Summary
Her presenterer vi en protokoll for innsamling av konfokalmikroskopi Raman Spectra fra menneskelige i kliniske studier kombinert med chemometric tilnærminger for Spectral avvikende fjerning og den påfølgende ekstraksjon av viktige funksjoner.
Abstract
Utvikling av denne in vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopiske metoden muliggjør direkte måling av vann, proteiner og lipider med dybde oppløsning i menneskelige. Denne informasjonen er svært viktig for hud-relaterte sykdommer og karakteriserer hudpleieprodukt ytelse. Denne protokollen illustrerer en metode for konfokalmikroskopi Raman Spectra samling og den påfølgende analyse av Spectral datasettet utnytte kjemometri. Målet med denne metoden er å etablere en standard protokoll for datainnsamling og gi generell veiledning for dataanalyse. Forbehandling (for eksempel fjerning av avvikende Spectra) er et kritisk trinn ved behandling av store datasett fra kliniske studier. Som et eksempel gir vi veiledning basert på tidligere kjennskap til et datasett for å identifisere outliers og utvikle spesifikke strategier for å fjerne dem. En hovedkomponent analyse utføres, og lasting Spectra sammenlignes med Spectra fra referansemateriale for å velge antall komponenter som brukes i den endelige multivariabel kurve oppløsning (MCR) analyse. Denne tilnærmingen er vellykket for å utvinne meningsfull informasjon fra en stor Spectral datasett.
Introduction
I kliniske studier har in vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopi vist sin unike evne til å bestemme stratum corneum tykkelse og vanninnhold1,2,3,4, og sporing av inntrengning av aktivt materiale lokalt påføres huden5,6. Som en ikke-invasiv tilnærming, konfokalmikroskopi Raman spektroskopi oppdager molekylære signaler basert på vibrasjonen moduser. Dermed er merking ikke nødvendig7. In vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopi gir kjemisk informasjon med dybde oppløsning basert på den konfokalmikroskopi natur teknikken. Denne dybde avhengige informasjonen er svært nyttig i å studere virkningene av hudpleieprodukter4,8, aldring9,10, sesongmessige endringer3, samt hudbarriere funksjon sykdommer, som atopisk dermatitt11,12. Det er mye informasjon i høy frekvens regionen konfokalmikroskopi Raman spektroskopi (2500-4000 cm-1), der vann produserer distinkte topper i regionen mellom 3250-3550 cm-1. Men Raman toppene av proteiner og lipider, som er sentrert mellom ca 2800-3000 cm-1, overlapper hverandre fordi signalene er hovedsakelig produsert fra metylen (-CH2-) og methyl (-CH3) grupper13 . Dette overlappet informasjon presenterer en teknisk utfordring ved innhenting relative mengder av individuelle molekylære arter. Toppmontering14,15 og selektiv topp posisjon12,16 tilnærminger har blitt brukt til å løse denne utfordringen. Det er imidlertid vanskelig for disse enkelt topp-baserte metoder for å trekke ut ren komponentinformasjon fordi flere Raman topper fra samme komponent endres samtidig17. I vår nylige utgivelse18ble en MCR-tilnærming foreslått for å belyse den rene komponentinformasjonen. Ved hjelp av denne tilnærmingen, tre komponenter (vann, proteiner og lipider) ble utvunnet fra en stor in vivo konfokalmikroskopi Raman spektroskopiske datasett.
