Summary
Burada, spektral dış atriden çıkarılması ve daha sonra temel özelliklerin çıkarılması için kemometrik yaklaşımlar ile birlikte klinik çalışmalarda insan deneklerinden konfokal Raman spektrasının toplanması için bir protokol saklıyız.
Abstract
Bu in vivo konfokal Raman spektroskopik yöntemin geliştirilmesi insan deneklerde derinlik çözünürlüğü ile su, protein ve lipidlerin doğrudan ölçülmesini sağlar. Bu bilgiler ciltle ilgili hastalıklar ve cilt bakım ürün performansı nın karakterizei için çok önemlidir. Bu protokol, konfokal Raman spektrum toplama yöntemini ve kemometriden yararlanan spektral veri setinin sonraki analizini göstermektedir. Bu yöntemin amacı, veri toplama için standart bir protokol oluşturmak ve veri analizi için genel rehberlik sağlamaktır. Ön işleme (örneğin, aykırı spektrumların kaldırılması) klinik çalışmalardan büyük veri kümelerini işlerken kritik bir adımdır. Örnek olarak, aykırı kişilerin türlerini belirlemek ve bunları kaldırmak için belirli stratejiler geliştirmek için bir veri kümesinin önceden bilgisine dayalı rehberlik sağlarız. Bir temel bileşen analizi gerçekleştirilir ve yükleme spektrumları son çok değişkenli eğri çözünürlük (MCR) analizinde kullanılan bileşen sayısını seçmek için referans malzemelerden spektrumlarla karşılaştırılır. Bu yaklaşım, büyük bir spektral veri kümesinden anlamlı bilgi ayıklamak için başarılı dır.
Introduction
Klinik çalışmalarda, in vivo konfokal Raman spektroskopistrat korneum kalınlığı ve su içeriği1,2,3,4belirlemek için eşsiz yeteneğini göstermiştir ve penetrasyon izleme aktif maddeler topikal cilde uygulanan5,6. Noninvaziv bir yaklaşım olarak, konfokal Raman spektroskopisi titreşim modlarına göre moleküler sinyalleri algılar. Bu nedenle, etiketleme7gerekli değildir. In vivo confokal Raman spektroskopisi tekniğin konfokal doğasına göre derinlik çözünürlüğü ile kimyasal bilgi sağlar. Bu derinliğe bağlı bilgi cilt bakım ürünleri4,8,yaşlanma9,10, mevsimsel değişiklikler3,yanı sıra cilt bariyerfonksiyon hastalıklarının etkilerini çalışmada çok yararlıdır, atopik dermatit gibi11,12. Konfokal Raman spektroskopisinin yüksek frekanslı bölgesinde (2.500-4.000 cm-1)çok fazla bilgi vardır ve burada su 3.250-3.550 cm-1arasında bölgede belirgin zirveler üretir. Ancak, yaklaşık 2.800-3.000 cm-1arasında ortalanan protein ve lipidlerin Raman zirveleri, sinyaller esas olarak metilen (-CH2-) ve metil (-CH3)gruplarından üretildiği için birbiriyle örtüşmektedir13 . Bu örtüşen bilgiler, tek tek moleküler türlerin göreceli miktarda elde ederken teknik bir sorun teşkil etmektedir. Tepe uydurma14,15 ve seçici tepe konumu12,16 yaklaşımlar bu sorunu çözmek için kullanılmıştır. Ancak, aynı bileşenden birden çok Raman tepe noktası aynı anda17olarak değiştiğinden, bu tek tepe tabanlı yöntemlerin saf bileşen bilgilerini ayıklamaları zordur. Bizim son yayın18,bir MCR yaklaşım saf bileşen bilgilerini açıklamak için önerilmiştir. Bu yaklaşım kullanılarak, büyük bir in vivo konfokal Raman spektroskopik veri setinden üç bileşen (su, protein ve lipidler) çıkarıldı.
