Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la collecte des spectres raman confocals des sujets humains dans les études cliniques combinées avec des approches chimiométriques pour l'ablation spectrale et l'extraction ultérieure des dispositifs principaux.
Abstract
Le développement de cette méthode spectroscopique in vivo confocale Raman permet la mesure directe de l'eau, des protéines et des lipides avec une résolution de profondeur chez les sujets humains. Cette information est très importante pour les maladies liées à la peau et la caractérisation des performances des produits de soins de la peau. Ce protocole illustre une méthode de collecte de spectres Raman confocalete et l'analyse ultérieure du jeu de données spectrale tirant parti de la chimiométrie. L'objectif de cette méthode est d'établir un protocole standard pour la collecte de données et de fournir des orientations générales pour l'analyse des données. Le prétraitement (p. ex., suppression des spectres aberrants) est une étape critique dans le traitement de grands ensembles de données provenant d'études cliniques. À titre d'exemple, nous fournissons des conseils basés sur la connaissance préalable d'un ensemble de données pour identifier les types d'valeurs aberrantes et élaborer des stratégies spécifiques pour les supprimer. Une analyse principale des composants est effectuée, et les spectres de chargement sont comparés aux spectres des matériaux de référence pour sélectionner le nombre de composants utilisés dans l'analyse finale de la résolution de la courbe multivariée (MCR). Cette approche est efficace pour extraire des informations significatives à partir d'un large jeu de données spectrales.
Introduction
Dans les études cliniques, la spectroscopie in vivo confocale de Raman a montré sa capacité unique pour déterminer l'épaisseur et la teneur en eau de corneum de strate1,2,3,4, et le suivi de la pénétration de matériaux actifs appliqués topiquement sur la peau5,6. Comme approche non invasive, la spectroscopie raman confocale détecte les signaux moléculaires basés sur les modes vibratoires. Ainsi, l'étiquetage n'est pas nécessaire7. La spectroscopie in vivo confocale de Raman fournit des informations chimiques avec une résolution de profondeur basée sur la nature confocale de la technique. Cette information de profondeur-dépendante est très utile en étudiant les effets des produits de soin de peau4,8, vieillissement9,10, changements saisonniers3, ainsi que les maladies de fonction de barrière de peau, comme la dermatite atopique11,12. Il y a beaucoup d'informations dans la région à haute fréquence de la spectroscopie raman confocale (2 500 à 4 000 cm-1), où l'eau produit des pics distincts dans la région entre 3 250 et 3 550 cm-1. Cependant, les pics Raman de protéines et de lipides, qui sont centrés entre environ 2 800 et 3 000 cm-1, se chevauchent parce que les signaux sont principalement produits à partir de méthylène (-CH2-) et de méthyle (-CH3) groupes13 . Cette information qui se chevauche présente un défi technique lors de l'obtention de quantités relatives d'espèces moléculaires individuelles. Le pic14,15 et la position de pointe sélective12,16 approches ont été utilisées pour résoudre ce défi. Cependant, il est difficile pour ces méthodes basées sur le pic unique d'extraire des informations sur les composants purs parce que plusieurs pics Raman à partir du même composant changent simultanément17. Dans notre publication récente18, une approche MCR a été proposée pour élucider l'information sur les composants purs. Grâce à cette approche, trois composants (eau, protéines et lipides) ont été extraits d'un grand ensemble de données spectroscopiques confocales de Raman in vivo.
