Summary
Здесь мы представляем протокол для сбора конфокальных спектров Раман из человеческих субъектов в клинических исследованиях в сочетании с химиометрическими подходами для удаления спектральных выбросов и последующего извлечения ключевых особенностей.
Abstract
Разработка этого in vivo confocal Raman спектроскопического метода позволяет непосредственно измерять воду, белки и липиды с разрешением глубины у людей. Эта информация очень важна для заболеваний, связанных с кожей и характеризующих производительность продукта по уходу за кожей. Этот протокол иллюстрирует метод сбора конфокальных спектров Раман и последующего анализа спектрального набора данных с использованием химиометрии. Цель этого метода заключается в создании стандартного протокола для сбора данных и обеспечении общего руководства для анализа данных. Предварительная обработка (например, удаление спектров выбросов) является критическим шагом при обработке больших наборов данных из клинических исследований. В качестве примера мы предоставляем рекомендации, основанные на предварительных знаниях набора данных для определения типов выбросов и разработки конкретных стратегий для их устранения. Выполняется основной анализ компонентов, а спектры загрузки сравниваются со спектрами из справочных материалов для выбора количества компонентов, используемых в окончательном анализе разрешения многовариантной кривой (MCR). Этот подход успешен для извлечения значимой информации из большого спектрального набора данных.
Introduction
В клинических исследованиях, in vivo confocal Раман спектроскопии показал свою уникальную способность для определения толщины роговицы слоя и содержания воды1,2,3,4, и отслеживания проникновения активные материалы местно применяется к коже5,6. В качестве неинвазивного подхода конфокальная Рамана спектроскопия обнаруживает молекулярные сигналы на основе вибрационных режимов. Таким образом, маркировка не требуется7. In vivo confocal Raman спектроскопия обеспечивает химическую информацию с разрешением глубины на основе конфокального характера техники. Эта глубинно зависимая информация очень полезна при изучении последствий продуктов по уходу за кожей4,8,старение9,10, сезонные изменения3,а также заболевания функции кожного барьера, атопический дерматит11,12. Существует много информации в высокочастотной области конфокальной раманской спектроскопии (2500-4000 см-1),где вода производит различные пики в регионе между 3250-3,550 см-1. Тем не менее, Раман пики белков и липидов, которые сосредоточены между примерно 2800-3000 см-1, перекрывают друг друга, потому что сигналы в основном производятся из метилена (-CH2-) и метил (-CH3)группы 13 . Эта перекрытая информация представляет собой техническую проблему при получении относительного количества отдельных молекулярных видов. Для решения этой задачи были использованы пиковые установки14,15 и селективная пиковая позиция12,16 подходов. Тем не менее, это трудно для этих одного пиковых методов для извлечения чистой информации компонента, потому что несколько пиков Раман из одного и того же компонента изменения одновременно17. В нашей недавней публикации18, MCR подход был предложен, чтобы прояснить чисто компонент информации. Используя этот подход, три компонента (вода, белки и липиды) были извлечены из большого in vivo конфокального спектроскопического набора данных Раман.