Büyük klinik çalışmaların yürütülmesi in vivo spektroskopik veri toplayan bireyler üzerinde talep olabilir. Bazı durumlarda, spektral edinimi bir gün içinde birçok saat için işletim ekipmanı gerektirebilir ve çalışma haftalar veya aylara kadar uzayabilir. Bu koşullar altında, spektroskopik veriler, tüm spektroskopik eserler kaynaklarını tanımlamak, dışlamak ve düzeltmek için teknik uzmanlığa sahip olmayan ekipman operatörleri tarafından oluşturulabilir. Elde edilen veri kümesi, analizden önce tanımlanması ve verilerden dışlanması gereken spektroskopik aykırılıkların küçük bir kısmını içerebilir. Bu makalede, MCR ile verileri analiz etmeden önce klinik Raman veri kümesini "temizlemek" için bir kemometrik analiz süreci ayrıntılı olarak gösteriş. Aykırılaştırıcıları başarılı bir şekilde kaldırmak için, aykırı lık türleri ve aykırı spektrumların üretimi için potansiyel nedenin tanımlanması gerekir. Daha sonra, hedeflenen aykırı kaldırmak için belirli bir yaklaşım geliştirilebilir. Bu, veri oluşturma süreci ve çalışma tasarımı hakkında ayrıntılı bir anlayış da dahil olmak üzere veri kümesi hakkında önceden bilgi gerektirir. Bu veri setinde, aykırı ların çoğu düşük sinyal-gürültü spektrumlarıdır ve öncelikle cilt yüzeyinin üzerinde toplanan spektrumlardan (30.862'nin 6.208'i) ve 2) floresan oda Lambasından spektruma güçlü katkı (30.862'nin 67'si) kaynaklanmaktadır. Lazer odak noktası cilt yüzeyine yaklaştıkça ve çoğunlukla derinin altındaki alet penceresinde olduğundan, deri yüzeyinde toplanan spektrumlar zayıf bir Raman yanıtı üretir. Floresan oda ışığının güçlü bir katkısı olan spektrumlar, konfokal Raman toplama penceresinin deneğin vücut bölgesi tarafından tam olarak kapsanmayan bir durum yaratan enstrüman operatörü hatası veya denek hareketi nedeniyle oluşturulur. Bu tür spektral eserler, veri toplama sırasında spektroskopik bir uzman tarafından tespit edilip düzeltilebilse de, bu çalışmada kullanılan eğitimli cihaz operatörlerine, felaket başarısızlık gözlendi. Aykırıları tanımlama ve hariç çıkarma görevi veri çözümleme protokolüne dahil edilir. Sunulan protokol bu sorunu çözmek için geliştirilmiştir. Cilt yüzeyinin üzerindeki düşük sinyal-gürültü spektrumlarını gidermek için, cilt yüzeyinin üzerinde toplanan spektrumların uzaklaştırılmasına izin vermek için öncelikle cilt yüzeyinin yerinin belirlenmesi gerekir. Cilt yüzeyinin konumu Raman lazer odak noktasının ciltte yarısı, cilttenyarısının ise Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi olduğu derinlik olarak tanımlanır. Düşük sinyal-gürültü spektrumları çıkarıldıktan sonra, floresan oda ışık zirveleri hakim faktör ayıklamak için bir temel bileşen analizi (PCA) uygulanır. Bu aykırılar, ilgili faktörün puan değerine göre kaldırılır.
Bu protokol, MCR işleminde altı temel bileşenin nasıl belirlendiği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Bu, farklı sayıda ana bileşenle oluşturulan modeller için yüklemeler arasında spektral şekil karşılaştırması takip eden bir PCA analizi ile yapılır. Referans materyallerin ve insan deneklerin veri toplaması için deneysel süreç de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Pekin Çocuk Hastanesi kurumsal inceleme komitesi tarafından 1975 Helsinki Bildirgesi'nin etik kurallarına uygun olarak onaylanmıştır. İyi Klinik Uygulama için ICH yönergelerine göre yapılmıştır. Çalışma Mayıs-Temmuz 2015 tarihleri arasında gerçekleştirildi.
1. Atopik dermatit ile insan deneklerinden in vivo konfokal Raman spektrumlarının toplanması
- Aşağıdaki ölçütlerle uyumlu konuları dahil edin.
- 4-18 yaş arası konuları ekleyin.