L'exécution de grandes études cliniques peut être exigeante sur les individus recueillant des données spectroscopiques in vivo. Dans certains cas, l'acquisition spectrale peut nécessiter de l'équipement d'exploitation pendant de nombreuses heures dans une journée et l'étude peut s'étendre jusqu'à des semaines ou des mois. Dans ces conditions, les données spectroscopiques peuvent être générées par des opérateurs d'équipement qui n'ont pas l'expertise technique nécessaire pour identifier, exclure et corriger toutes les sources d'artefacts spectroscopiques. L'ensemble de données qui en résulte peut contenir une petite fraction des valeurs aberrantes spectroscopiques qui doivent être identifiées et exclues des données avant l'analyse. Cet article illustre en détail un processus d'analyse chimiométrique pour « nettoyer » un jeu de données clinique de Raman avant d'analyser les données avec MCR. Pour réussir à supprimer les valeurs aberrantes, les types de valeurs aberrantes et la cause potentielle de la génération des spectres aberrants doivent être identifiés. Ensuite, une approche spécifique peut être développée pour supprimer les valeurs aberrantes ciblées. Cela nécessite une connaissance préalable de l'ensemble de données, y compris une compréhension détaillée du processus de génération de données et de la conception de l'étude. Dans cet ensemble de données, la majorité des valeurs aberrantes sont des spectres de faible signal au bruit et proviennent principalement de 1) spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau (6 208 sur 30 862), et 2) une forte contribution au spectre de la lumière fluorescente de la pièce (67 sur 30 862). Les spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau produisent une faible réponse Raman, car le point focal laser s'approche de la surface de la peau et se trouve principalement dans la fenêtre de l'instrument sous la peau. Spectra avec une forte contribution de la lumière de pièce fluorescente sont générés en raison de l'erreur de l'opérateur d'instrument ou le mouvement du sujet, ce qui produit une condition où la fenêtre de collecte raman confocale n'est pas entièrement couverte par le site du corps du sujet. Bien que ces types d'artefacts spectraux aient pu être identifiés et assainis lors de l'acquisition spectrale par un expert spectroscopique au moment de l'acquisition de données, les opérateurs d'instruments formés utilisés dans cette étude ont reçu l'instruction de recueillir toutes les données à moins qu'un une défaillance catastrophique a été observée. La tâche d'identifier et d'exclure les valeurs aberrantes est intégrée au protocole d'analyse des données. Le protocole présenté est élaboré pour résoudre ce défi. Pour s'attaquer aux spectres de faible signal au bruit au-dessus de la surface de la peau, l'emplacement de la surface de la peau doit d'abord être déterminé pour permettre l'élimination des spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau. L'emplacement de la surface de la peau est défini comme la profondeur où le point focal laser Raman est la moitié dans la peau et la moitié de la peau comme illustré dans la figure supplémentaire 1. Après avoir supprimé les spectres signal-bruit bas, une analyse principale des composants (PCA) est mise en œuvre pour extraire le facteur dominé par les pics fluorescents de lumière ambiante. Ces valeurs aberrantes sont supprimées en fonction de la valeur de score du facteur correspondant.
Ce protocole fournit des renseignements détaillés sur la façon dont six composantes principales sont déterminées dans le processus de RMC. Cela se fait au moyen d'une analyse PCA suivie d'une comparaison spectrale des formes entre les charges des modèles générés avec un nombre différent de composants principaux. Le processus expérimental de collecte de données de matériaux de référence ainsi que les sujets humains est également expliqué en détail.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'Hôpital pour enfants de Beijing conformément aux lignes directrices éthiques de la Déclaration d'Helsinki de 1975. Il a été mené conformément aux lignes directrices du PCI pour les bonnes pratiques cliniques. L'étude a eu lieu de mai à juillet 2015.
1. Collection de spectres raman confocalininin in vivo de sujets humains avec la dermatite atopique
- Inclure les sujets en conformité avec les critères suivants.
- Inclure les sujets âgés de 4 à 18 ans.
- Inclure les sujets présentant une dermatite atopique légère à modérée (score de 2 ou 3 selon l'évaluation globale du médecin) présentant des symptômes de maladie séfoisclée sur 5 à 30 % de la surface du corps, avec au moins deux lésions sur les bras.
- Inclure les sujets qui sont en bonne santé, à l'exclusion des symptômes directement liés à la maladie de la MA.