Выполнение крупных клинических исследований может быть требовательным к лицам, собирающим в vivo спектроскопические данные. В некоторых случаях, спектральные приобретения может потребовать операционного оборудования в течение многих часов в день, и исследование может продлиться до недель или месяцев. В этих условиях спектроскопические данные могут генерироваться операторами оборудования, которые не имеют технических знаний для выявления, исключения и исправления всех источников спектроскопических артефактов. Полученный набор данных может содержать небольшую часть спектроскопических выбросов, которые необходимо идентифицировать и исключить из данных до анализа. В этой статье подробно иллюстрируется процесс химиометрического анализа для «очистки» клинического набора данных Рамына перед анализом данных с помощью MCR. Для успешного удаления выбросов необходимо определить типы выбросов и потенциальную причину генерации спектров выбросов. Затем может быть разработан конкретный подход для удаления целевых выбросов. Это требует предварительного знания набора данных, включая детальное понимание процесса генерации данных и проектирования исследования. В этом наборе данных большинство выбросов являются низкой спектрами сигнала к шуму и происходят в основном из 1) спектров, собранных над поверхностью кожи (6208 из 30 862), и 2) сильный вклад в спектр от флуоресцентного света комнаты (67 из 30 862). Спектры, собранные над поверхностью кожи, производят слабую реакцию Раман, так как лазерный координационный центр приближается к поверхности кожи и в основном находится в окне прибора под кожей. Спектра с сильным вкладом флуоресцентного света комнаты генерируются либо из-за ошибки оператора инструмента или субъекта движения, который производит условие, при котором конфоконсльное окно коллекции Раман не полностью покрыто тела объекта субъекта. Хотя эти типы спектральных артефактов могут быть идентифицированы и исправлены в ходе спектрального приобретения спектроскопическим экспертом во время получения данных, обученным операторам приборов, использоваваемым в этом исследовании, было поручено собирать все данные, если катастрофический сбой наблюдался. Задача выявления и исключения выбросов включена в протокол анализа данных. Представленный протокол разработан для решения этой проблемы. Для решения низких сигнальных-шумовых спектров над поверхностью кожи необходимо сначала определить местоположение поверхности кожи, чтобы позволить удаление спектров, собранных над поверхностью кожи. Расположение поверхности кожи определяется как глубина, где Раман лазерный координационный центр наполовину в коже и половина из кожи, как показано на дополнительной рисунке 1. После удаления низкой спектры сигнала к шуму, основной анализ компонентов (PCA) реализуется для извлечения фактора, в котором доминируют флуоресцентные пики света комнаты. Эти выбросы удаляются на основе значения оценки соответствующего фактора.
Этот протокол содержит подробную информацию о том, как шесть основных компонентов определяются в процессе MCR. Это делается на основе анализа PCA с последующим сравнением спектральной формы между нагрузками для моделей, генерируемых с разным количеством основных компонентов. Подробно подробно разъясняется также экспериментальный процесс сбора данных справочных материалов, а также и субъектов человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено институциональным комитетом по обзору Пекинской детской больницы в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации 1975 года. Она проводилась в соответствии с руководящими принципами ICH для хорошей клинической практики. Исследование проводилось с мая по июль 2015 года.
1. Коллекция in vivo confocal Raman spectra от человеческих подданных с атопическим дерматитом
- Включите предметы в соответствии со следующими критериями.
- Включайте предметы в возрасте от 4 до 18 лет.
- Включите предметы с легкой до умеренной атопический дерматит (оценка 2 или 3 в соответствии с глобальной оценки врача) с активными симптомами заболевания на 5%-30% поверхности тела, по крайней мере два поражения на руках.
- Включите предметы, которые находятся в добром здравии, за исключением симптомов, непосредственно связанных с болезнью АД.
- Включите темы, которые предоставляют письменное информированное согласие.
- Включите объекты, которые имеют индивидуальный угол зрения топологии (ITA) выше 40 в месте тестирования.
- Исключить предметы, которые отвечают любому из следующих критериев.
- Исключите испытуемых, которые в настоящее время либо участвуют, либо ранее участвовали в клиническом исследовании в любом испытательном центре в течение предыдущих 4 недель.
- Исключить субъектов с раком или которые были диагностированы или лечение рака в течение 5 лет до исследования.
- Исключить диабетических субъектов.
- Исключить испытуемых, которые имеют иммунологическое или инфекционное заболевание, которое может поставить субъекта в опасности или помешать точности результатов исследования (например, гепатит, туберкулез, ВИЧ, СПИД, волчанка, или ревматоидный артрит).
- Исключить субъектов, которые имеют кожные заболевания, которые могут помешать инструментальные измерения или будет препятствовать четкой оценки кожи только атопический дерматит. Примеры включают очень сухую кожу, поврежденную кожу, порезы, царапины, солнечные ожоги, родинки, татуировки, обширные рубцы, сыпь, чрезмерный рост волос, или акне.