- Hafif ve orta derecede atopik dermatit olan olguları (Hekimin küresel değerlendirmesine göre 2 veya 3 puan) vücut yüzeyinin %5-30'unda aktif hastalık semptomları olan ve kollarda en az iki lezyon bulunan denekleri dahil edin.
- Doğrudan AD hastalığı ile ilgili belirtiler hariç, sağlıklı olan konular içerir.
- Yazılı bilgilendirilmiş onay sağlayan konuları ekleyin.
- Test yerinde 40'tan yüksek bir topoloji açısı (ITA) değeriolan konuları ekleyin.
- Aşağıdaki ölçütlerden herhangi birini karşılayan konuları hariç tinleyin.
- Önceki 4 hafta içinde herhangi bir test tesisinde şu anda katılan veya daha önce bir klinik çalışmaya katılmış olan denekleri hariç tinleyin.
- Çalışmadan önce 5 yıl içinde kanser tanısı almış veya tedavi edilmiş olan veya kanserli bireyleri hariç tut.
- Diyabetik denekler hariç.
- Deneği riske atabilecek veya çalışma sonuçlarının doğruluğuna müdahale edebilecek immünolojik veya bulaşıcı hastalığı olan denekleri hariç tinkişi (hepatit, tüberküloz, HIV, AIDS, lupus veya romatoid artrit).
- Enstrümental ölçümleri engelleyebilecek veya cildin sadece atopik dermatitiçin net değerlendirmesini engelleyebilecek cilt rahatsızlıkları olan denekleri hariç tinleyin. Örnekler son derece kuru cilt, hasarlı cilt, kesikler, çizikler, güneş yanığı, doğum lekeleri, dövmeler, geniş yara izi, döküntüleri, aşırı saç büyüme, ya da akne içerir.
- Son bir ay içinde küçük sakinleştiriciler dışında oral immünsupresif ilaçlar, antibiyotikler veya diğer sistemik tedaviler kullanan denekler hariç.
- Araştırmacının görüşüne göre, onları çalışmaya katılmaktan alıkoyan diğer tıbbi durumları olan denekleri hariç tut.
- Test alanında daha yüksek pigmentasyona sahip nesneleri hariç tinler.
- Atopik dermatit çalışma katılımcısının lezyon alanını etiketleyin ve Şekil 1A'dagösterildiği gibi lezyon bölgesinin üzerinde veya yakınında 3 cm x 4 cm alana sahip işaretleyin.
- Şekil 1B'degösterildiği gibi lezyon dışı alanı muadili gövde bölgesinde (örn. sol önkol vs. sağ önkol) aynı belirteçle etiketleyin.
- Şekil 2A ve Şekil 2B'degösterildiği gibi işaretli gövde bölgesini in vivo konfokal Raman aletinin penceresi ile yakın temas halinde yerleştirin. Vücut yerinde oda ışığının etkisini önlemek için tüm pencereyi kapatın.
- Raman veri toplama gerçekleştirin.
NOT: Cihaz, 17 mW gücünde 671 nm lazer kullanarak 2 cm-1 ve 50x mikroskopi hedefi (NA = 0.9 yağ daldırma) spektral çözünürlüğe sahiptir. Dalga boyu dahili neon-argon lamba spektrumu kullanılarak kalibre edilir. Yoğunluk kalibrasyonu, NIST (Ulusal Standartlar Enstitüsü) cam kalibrasyon standardının spektrumunun ölçülmesi ile yapılır.- Odak noktasını Şekil 2C'de gösterildiği gibi bir spektrum gözlemlenene kadar hareket ettirin ve odağı cilt yüzeyinden 10 μm uzağa taşıyın.
- 2.510 cm-1-4.000 cm-1 frekans lı bölgede 2 μm adım boyutuyla 26 adım için veri toplamaya başlayın. 1 s pozlama süresi kullanın ve toplam ~ 10-15 dakika süren her alan için sekiz çoğaltmaölçün.
2. Referans malzemelerden konfokal Raman spektrumlarının toplanması
- Referans malzemeleri yerleştirin, insan cilt stratum korneum önemli bileşenleri19, konfokal Raman aracının penceresine (Malzemeler Tablosubakınız : Sığır Serum Albumin (BSA), deiyonize su (DI su), ceramid, kolesterol, ücretsiz yağ asidi ve skualen).