- Inclure les sujets qui donnent un consentement éclairé écrit.
- Inclure les sujets dont la valeur d'angle de topologie (ITA) est supérieure à 40 à l'emplacement de test.
- Exclure les sujets qui répondent à l'un des critères suivants.
- Exclure les sujets qui participent actuellement ou qui ont déjà participé à une étude clinique dans n'importe quel établissement d'essai au cours des quatre semaines précédentes.
- Exclure les sujets atteints de cancer ou qui ont été diagnostiqués ou traités pour un cancer dans les 5 ans précédant l'étude.
- Exclure les sujets diabétiques.
- Exclure les sujets qui ont une maladie immunologique ou infectieuse qui pourrait mettre le sujet à risque ou interférer avec l'exactitude des résultats de l'étude (c.-à-d. l'hépatite, la tuberculose, le VIH, le sida, le lupus ou la polyarthrite rhumatoïde).
- Exclure les sujets qui ont des conditions cutanées qui pourraient interférer avec les mesures instrumentales ou empêcher l'évaluation claire de la peau que de dermatite atopique. Les exemples incluent la peau extrêmement sèche, la peau endommagée, les coupures, les rayures, les coups de soleil, les taches de naissance, les tatouages, les cicatrices étendues, les éruptions cutanées, la croissance excessive de cheveux, ou l'acné.
- Exclure les sujets qui utilisent des médicaments immunosuppresseurs oraux, des antibiotiques ou d'autres thérapies systémiques au cours du dernier mois, à l'exception des tranquillisants mineurs.
- Exclure les sujets atteints d'autres affections médicales qui, de l'avis de l'enquêteur, les empêchent d'étudier.
- Exclure les sujets ayant une pigmentation plus élevée dans la zone d'essai.
- Étiqueter la zone de lésion du participant à l'étude de dermatite atopique et marquer avec une zone de 3 cm x 4 cm sur ou près du site de lésions comme indiqué dans la figure 1A.
- Étiqueter la zone de non-lésion avec le même marqueur dans le site du corps homologue (p. ex., avant-bras gauche vs avant-bras droit) comme le montre la figure 1B.
- Placez le site du corps marqué en contact étroit avec la fenêtre de l'instrument raman confocal in vivo comme le montre la figure 2A et la figure 2B. Couvrez toute la fenêtre pour éviter l'impact de la lumière de la pièce sur le site du corps.
- Effectuer la collecte de données Raman.
REMARQUE : L'instrument a une résolution spectrale de 2 cm-1 et 50x d'objectif de microscopie (NA - 0,9 immersion d'huile), à l'aide d'un laser de 671 nm d'une puissance de 17 mW. La longueur d'onde est calibrée à l'aide du spectre d'une lampe au néon-argon intégrée. L'étalonnage de l'intensité se fait en mesurant le spectre d'une norme d'étalonnage du verre du NIST (National Institute of Standards).- Déplacez la mise au point jusqu'à ce qu'un spectre tel qu'illustré dans la figure 2C soit observé, puis déplacez-la loin de la surface de la peau de 10 m.
- Démarrez la collecte de données pendant 26 étapes avec une taille d'étape de 2 m dans la région de fréquence de 2 510 cm-1à 4 000 cm-1. Utilisez un temps d'exposition de 1 s et mesurez huit répliques pour chaque zone d'une durée totale de 10 à 15 min.
2. Collection de spectres Raman confocals à partir de matériaux de référence
- Placez les matériaux de référence, les principaux composants de la strate de peau humaine corneum19, sur la fenêtre de l'instrument raman confocal (voir Tableau des matériaux: Albumine de sérum bovin (BSA), eau déionisée (eau DI), céramide, cholestérol, libre l'acide gras et le squalène).
- Recueillir les spectres Raman des matériaux de référence consécutivement de l'extérieur du matériau au centre des matériaux en utilisant les mêmes paramètres de collecte que décrits ci-dessus.