- Исключите испытуемых, которые используют пероральные иммуносупрессивные препараты, антибиотики или другие системные методы лечения в течение последнего месяца, за исключением незначительных транквилизаторов.
- Исключить предметы с любыми другими заболеваниями, что, по мнению следователя, исключает их от участия в учебе.
- Исключите испытуемых с более высокой пигментацией в области тестирования.
- Пометьте область поражения участника исследования атопического дерматита и пометьте площадью 3 см х 4 см на участке поражения или вблизи него, как показано на рисунке 1А.
- Пометьте область непоражения тем же маркером на сайте тела аналога (например, левое предплечье против правого предплечья), как показано на рисунке 1B.
- Поместите отмеченный сайт тела в тесном контакте с окном in vivo confocal Raman инструмент, как показано на рисунке 2И Рисунок 2B. Обложка все окно, чтобы избежать воздействия света комнаты на сайте тела.
- Выполните сбор данных Raman.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор имеет спектральное разрешение 2 см-1 и 50x цель микроскопии (NA 0.9 погружения масла), используя лазер 671 nm с силой 17 mW. Длина волны откалибрована с использованием спектра встроенной неон-аргоновой лампы. Калибровка интенсивности осуществляется путем измерения спектра стандарта калибровки стекла NIST (Национальный институт стандартов).- Переместите фокус до тех пор, пока не будет наблюдаться спектр, как показано на рисунке 2C, а затем отодьте фокус от поверхности кожи на 10 мкм.
- Начните сбор данных для 26 шагов с размером 2 мкм в области частоты 2510 см-1-4,000 см-1. Используйте время экспозиции 1 с и измерьте восемь репликантов для каждой области продолжительностью 10–15 минут.
2. Коллекция конфокальных спектров Раман из справочных материалов
- Поместите справочные материалы, основные компоненты в коже человека слой роговицы19, на окне конфокальный инструмент Раман (см. Таблица материалов: Сыворотка Булбордин крупного рогатого скота (BSA), деионизированной воды (DI воды), керамид, холестерин, бесплатно жирной кислоты и сквален).
- Собирайте спектры репорантентовых материалов из внешнего материала в материальный центр, используя те же параметры сбора, что и описано выше.
- Интегрируйте область под каждым Раманской спектрой между диапазоном 2510–4000 см-1 и определите три верхних максимальных значения в этих 26 измерениях. Средний Раман спектра из этих трех точек, чтобы получить окончательный справочный материал спектра.
3. Удаление спектра выбросов с помощью анализа хемометрии
- Определите поверхность кожи и удалите спектры из кожи.
- Измените расширение файла с '.ric' на '.mat' и загрузите файл .mat на программную платформу MATLAB.
- Исправьте базовый универсал с помощью базового (автоматическивзвешенные наименьшие квадраты) путем нажатия правого нажатия импортного набора данных в рамках анализа (ru) Прочие инструменты Предварительная обработка в программном обеспечении PLS-Toolbox с настройками по умолчанию.
- Суммировать значения между 2,910-2,965 см-1, чтобы получить значения интенсивности под каждым спектром Рамана из 26 последовательных шагов измерения, как показано на рисунке 3А через сумма функции в MATLAB.
- Интерполировать смещение значения инструмента (значение на X-оси на рисунке 3B)от 26-260 с помощью функции linspace в MATLAB.
- Интерполировать значение интенсивности от 26 до 260 с помощью метода spline в MATLAB, используя вновь генерируемые значения 260 позиций.
- Используйте полифит-и полививные функции MATLAB для получения нового набора значений интенсивности с 260 точками. Во-первых, используйте значения 260 позиций и интенсивности в качестве входов X и Y для полифитной функции, соответственно. Установите значение степени до 20. Затем используйте коэффициенты вывода и значения расширенного положения 260 в качестве входных данных для поливалов для получения окончательных значений интенсивности 260.