- Referans malzemelerin Raman spektrumlarını yukarıda açıklandığı gibi aynı toplama parametrelerini kullanarak malzemenin dışından malzeme merkezine ardışık olarak toplayın.
- 2.510-4.000 cm-1 aralığı arasındaki her Raman spektrumunun altındaki alanı entegre edin ve bu 26 ölçümde en yüksek üç maksimum değer noktasını belirleyin. Son referans malzeme spektrumelde etmek için bu üç noktadan Raman spektrumortalama.
3. Kemometrik analiz yoluyla aykırı spektrumların çıkarılması
- Cilt yüzeyini belirleyin ve cilt dışı spektrumları çıkarın.
- Dosya uzantısını '.ric'den '.mat' olarak değiştirin ve .mat dosyasını MATLAB yazılım platformuna yükleyin.
- Analyze altında içe aktarılan veri kümesini sağ tıklatarak Taban Çizgisi(Otomatik Ağırlıklı En Küçük Kareler) kullanarak taban çizgisini düzeltin | Diğer Araçlar | Varsayılan ayarı ile PLS_Toolbox yazılımında ön işleme.
- Şekil 3A'da matlab'daki toplam fonksiyonu ile gösterildiği gibi, her Raman spektrumu altındaki yoğunluk değerlerini elde etmek için 2.910-2.965 cm-1 arasındaki değerleri özetleyin.
- MATLAB'daki linspace işlevini kullanarak enstrüman ofset değerini (Şekil 3B'dekiX eksenindeki değer) 26-260'tan enterpolasyona edin.
- MATLAB'da spline yöntemini kullanarak yoğunluk değerini 26'dan 260'a enterpole edin ve yeni oluşturulan 260 konum değerlerinden yararlanın.
- 260 puanlık yeni yoğunluk değerleri kümesini elde etmek için MATLAB'ın polifit ve polival işlevlerini kullanın. İlk olarak, polifit işlevi için 260 konum ve yoğunluk değerlerini X ve Y girişleri olarak kullanın. Derece değerini 20 olarak ayarlayın. Daha sonra, son 260 yoğunluk değerlerini elde etmek için polival girdisi olarak çıktı katsayılarını ve 260 genişletilmiş konum değerlerini kullanın.
- Yeni enterpolasyona tabi 260 yoğunluk değerlerinden maksimum ve minimum noktaları belirlemek için MATLAB'ın maksimum ve min işlevlerini kullanın.
- Maksimum ve minimum yoğunluk değerinin toplamını ikiye bölerek ortalama yoğunluk değerini hesaplayın.
- Ortalama yoğunluk değerine en yakın olan 260 yoğunluk değerinden (adım 3.1.6'dan hesaplanan) yoğunluk değerini belirleyin ve buna karşılık gelen konum değerini cilt yüzeyi olarak ayarlayın. Bu konum değerini Şekil 3B'degösterildiği gibi X eksenindeki sıfır noktası olarak ayarlayın.
- Diğer tüm konum değerlerini sıfır noktasına ve bilinen 2 μm adım boyutuna göre değiştirin.
- Konum değerine göre deri yüzeyinin üzerinde toplanan tüm spektrumları çıkarın.
- Bir veri kümesi oluşturmak ve "RamanData.mat" adını yeniden adlandırmak için verilerin geri kalanını PLS_Toolbox'a aktarın.
- Oda ışık efekti ile aykırı spektrumları çıkarın.
- Cilt dışı spektrumların çıkarılmasından sonra Raman spectra veri kümesini (RamanData.mat) yükleyin ve PCA analizini uygulayın.
- Veri kümesini MATLAB platformu altında PLS_Toolbox yazılımına yükleyin ve Analiz | PCA.
- Ön işleme yaklaşımı olarak Normalleştir'i seçin ve çapraz doğrulama için Yok'u seçin.
- PcA ayrıştırma analizi için üç bileşeni Ek Şekil 2'degösterildiği gibi kullanın.
- In vivo Raman cihazının toplama penceresindeki kapağı çıkarın ve referans malzeme veri toplamada kullanılan parametreleri kullanarak yüksek frekanslı bölgede oda ışığı spektrumlarını toplayın.