- Intégrez la zone sous chaque spectre Raman entre la plage de 2 510 à 4 000 cm-1 et identifiez les trois principaux points de valeur maximale dans ces 26 mesures. Moyenne des spectres Raman à partir de ces trois points pour obtenir les spectres de matériau de référence final.
3. Enlèvement des spectres aberrants par l'analyse chimiométrique
- Déterminez la surface de la peau et enlevez les spectres hors de la peau.
- Modifiez l'extension de fichier de '.ric' à '.mat' et chargez le fichier .mat vers la plate-forme logicielle MATLAB.
- Corriger la ligne de base à l'aide de Baseline (Automatic Weighted Least Squares) en cliquant à droite sur l'ensemble de données importés sous Analyse . Autres outils (fr) Prétraitement dans le logiciel PLS-Toolbox avec paramètre par défaut.
- Résumez les valeurs entre 2 910 et 2 965 cm-1 pour obtenir les valeurs d'intensité sous chaque spectre Raman à partir des 26 étapes consécutives de mesure comme indiqué à la figure 3A via la fonction de somme dans MATLAB.
- Interpoler la valeur de compensation de l'instrument (valeur de l'axe X dans la figure 3B) de 26 à 260 en utilisant la fonction linspace dans MATLAB.
- Interpoler la valeur d'intensité de 26 à 260 en utilisant la méthode spline dans MATLAB, en tirant parti des 260 valeurs de position nouvellement générées.
- Utilisez les fonctions polyfit et polyval de MATLAB pour obtenir le nouvel ensemble de valeurs d'intensité avec 260 points. Tout d'abord, utilisez les 260 valeurs de position et d'intensité comme entrées X et Y pour la fonction polyfit, respectivement. Définir la valeur de degré à 20. Ensuite, utilisez les coefficients de sortie et les 260 valeurs de position étendues comme entrée pour polyval pour obtenir les valeurs finales d'intensité de 260.
- Utilisez les fonctions max et min de MATLAB pour identifier les points maximum et minimum des valeurs d'intensité nouvellement interpolées de 260.
- Calculez la valeur moyenne de l'intensité en divisant la somme de la valeur d'intensité maximale et minimale par deux.
- Identifiez la valeur d'intensité des 260 valeurs d'intensité (calculées à partir de l'étape 3.1.6) qui est la plus proche de la valeur d'intensité moyenne et fixez sa valeur de position correspondante en tant que surface de la peau. Définir cette valeur de position comme point zéro dans l'axe X comme l'illustre la figure 3B.
- Modifier toutes les autres valeurs de position en fonction du point zéro et de la taille d'étape connue de 2 m.
- Enlevez tous les spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau en fonction de leur valeur de position.
- Importer le reste des données sur PLS-Toolbox pour créer un jeu de données et le renommer "RamanData.mat".
- Retirez les spectres aberrants avec l'effet de lumière de la pièce.
- Chargez le jeu de données spectre Raman (RamanData.mat) après l'élimination des spectres hors de peau et implémenter l'analyse PCA.
- Chargez le jeu de données dans le logiciel PLS-Toolbox sous la plate-forme MATLAB et cliquez à droite sur le jeu de données pour choisir Analyze. PCA.
- Sélectionnez Normaliser comme approche de prétraitement et choisissez None pour la validation croisée.
- Utiliser les trois composants pour l'analyse de décomposition de l'APC, comme le montre la figure 2 supplémentaire.
- Retirez le couvercle de la fenêtre de collecte de l'instrument Raman in vivo et collectez les spectres lumineux de la pièce dans la région à haute fréquence en utilisant les mêmes paramètres utilisés pour la collecte de données sur les matériaux de référence.
- Identifiez le facteur d'effet de lumière de la pièce par comparaison avec les spectres de fond lumineux de la pièce, comme le montre la figure supplémentaire 3.