Gjennomføringen av store kliniske studier kan være krevende for enkeltpersoner å samle inn vivo spektroskopiske data. I noen tilfeller kan Spectral oppkjøp kreve drifts utstyr i mange timer på en dag, og studien kan forlenge opp til uker eller måneder. Under disse forholdene kan spektroskopiske data genereres av utstyrs operatører som mangler teknisk ekspertise for å identifisere, ekskludere og korrigere for alle kilder til spektroskopiske artefakter. Det resulterende datasettet kan inneholde en liten brøkdel av spektroskopiske outliers som må identifiseres og ekskluderes fra dataene før analysen. Dette papiret illustrerer i detalj en chemometric analyse prosess for å "rydde opp" et klinisk Raman datasett før analysere dataene med MCR. Å med hell fjerne det outliers, typene av outliers og det muligheter anledning for det generasjon av det avvikende Spectra nød å bli kjennemerke. Deretter kan en bestemt tilnærming utvikles for å fjerne målrettede outliers. Dette krever forhåndskunnskap om datasettet, inkludert en detaljert forståelse av dataene og studie utformingen. I dette datasettet, flertallet av outliers er lav signal-til-støy Spectra og kommer først og fremst fra 1) Spectra samlet over hudoverflaten (6 208 av 30 862), og 2) sterkt bidrag til spekteret fra fluorescerende rom lys (67 ut av 30 862). Spectra samlet over hudoverflaten produsere en svak Raman respons, som laser fokuspunktet nærmer seg hudoverflaten og er for det meste i instrumentet vinduet under huden. Spectra med et sterkt bidrag fra fluorescerende rom lys genereres på grunn av enten instrument operatørfeil eller motivbevegelse, som produserer en tilstand der konfokalmikroskopi Raman samling vinduet ikke er fullt ut dekket av faget kropp nettsted. Selv om disse typene av Spectral artefakter kunne identifiseres og utbedres i løpet av Spectral oppkjøp av en spektroskopiske-ekspert på tidspunktet for datainnhenting, ble de trente instrument operatørene som ble brukt i denne studien, instruert til å samle inn alle data med katastrofal svikt ble observert. Oppgaven med å identifisere og ekskludere outliers er innlemmet i dataanalyse protokollen. Protokollen som presenteres er utviklet for å løse denne utfordringen. For å møte den lave signal-til-støy Spectra over hudens overflate, må plasseringen av hudoverflaten bestemmes først for å tillate fjerning av Spectra samlet over hudoverflaten. Plasseringen av hudoverflaten er definert som dybden der Raman laser knutepunkt er halvparten i huden og halvparten ut av huden som illustrert i supplerende figur 1. Etter å ha fjernet lav signal-til-støy Spectra, en rektor komponent analyse (PCA) er implementert for å trekke ut faktoren dominert av fluorescerende rom lys topper. Disse outliers er fjernet basert på score verdien av den tilsvarende faktoren.
Denne protokollen gir detaljert informasjon om hvordan seks hovedkomponenter bestemmes i MCR-prosessen. Dette gjøres gjennom en PCA-analyse etterfulgt av Spectral figur sammenligning mellom belastninger for modeller generert med et ulikt antall hovedkomponenter. Den eksperimentelle prosessen for datainnsamling av referansematerialer så vel som de menneskelige fagene er også forklart i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av den institusjonelle gjennomgangen komité Beijing Children ' s Hospital i samsvar med de etiske retningslinjene i 1975 erklæringen av Helsingfors. Det ble gjennomført i henhold til ICH retningslinjer for god klinisk praksis. Studien fant sted fra mai til juli 2015.
1. innsamling av in vivo konfokalmikroskopi Raman Spectra fra menneskelige motiver med atopisk dermatitt
- Inkluder emner i samsvar med følgende kriterier.
- Ta med emner mellom 4 – 18 år.
- Inkluder motiver med mild til moderat atopisk dermatitt (score på 2 eller 3 i henhold til legens globale vurdering) med aktive sykdomssymptomer på 5% – 30% av kroppens overflate, med minst to lesjoner på armene.
- Ta med emner som er i god helse, med unntak av symptomer som er direkte relatert til AD-sykdommen.
- Inkluder emner som gir skriftlig informert samtykke.
- Inkluder emner som har en individuell topologi vinkel (ITA) verdi som er høyere enn 40 på test plasseringen.
- Utelat emner som oppfyller ett av følgende kriterier.
- Ekskluder emner som enten deltar i øyeblikket eller tidligere har deltatt i en klinisk studie på et hvilket som helst testanlegg i løpet av de siste 4 ukene.
- Ekskluder personer med kreft eller som har blitt diagnostisert eller behandlet for kreft innen 5 år før studien.
- Ekskluder diabetiker.
- Ekskluder personer som har en Immunologic eller smittsom sykdom som kan sette motivet i fare eller forstyrre nøyaktigheten av studieresultatene (dvs. hepatitt, tuberkulose, HIV, AIDS, lupus eller revmatoid artritt).