- Ek Şekil 3'tegösterildiği gibi oda ışığı arka plan spektrumları ile karşılaştırıldığında oda ışık efekti faktörünü tanımlayın.
- Spektrumları normalden çok daha yüksek bir puan değerine sahip olarak kaldırın (bu çalışmada 0,16 olan tüm veri kümesinin puan değerlerinin %99,8'inden fazlası).
4. MCR ayrıştırma analizinde bileşenlerin sayısının seçimi
- Raman spektrum taban çizgisini yukarıda açıklanan yaklaşımı kullanarak düzeltin (bölüm 3.1.2).
- "Normalize etmek" yerine "PQN" - "Mean Center" seçmek dışında yukarıda açıklandığı şekilde önceden işlenmiş veri kümesinde PCA çözümlemesini (bölüm 3.2) gerçekleştirin ve logaritmik ölçekteki özdeğerleri ve bileşen sayısı (20) varsayılan sayı olarak Bileşenleri Seç düğmesini tıklatarak ayrışma çözümlemesi ve Y değeri olarak log(eigenvalues) seçeneğini belirleyin. MCR çözümlemesi için kullanılan bileşenlerin sayısı olarak üç ila sekiz seçin.
- MCR analizini gerçekleştirin.
- Veri Seçimini düğmesi aracılığıyla veri kümesini MCR_main yazılımı20'ye yükleyin.
- Bileşen sayısının belirlenmesi düğmesini tıklatarak bileşen sayısını (üç ila sekiz) seçin.
- İlk Tahmin sekmesinin altındaki Saf düğmesini tıklatın, değişken seçim sekmesinin yönünün altındaki Konsantrasyon'u seçin ve Yap düğmesini tıklatın.
- Tamam düğmesini ve ardından bir sonraki sayfaya Devam düğmesini tıklatın.
- Bir sonraki sayfada Devam et'i tıklatın ve ardından sırasıyla olumsuzluk olmayan profillere sahip türlerin Uygulama ve Nr. altında fnnls ve 6'yı seçin. Devam et düğmesini tıklatın.
- Bu sayfa için bölüm 4.3.5 ile aynı parametreleri seçin ve Devam et'itıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu klinik çalışmada 4-18 yaş arası 28 denekten in vivo konfokal Raman spektrumları toplanmıştır. Yukarıda belirtilen veri toplama protokolü ile toplam 30.862 Raman spektrum u toplanmıştır. Bu büyük spektral veri seti Şekil 4A'dagösterildiği gibi %20 spektral dışlayıcılar içerir. Düşük sinyal-gürültü outlier spektrumları cilt yüzeyi belirlendikten sonra kaldırıldı, oda ışık özellikleri ile spektrumları tanımlamak için PCA izledi. Bu PCA modelinde üçüncü faktör oda ışık zirveleri tanımlanır. Bu, aynı konfokal Raman aleti kullanılarak çalışma alanında ayrı olarak toplanan floresan oda ışığı spektrumu ile faktör 3'ün yükleme spektrumlarının karşılaştırılması ile doğrulanır (bkz. Ek Şekil 3). Şekil 4 B, bu işlemden sonra aykırı spektrumların çoğunun kaldırıldığını gösterir.
PCA önceden işlenmiş konfokal Raman veri setinde yapıldı ve kullanılan faktörlerin sayısı ile birlikte eigenvalue Şekil 5çizilir . Önceki çalışmalara göre12,19, model en az üç bileşeni içermelidir: su, protein, ve lipid. Şekil 5'tegösterildiği gibi faktör 9 için eigenvalue'da önemli bir azalma gözlenmiştir. Bu gözlem, MCR modeline dahil edilmesi için üç ile sekiz faktör arasında değişen temel bileşen sayısına sahip modellerin araştırılmasını önermektedir. Protein, su ve lipid ile en uyumlu spektroskopik özellikler içeren MCR yüklemeleri Şekil 6'dagösterilmiştir.
