Summary
在这里，我们提出了一个方案，从临床研究中从人类受试者收集共聚焦拉曼光谱，结合化学方法去除光谱异常值和随后提取关键特征。
Abstract
开发这种在体内共聚焦拉曼光谱法，能够直接测量水、蛋白质和脂质，在人体中具有深度分辨率。此信息对于皮肤相关疾病和皮肤护理产品性能描述非常重要。该协议说明了一种用于共聚焦拉曼光谱收集的方法，以及利用化学测量法对光谱数据集的后续分析。此方法的目标是建立数据收集的标准协议，并为数据分析提供一般指导。在从临床研究中处理大型数据集时，预处理（例如，去除异常光谱）是关键步骤。例如，我们根据数据集的先前知识提供指导，以确定异常值的类型并制定特定的策略来删除它们。执行主组分分析，并将载荷光谱与参考材料中的光谱进行比较，以选择最终多变量曲线分辨率 （MCR） 分析中使用的分量数。此方法成功从大型光谱数据集中提取有意义的信息。
Introduction
在临床研究中，在体内共聚焦拉曼光谱显示其独特的能力，以确定地层角膜厚度和含水量1，2，3，4，并跟踪渗透活性材料局部地应用于皮肤5，6。作为一种非侵入性的方法，共聚焦拉曼光谱检测基于振动模式的分子信号。因此，不需要标签7。在体内共聚焦拉曼光谱提供基于该技术共聚焦特性的化学信息，其深度分辨率。这种深度依赖信息在研究护肤品4、8、老化9、10、季节变化3以及皮肤屏障功能疾病的影响方面非常有用，如特应性皮炎11，12。在共聚焦拉曼光谱的高频区域（2，500-4，000厘米-1），水在3，250~3，550厘米-1之间产生不同的峰。然而，蛋白质和脂质的拉曼峰，集中在大约2，800-3，000厘米-1之间，相互重叠，因为信号主要来自亚甲（-CH2-）和甲基（-CH3）组13.在获得相对数量的单个分子物种时，这种重叠的信息带来了技术挑战。峰值拟合14，15和选择性峰值位置12，16方法已被用来解决这一挑战。但是，这些基于单峰的方法很难提取纯组件信息，因为来自同一组件的多个 Raman 峰值同时更改17。在我们最近的第18号出版物中，有人提出了一种MCR方法来阐明纯成分信息。使用这种方法，从大型体内共聚焦拉曼光谱数据集中提取了三个组分（水、蛋白质和脂质）。
大型临床研究的执行对收集体内光谱数据的个人可能要求很高。在某些情况下，频谱采集可能需要一天操作设备数小时，研究可长达数周或数月。在这些情况下，光谱数据可能由缺乏技术专业知识的设备操作员生成，以识别、排除和校正所有光谱伪影源。生成的数据集可能包含一小部分光谱异常值，需要在分析之前从数据中识别和排除。本文详细介绍了在使用MCR分析数据之前，为"清理"临床拉曼数据集而进行化学分析的过程。要成功去除异常值，需要确定异常值的类型和生成异常值光谱的潜在原因。然后，可以开发一种特定的方法来删除目标异常值。这需要事先了解数据集，包括详细了解数据生成过程和研究设计。在此数据集中，大多数异常值都是低信噪光谱，主要来自皮肤表面上方收集的 1 光谱（30，862 中的 6，208 个）和 2） 荧光室光光谱（30，862 中的 67 个）。在皮肤表面上方收集的光谱会产生微弱的拉曼反应，因为激光焦点接近皮肤表面，并且主要位于皮肤下方的仪器窗口。由于仪器操作员错误或主体移动，产生荧光室光的强烈贡献的光谱，这会产生一种情况，即共聚焦拉曼收集窗口未完全覆盖主体的身体部位。尽管在获取数据时，光谱专家可以在光谱采集期间识别和修正这些类型的光谱伪像，但本研究中使用的训练有素的仪器操作员已指示收集所有数据，除非灾难性故障被观察到。识别和排除异常值的任务已合并到数据分析协议中。提出的协议是为了解决这一挑战而制定的。为了解决皮肤表面上方的低信噪光谱，首先需要确定皮肤表面的位置，以便去除皮肤表面上方收集的光谱。皮肤表面的位置被定义为拉曼激光焦点在皮肤中一半和皮肤的一半的深度，如补充图1所示。去除低信噪点后，实施主要分量分析（PCA），以提取荧光室光峰占主导地位的因子。这些离群值根据相应因子的分数值被删除。
该协议提供了在 MCR 过程中如何确定六个主要组件的详细信息。这通过 PCA 分析完成，然后对具有不同数量主分量生成的模型的载荷进行光谱形状比较。详细介绍了参考资料和人体资料数据收集的实验过程。
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Protocol