- Supprimer les spectres avec une valeur de score correspondante significativement plus élevée que la normale (plus de 99,8% des valeurs de score de l'ensemble des données, soit 0,16 dans cette étude).
4. Sélection du nombre des composants dans l'analyse de décomposition MCR
- Corriger la ligne de base des spectres Raman à l'aide de la même approche décrite ci-dessus (section 3.1.2).
- Effectuer l'analyse PCA sur le jeu de données prétraité tel que décrit ci-dessus (section 3.2) sauf pour sélectionner "PQN" - "Mean Center" plutôt que "Normaliser", et tracer les valeurs eigengiques à l'échelle logarithmique avec le nombre de composants (20) comme numéro par défaut dans l'analyse de décomposition en cliquant sur le bouton Sélectionner les composants et sélectionner le journal (eigenvalues) comme valeur Y. Choisissez trois à huit comme nombre de composants utilisés pour l'analyse MCR.
- Effectuer l'analyse MCR.
- Chargez le jeu de données dans le logiciel MCR-main20 via le bouton De sélection de données.
- Choisissez le nombre de composants (trois à huit) en cliquant sur la détermination du bouton nombre de composants.
- Cliquez sur le bouton Pure sous l'onglet Estimation initiale, sélectionnez Concentration sous la direction de l'onglet sélection variable et cliquez sur le bouton Faire.
- Cliquez sur le bouton OK, puis le bouton Continuer à la page suivante.
- Cliquez sur Continuer dans la page suivante, puis sélectionnez fnnls et 6 sous la mise en œuvre et Nr. des espèces avec des onglets de profils de non-négativité, respectivement. Cliquez sur le bouton Continuer.
- Choisissez les mêmes paramètres que la section 4.3.5 pour cette page et cliquez sur Continuer.
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Representative Results
Dans cette étude clinique, les spectres confocals in vivo de Raman ont été rassemblés de 28 sujets de 4-18 ans. Un total de 30 862 spectres Raman ont été recueillis avec le protocole de collecte de données mentionné ci-dessus. Ce grand jeu de données spectrales contient 20% d'aberrations spectrales comme le montre la figure 4A. Les spectres aberrants signal-bruit bas ont été enlevés après avoir déterminé la surface de la peau, suivis par le PCA pour identifier les spectres avec des dispositifs de lumière de pièce. Le troisième facteur de ce modèle PCA est identifié les pics de lumière de pièce. Ceci est confirmé par la comparaison des spectres de chargement du facteur 3 avec un spectre de lumière fluorescente recueillie séparément sur le site d'étude à l'aide du même instrument raman confocal (voir la figure supplémentaire 3 ). Figure 4 B indique que la plupart des spectres aberrants ont été supprimés après ce processus.
L'APC a été effectuée sur le jeu de données raman confocal prétransformé et la valeur eigen ainsi que le nombre de facteurs utilisés sont tracés à la figure 5. Selon les études antérieures12,19, le modèle devrait inclure au moins trois composants: l'eau, les protéines et les lipides. Une diminution significative de la valeur eigen a été observée pour le facteur 9, comme le montre la figure 5. Cette observation suggère d'étudier des modèles dont le nombre de composants principaux varie entre trois et huit facteurs à inclure dans le modèle MCR. Les charges DE MCR qui contiennent des caractéristiques spectroscopiques les plus compatibles avec les protéines, l'eau et les lipides sont indiquées dans la figure 6.