Şekil 1 . Ön kolda lezyon ve non-lezyon işareti nin çizimi. (A) Bir lezyon sahasında 3 cm x 4 cm işaretli alan. (B) Lezyon olmayan bir alanda 3 cm x 4 cm işaretli alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 . Confocal Raman veri toplama İllüstrasyon. (A) Konfokal Raman aleti. (B) İnsan öznesinin ön kolunda ki spektrum koleksiyonu. (C) Veri toplama için referans konumunu belirleyen bir ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 . Cilt yüzeyinin belirlenmesi. (A) Her Raman spektrumu altında protein alanının entegrasyonu. (B) Cilt yüzeyini maksimum ve minimum noktalara göre ayarlamak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 . Raman dataset spektrum. (A) Confokal Raman spektrumları dış spektrumların çıkarılmasından önce. (B) Dış spektrumların çıkarılmasından sonra Confokal Raman spektrumları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 . PCA analizinden bileşen sayısını belirleme. (A) PCA modelinde kullanılan bileşen sayısının bir fonksiyonu olarak çizilen logaritmik ölçekteki eigenvalue. (B) 'n' ve 'n + 1' bileşenleri arasındaki özdeğerler arasındaki fark Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6 . Yükleme şeklinin ilgili referans malzemelerin spektrumları ile MCR modelinde üç ila sekiz bileşenle karşılaştırılması. (A) Protein, (B) su ve (C) lipid faktörlerinin şekli, MCR modelinde BSA, su ve lipid referans malzemelerinin spektrumlarına göre sırasıyla üç ila sekiz bileşenden oluşur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7 . Son modelde kullanılmayan altı bileşenli MCR modelinden ek üç yükleme. Bu üç MCR bileşenine floresan ve temel yapılar hakimdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1. Lazer odağının merkezinin cilde dokunduğu cilt yüzeyinin belirlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2. PLS_Toolbox yazılım PCA analizinde üç bileşenseçiminin çizimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3. Oda ışığının referans spektrumuna yerleştirilmiş oda ışığının hakim olduğu yükleme faktörünün tanımlanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4. Kozmik ışınların çıkarılmasından önce ve sonra MCR modelinden yüklemelerin karşılaştırılması. (A), (B), ve (C) sırasıyla su, protein ve lipidi temsil eden faktörlerdir. Son MCR modelinde kullanılmayan ek yükleme faktörleri d, e ve f' dir. Lütfen bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 5. Stratum corneum tipik lipid malzemelerin Raman spektrumları. (A) Kolesterol 3-sülfat sodyum ve kolesterol. (B) Oleik, palmitik, palmitoleik ve stearik asit. (C) Skualen. (D) N-behenoyl-D-eritros-sfingosin, N-Lignoceroyl-D-eritros-sfenanin, ve D-Eritros-Dihyrosfingosine. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veri toplama sırasında, protokolün bölüm 2 ve 3'te açıklandığı gibi, her derinlik profili, gösterge penceresi ile deri arasında temas olan bir alanda, kırmızı dairelerde vurgulanan mikroskobik görüntülerden daha koyu alanları bularak toplanmıştır. Şekil 2C. Bu alanlar tespit edildikten sonra, veri analizi prosedürü için deri yüzeyinin konumunu doğru bir şekilde belirlemek için cilt yüzeyinin üzerindeki derinlik profilinin başlatılması çok önemliydi. Cilt yüzeyinin konumu daha sonra ilgili derinlik profilinde her spektrumun göreli derinliğini belirlemek için kullanılmıştır. Protokolün 1. Bu, cilt yüzeyinin her iki tarafındaki maksimum ve minimum sinyal yoğunluğunun konumlarının başarılı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu alanlar yüksek floresan arka plan sinyali ürettiğinden, kalem işaretleri ve çiller gibi daha yüksek pigmentli alanlar içeren konumların ölçülmesini önlemek de önemlidir. Pozlama süresinin seçimi spektral kalite ve ölçüm süresi arasında bir dengedir. Daha uzun pozlama süresi sinyalden gürültüye iyi gelir ve genel ölçüm süresini önemli ölçüde artırır. Ancak, birçok konu uzun süre hareketsiz kalmayı zor bulur. Bu çocuklar için son derece zor, örneğin. Lazer gücünün artırılması sinyal-gürültüartırır. Ancak, çok fazla güç enerji emilimi nedeniyle cilde zarar verebilir. Çin ulusal standardı (GB 7247.1-2012) tarafından tanımlanan maksimum izin verilen pozlama, 17 mW lazer gücü ve uluslararası lazer güvenlik standardı (IEC 60285-1:2007; <20 mW 671 nm ve <30 mW 785 nm için) aşınamaz. Diğer güvenlik önlemleri arasında her deneğin veri edinilmeden önce göz koruması takmasını, vücut sitelerinin 40'Tan yüksek bir topoloji açısına (ITA) sahip olmasını sağlamak ve yüksek cilt pigmentasyonu olan alanlardan kaçınmak yer almaktadır.