这项研究是北京儿童医院机构审查委员会根据1975年《赫尔辛基宣言》的道德准则批准的。它根据ICH良好临床实践指南进行。研究于2015年5月至7月进行。
1. 从具有特应性皮炎的人体受试者体内共聚焦拉曼光谱中收集
- 包括符合以下标准的主题。
- 包括4~18岁的受试者。
- 包括轻度至中度特应性皮炎（根据医生的全球评估得分为2或3分），在身体表面的5%-30%有活动性疾病症状，手臂至少出现两个病变。
- 包括健康状况良好的受试者，不包括与AD疾病直接相关的症状。
- 包括提供书面知情同意的主题。
- 包括测试位置的单个拓扑角度 （ITA） 值高于 40 的受试者。
- 排除符合以下任何条件的主题。
- 不包括当前参与或以前在前 4 周内在任何测试设施参与临床研究的受试者。
- 不包括在研究前5年内被诊断为或治疗的癌症患者。
- 不包括糖尿病受试者。
- 排除患有免疫或传染病的受试者，这些疾病可能使受试者处于危险之中或干扰研究结果的准确性（如肝炎、结核病、艾滋病毒、艾滋病、狼疮或风湿性关节炎）。
- 排除有皮肤条件，可能干扰仪器测量或将阻止皮肤只有特应性皮炎的明确评估的主题。示例包括极其干燥的皮肤、受损的皮肤、割伤、划痕、晒伤、胎记、纹身、大面积疤痕、皮疹、过度的头发生长或痤疮。
- 不包括在过去一个月内使用口服免疫抑制药物、抗生素或其他全身疗法的受试者，但轻微镇静剂除外。
- 排除有研究者认为无法参加学习的任何其他医疗状况的受试者。
- 排除测试区域中色素沉着较高的受试者。
- 标记特应性皮炎研究参与者的病变区域，并在病变部位或附近标记3厘米×4厘米区域，如图1A所示。
- 在相对体位（例如左前臂与右前臂）中用相同的标记标记标记非病变区域，如图1B所示。
- 将标记的体位与体内共聚焦拉曼仪器的窗口密切接触，如图2A和图2B所示。覆盖整个窗口，避免房间光线对车身部位的影响。
- 执行拉曼数据收集。
注：该仪器的光谱分辨率为2厘米-1和50x显微镜物镜（NA = 0.9油浸注），使用功率为17 mW的671nm激光。波长使用内置霓虹灯的光谱进行校准。强度校准是通过测量 NIST（美国国家标准协会）玻璃校准标准的光谱来完成的。- 移动焦点，直到如图2C所示的光谱被观察，然后将焦点移离皮肤表面 10 μm。
- 在 2，510 厘米-1±4，000 厘米-1频率区域中，以 2 μm 步长大小开始 26 个步骤的数据收集。使用 1 秒的曝光时间，并测量每个区域的 8 次复制，总面积为 ±10-15 分钟。
2. 从参考资料中收集共聚焦拉曼光谱
- 将参考材料，人类皮肤层角质的主要成分19，在共聚焦拉曼仪器的窗口（见材料表：牛血清白蛋白（BSA），脱离子水（DI水），神经酰胺，胆固醇，免费脂肪酸和角鲨烯）。
- 使用上述相同的收集参数，从材料外部连续收集参考材料的拉曼光谱到材料中心。
- 将每个拉曼光谱下的区域集成在 2，510-4，000cm-1的范围之间，并确定这 26 个测量值中的前三个最大值点。从这三个点平均拉曼光谱，以获得最终参考材料光谱。
3. 通过化学分析去除异常光谱
- 确定皮肤表面并去除皮肤外光谱。
- 将文件扩展名从".ric"更改为".mat"，并将 .mat 文件加载到 MATLAB 软件平台。
- 通过右键单击"分析 " 下的导入数据集，使用基线（自动加权最小平方）更正基线其他工具 |PLS_工具箱软件中具有默认设置的预处理。
- 总结 2，910~2，965cm-1之间的值，通过 MATLAB 中的总和函数从 26 个连续的步数测量中获取每个 Raman 频谱下的强度值，如图3A所示。
- 使用 MATLAB 中的linspace函数从 26-260 中插入仪器偏移值（图 3B中 X 轴中的值）。
- 使用 MATLAB 中的样条线方法，利用新生成的 260 个位置值，将强度值从 26 点插入到 260。
- 使用 MATLAB 的多配度和多面函数获取具有 260 点的新强度值集。首先，将 260 位置和强度值分别用作多配合函数的 X 和 Y 输入。将度值设置为 20。然后，使用输出系数和 260 扩展位置值作为多面数的输入，以获得最终的 260 强度值。
