לזהות את הרכיבים המרכזיים הדרושים עבור המודל הסופי.
השוואת עמסות עם ספקטרום ראמאן מחומרים התייחסות בקלות מאפשר זיהוי והקצאת שניים מרכיבי mcr הסופי לחלבון ומים, כי הם שולטים העמסה mcr עבור כל הדגמים נבדק ולהתאים את ההפניה המתאימה ספקטרה, שהם BSA ו-DI מים. עם זאת, המאפיינים הספקטרוסקופיים הצפויים של השומנים בחלק מרכיבי MCR היה משחק חלש יותר ספקטרום התייחסות ליפיד מומחשים מודלים MCR המכילים שלושה וארבעה רכיבים. בנוסף, שיורית פסגות החלבון (2840 – 3000 ס"מ-1) נצפו בטעינת המים mcr עבור כל הדגמים נבדק מתחת לשישה רכיבים. בהתבסס על תצפיות אלה, נעשה שימוש במודל MCR של שישה רכיבים בניתוח MCR הסופי. שלושה מתוך ששת המרכיבים הוקצו למים, חלבונים וליפיד על ידי התאמת ספקטרום הטעינה שלהם לספקטרום ההפניה המקביל. הפרשנות וההקצאה של פקטור שומנים בדם מבוסס על השוואה של הטעינה ראמאן ספקטרום של שלושה מרכיבים ceramide הנציג, כולל N-behenoyl-D-אריא-הספיגוסין, N-ליגאוקסיל-D-אריא-הספיגנין, ו . ד-אריאו-דירוביגוסינוס ספקטרום ראמאן של חומרים אחרים השומנים ברובד הקרנית גם נבדקו. חומרים אלה כוללים חומצות שומן (אולאית, פלמיטיק, פאלמיאולאית, חומצה סטארית), כולסטרול (כולסטרול 3-סולפט נתרן וכולסטרול), ו סקוואלן, כפי שמוצג באיור 5. פקטור השומנים המשמש המודל הסופי MCR היה משחק חזק כדי להתאים את ספקטרום ceramide ועקבי עם חומרים אחרים המכילים שרשרת פחמימנים ארוכים. שלושת רכיבי MCR האחרים נשלטים על ידי ממצאים של אור השמש הבסיסית ואת ערכי הניקוד המקביל שלהם לא נעשה שימוש בחישובים כלשהם. שלושת המרכיבים הללו מוצגים באיור 7.
גישת הניתוח הכוללת המוצגת בכתב יד זה מייצרת שיטה סופית עם ספציפיות ודיוק משופרות למדידת הרכיבים המרכזיים בעור ביחס לשיא בודד או לשיא של גישות בהתאמה. מתודולוגיה זו ממחישה כי ניתן לחלץ רכיבים קריטיים מערכת נתונים קלינית המכילה שבר קטן יחסית של ספקטרום שגוי. מאמצים עתידיים מתמקדים באוטומציה של מתודולוגיה זו לחבילת תוכנה כדי לשפר את יעילותה ולצמצם את כמות המומחיות הטכנית הדרושה לניתוח. מתודולוגיה דומה מפותחת עבור ספקטרום ראמאן שנאסף באזור טביעת האצבע (400 – 1800 ס מ-1) באמצעות מקור לייזר nm 785 במקום 671 ננומטר לייזר שולבו לתוך אותו מכשיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מכירים במידה רבה את התמיכה הכספית ממחלקת הטיפול האנליטי והאישי של הארגון. אנו רוצים להביע את הכרת התודה שלנו לבמאים המנהלים האנליטיים גב' יסמין וואנג וד ר רוב גרדנר על הדרכתו והתמיכה שלהם ועל הגברת לי יאנג לעזרתה באיסוף מידע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M.
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