- Ekskluder motiver som har hudsykdommer som kan forstyrre instrumental målinger eller vil hindre den klare vurderingen av huden bare til atopisk dermatitt. Eksempler inkluderer ekstremt tørr hud, skadet hud, kutt, riper, solbrenthet, fødselsmerker, tatoveringer, omfattende arrdannelse, utbrudd, overdreven hårvekst, eller akne.
- Ekskluder emner som bruker orale immunsuppressiv legemidler, antibiotika eller andre systemiske terapier i løpet av den siste måneden, med unntak av mindre beroligende midler.
- Ekskluder med andre medisinske tilstander som, i den oppfatning av etterforsker, utelukker dem fra studie deltakelse.
- Ekskluder motiver med høyere pigmentering i testområdet.
- Merk den lesjon området av atopisk dermatitt studien deltaker og merke med et 3 cm x 4 cm område på eller i nærheten av lesjon området som vist i figur 1a.
- Merk området for ikke-lesjon med samme markør i motstykket (f.eks. venstre underarm kontra høyre underarm) som vist i figur 1B.
- Plasser det markerte kropps området i nær kontakt med vinduet på in vivo konfokalmikroskopi Raman instrument som vist i figur 2A og figur 2B. Dekk hele vinduet for å unngå virkningen av rommet lys på kroppen området.
- Utfør datainnsamlingen for Raman.
Merk: instrumentet har en Spectral oppløsning på 2 cm-1 og 50x mikroskopi objektiv (NA = 0,9 olje nedsenking), ved hjelp av en 671 NM laser med en effekt på 17 MW. Bølgelengde er kalibrert ved hjelp av spekteret av en innebygd Neon-Argon lampe. Intensiteten kalibrering gjøres ved å måle spekteret av en NIST (National Institute of Standards) glass kalibrering standard.- Flytt fokuset til et spektrum som illustrert i figur 2C er observert, og flytt deretter fokuset bort fra hudoverflaten 10 μm.
- Start datainnsamlingen i 26 trinn med en trinn størrelse på 2 μm i 2 510 cm-1– 4 000 cm-1 frekvensområde. Bruk en eksponeringstid på 1 s og mål åtte replikerer for hvert område som varer ~ 10 – 15 min totalt.
2. innsamling av konfokalmikroskopi Raman Spectra fra referansemateriale
- Plasser referansemateriale, de viktigste komponentene i menneskets hud stratum corneum19, på vinduet til konfokalmikroskopi Raman instrument (se tabell over materialer: STORFE serum albumin (BSA), deionisert vann (di vann), Ceramide, kolesterol, gratis fettsyrer og squalene).
- Samle referansematerialet ' Raman Spectra etter hverandre fra utsiden av materialet til Material senteret ved hjelp av de samme parametrene som beskrevet ovenfor.
- Integrer området under hver Raman Spectra mellom utvalget av 2510-4000 cm-1 og identifisere de tre høyeste maksimale verdi punkter i disse 26 målingene. Gjennomsnittlig Raman Spectra fra de tre punktene for å få det endelige referansematerialet Spectra.
3. fjerning av avvikende Spectra gjennom kjemometri analyse
- Bestem hudoverflaten og fjern ut-av-huden Spectra.
- Endre filtypen fra '. Ric ' til '. mat ' og Last inn. mat filen til MATLAB programvareplattform.
- Rett opp grunnlinjen ved hjelp av opprinnelig plan (automatiske vektet minst firkanter) ved å høyreklikke det importerte datasettet under analyser | Andre verktøy | Forbehandling i PLS_Toolbox programvare med standardinnstilling.
- Oppsummer verdiene mellom 2910-2965 cm-1 for å oppnå intensiteten verdier under hvert Raman spektrum fra 26 sammenhengende trinn måling som vist i Figur 3A via Sum -funksjonen i MATLAB.
- Interpolere verdi for instrument forskyvning (verdi i X-aksen i Figur 3B) fra 26 til 260 ved hjelp av linspace -funksjonen i MATLAB.
- Interpolere intensiteten verdien fra 26 til 260 ved hjelp av spline -metoden i MATLAB, utnytte de nylig genererte 260 posisjons verdier.
- Bruk MATLAB ' s Polyfit og polyval funksjoner for å få det nye settet med intensitet verdier med 260 poeng. Bruk først verdiene for 260-posisjon og-intensitet som X-og Y-innganger for Polyfit -funksjonen. Angi grad verdien til 20. Deretter bruker du utdata koeffisienter og 260 utvidede posisjons verdier som inn data for polyval å oppnå de endelige 260 intensitet verdier.