- Используйте максимальные и минные функции MATLAB для определения максимальных и минимальных точек от новых интерполированных 260 значений интенсивности.
- Рассчитайте среднее значение интенсивности, разделив сумму максимального и минимального значения интенсивности на два.
- Определите значение интенсивности из значений интенсивности 260 (рассчитано с шага 3.1.6), которое ближе всего к среднему значению интенсивности, и установите соответствующее значение положения в качестве поверхности кожи. Установите это значение позиции в качестве нулевой точки на оси X, как показано на рисунке 3B.
- Измените все другие значения позиции в соответствии с нулевой точкой и известным размером шага 2 мкм.
- Удалите все спектры, собранные над поверхностью кожи в соответствии с их значением положения.
- Импортируйте остальные данные в PLS-Toolbox, чтобы создать набор данных и переименовать его в "RamanData.mat".
- Удалите выпадающие спектры с эффектом света комнаты.
- Загрузите набор спектров Raman spectra (RamanData.mat) после удаления спектра вне кожи и вневните анализ PCA.
- Загрузите набор данных в программное обеспечение PLS-Toolbox под платформой MATLAB и нажмите правой кнопкой мыши, чтобы выбрать Анализ (ru) PCA.
- Выберите нормализовать в качестве подхода предварительной обработки и выбрать нет для перекрестной проверки.
- Используйте три компонента для анализа разложения PCA, как показано на дополнительном рисунке 2.
- Снимите крышку на окне коллекции инструмента in vivo Raman и соберите световые спектры комнаты в высокочастотной области, используя те же параметры, что и для сбора данных справочных материалов.
- Определите фактор эффекта света комнаты путем сравнения с спектрами фона света комнаты как показано в Дополнительной рисунке 3.
- Удалите спектру с значительно более высоким соответствующим значением оценки, чем обычно (более 99,8% значений оценки всего набора данных, что составляет 0,16 в данном исследовании).
4. Выбор количества компонентов в анализе разложения MCR
- Исправьте базовый участок Раманской спектры, используя тот же подход, описанный выше (раздел 3.1.2).
- Выполните анализ PCA на предварительно обработанном наборе данных, как описано выше (раздел 3.2), за исключением выбора "P'N" - "Средний центр", а не "Нормализация", и участок eigenvalues в логарифмической шкале вместе с числом компонентов (20) в качестве номера по умолчанию в анализ разложения, нажав кнопку «Выбрать компоненты» и выберите журнал (eigenvalues) в качестве значения Y. Выберите от трех до восьми компонентов, используемых для анализа MCR.
- Выполняйте анализ MCR.
- Загрузите набор данных в программное обеспечение MCR-main20 с помощью кнопки «Выбор данных».
- Выберите количество компонентов (от трех до восьми), нажав кнопку Определение количества компонентов.
- Нажмите кнопку Pure под вкладкой «Первоначальная оценка», выберите «Концентрацию под направлением вкладки выбора переменной» и нажмите кнопку «До».
- Нажмите кнопку OK, а затем кнопку Продолжить на следующую страницу.
- Нажмите Продолжить на следующей странице, а затем выбрать фнлы и 6 под реализации и Nr. видов с неотрицательность профилей вкладок, соответственно. Нажмите кнопку "Продолжить".
- Выберите те же параметры, что и раздел 4.3.5 для этой страницы и нажмите Продолжить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом клиническом исследовании, in vivo confocal Raman спектры были собраны из 28 субъектов от 4-18 лет. В общей сложности было собрано 30 862 раманенных спектра с упомянутым выше протоколом сбора данных. Этот большой спектральный набор данных содержит 20% спектральных выбросов, как показано на рисунке 4A. Низкий сигнал к шуму выброс спектры были удалены после определения поверхности кожи, а затем PCA для идентификации спектра с функциями освещения комнаты. Третьим фактором в этой модели PCA являются пики комнатного света. Это подтверждается сравнением спектров загрузки фактора 3 со спектром флуоресцентного комнатного света, собранного отдельно на исследуемом месте с использованием того же конфокального инструмента Раман (см. Дополнительная рисунок 3). Рисунок 4 B указывает на то, что большая часть спектров выбросов была удалена после этого процесса.