Figure 1 . Illustration de la marque de lésion et de non-lésion sur l'avant-bras. (A) Une zone marquée de 3 cm x 4 cm sur un site de lésion. (B) Zone marquée de 3 cm x 4 cm sur un site non lésion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 . Illustration de la collection de données raman confocale. (A) Instrument Confocal Raman. (B) Collection Spectra sur l'avant-bras du sujet humain. (C) Une capture d'écran de déterminer la position de référence pour la collecte de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 . Détermination de la surface de la peau. (A) Intégration de la zone protéique sous chaque spectre Raman. (B) Réglage de la surface de la peau en fonction des points maximum et minimum. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 . Spectres de jeu de données Raman. (A) Spectres Confocal Raman avant l'enlèvement des spectres aberrants. (B) Spectres Confocal Raman après suppression des spectres aberrants. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 . Détermination du nombre de composants issus de l'analyse PCA. (A) Eigenvalue sur une échelle logarithmique tracée en fonction du nombre de composants utilisés dans le modèle PCA. (B) Différence dans les eigenvalues entre les composants 'n' et 'n '1' Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Figure 6 . Comparaison de la forme de chargement avec les spectres des matériaux de référence correspondants avec trois à huit composants dans le modèle MCR. (A) Protéines, (B) eau, et (C) la forme des facteurs lipidiques avec trois à huit composants dans le modèle MCR par rapport aux spectres de BSA, d'eau et de référence lipidique, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 . Les trois chargements supplémentaires du modèle MCR à six composants non utilisés dans le modèle final. Ces trois composantes du MCR sont dominées par la fluorescence et les artefacts de base. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1. Illustration de la détermination de la surface de la peau où le centre de la mise au point laser touche la peau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 2. Illustration de la sélection de trois composants dans l'analyse PCA logicielle de PLS-Toolbox. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 3. Identification du facteur de chargement dominé par la lumière de la pièce superposée à un spectre de référence de la lumière ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 4. Comparaison des chargements du modèle MCR avant et après l'enlèvement des rayons cosmiques. (A), (B), et (C) sont les facteurs représentant l'eau, les protéines et les lipides, respectivement. Les facteurs de chargement supplémentaires non utilisés dans le modèle MCR final sont d, e, et f. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 5. Spectres raman des matériaux lipidiques typiques dans le cornée de strate. (A) Cholestérol 3-sulfate sodium et cholestérol. (B) Acide oleique, palmitique, palmiticléique et stéarique. (C) Squalene. (D) N-behenoyl-D-erythro-sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine, et D-Erythro-Dihyrosphingosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Au cours de la collecte de données, telle que décrite dans les sections 2 et 3 du protocole, chaque profil de profondeur a été recueilli dans une zone avec contact entre la fenêtre de l'instrument et la peau en trouvant les zones les plus sombres des images microscopiques mises en évidence dans les cercles rouges dans Figure 2C. Une fois que ces zones ont été localisées, il était essentiel de commencer le profil de profondeur au-dessus de la surface de la peau pour déterminer avec précision l'emplacement de la surface de la peau pour la procédure d'analyse des données. L'emplacement de la surface de la peau a ensuite été utilisé pour déterminer la profondeur relative de chaque spectre dans le profil de profondeur correspondant. Comme mentionné dans la section 1 du protocole, le début du profil de profondeur à 10 m au-dessus de la surface de la peau produit cinq points de données à l'extérieur de la peau. Cela permet de déterminer avec succès l'emplacement de l'intensité maximale et minimale du signal des deux côtés de la surface de la peau. Il est également important d'éviter de mesurer les endroits qui contiennent des marques de stylo et des zones pigmentées plus élevées comme les taches de rousseur, parce que ces zones produisent un signal de fond à fluorescence élevée. Le choix du temps d'exposition est un équilibre entre la qualité spectrale et la durée de mesure. Un temps d'exposition plus long améliore le signal au bruit et augmente considérablement le temps de mesure global. Cependant, de nombreux sujets trouvent difficile de rester immobile pendant de longues périodes de temps. C'est extrêmement difficile pour les enfants, par exemple. L'augmentation de la puissance laser augmente le signal au bruit. Cependant, trop de puissance peut endommager la peau en raison de l'absorption de l'énergie. Les expositions maximales autorisées, la puissance laser de 17 mW telle que définie par la norme nationale chinoise (GB 7247.1-2012), et la norme internationale de sécurité laser (IEC 60285-1:2007; 'lt;20 mW pour 671 nm et 'lt;30 mW pour 785 nm), ne peuvent pas être dépassées. D'autres précautions de sécurité comprennent s'assurer que chaque sujet porte une protection oculaire avant l'acquisition de données, que les sites du corps ont un angle de topologie individuel (ITA) valeur supérieure à 40, et d'éviter les zones avec une pigmentation de la peau élevée.