Deri yüzeyinin yerini belirlemek için, protein Raman tepe altında alan (2,910-2,965 cm-1) protein sinyalinin derinlik profili elde etmek için entegre edildi. Raman spektrumları, zirvelerin entegrasyonundan önce PLS_Toolbox'ın otomatik ağırlıklı en az kare yöntemi kullanılarak ilk temel düzeltildi. Bir derinlik profilinden 26 veri noktası, alet ofset vaue (Şekil 3A'dakiX ekseni değeri) ve karşılık gelen yoğunluk değeri için spline yöntemi kullanılarak 260 noktaya enterpolasyona tabi edildi. Elde edilen veriler MATLAB'daki polifit ve polival fonksiyonlar kullanılarak20 sıra polinom üzerine enterpolasyon yapıldı ve enterpolasyonlu verilerin maksimum ve minimum noktaları belirlendi. Ortalama yoğunluk değeri, maksimum ve minimum değerlerin toplamının 2'ye bölünmesiyle hesaplanmıştır. Deri yüzeyi, enterpolasyonlu derinlik profilindeki yoğunluk değerinin ortalama yoğunluğa en yakın olduğu yer olarak tanımlanmıştır. Deri yüzeyinin tam konumu deneysel bir veri noktası ile çakışması gerekmez. Bu yöntem sadece emilimi ve Kiriş21saçılma nedeniyle cildin sınırlı bir derinliği ölçebilirsiniz. Deri yüzeyinin altında ~50 μm'nin altında spektroskopik veri toplanması deneysel parametrelerde önemli değişiklikler gerektirebilir.
Protokolün 3. Kozmik ışın çıkarmadan önce ve sonra oluşturulan yükleme spektrumlarının karşılaştırılması Ek Şekil 4'tegösterilmiştir. Ek Şekil 4'te gösterilen yükleme spektrumlarının karşılaştırılması, az sayıdaki spektrumun kozmik ışınlarla olan etkisinin önemsiz olduğunu göstermektedir. Su, protein ve lipidi temsil eden üç faktör aynıydı ve gürültü ve spektral objelerle ilişkili ek üç yükleme de çok benzerdi. Bu spektrumlarda kozmik ışınların düşük bir oluşumu atfedilebilir (~ 0.25%) Çünkü spektrumdaki kozmik ışınların yeri rastgeledir.
MCR analizinde kullanılan bileşenlerin sayısının seçimi önemlidir, çünkü yüklemelerin şeklinin her yüklemeden sorumlu ilgili moleküler türler açısından yorumlanması hem ilgili skoru hem de değerleri ve genel yöntem performansı kullanılır. Protokolün 4. Bu araştırma, aşağıdaki MCR analizinde kullanılması gereken bileşenlerin sayısını belirlemek için kullanılmıştır. Bir logaritmik ölçekte eigenvalue çizilmesi, şekil 5A'dagösterildiği gibi, bu tanımlama işlemini ham özdeğerleri incelemekten daha kolay hale getirebilir. Her eigenvalue, bir bileşenin yakalayabileceği varyansın bir temsilidir. Eigenvalue ne kadar büyükse, bu bileşen spektrumda o kadar fazla varyans modelleyebilir. Benzer boyuta sahip değerler birlikte seçilmeli veya ortadan kaldırılmalıdır22. Bu kılavuzdan sonra, mcr çözümlemesi için iki, beş ve sekiz bileşen kabul edildi, çünkü üç, dört ve beş bileşen boyut olarak benzer özdeğerler üretir. Benzer bir eğilim de bileşenler altı, yedi ve sekiz için gözlendi. Şekil 5 B, ikinci, beşinci ve sekizinci bileşenlerden sonra yerel maxima'yı gösteren 'n' ve 'n+1' bileşenleri arasındaki özdeğerler arasındaki farkın bir çizimidir. Çalışma tasarımı ile birlikte cildin moleküler bileşimi hakkında önceden bilgi yüksek frekansraman spektrumları modellemek için gerekli üç bileşenin en az destekler. Bu nedenle, üç ila sekiz bileşen içeren birden fazla MCR modeli araştırılmış ve son model için gerekli olan temel bileşenleri belirlemek için yüklemeler referans malzemelerden spektrumlarla karşılaştırılmıştır.