- 使用 MATLAB 的最大值和最小值从新插值的 260 强度值中识别最大点和最小点。
- 通过将最大和最小强度值的总和除以 2 来计算平均强度值。
- 从最接近平均强度值的 260 强度值（从步骤 3.1.6 计算）中标识强度值，并将其相应的位置值设置为外观表面。将此位置值设置为 X 轴中的零点，如图 3B所示。
- 根据零点和已知的 2 μm 步长大小更改所有其他位置值。
- 根据其位置值移除皮肤表面上方收集的所有光谱。
- 将其余数据导入 PLS_工具箱以创建数据集并将其重命名为"RamanData.mat"。
- 使用房间光效果移除离群光谱。
- 删除皮肤外光谱后加载拉曼光谱数据集 （RamanData.mat），并实施 PCA 分析。
- 将数据集加载到 MATLAB 平台下的 PLS_工具箱软件中，然后右键单击数据集以选择"分析" |PCA.
- 选择"规范化"作为预处理方法，然后选择"无"进行交叉验证。
- 使用三个组件进行 PCA 分解分析，如补充图 2所示。
- 取下体内拉曼仪器收集窗口的盖子，使用用于参考材料数据收集的相同参数收集高频区域的室内光光谱。
- 通过与房间光背景光谱的比较来确定房间光效应因子，如补充图3所示。
- 删除相应分数值明显高于正常值的光谱（超过整个数据集分数值的 99.8%，本研究中为 0.16）。
4. 在MCR分解分析中选择组件数量
- 使用上述相同方法（第 3.1.2 节）更正拉曼光谱基线。
- 按上述前处理数据集（第 3.2 节）执行 PCA 分析，但选择"PQN" = "平均中心"而不是"标准化"，并在对数刻度中绘制功能值以及组件数 （20） 作为中的默认数字。通过单击"选择组件"按钮并选择日志（igenvalue）作为 Y 值进行分解分析。选择三到八作为 MCR 分析所用的组件数。
- 执行 MCR 分析。
- 通过"数据选择"按钮将数据集加载到 MCR_主软件20中。
- 单击"确定组件数"按钮，选择组件数（三到八个）。
- 单击"初始估计"选项卡下的"纯"按钮，在"变量选择方向"选项卡下选择"浓度"，然后单击"执行"按钮。
- 单击"确定"按钮，然后单击"继续"按钮到下一页。
- 单击下一页中的"继续"，然后分别在具有非负性配置文件选项卡的"实现"和"Nr"下选择fnnls和6。单击"继续"按钮。
- 为此页面选择与第 4.3.5 节相同的参数，然后单击"继续"。
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Representative Results
在这项研究中，从4-18岁的28名受试者中收集了体内共聚焦拉曼光谱。根据上述数据收集协议，共收集了30，862个拉曼光谱。此大型光谱数据集包含 20% 的光谱异常值，如图4A所示。确定皮肤表面后，去除低信噪离异常值光谱，然后由 PCA 识别具有房间光线特征的光谱。此 PCA 模型中的第三个因素是识别房间光峰。通过将因子 3 的载荷光谱与使用同一共聚焦拉曼仪器在研究现场单独收集的荧光室光谱进行比较，证实了这一点（参见补充图 3）。图 4B表示大多数异常值光谱在此过程后被移除。
PCA 在预处理共聚焦拉曼数据集上执行，图 5中绘制了 iigenvalue 以及使用的因素数。根据先前的研究12，19，模型应该包括至少三个成分：水，蛋白质和脂质。如图5所示，因子9的显著值显著下降。该观察建议调查模型，主要组件的数量在 MCR 模型中包含的 3 到 8 个因素之间。包含与蛋白质、水和脂质最一致的光谱特征的MCR载荷如图6所示。
图 1.前臂上的病变和非病变标记的插图。（A） 病变部位的3厘米x4厘米标记区域。（B） 非病变部位的3厘米x4厘米标记区域。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.共聚焦拉曼数据收集的插图。（A） 共聚焦拉曼仪器.（B） 人类主体前臂的光谱集合。（C） 确定数据收集参考位置的屏幕截图。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.确定皮肤表面。（A） 每个拉曼光谱下的蛋白质区域的整合.（B） 根据最大点和最小点设置皮肤表面。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.拉曼数据集光谱。（A） 在去除异常值光谱之前，共聚焦拉曼光谱。（B） 去除异常值光谱后，共聚焦拉曼光谱。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.确定 PCA 分析中的组件数。（A） 对数刻度上的 Eigenvalue 绘制为 PCA 模型中使用的组件数的函数。（B） "n" 和 "n = 1" 组件之间的值差异请点击此处查看此图的较大版本。