Pour déterminer l'emplacement de la surface de la peau, la zone sous le pic de protéine Raman (2 910-2,965 cm-1) a été intégrée pour obtenir le profil de profondeur du signal protéique. Les spectres Raman ont d'abord été corrigés de base à l'aide de la méthode automatisée pondérée du moins carré de PLS-Toolbox avant l'intégration des pics. Les 26 points de données d'un profil de profondeur ont été interpolés à 260 points à l'aide de la méthode de linspace pour l'instrument offset vaue (valeur de l'axe X dans la figure 3A) et de la méthode spline pour la valeur d'intensité correspondante. Les données résultantes ont été interpolées sur un 20e ordre polynomial utilisant les fonctions polyfit et polyval dans MATLAB et les points maximum et minimum des données interpolées ont été déterminés. La valeur moyenne d'intensité a été calculée en divisant la somme des valeurs maximales et minimales par 2. La surface de la peau a été définie comme l'endroit où la valeur d'intensité du profil de profondeur interpolé était la plus proche de l'intensité moyenne. L'emplacement exact de la surface de la peau n'a pas besoin de coïncider avec un point de données expérimental. Cette méthode ne peut mesurer qu'une profondeur limitée de la peau en raison de l'absorption et de la diffusion du faisceau21. La collecte de données spectroscopiques inférieures à 50 m sous la surface de la peau peut nécessiter des changements significatifs aux paramètres expérimentaux.
Comme décrit à la section 3 du protocole, après l'élimination des spectres aberrants avec un signal faible au bruit et une forte contribution des lumières de la pièce, une petite fraction des spectres contenant des rayons cosmiques est restée dans l'ensemble de données. Une comparaison des spectres de chargement générés avant et après l'enlèvement des rayons cosmiques est montrée dans la figure supplémentaire 4. Une comparaison des spectres de chargement indiqués dans la figure supplémentaire 4 indique que l'impact d'un petit nombre de spectres avec les rayons cosmiques était négligeable. Les trois facteurs représentant l'eau, les protéines et les lipides étaient identiques, et les trois charges supplémentaires associées au bruit et aux artefacts spectraux étaient également très semblables. Cela pourrait être attribué à une faible occurrence de rayons cosmiques dans les spectres (0,25%) parce que l'emplacement des rayons cosmiques dans les spectres sont aléatoires.
La sélection du nombre de composants utilisés dans l'analyse MCR est critique, car l'interprétation de la forme des charges en termes d'espèces moléculaires correspondantes responsables de chaque chargement a un impact significatif à la fois sur la façon dont le score correspondant sont utilisés et les performances globales de la méthode. Comme décrit dans la section 4 du protocole, PCA a été exécuté d'abord pour étudier l'évolution d'eigenvalue liée à l'augmentation du nombre des composants. Cette enquête a permis d'identifier le nombre de composants qui devraient être utilisés dans l'analyse SUIVANTE du RMC. Tracer la valeur eigenmique sur une échelle logarithmique peut faciliter ce processus d'identification que l'examen des valeurs éigenvalues brutes, comme le montre la figure 5A. Chaque eigenvalue est une représentation de la variance qu'un composant peut capturer. Plus l'eigenvalue est grande, plus ce composant peut modéliser de variance dans les spectres. Les valeurs eigenvaleurs de taille similaire doivent être sélectionnées ou éliminées ensemble22. Suivant cette ligne directrice, deux, cinq et huit composants ont été pris en considération pour l'analyse MCR parce que les composants trois, quatre et cinq produisent des valeurs de taille similaire. Une tendance similaire a également été observée pour les composantes six, sept et huit. Figure 5 B est une parcelle de la différence dans les eigenvalues entre les composants 'n' et 'n'1' montrant les maxima locaux après les deuxième, cinquième et huitième composants. Les connaissances préalables sur la composition moléculaire de la peau combinées à la conception de l'étude appuient un minimum de trois composants nécessaires pour modéliser les spectres Raman à haute fréquence. Par conséquent, plusieurs modèles MCR contenant de trois à huit composants ont été étudiés et les charges ont été comparées aux spectres des matériaux de référence pour identifier les composants clés requis pour le modèle final.