- Bruk funksjonene Max og min i MATLAB til å identifisere maksimums-og minimums punktene fra de nylig interpolert verdiene for 260 intensitet.
- Beregn gjennomsnittsverdien for intensitet ved å dividere summen av maksimums-og minimumsverdien for intensitet med to.
- Identifiser intensitet verdien fra 260 intensitet verdier (beregnet fra trinn 3.1.6) som er nærmest gjennomsnittet intensitet verdi og sette sin tilsvarende posisjon verdi som hudens overflate. Angi denne plasserings verdien som nullpunktet i X-aksen som illustrert i Figur 3B.
- Endre alle de andre posisjons verdiene i henhold til nullpunktet og den kjente trinn størrelsen på 2 μm.
- Fjern alle de Spectra som er samlet over hudoverflaten i henhold til deres posisjon verdi.
- Importer resten av dataene til PLS_Toolbox for å opprette et datasett og gi det navnet "RamanData. mat".
- Fjern avvikende Spectra med rommet lyseffekt.
- Last Raman Spectra datasettet (RamanData. mat) etter fjerning av det ut-av-huden Spectra og implementere PCA analyse.
- Laste inn datasettet i PLS_Toolbox programvare under MATLAB-plattformen, og høyreklikk datasettet for å velge analyser | I PCA.
- Velg normalisere som forbehandling tilnærming og velg ingen for kryss valideringen.
- Bruk de tre komponentene for ned brytnings analysen for PCA som vist i supplerende figur 2.
- Fjern dekselet på in vivo Raman instrumentets innsamlings vindu og samle rom lyset Spectra i høyfrekvensområdet ved hjelp av de samme parametrene som brukes for referansematerialer datainnsamling.
- Identifiser rommet lyseffekt faktor gjennom sammenligning med rommet lys bakgrunn Spectra som vist i supplerende figur 3.
- Fjern Spectra med en signifikant høyere tilsvarende score verdi enn normalt (mer enn 99,8% av poengsummen verdiene for hele datasettet, som er 0,16 i denne studien).
4. valg av antall komponenter i MCR-ned brytnings analyse
- Korriger Raman Spectra Baseline med samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor (pkt. 3.1.2).
- Utfør PCA-analysen på preprocessed datasett som beskrevet ovenfor (del 3,2), bortsett fra å velge "PQN" – "Mean Center" i stedet for "normalisere", og plotte hva i logaritmisk skala sammen med antall komponenter (20) som standardnummer i ned brytings analysen ved å klikke Velg komponenter -knappen og velge Logg (hva) som Y-verdi. Velg tre til åtte som antall komponenter som brukes for MCR-analysen.
- Utføre MCR-analyse.
- Last datasettet inn i MCR_main-programvaren20 via data utvalgs knappen.
- Velg antall komponenter (tre til åtte) ved å klikke på fastsettelse av antall komponenter -knappen.
- Klikk på Pure -knappen under den første estimering kategorien, velg konsentrasjon under retning av variabelen utvalg kategorien, og klikk på do knapp.
- Klikk på OK -knappen og deretter på Fortsett -knappen til neste side.
- Klikk Fortsett på neste side, og velg deretter fnnls og 6 under implementeringen og Nr. av arter med ikke-negativitet profiler , henholdsvis. Klikk på Fortsett -knappen.
- Velg de samme parametrene som del 4.3.5 for denne siden, og klikk på Fortsett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne kliniske studien ble in vivo konfokalmikroskopi Raman Spectra samlet inn fra 28 fra 4 – 18 år gammel. Totalt 30 862 Raman Spectra ble samlet inn med datainnsamlings protokollen nevnt ovenfor. Denne store Spectral datasettet inneholder 20% Spectral outliers som vist i Figur 4A. Den lave signal-til-støy avvikende Spectra ble fjernet etter fastsettelse hudoverflaten, etterfulgt av PCA å identifisere Spectra med lysfunksjoner. Den tredje faktoren i denne PCA-modellen er identifisert rom lys topper. Dette bekreftes ved sammenligning av lasting Spectra faktor 3 med et spektrum av fluorescerende rom lys samlet inn separat på studien området ved hjelp av samme konfokalmikroskopi Raman instrument (se supplerende Figur 3). Figur 4 B indikerer at de fleste av avvikende Spectra ble fjernet etter denne prosessen.