图 6.在MCR模型中，用三到八个分量比较了载荷形状与相应参考材料的光谱。（A） 蛋白质， （B） 水和 （C） 脂质因子的形状在 MCR 模型中具有三到八个成分，与 BSA、 水和脂质参考材料的光谱相比。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7.最终模型中未使用的六个组件 MCR 模型的额外三个负载。这三个MCR组分主要由荧光和基线伪影组成。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1。激光聚焦中心接触皮肤的皮肤表面的确定说明。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图2。PLS_工具箱软件 PCA 分析中三个组件的选择说明。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图3。由房间光线叠加在房间光线参考光谱上控制的载荷因子的识别。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图4。删除宇宙射线前后MCR模型载荷的比较。（A） （B） 和 （C） 分别代表水、 蛋白质和脂质的因素.最终 MCR 模型中未使用的附加加载因子为 d、e 和 f。请单击此处查看此图的较大版本。
补充图5。角膜层典型脂质物质的拉曼光谱。（A） 胆固醇 3 硫酸盐钠和胆固醇.（B） 油性、棕榈酸、棕榈酸和硬脂酸。（C） 鳞状烯.（D） N-behenoyl-D-红血红素-芬戈辛、N-利格诺塞罗伊尔-D-红细胞生成素和D-Erythro-Dihyrosphinine。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在数据收集过程中，如协议第 2 节和第 3 节所述，通过在中的红色圆圈中突出显示的微观图像中查找较暗的区域，在仪器窗口和皮肤之间具有接触的区域收集每个深度剖面。图2C.找到这些区域后，在皮肤表面上方启动深度轮廓以准确确定数据分析过程的皮肤表面位置至关重要。皮肤表面的位置随后用于确定相应深度轮廓中每个光谱的相对深度。如协议第 1 节所述，在皮肤表面上方 10 μm 处开始深度轮廓会产生皮肤外的五个数据点。这允许成功确定皮肤表面两侧最大和最小信号强度的位置。避免测量包含笔标记和较高色素区域（如雀斑）的位置也很重要，因为这些区域会产生高荧光背景信号。曝光时间的选择是光谱质量和测量持续时间之间的平衡。较长的曝光时间可提高信噪点，并显著提高整体测量时间。然而，许多受试者发现长时间保持一动不动是很有挑战性的。例如，这对儿童来说是极具挑战性的。激光功率的增加会增加信噪。然而，过多的能量会由于能量的吸收而损害皮肤。中国国家标准（GB 7247.1-2012）规定的17 mW激光功率（GB 7247.1-2012）和国际激光安全标准（IEC 60285-1：2007;<20 mW，671 nm为<30 mW，785 nm）不可超过。其他安全预防措施包括确保每个受试者在采集数据之前都佩戴眼睛防护，身体部位的单个拓扑角度 （ITA） 值高于 40，以及避免皮肤色素沉着高的区域。
为了确定皮肤表面的位置，将蛋白质拉曼峰（2，910-2，965cm-1）下的区域整合在一起，以获得蛋白质信号的深度剖面。在集成峰值之前，首先使用 PLS_工具箱中的自动加权最小平方法对拉曼光谱进行基线校正。使用用于仪器偏移的linspace方法（图 3A中的 X 轴值）和相应强度值的样条方法将一个深度轮廓中的 26 个数据点插值到 260 点。使用 MATLAB 中的多配合和多面值函数将所得数据插值到 20阶多项式上，并确定了插值数据的最大点和最小点。平均强度值的计算方法是将最大值和最小值之和除以 2。外观表面定义为插值深度轮廓的强度值最接近平均强度的位置。皮肤表面的确切位置不需要与实验数据点重合。由于光束21的吸收和散射，这种方法只能测量皮肤的有限深度。在皮肤表面下收集低于 ±50 μm 的光谱数据可能需要对实验参数进行重大更改。