PCA был выполнен на предварительно обработанном наборе данных Confocal Raman и eigenvalue вместе с числом используемых факторов, нарисованных на рисунке 5. Согласно предварительным исследованиям12,19, модель должна включать в себя по крайней мере три компонента: вода, белок и липид. Значительное снижение eigenvalue наблюдалось для фактора 9, как показано на рисунке 5. Это наблюдение предполагает изучение моделей с числом основных компонентов, варьируясь от трех до восьми факторов для включения в модель MCR. НАгрузки MCR, содержащие спектроскопические особенности, наиболее совместимые с белком, водой и липидом, показаны на рисунке 6.
Рисунок 1 . Иллюстрация знака поражения и непоражения на предплечье. (A) A 3 см х 4 см отмеченной области на месте поражения. (B) A 3 см х 4 см отмеченной области на месте не-поражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . Иллюстрация сбора данных конфокального Рамана. (A) Конфокальный Роман инструмент. (B) Спектра коллекции на предплечье человека. (C) Скриншот определения базирования для сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 . Определение поверхности кожи. (A) Интеграция белковой области под каждым спектром Рамына. (B) Установка поверхности кожи на основе максимального и минимального точек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 . Спектры набора данных Раман. (A) Confocal Раман спектра до удаления выброса спектра. (B) Confocal Раман спектра после удаления выброса спектра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 . Определение количества компонентов из анализа PCA. (A) Eigenvalue по логарифмической шкале, построенной как функция количества компонентов, используемых в модели PCA. (B) Разница в eigenvalues между 'n' и 'n q 1' компоненты Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 . Сравнение формы загрузки с спектрами соответствующих справочных материалов с тремя-восемью компонентами в модели MCR. (A) Белок, (B) вода, и (C) форма липидных факторов с 3 до 8 компонентами в модели MCR сравнено с спектрами справки BSA, воды, и липидных справочных материалов, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7 . Дополнительные три загрузки из шести компонентов модели MCR не используются в окончательной модели. В этих трех компонентах MCR преобладают флуоресценция и базовые артефакты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1. Иллюстрация определения поверхности кожи, где центр лазерного фокуса касается кожи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 2. Иллюстрация выбора трех компонентов в анализе ПРОГРАММНОго обеспечения PLS-Toolbox PCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 3. Идентификация фактора загрузки, в котором доминирует комнатный свет, накладывается на эталонный спектр комнатного света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 4. Сравнение погрузок с модели MCR до и после удаления космических лучей. (A), (B), и (C) являются факторами, представляющими воду, белок и липид, соответственно. Дополнительные факторы загрузки, не используемые в окончательной модели MCR, d, e и f. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 5. Раман спектры типичных липидных материалов в прослойке роговицы. (A) Холестерин 3-сульфат натрия и холестерина. (B) Oleic, Palmitic, palmitoleic, и стеариновая кислота. (C) Сквален. (D) N-behenoyl-D-эритро-сфингозин, N-Lignoceroyl-D-эритро-сфинганин, и D-Эритро-дихиросфингозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время сбора данных, как описано в разделе 2 и 3 протокола, каждый профиль глубины был собран в области со контактом между окном инструмента и кожей, найдя темные области из микроскопических изображений, выделенных в красных кругах в Рисунок 2C. После того, как эти области были расположены, было важно, чтобы начать глубину профиля над поверхностью кожи, чтобы точно определить местоположение