Referans malzemelerden Raman spektrumile yüklemelerin kolayca karşılaştırılması, test edilen tüm modeller için MCR yüklemelerine hakim oldukları ve ilgili referansla eşleştikleri için son MCR bileşenlerinden ikisinin protein ve suya atanmasına ve tanımlanmasına olanak tanır. spektrum, BSA ve DI su vardır. Ancak, bazı MCR bileşenlerinde lipidin beklenen spektroskopik özellikleri, üç ve dört bileşeniçeren MCR modellerinde gösterilen lipid referans spektrumu ile daha zayıf bir eşleşmeydi. Buna ek olarak, altı bileşenin altında test edilen tüm modeller için MCR su yüklemelerinde artık protein zirveleri (2.840-3.000 cm-1)gözlenmiştir. Bu gözlemlere dayanarak, son MCR analizinde altı bileşenli BIR MCR modeli kullanılmıştır. Altı bileşenden üçü su, protein ve lipide, yükleme spektrumlarını ilgili referans spektrumuyla eşleştirerek tahsis edildi. Lipid faktörünün yorumlanması ve atanması, N-behenoyl-D-eritrosit-sfingosin, N-Lignoceroyl-D-eritrosit-sfinkin dahil olmak üzere üç temsili ceramid malzemenin Raman spektrumları ile karşılaştırılmasına dayanır ve D-Eritros-Dihyrosphingosine. Stratum korneumdaki diğer lipid malzemelerin Raman spektrumları da incelendi. Bu malzemeler yağ asitleri içerir (oleik, palmitoleik, ve stearik asit), kolesterol (kolesterol 3-sülfat sodyum ve kolesterol), ve skualen, Ek Şekilgösterildiği gibi 5 . Son MCR modelinde kullanılan lipid faktörü ceramide spektrumları ile güçlü bir uyum ve uzun zincir hidrokarbonlar içeren diğer malzemeler ile tutarlı oldu. Diğer üç MCR bileşenifloresan ve temel yapılara hakim olmuş ve karşılık gelen puan değerleri hiçbir hesaplamada kullanılmamış. Bu üç bileşen Şekil 7'degösterilmiştir.
Bu el yazmasında sunulan genel analiz yaklaşımı, ciltteki temel bileşenleri ölçmek için diğer tek tepe veya tepeye uygun yaklaşımlara kıyasla geliştirilmiş özgüllük ve doğrulukla son bir yöntem üretmektedir. Bu metodoloji, kritik bileşenlerin kötü spektrumların nispeten küçük bir kısmını içeren bir klinik veri kümesinden çıkarılabileni göstermektedir. Gelecekteki çabalar, verimliliğini artırmak ve analiz için gerekli teknik uzmanlık miktarını azaltmak için bu metodolojinin bir yazılım paketine otomasyonu üzerinde yoğunlaşmaktadır. Benzer metodoloji, parmak izi bölgesinde toplanan Raman spektrumları için (400-1.800 cm-1)aynı cihaza dahil edilen 671 nm lazer yerine 785 nm lazer kaynağı kullanılarak geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar büyük ölçüde kurumsal fonksiyon analitik ve kişisel temizlik bakım departmanı mali destek kabul. Analitik yardımcı yönetmenler Bayan Jasmine Wang ve Dr. Robb Gardner'a rehberlik ve desteklerinden dolayı şükranlarımızı sunmak ve veri toplama konusundaki yardımları için Bayan Li Yang'a teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