如协议第3节所述，在从室内灯光中去除信号到噪声低和贡献高的离群光谱后，数据集中仍有一小部分包含宇宙射线的光谱。补充图4显示了宇宙射线去除前后产生的载荷光谱的比较。补充图4所示的载荷光谱比较表明，少量光谱对宇宙射线的影响可以忽略不计。代表水、蛋白质和脂质的三个因素是相同的，与噪声和光谱伪影相关的附加三个载荷也非常相似。这可能是由于光谱中宇宙射线发生率低（±0.25%）因为宇宙射线在光谱中的位置是随机的。
选择 MCR 分析中使用的组分数至关重要，因为根据负责每个载荷的相应分子物种来解释载荷的形状会显著影响相应的分数值和整体方法性能。如协议第 4 节所述，首先执行 PCA 是为了调查与组件数量增加相关的同质值演变。此调查用于确定在以下 MCR 分析中应使用的组件数。在对数尺度上绘制对数值可以使此识别过程比检查原始值更容易，如图5A所示。每个功能值是一个组件可以捕获的方差的表示形式。特征值越大，该分量在光谱中可以建模的方差就越大。应同时选择或消除大小相似的 Eigen 值22。遵循此准则，MCR 分析考虑了 2 个、5 个和 8 个组件，因为组件 3、4 和 5 产生的同码值大小相似。第六、七和八个组成部分也出现了类似的趋势。图 5B是第二个、第五个和第八个分量之后显示局部最大值的 "n" 和"n+1"分量之间的 igenvalue 差异图。对皮肤分子成分的先前知识与研究设计相结合，支持至少三个组件，以建模高频拉曼光谱。因此，研究了多个包含三到八个组件的 MCR 模型，并将载荷与参考材料的光谱进行比较，以确定最终模型所需的关键组件。
从参考材料中比较拉曼光谱与拉曼光谱，可轻松识别两个最终 MCR 组件并将其分配给蛋白质和水，因为它们主导了所有测试型号的 MCR 载荷，并匹配相应的参考光谱，这是BSA和DI水。然而，某些MCR组分中脂质的预期光谱特性与MCR模型中所示的含有三个和四个分量的脂质参考谱的匹配性较弱。此外，在MCR水负荷中观察到六个组分以下的所有模型的残余蛋白峰（2，840~3，000厘米-1）。基于这些观察结果，在最终MCR分析中使用了六个分量MCR模型。六个组分中的三个通过将它们的载荷谱与相应的参考谱匹配，被分配给水、蛋白质和脂质。脂质因子的解释和分配基于三种代表性的神经酰胺材料（包括N-behenoyl-D-红细胞-苯丙胺、N-利诺塞罗伊尔-D-红细胞-苯丙胺）与拉曼光谱的载荷比较，D-埃里特罗-双色辛。还检查了角质层中其他脂质物质的拉曼光谱。这些材料包括脂肪酸（油酸、棕榈酸、棕榈酸和硬脂酸）、胆固醇（胆固醇3-硫酸盐钠和胆固醇）和角鲨烯，如补充图5所示。最终MCR模型中使用的脂质因子与神经酰胺光谱有很强的匹配性，并且与其他含有长链碳氢化合物的材料一致。其他三个MCR组分由荧光和基线伪影为主，其相应的分数值未在任何计算中使用。这三个组件如图7所示。
与其他单峰或峰值拟合方法相比，本手稿中介绍的整体分析方法产生了最终方法，提高了测量皮肤关键成分的特异性和准确性。此方法表明，可以从包含相对较小的坏光谱的临床数据集中提取关键组件。今后的努力重点是将这种方法自动化到软件包中，以提高其效率并减少分析所需的技术专门知识。正在开发类似的方法，用于使用785nm激光源而不是在同一仪器中加入671nm激光的指纹区域（400×1，800cm-1）收集的拉曼光谱。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者非常认可企业职能部门分析和个人清洁护理部门的财政支持。我们要感谢分析副董事王茉莉女士和罗布·加德纳博士的指导和支持，感谢李阳女士在数据收集方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
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