поверхности кожи для процедуры анализа данных. Расположение поверхности кожи впоследствии использовалось для определения относительной глубины каждого спектра в соответствующем профиле глубины. Как уже упоминалось в разделе 1 протокола, начиная профиль глубины 10 мкм над поверхностью кожи производит пять точек данных за пределами кожи. Это позволяет успешно определить расположение максимальной и минимальной интенсивности сигнала по обе стороны поверхности кожи. Важно также, чтобы избежать измерения мест, которые содержат знаки пера и более высокие пигментные области, такие как веснушки, потому что эти области производят высокий фон флуоресценции фонового сигнала. Выбор времени экспозиции представляет собой баланс между спектральным качеством и продолжительностью измерений. Более длительное время экспозиции улучшает время от сигнала к шуму и значительно увеличивает общее время измерения. Тем не менее, многие субъекты считают сложным оставаться неподвижным в течение длительных периодов времени. Это чрезвычайно сложно для детей, например. Увеличение мощности лазера увеличивает сигнал к шуму. Однако, слишком много энергии может повредить кожу из-за поглощения энергии. Максимальная допустимая экспозиция, мощность лазера мощностью 17 мВт, как это определено в китайском национальном стандарте (GB 7247.1-2012), и международный стандарт лазерной безопасности (IEC 60285-1:2007; lt;20 мВт для 671 нм и lt;30 мВт за 785 нм), не могут быть превышены. Другие меры предосторожности включают в себя обеспечение того, чтобы каждый субъект носит защиту глаз до получения данных, что сайты тела имеют индивидуальный угол топологии (ITA) значение выше, чем 40, и избежать областей с высокой пигментацией кожи.
Для определения расположения поверхности кожи, область под белком Рамен пик (2,910-2,965 см-1) была интегрирована для получения глубины профиля белка сигнала. Раманские спектры были впервые исправлены с помощью автоматизированного взвешенного метода наименьшего квадрата от PLS-Toolbox до интеграции пиков. 26 точек данных из одного профиля глубины были интерполированы до 260 точек с использованием метода linspace для инструмента смещения vaue (X-оси значение на рисунке 3A) и метод spline для соответствующего значения интенсивности. Полученные данные были интерполированы на полиномиальный20-й порядок с использованием полифитных и полиамоза функций в MATLAB и определены максимальные и минимальные точки интерполированных данных. Среднее значение интенсивности рассчитывалось путем деления суммы максимальных и минимальных значений на 2. Поверхность кожи была определена как место, где значение интенсивности от интерполированного профиля глубины было ближе всего к средней интенсивности. Точное расположение поверхности кожи не должно совпадать с экспериментальной точкой данных. Этот метод может измерять только ограниченную глубину кожи из-за поглощения и рассеяния луча21. Сбор спектроскопических данных ниже 50 мкм под поверхностью кожи может потребовать значительных изменений экспериментальных параметров.
Как описано в разделе 3 протокола, после удаления выпадающих спектров с низким сигналом к шуму и высоким вкладом от комнатных огней, небольшая часть спектра, содержащего космические лучи, осталась в наборе данных. Сравнение спектров погрузки, генерируемых до и после удаления космических лучей, показано на дополнительной диаграмме 4. Сравнение спектров нагрузки, показанное на дополнительной диаграмме 4, показывает, что воздействие небольшого числа спектров с космическими лучами было незначительным. Три фактора, представляющие воду, белок и липид, были идентичны, и дополнительные три нагрузки, связанные с шумом и спектральными артефактами, также были очень похожи. Это может быть связано с низким появлением космических лучей в спектрах (0,25%) потому что расположение космических лучей в спектрах является случайным.