La comparaison des charges avec les spectres Raman à partir de matériaux de référence permet facilement d'identifier et d'attribuer deux des composants mm. finaux aux protéines et à l'eau, car ils dominent les charges MCR pour tous les modèles testés et correspondent à la référence correspondante. spectres, qui sont de l'eau BSA et DI. Cependant, les propriétés spectroscopiques attendues des lipides dans certains des composants MCR étaient une correspondance plus faible au spectre de référence de lipide illustré dans les modèles de MCR qui contiennent trois et quatre composants. De plus, des pics de protéines résiduelles (2 840 à 3 000 cm-1)ont été observés dans les charges d'eau MCR pour tous les modèles testés en dessous de six composants. Sur la base de ces observations, un modèle MCR à six composants a été utilisé dans l'analyse finale du MCR. Trois des six composants ont été assignés à l'eau, aux protéines et aux lipides en faisant correspondre leur spectre de chargement au spectre de référence correspondant. L'interprétation et l'attribution du facteur lipidique sont basées sur la comparaison de la charge aux spectres Raman de trois matériaux représentatifs de céramide, y compris N-behenoyl-D-erythro-sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine, et D-Erythro-Dihyrosphingosine. Les spectres raman d'autres matériaux lipidiques dans le cornée de strate ont également été examinés. Ces matériaux comprennent les acides gras (acide oleique, palmitique, palmitéeté et stéarique), le cholestérol (cholestérol 3-sulfate sodium et cholestérol), et le squalène, comme le montre la figure supplémentaire 5. Le facteur lipidique utilisé dans le modèle final de MCR correspondait fortement aux spectres de céramide et correspondait à d'autres matériaux qui contiennent des hydrocarbures à longue chaîne. Les trois autres composantes du MCR étaient dominées par la fluorescence et les artefacts de base, et leurs valeurs de score correspondantes n'ont été utilisées dans aucun calcul. Ces trois composantes sont indiquées à la figure 7.
L'approche d'analyse globale présentée dans ce manuscrit produit une méthode finale avec une spécificité et une précision améliorées pour mesurer les composants clés de la peau par rapport à d'autres approches de pointe ou de pointe. Cette méthodologie démontre que les composants critiques peuvent être extraits d'un ensemble de données cliniques qui contient une fraction relativement faible de mauvais spectres. Les efforts futurs sont axés sur l'automatisation de cette méthodologie dans un logiciel afin d'améliorer son efficacité et de réduire la quantité d'expertise technique requise pour l'analyse. Une méthodologie similaire est en cours d'élaboration pour les spectres Raman collectés dans la région des empreintes digitales (400 à 1 800 cm-1) à l'aide d'une source laser de 785 nm plutôt que du laser de 671 nm incorporé dans le même instrument.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent grandement le soutien financier du service d'analyse de la fonction corporative et du service de nettoyage personnel. Nous tenons à exprimer notre gratitude aux directeurs associés analytiques Mme Jasmine Wang et Dr Robb Gardner pour leurs conseils et leur soutien et à Mme Li Yang pour son aide sur la collecte de données.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
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