PCA ble utført på preprocessed konfokalmikroskopi Raman datasett og eigenvalue sammen med antall faktorer som brukes er plottet i figur 5. Ifølge tidligere studier12,19, bør modellen inneholde minst tre komponenter: vann, protein, og lipid. En signifikant reduksjon i eigenvalue ble observert for faktor 9 som vist i figur 5. Denne observasjonen antyder å undersøke modeller med antall hovedkomponenter som varierer mellom tre og åtte faktorer for inkludering i MCR-modellen. MCR-belastninger som inneholder spektroskopiske funksjoner mest konsistent med protein, vann og lipid er vist i figur 6.
Figur 1 . Illustrasjon av lesjon og ikke-lesjon merke på under armen. (A) en 3 cm x 4 cm markerte området på en lesjon området. (B) a 3 cm x 4 cm markerte området på en ikke-lesjon området. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Illustrasjon av konfokalmikroskopi Raman datainnsamling. (A) konfokalmikroskopi Raman instrument. (B) Spectra samling på under armen av menneskelig gjenstand. (C) et skjermbilde av fastsettelse av referanse posisjon for datainnsamling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Fastsettelse av hudoverflaten. (A) integrering av protein området under hvert Raman spektrum. (B) innstilling av hudoverflaten basert på maksimum og minimum poeng. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Raman datasett Spectra. (A) konfokalmikroskopi Raman Spectra før fjerning av avvikende Spectra. (B) konfokalmikroskopi Raman Spectra etter fjerning av avvikende Spectra. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Fastsettelse av antall komponenter fra PCA-analyse. (A) Eigenvalue på en logaritmisk skala plottet som en funksjon av antall komponenter som brukes i PCA-modell. (B) forskjell i hva mellom ' n ' og ' n + 1 ' komponenter Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Sammenligning av laste figuren med tilsvarende referansemateriale ' Spectra med tre til åtte komponenter i MCR-modell. (A) protein, (B) vann, og (C) lipid faktorer ' form med tre til åtte komponenter i MCR-modellen sammenlignet med BSA, vann, og lipid referansematerialer ' Spectra, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . De tre andre belastninger fra den seks-komponent MCR-modellen brukes ikke i den endelige modellen. Disse tre MCR-komponentene domineres av fluorescens og Baseline-artefakter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1. Illustrasjon av fastsettelse av hudoverflaten der midten av laser fokus berører huden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2. Illustrasjon av valget av tre komponenter i PLS_Toolbox programvare PCA-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 3. Identifisering av laste faktoren dominert av rom lys oppå en referanse spektrum av lys fra rommet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 4. Sammenligning av belastninger fra MCR-modellen før og etter fjerning av kosmiske stråler. (A), (B), og (C) er de faktorene som representerer vann, protein, og lipid, henholdsvis. De ekstra belastnings faktorene som ikke brukes i den endelige MCR-modellen, er d, e og f. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 5. Raman Spectra av typiske lipid materialer i stratum corneum. (A) kolesterol 3-sulfat natrium og kolesterol. (B) oljesyre, palmitinsyre, palmitoleic og stearinsyre. (C) squalene. (D) N-Behenoyl-d-erytro-Sfingosin, n-Lignoceroyl-d-erytro-sphinganine, og D-Erytro-Dihyrosphingosine. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av datainnsamlingen, som beskrevet i punkt 2 og 3 i protokollen, ble hver dybde profil samlet i et område med kontakt mellom instrument vinduet og huden ved å finne de mørkere områdene fra de mikroskopiske bildene som er uthevet i de røde sirklene i Figur 2C. Når disse områdene var plassert, var det avgjørende å starte dybde profilen over hudoverflaten for å nøyaktig bestemme plasseringen av hudens overflate for dataanalyse prosedyre. Plasseringen av hudoverflaten ble senere brukt til å bestemme den relative dybden av hvert spektrum i den tilsvarende dybde profilen. Som nevnt i del 1 av protokollen, starter dybde profilen 10 μm over hudoverflaten produserer fem datapunkter utenfor huden. Dette gjør det mulig for vellykket å bestemme plasseringen av maksimal og minimum signal intensitet på begge sider av hudoverflaten. Det er også viktig å unngå å måle steder som inneholder penn merker og høyere pigmentert områder som fregner, fordi disse områdene produserer en høy fluorescens bakgrunns signal. Valget av eksponeringstid er en balanse mellom Spectral kvalitet og målings varighet. Lengre eksponeringstid forbedrer signal-til-støy og øker den totale målings tiden betraktelig. Men mange synes det er vanskelig å holde seg i en lengre periode. Dette er svært utfordrende for barn, for eksempel. Økende laser effekt øker signal-til-støy. Men for mye makt kan skade huden på grunn av absorpsjon av energien. Den maksimale tillatte eksponeringen, 17 mW laser strøm som definert av den kinesiske nasjonal standarden (GB 7247.1-2012), og den internasjonale laser sikkerhetsstandarden (IEC 60285-1:2007; < 20 mW for 671 NM og < 30 mW for 785 NM), kan ikke overskrides. Andre sikkerhetsforanstaltninger inkluderer å sikre at hvert har på seg øyebeskyttelse før datainnhenting, at kroppens nettsteder har en individuell topologi vinkel (ITA) verdi høyere enn 40, og unngå områder med høy hud pigmentering.
For å bestemme plasseringen av hudoverflaten, ble området under proteinet Raman Peak (2910-2965 cm-1) integrert for å oppnå dybde profilen til protein signalet. Den Raman Spectra ble først Baseline-korrigert ved hjelp av automatiserte vektet minst firkantet metode fra PLS_Toolbox før integreringen av toppene. De 26 datapunktene fra én dybde profil ble interpolert til 260 punkt ved hjelp av linspace -metoden for instrument Forskyvnings Vaue (X-akse-verdi i Figur 3A) og spline -metoden for den tilsvarende intensitet verdien. De resulterende dataene ble interpolert på en 20th rekkefølge polynom ved hjelp av Polyfit og polyval funksjoner i MATLAB og maksimum og minimum poeng av interpolert data ble bestemt. Gjennomsnittlig intensitet-verdien ble beregnet ved å dividere summen av maksimums-og minimumsverdier med 2. Hudoverflaten ble definert som stedet der intensitet verdien fra interpolert dybde profilen var nærmest gjennomsnittet intensitet. Den nøyaktige plasseringen av hudoverflaten trenger ikke å falle sammen med et eksperimentelt datapunkt. Denne metoden kan bare måle en begrenset dybde av huden på grunn av absorpsjon og spredning av strålen21. Innsamling spektroskopiske data under ~ 50 μm under hudoverflaten kan kreve betydelige endringer i de eksperimentelle parametrene.
Som beskrevet i avsnitt 3 av protokollen, etter fjerning av avvikende Spectra med lav signal-til-støy og høyt bidrag fra rommet lys, en liten brøkdel av Spectra inneholder kosmiske stråler forble i datasettet. En sammenligning av lasting Spectra generert før og etter kosmisk stråle fjerning er vist i supplerende figur 4. En sammenligning av lasting Spectra vist i supplerende figur 4 indikerer at virkningen av et lite antall Spectra med kosmiske stråler var ubetydelig. De tre faktorene som representerte vann, proteiner og lipid var identiske, og de tre belastninger knyttet til støy og Spectral-artefakter var også svært like. Dette kan tilskrives en lav forekomst av kosmiske stråler i Spectra (~ 0,25%) fordi plasseringen av kosmiske stråler i Spectra er tilfeldig.