Выбор количества компонентов, используемых в анализе MCR, имеет решающее значение, поскольку интерпретация формы нагрузок с точки зрения соответствующих молекулярных видов, ответственных за каждую загрузку, существенно влияет на то, как соответствующий балл используются значения и общая производительность метода. Как описано в разделе 4 протокола, PCA была проведена первой для изучения эволюции eigenvalue, связанной с увеличением числа компонентов. Это исследование было использовано для определения числа компонентов, которые должны быть использованы в следующем анализе MCR. Прокладка eigenvalue на логарифмической шкале может сделать этот процесс идентификации проще, чем изучение сырья eigenvalues, как показано на рисунке 5A. Каждая eigenvalue представляет собой представление дисперсии, которую может захватить один компонент. Чем больше eigenvalue, тем больше дисперсии этот компонент может моделировать в спектрах. Eigenvalues с подобным размером должны быть выбраны или устранены вместе22. В соответствии с этим руководством для анализа MCR были рассмотрены два, пять и восемь компонентов, поскольку компоненты три, четыре и пять производят эйгензначения, сходные по размеру. Аналогичная тенденция наблюдалась и в компонентах 6, 7 и 8. Рисунок 5 B — это сюжет разницы в эйгенвале между компонентами 'n' и 'n'1', показывающий локальную максиму после второго, пятого и восьмого компонентов. Предварительные знания о молекулярном составе кожи в сочетании с дизайном исследования поддерживают как минимум три компонента, необходимых для моделирования высокочастотных спектров Раман. Таким образом, было исследовано несколько моделей MCR, содержащих от трех до восьми компонентов, и нагрузки были сопоставлены со спектрами из справочных материалов для определения ключевых компонентов, необходимых для конечной модели.
Сравнение погрузок с Рамановыми спектрами из справочных материалов легко позволяет выявить и назначить два последних компонента MCR белу и воде, поскольку они доминируют в нагрузках MCR для всех проверенных моделей и соответствуют соответствующей ссылке спектры, которые являются BSA и DI воды. Тем не менее, ожидаемые спектроскопические свойства липидов в некоторых компонентах MCR были слабее, чтобы соответствовать липидного референса, иллюстрированного в моделях MCR, которые содержат три и четыре компонента. Кроме того, в нагрузочных водах MCR для всех моделей, протестированных ниже шести компонентов, наблюдались остаточные протеиновые пики (2840–3000 см-1). На основе этих наблюдений в конечном счете была использована шестикомпонентная модель MCR. Три из шести компонентов были назначены воде, белку и липидам, сопоставив их спектр нагрузки с соответствующим эталонным спектром. Интерпретация и назначение липидного фактора основано на сравнении нагрузки на раманские спектры трех репрезентативных материалов керамида, в том числе N-behenoyl-D-erythro-sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine, и D-Эритро-Дихиросфингозин. Были также исследованы раманные спектры других липидных материалов в роговице слоя. Эти материалы включают жирные кислоты (олеиновые, пальмитические, пальмитольский и стеариновая кислота), холестерин (холестерин 3-сульфат натрия и холестерина), и сквален, как показано на дополнительной рисунке 5. Липидный фактор, используемый в окончательной модели MCR, был сильным совпадением с церамидными спектрами и соответствовал другим материалам, которые содержат углеводороды длинной цепи. В остальных трех компонентах MCR доминировали флуоресценция и базовые артефакты, и соответствующие значения оценки не использовались ни в каких расчетах. Эти три компонента показаны на рисунке 7.
Общий подход к анализу, представленный в данной рукописи, дает окончательный метод с улучшенной специфичностью и точностью измерения ключевых компонентов кожи по сравнению с другими подходами, подходящими для пиковых или пиковых. Эта методология показывает, что критические компоненты могут быть извлечены из клинического набора данных, который содержит относительно небольшую долю плохих спектров. Будущие усилия сосредоточены на автоматизации этой методологии в пакет программного обеспечения для повышения ее эффективности и сокращения объема технических знаний, необходимых для анализа. Аналогичная методология разрабатывается для Рамана спектры, собранные в области отпечатков пальцев (400-1800 см-1) с использованием 785 нм лазерный источник, а не 671 нм лазер включен в тот же инструмент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы в значительной степени признают финансовую поддержку со стороны отдела корпоративной функции аналитического и личного чистки. Мы хотим выразить нашу благодарность директорам по аналитическим партнерам г-же Джасмин Ван и д-ру Роббу Гарднеру за их руководство и поддержку, а г-же Ли Ян за помощь в сборе данных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M.
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