Valget av antall komponenter som brukes i MCR-analysen er kritisk, fordi tolkning av belastninger ' form i forhold til de tilsvarende molekylære artene som er ansvarlig for hver lasting i betydelig grad påvirker både hvordan tilsvarende score verdier brukes og generell metode ytelse. Som beskrevet i punkt 4 i protokollen, ble PCA utført først for å undersøke den eigenvalue utviklingen knyttet til det økende antallet av komponentene. Denne undersøkelsen ble brukt til å identifisere antall komponenter som skal brukes i følgende MCR-analyse. Å plotte eigenvalue på en logaritmisk skala kan gjøre denne identifikasjonsprosessen enklere enn å undersøke den rå hva, som vist i figur 5a. Hver eigenvalue er en representasjon av variansen som en komponent kan fange opp. Jo større eigenvalue, jo mer varians denne komponenten kan modellen i Spectra. Hva med tilsvarende størrelse bør velges eller elimineres sammen22. Etter denne retningslinjen ble det vurdert to, fem og åtte komponenter for MCR-analysen fordi komponentene tre, fire og fem produserer hva lik i størrelse. En lignende trend ble også observert for komponenter seks, syv og åtte. Figur 5 B er et plott av forskjellen i hva mellom ' n ' og ' n + 1 ' komponenter som viser lokale Maxima etter andre, femte og åttende komponenter. Tidligere kunnskap om molekyl sammensetningen av huden kombinert med studien design støtter et minimum av tre komponenter som kreves for å modellere den høye frekvensen Raman Spectra. Derfor ble flere MCR-modeller som inneholder tre til åtte komponenter undersøkt, og belastninger ble sammenlignet med Spectra fra referansemateriale for å identifisere nøkkelkomponentene som kreves for den endelige modellen.
Sammenligning av belastninger med Raman Spectra fra referansematerialer gjør det enkelt å identifisere og tilordne to av de endelige MCR-komponentene til protein og vann fordi de dominerer MCR-belastninger for alle modeller som er testet og samsvarer med den tilsvarende referansen Spectra, som er BSA og DI vann. De forventede spektroskopiske egenskapene til lipid i noen av MCR-komponentene var imidlertid en svakere match til lipid referanse spekteret illustrert i MCR-modeller som inneholder tre og fire komponenter. I tillegg ble gjenværende protein topper (2840 – 3000 cm-1) OBSERVERT i MCR-belastninger for alle modeller testet under seks komponenter. Basert på disse observasjonene ble det brukt en seks-komponent MCR-modell i den endelige MCR-analysen. Tre av de seks komponentene ble tildelt vann, protein og lipid ved å matche deres lasting spektrum til tilsvarende referanse spektrum. Tolkningen og tildeling av lipid Factor er basert på sammenligning av lasting til Raman Spectra av tre representative Ceramide materialer, inkludert N-behenoyl-D-erytro-sfingosin, N-Lignoceroyl-D-erytro-sphinganine, og D-Erytro-Dihyrosphingosine. Den Raman Spectra av andre lipid materialer i stratum corneum ble også undersøkt. Disse materialene omfatter fettsyrer (oljesyre, palmitinsyre, palmitoleic, og stearins syre), kolesterol (kolesterol 3-sulfat natrium og kolesterol), og squalene, som vist i supplerende figur 5. Lipid faktoren som brukes i den endelige MCR-modellen var en sterk match til Ceramide Spectra og i samsvar med andre materialer som inneholder lange kjeden hydrokarboner. De tre andre MCR-komponentene ble dominert av fluorescens og grunnlinje artefakter, og de tilsvarende poeng sum verdiene ble ikke brukt i noen beregninger. Disse tre komponentene er vist i figur 7.
Den generelle analyse tilnærmingen som presenteres i dette manuskriptet, gir en endelig metode med forbedret spesifisitet og nøyaktighet for å måle nøkkelkomponentene i huden sammenlignet med andre enkeltstående topp-eller topp tilpassede tilnærminger. Denne metoden viser at kritiske komponenter kan trekkes ut fra et klinisk datasett som inneholder en relativt liten brøkdel av dårlig Spectra. Fremtidig innsats er fokusert på automatisering av denne metodikken i en programvarepakke for å forbedre sin effektivitet og redusere mengden av teknisk ekspertise som kreves for analysen. Lignende metodikk er utviklet for Raman Spectra samlet i fingeravtrykk regionen (400-1800 cm-1) ved hjelp av en 785 NM laser kilde i stedet for 671 NM laser innlemmet i samme instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne i stor grad erkjenner den økonomiske støtten fra bedriftens funksjon analytiske og personlige rensing omsorg avdeling. Vi ønsker å uttrykke vår takknemlighet til analytiske knytte direktører MS Jasmine Wang og Dr. Robb Gardner for deres veiledning og støtte og MS Li Yang for hennes hjelp på datainnsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M.
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
